TECNICAS DE ANALISIS, PRUEBAS DE ANDEN

PRUEBA DE REDUCTASAAzul de metileno

PRUEBA DE LA REDUCTASIMETRIA EN LECHE

Fundamento

La mayoría de los gérmenes de la leche elaboran reductasas que modifican el potencial de óxido-

reducción de la misma. Para demostrar ese fenómeno basta añadir a la leche una sustancia que se

decolore al pasar de la forma oxidada a la forma reducida. La rapidez con que cambia de color está

en función de la población bacteriana y, por ello, puede ser un índice del grado de contaminación

de la leche. El colorante más empleado es el azul de metileno, pero también se pueden utilizar la

resazurina y el cloruro de 2, 3, 5, trifenil-tetrazolium, ya que son colorantes fácilmente absorbibles

por las células vivas.

En general se admite que la decoloración es más rápida cuanto mayor es el número de

microorganismos en la leche. Sin embargo, las bacterias presentan distinta habilidad para reducir

el azul de metileno, así elStreptococcus liquefaciens, los gérmenes del grupo coliaerógenos y los de

la putrefacción (Bacillus subtilis) se muestran muy activos. Las células somáticas presentes en la

leche también influye mucho en la velocidad de decoloración, sobretodo los leucocitos.

Material

Tubos de ensayo con tapones estériles.

Baño maría ó estufa a 37°C.

Pipetas graduadas

Reactivos

Solución de azul de metileno. Preparar una solución madre diluyendo unos gramos de azul de

metileno en alcohol de 96° hasta conseguir la saturación.

Para preparar la solución de trabajo tomar 2.5 mL de la solución madre y adicionar 97.5 mL de

agua destilada estéril.

Procedimiento

Agitar la leche y agregar 10 mL de leche a un tubo de ensayo.

Añadirle 0.5 mL azul de metileno, evitar el contacto con la leche.

Tapar los tubos e introducirlos en baño maría a 37°C.

Realizar dos ensayos simultáneos para cada muestra.

Leer los resultados al cabo de 10 minutos y a la hora.

Observaciones e Interpretación

La presencia de microorganismos en la leche y por su acción reductora, se produce una

modificación del color del azul de metileno, pasando de color azul intenso a azul claro, pudiendo

desaparece totalmente de acurdo a la carga microbiana presente. Una leche con un contenido

bajo en microorganismos, no modifica el tinte azul del colorante o tarda mucho tiempo en

modificarlo. Ser considera que en la leche natural fresca el tiempo de decoloración del colorante

en la prueba de la reductasimetría debe ser superior a las dos horas, mientras que en la certificada

debe ser superior a las cinco horas, dada la mayor calidad higiénica de los productos obtenidos en

las granjas diplomadas.

METODOLOGÍAMATERIAL•Solución de azul de metileno al 1%.•Tubos de ensayo con torunda y capuchón estériles.•1 vaso de pp.•1 pipeta graduada de 10 ml estéril a 110 ºC.•1 pipeta graduada de 5 ml. estéril a 110 ºC.

EQUIPO•Estufa

PROCEDIMIENTO1. En un tubo estéril se colocan 5 ml de leche se le añaden 10 gotas de azul de metileno, se tapa con una torunda de alcohol e invertir el tubo una o dos veces para mezclar la leche con el colorante.2. Se incuba a 38º C en la estufa .3. Se efectúan observaciones cada 15 minutos durante 7 horas, anotando el porcentaje de decoloración y el tiempo que tarda en ser decolorado al azul de metileno.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSSe pueden calcular aproximadamente los resultados de la prueba del azul del metileno de la siguiente forma:

Tiempo de decoloración N ú m e r o e s ti m a d o d e bacterias por mL

Calidad de la leche

5 horas 100 000 a 200 000 Buena2 a 4 horas 200 000 a 2 000 000 Buena a regularMenos de 2 horas 2 a 10 millones Mala

