Aplicación de la citometría de flujo al Aplicación de la citometría de flujo al estudio de la enfermedad mínima estudio de la enfermedad mínima

residual en leucemias agudasresidual en leucemias agudas

Air-cooled Argon Ion Laser

Beam Shaping Lenses

High SensitivityQuartz Flow Cell

Forward ScatterDetector

Side ScatterDetector

525BP FL1 (FITC)

575BP FL2 (RD1)

620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5)

488DL488BK

550DL600DL

645DL

Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos

Láser, cámara de flujo y sistema óptico

11 de octubre de 2007

Leucemias Agudas. Respuesta al Leucemias Agudas. Respuesta al Tratamiento Tratamiento

AMO: < 5% blastos

SP: plaquetas > 100x109/L

RAN > 1x109/L

Cariotipo normal

Remisión completa morfológica Remisión completa citogenética

5%

10-5

E.Indetectable

EMR

Recaída

Tiempo

MORFOLOGÍA

CITOGENÉTICA

PCR

CITOMETRÍA

% Blastos en M.O.

Tratamiento Inducción

Tratamiento Consolidación

TPH Tratamiento Mantenimiento

Enfermedad Residual MínimaEnfermedad Residual Mínima

1012

1010

100-2

Carga

Normal LMA M0 LMA M1

LMA M7 LLA

MorfologíaMorfología

Linfoblastos reactivos

Linfoblastos LLA pro B

Morfología (LLA post inducción)Morfología (LLA post inducción)

Linfoblastos reactivos

Linfoblastos LLA bcr-abl

Morfología (LLA post inducción)Morfología (LLA post inducción)

Características de la muestra

• Aspirado medular

• Debe ser representativo de médula ósea

aspirado enérgico

1,5 mL de muestra

evitar la dilución con sangre medular

• Procesar en < 24 horas

Evitar pérdidas selectivas de células

EMR. CFMEMR. CFM

• Diferenciar las LMA de las LLA (B y T).

• Subclasificación precisa de las LLA (B y T).

• Diagnóstico preciso de M0, M6 (maduras) y M7.

• Diagnóstico de L.A. bifenotípicas y L.A. con marcadores aberrantes.

• Orientar la búsqueda de alteraciones citogenéticas específicas:

My: t(8;21) (ETO-AML1); t(15;17) (PML-RARa); inv(16) (CBFb-MYH11X)

Ly: t(9;22) (BCR-ABL); t(v;11q23) (MLL); t(1;19) (E2A-PBX1); t(12;21) (TEL-AML1)

• Detección de IFL al diagnóstico para el seguimiento de EMR.

Estudio Inicial de la LeucemiaEstudio Inicial de la LeucemiaObjetivos de la CFMObjetivos de la CFM

EMR. Citometría de flujo EMR. Citometría de flujo multiparamétricamultiparamétrica

PASOS:

• En el momento del diagnóstico:

1. Inmunofenotipos Leucémicos (IFL)

2. Diseñar paneles de seguimiento específicos

• Durante el seguimiento:

3. Obtención de muestras adecuadas

4. Aplicación de los paneles de seguimiento

5. Adquisición: Live gate

Estrategia de live-gate o list-gate

Inmunofenotipo leucémico al diagnóstico: CD19+CD34+CD10- y CD19+CD20-CD10-

1. 1. Se adquieren 20000 leucocitos y se establece el % de células B

2. 2. En una live-gate (azul) se adquieren sólo las células CD19+

3. 3. Células CD19+ con el fenotipo leucémico CD20-CD10-

4. 4. Células CD19+ con el fenotipo leucémico CD34+ CD10-

EMR. CFMEMR. CFM

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ALBA BORRAS RECHE.008CD10 PE ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

JUAN M.LOZANO GONZALEZ.013CD10 PE ->CD10 CD10

CD20 CD20

Morfología vs InmunofenotipoMorfología vs Inmunofenotipo

IFL: CD19+ CD20- CD10- (LAL Pro-B)

EMR: 1,43%

Normal

EMR. LLA-B MLL+EMR. LLA-B MLL+

CD20

CD10

CD10

CD20

CD19

Post-Inducción: 0,14% de células

CD19+CD13+ (histogramas 1 y 2).

Post-Consolidación: EMR no detectable (histogramas 3 y 4).