RESULTADOS:Tiempo de decoloración:_________________________

4.1. PRUEBA DE LA REDUCTASA.

En un tubo de ensayo, grande y estéril, se vierten asépticamente 20 ml de leche (dentro de las 4 horas siguientes a la extracción de la muestra) y 1 ml de solución de azul de metileno, obtenida por mezcla de 5 ml de su solución alcohólica saturada con 195 ml de agua. Se tapa el tubo y se calienta 5Â’ a 37°C, luego se invierte varias veces para asegurar la distribución uniforme de la crema y se incuba a 37°-38°C en posición vertical, invirtiendo cada media hora y protegido de la luz solar o eléctrica. Se mide el tiempo desde que se inicia la incubación hasta que por lo menos los 4/5 de la leche se han descolorado. La leche cruda y la pasteurizada deben resistir mas de 5½ horas sin descolorarse y la destinada a la pasteurización, por lo menos 3 horas.

Según otra técnica, se colocan en un tubo con tapa atornillada (en las Pruebas de reductasa todo el material usado debe ser estéril) 10 ml de leche y 1 ml de una solución de 1 tableta con 8,8 mg de tiocianato de azul de metileno en 200 m1 de agua destilada estéril. El tubo, llevado a 36°C, se tapa y se invierte 3 veces. Si después de 30 minutos de incubación a 36°C la mezcla sigue azul, se sigue 1, 2 o más horas hasta que 4/5 del volumen estén descolorados.

PRUEBA DE ALCOHOLAlcohol

PRUEBA DEL ALCOHOL

Fundamento

Cuando se añade a la leche una cierta cantidad de alcohol etílico se produce una deshidratación,

parcial o total, de ciertos coloides hidrófilos, que puede desembocar en su desnaturalización, y con

ello a la pérdida de su equilibrio y floculación. Este resultado sólo se alcanza con un cierto grado

alcohólico de la mezcla final, por debajo del cual las leches térmicamente estables no floculan,

mientras que la leche anormal, esto es la térmicamente inestable, flocula. Todo sucede como si

existiera un paralelismo entre la resistencia al calentamiento y la estabilidad en presencia del

alcohol. Es posible, por consiguiente, traducir en grado alcohólico la resistencia necesaria a un

procedimiento dado de calentamiento. Por lo que todas las leches estables en presencia de esta

cantidad de alcohol resistirán el calentamiento correspondiente.

Basándose en este principio se ha ideado un método simple de control o de selección, que

consiste en mezclar de golpe volúmenes iguales de leche cruda y de una solución acuosa de

alcohol etílico de concentración conocida. La elección de esta última varía según la modalidad de

calentamiento (pasterización, esterilización, etc.) a que ha de someterse la leche. La mezcla se

agita en frío y se observa, preferentemente después de haberla extendido sobre una superficie de

color oscuro o negra. Si no se produce floculación alguna, la leche resistirá perfectamente el

calentamiento correspondiente al grado de la solución alcohólica. Si se observa floculación, la

leche no se mantendrá estable durante el calentamiento. La concentración de la solución

alcohólica, generalmente fijada a 68% cuando se ensayan leches para la pasterización, y debe

elevarse hasta 72° o más (a veces hasta 74°) cuando se trata de seleccionar leches para la

esterilización. La mayor frecuencia de reacciones positivas con leche normal, excluye el empleo de

etanol más concentrado para realizar esta prueba.

Material

Pipetas de 2 mL y de 5 mL.

Tubos de ensayo de 10 mL.

Reactivos

Alcohol de 68° (se prepara llevando 72 mL de alcohol etílico neutralizado de 95° hasta 100 mL

con agua destilada).

Alcohol de 72° (se prepara llevando 76 mL de alcohol etílico neutralizado de 95° hasta 100 mL

con agua destilada).

Procedimiento

Poner en dos tubos de ensayo 2 mL de leche y añadir 4 mL de alcohol a 68° y de alcohol 72°,

respectivamente.

Una vez cerrado invertir varias veces el tubo de ensayo para permitir una buena

homogenización de la muestra.

Observaciones e Interpretación

Las leches ácidas inestables en presencia de calor, se coagulan en la prueba del alcohol. Las leches

con un equilibrio salino incorrecto o al menos la mayoría de éstas, se coagulan en las mismas

condiciones. Conviene sin embargo, subrayar que el paralelismo entre la estabilidad térmica y la

inestabilidad en presencia del alcohol sólo se da en el caso de leches cuyo equilibrio salino queda

destruido por un exceso de cationes (particularmente leches demasiado ricas en calcio). En

cambio, las leches cuya inestabilidad térmica depende de un exceso de aniones se mantienen

estables en la prueba del alcohol, pero estas leches son sumamente raras y en la práctica puede

utilizarse esta prueba para eliminar aquellas con un equilibrio salino incorrecto. Las leches que

contienen un exceso de albúmina por causas fisiológicas (como por ejemplo los calostros) ó

patógenas (en el caso de las mastitis), se coagulan siempre cuando se les añade alcohol, incluso

cuando su equilibrio ácido-base es normal y cuando no han sufrido fermentación láctea.

Aunque no existe siempre una correspondencia absoluta entre la inestabilidad térmica y la

inestabilidad al alcohol (ya que se trata de procesos diferentes), esta prueba permite descubrir

una gran mayoría de las leches que no podrían soportar el calentamiento en general ni la

esterilización en particular, ya que incluso algunas muestras de leche fresca, normales en todos los

aspectos dan a veces un resultado positivo.

PUNTO CRIOSCOPICO(Crioscopo)

Punto Crioscópico

Punto de congelación (de la leche). Su determinación constituye uno de los procedimientos más exactos para averiguar su posible adulteración con agua (aguado). La adición de agua a la leche altera el punto de congelación de ésta, al diluirse lasconcentraciones de los compuestos disueltos en el agua de la leche (lactosa, cloruros). El descenso del punto de congelación es proporcional a la concentración de solutos en el agua; dando lugar, la adición de agua, a una disminución de la concentración de solutos. Es necesario establecer, previamente, el valor promedio del punto de congelación de la leche normal en la región donde se produce la leche a analizar.

Siendo:A: porcentaje de agua añadidaPC1: El punto de congelación de la leche normalPC2: El punto de congelación de la leche analizada Considerando 520, el punto cero.

Punto Crioscopico dentro del rango 0,530 a 0,570

TECNICAS DE ANALISIS PARA DETERMINAR PROPIEDADES QUíMICAS

HUMEDAD

a) Dean Stark

Destilación directa o destilación azeotrópica

Alimentos o homogéneos, voluminosos. Fue inventado por E.W. Dean y D.D. Stark en 1920 para determinar el contenido de agua

en el petróleo. El método presenta un precisión de ±0.1 ml

Fundamento: consiste en realizar una destilación a reflujo con solventes no miscibles con el agua, de mayor punto de ebullición y menos peso específico que esta (ej. Tolueno, heptano, xileno).

Material a utilizar:

1) Papel de filtro.2) Soporte.3) Nueces y pinzas.4) refrigerante.5) Colector con llave de teflón graduado.6) Matraz fondo redondo.7) Soporte para apoyo del matraz.8) Mangueras para entrada y salida de agua.9) Manta calefactora.10) Disolvente n-heptano.--> volátil de punto de ebullición próximo al del agua, e inmisible con la misma, esto quiere decir que no se puede mezclar con el agua.También se pueden usar tolueno y xileno.11) Pera, pelada y pesada 5 gramos=mililitros.12) Perlas de vidrio para introducir dentro del matraz.13) Balanza analítica.14)Clips. Para sujetar el refrigerante y el colector.15) Grafito para colocar en las uniones de los tubos.

Procedimiento:

1) Pesar 5 gramos de alimento y se trocea, (el alimento tiene que estar pelado).2) El alimento va al matraz de fondo redondo.3) Se coloca con el alimento el n-heptano que según el procedimiento tiene que ser 120 ml. (observar bien el material que no tenga fisuras).4) Se introducen en el matraz las perlas de vidrio o trozos de plato poroso o pedazos de porcelana. (Para estabilizar la ebullición y el movimiento brusco que esto provoca).5) Comienza el proceso de destilación, cuando los vapores del disolvente al alcanzar la temperatura de ebullición arrastran al agua y al enfriarse ambos condensan y se separan.6) Este enfriamiento es a causa del movimiento de agua circulante, al ingresar al refrigerante, y provoca la separación del n-heptano con el vapor de agua que sale del alimento.7) Éste es recogido en el colector separándose del disolvente, y mostrando una marcada diferencia de color (agua transparente, disolvente orgánico un color turbio que denota la separación) disolvente queda por encima del agua pues es menos denso que éste.8) El proceso se da por concluido cuando el nivel de agua recogido en el vástago permanece fijo.