Médula ósea en recuperación post QT (LMA-M2 en RC)

IFL: CD19+ CD45-

EMR: 0,024%

EMR. LLA-B común (TEL-AML1)EMR. LLA-B común (TEL-AML1)

Expresión normal

Expresión anómala

EMR. LLA-B (BCR-ABL)EMR. LLA-B (BCR-ABL)

Ddiagnóstico (sp)

LLA pro-B

Post-Inducción

EMR: 0,058%

4 meses después del diagnóstico

ER: 30,6%

LLA-B MLL+. Evolución EMRLLA-B MLL+. Evolución EMR

Inmunofenotipos Leucémicos (1)

NUMCross-LineageCD19+CD33+ 13CD19+CD13+ 7CD19+CD15+ 3

total 23AsincronismosCD19+CD22++CD34+ 5CD19+CD22++CD20- 5CD20+TdT+ 1IgMc+TdT+ 2

total 13HiperexpresiónCD34+++ 4CD10+++ 16

total 20Fenotipos infrecuentesCD19+CD45- 22CD19+CD34+CD10- 9CD19+CD34-CD10++ 6CD19+CD20-CD10- 5

Total 42

NUMFSC/ SSCHight FSC/ SSC 1

total 1AsincronismosTdT+CD5+ 1

total 1Fenotipos ectópicosCD1a+ 2CD3-CD4+CD8+ 2CD3dimCD7+ 1CD3dim/-CD4-CD8- 2

total 7Fenotipos infrecuentesCD34+CD7+ 1

Total 1Pérdidas antigénicasCD5- 1

Total 1

LLA-B (n=43)

Entre 1 y 5 IL/ paciente

LLA-T (n=4)

3 IL/ paciente

(1) No incluidos KOR-SA ni NG2

Estudio Inicial de la Leucemia. CFMEstudio Inicial de la Leucemia. CFM

• Infidelidad de línea (29%)– CD2 (21%)– CD7 (9%)– CD19 (2%)– CD20 (0,8%)– CD5 (0,8%)

• Sobrexpresión (21%)– CD33 (11%)– CD34 (9%)– CD13 (2%)– CD117 (0,8%)– CD15 (0,8%)

• Anormal FSC/SSC (17%)– Alto FSC/SSC (13%): CD2,

34, 7, 117, 19, 20– Bajo FSC/SSC (4%): CD13,

33,15

Fenotipos aberrantes en LMAFenotipos aberrantes en LMA126 pacientes (San Miguel- Blood 2001)126 pacientes (San Miguel- Blood 2001)

• Asincronía de antígenos (78%)– CD34+/ DR -/CD33+ (9%)– CD34+/CD56+ (8%)– CD34+/CD11b+ (5%)– CD34+/CD33++ (3%)– CD34+/CD14+ (3%)– CD34+/CD117+/DR - (2,3%)– CD34+/CD117-/CD15+ (2,3%)– CD34+/CD3-/CD13+/DR+ (1,5%)– CD34+/CD3-/CD13+/DR- (0,8%)– CD34+/CD3-/CD117+/DR+ (0,8%)– CD117+/CD33+/DR- (11%)– CD117+/CD34-/CD15- (6%)– CD117+/CD11b+ (5,5%)– CD117+/CD33+/CD34-/CD15+ (4%)– CD117+/DR-/CD15+ (2,3%)– CD117+/DR-/CD15- (2,3%)– CD117+/DR+/CD33+/CD34- (0,8%)– CD33++/DR-/CD34-/CD15-/CD14- (17%) – CD33-/CD13+ (14%)– CD33+/CD13- (7%) – CD33+/DR+/CD4+/CD45dim (0,8%)– CD33+/DR+/CD15-/CD14- (0,8%)– CD33+/CD45d/CD34-/CD15- (0,8%)– CD33+/DR+/CD56+/CD13+ (0,8%)

t(9;22) (BCR-ABL) KOR-SA+, CD66+, CD38 het / low, CD34 y CD10 hom, CD13+

11q23 (MLL) Pro-B, CD15+, NG2+, My+

t(1;19) (E2A-PBX1) Pre-B

t(12;21) (TEL-AML1) CD45-, CD20-, CD10+++, >DNA index

LLA-B. CorrelaciónLLA-B. Correlación citogenéticacitogenética

LMA. Correlación citogenéticaLMA. Correlación citogenética

CBF-MYH11X CD34+, CD13+, CD2+ (31%)

PML-RAR HLA-DR-, CD34-. CD15s- y CD13+ heterogéneo. Stop madurativo.

PLZF- RAR CD56+

AML1-ETO CD19+, CD56+, CD34+++

Paneles de anticuerpos monoclonales empleados para el estudio inicial de las LAs (FITC/ PE/ ECD/ PC5/ PC7)

cMPO/ cCD79a/ CD45/ cCD3nTdT/ cIgM/ CD45/ CD34CD45/ CD4/ CD8/ CD3/ CD19CD10/ CD20/ CD45/ CD34/ CD19CD38/ CD22/ CD45/ HLADR/ CD19CD15/ CD13/ CD45/ CD33/ CD19KOR-SA/ 7.1/ CD45/ CD24/ CD19IP (DNA)/ pan-B

cMPO/ cCD79a/ CD45/ cCD3nTdT/ cIgM/ CD45/ CD34CD45/ CD4/CD8/ CD3/ CD19CD7/ CD34/ CD3/ HLADR/ CD5CD7/ CD1a/ CD45/ CD33/ CD56CD7/ CD13/ CD45/ CD10/ CD2CD38/ TCR/ CD45/ TCR/ CD3

LLA de fenotipo B LLA de fenotipo T

INMUNOFENOTIPOS LEUCÉMICOS

LMAcMPO/ cCD79a/ CD45/ cCD3nTdT/ cIgM/ CD45/ CD34CD45/ CD4/ CD8/ CD3/ CD19CD15/ CD13/ CD45/ CD33/ CD34CD7/ CD117/ CD45/ CD34/ CD56CD65/ CD135/ CD45/ CD2/ CD34CD64/ CD11b/ CD45/ CD14/ CD16HLADR/ CD235a/ CD45/ CD34/ CD41

Estudio Inicial de la Leucemia. CFMEstudio Inicial de la Leucemia. CFM

EMR en LLA infantil. EMR en LLA infantil. CheckpointCheckpointCoustan-Smith E et al. Blood 2000

EMR POST-TRATAMIENTO DE INDUCCIÓN

ESTUDIOS SECUENCIALES

Van Dongen JJM et al. Lancet 1998 (n=129)

Recaídas (3 a)

Bajo Riesgo (EMR- en semanas 5 y 12) 2%

Alto Riesgo (EMR 0,1% en semanas 5 y 12) 75%

Riesgo Intermedio (EMR 0,1% en semanas 5 o 12) 23%

Coustan-Smith E et al. Blood 2000 (n=195)

(EMR 0,01%) Recaídas (4 a)

Post-inducción EMR+ y Semana 14 EMR+ 68%

Semana14 EMR- 7%

EMR en LLA infantil. CheckpointEMR en LLA infantil. Checkpoint

EMR en LLA infantil. CheckpointEMR en LLA infantil. CheckpointDworzak MN et al. Blood 2002

Alto Riesgo: EMR 0,1% en d. 33 y 0,01% en s. 12

EMR 10/ L en d. 33 y 1/ L en s. 12

DETERMINACIÓN SECUENCIAL

Vidriales MB et al. Blood 2003

EMR en el día 14 del tratamiento de inducción

0,5% RFS 16 m

<0,5% RFS NR

<0,03% RFS “extrapolada” a los 5 años de 90%

Vidriales MB et al. Blood 2003

EMR en el día 35 del tratamiento de inducción

0,05% RFS 17 m

<0,05% RFS 42 m

EMR en LLA de adultos. CheckpointEMR en LLA de adultos. Checkpoint

0 10 20 30 40 50 600

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Time (months)

0 10 20 30 40 50 600

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Time (months)

mediana (IC 95%)

EMR < 0,02 na

EMR 0,02 9 5 m

mediana (IC 95%)

EMR < 0,02 na

EMR 0,02 6 5 m

EFS OS

EMR en LLA Infantil. ResultadosEMR en LLA Infantil. Resultados

San Miguel JF et al. Blood 2001

EMR después del tratamiento de Inducción

EMR en LMA. CheckpointEMR en LMA. Checkpoint

Venditti A et al. Blood 2000

EMR después del tratamiento de consolidación

OS 0,035% 10m

<0,035% nr

RFS 0,035% 77% (7m)

<0,035% 17% (nr)

Buccisano F et al. Leukemia 2006

EMR después del tratamiento de consolidación

(cutoff : 0,035%)

Post-IND (pos) / Post-CONS (neg) =

Post-IND (neg) / Post-CONS (neg)

Checkpoint EMR en LMA. Checkpoint EMR en LMA.

EMR en LLA. ConclusionesEMR en LLA. Conclusiones

• La persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronóstico adverso independiente de otras variables

• Cantidad de EMR significativa:

Post-tratamiento de Inducción: 0,1%

Durante el resto del tratamiento: 0,01%

• Muy mal pronóstico:

Pacientes con EMR 1% post-Inducción

EMR persistente

• Muy buen pronóstico:

EMR- post-Inducción y post-Consolidación

EMR- precozmente (d. 19)

• La persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronóstico adverso independiente de otras variables

• Muchas veces no es posible incluir a todas las células leucémicas en un solo IFL.

• Cantidad de EMR significativa: variable según estudios

Post-tratamiento de Inducción: 0,1%, 0,5%,

* Post-Consolidación: 0,2% , 0,035%

• Muy mal pronóstico:

Pacientes con EMR 1% post-Inducción (83% recaidas)

• Muy buen pronóstico:

EMR- post-Inducción < 0,01%

EMR en LMA. ConclusionesEMR en LMA. Conclusiones