9) Hacemos la diferencia tomando el dato recogido del vástago.

Ejemplo: Si el dato recogido es 3,80ml--> el procedimiento es así :

5,00 ml es a 100%3,80 ml es X % = 3,80x100/5= 76%

- Este 76 % es la cantidad de agua recogida en 5 miligramos de pera pelada-

10) Cómo el agua se puede separar bien del disolvente este se puede volver a reutilizar.

Cálculos:

Dónde:V= Volumen de la muestra (mL)P= Peso de la muestra (g)

CENIZAS (KLEMM)

Método por incineración.

Fundamento: se basa en la destrucción de la materia orgánica presente en la muestra por calcinación dejando solo la materia inorgánica.

Material, insumos y equipo:

1. Balanza analítica, sensibilidad 0.1 mg

2. Crisoles o cápsulas de porcelana, sílice o platino

3. Desecador con deshidratante adecuado (sílicagel con indicador, oxido de calcio

u otro)

4. Mufla regulada a 550 ± 25 ºC

5. Material usual de laboratorio.

6. Peróxido de hidrógeno al 30%

Procedimiento:

1. Efectuar el análisis en duplicado

% de humedad=(V +0.1)P

∗100

2. Pesar al 0.1 mg en una cápsula previamente calcinada y tarada (m0) 2 gramos de muestra homogeneizada (m1).

3. Pre calcinar previamente la muestra en placa calefactora, evitando que se inflame, luego colocar en la mufla e incinerar a 550 °C por 8 horas, hasta cenizas blancas o grisáceas. Pre enfriar en la mufla apagada y si no se logran cenizas blancas o Grisáceas, humedecerlas con agua destilada, secar en el baño de agua y someter nuevamente a incineración.

4. Dejar enfriar en desecador y pesar (m2)

5. Mezclar cuidadosamente y completamente la muestra con la arena, mediante lavarilla de vidrio.

6. Determinación de las cenizas en una mufla a temperaturas de 500 y 600°C.

7. El agua y sustancias volátiles son evaporadas. Mientras que las orgánicas son incineradas en presencia del oxígeno del aire para producir CO2 y óxido de nitrógeno, la mayoría de los minerales son convertidos a óxidos (Sulfato, fosfato, cloruro y silicato).

Cálculo

CARBOHIDRATOS (Lane y Eynon)

Determinación de azucares reductores y totales.

Fundamento: Las muestras se someten a una hidrolisis acido fuerte para desdoblar los almidones y

obtener glucosa. Antes de su análisis, la muestra debe diluirse.

Reactivos:1. Solución de Fehling A (34,639 g de CuSO4◦5H2O en 500 ml de agua)

2. Solución de Fehling B (173 g de tartrato de sodio y potasio, y NaOH en 500 ml de agua)

3. Azul de metileno (1%)

4. Solución patrón de glucosa al 1%

5. Solución diluida de glucosa (50 mg/ml), preparada a partir de la solución patrón de glucosa (1%)

6. Solución de acetato básico de plomo al 30%

Dónde:m1= peso en vacío del vidrio (g)m2= peso de la muestra (g)m3= masa de la capsula (g) mas la muestra después del secado

% ceniza=m3−m1m2

x 100

7. Oxalato de sodio o potasio en polvo

8. Solución de HCl 1:1

9. Solución de NaOH 6 N.

Procedimiento:

A.- Estandarización de la solución de Fehling:

1. Colocar la solución diluida de glucosa en una bureta.2. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solución de Fehling A y 5 ml de

solución de Fehling B. Añadir 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio.

3. Llevar a ebullición la solución de Fehling y agregar lentamente la solución de glucosa sin dejar de calentar, hasta que desaparezca la coloración azul. En el momento en que desaparece el color del indicador, en los bordes del fondo de la fiola se puede observar cierto tono rojizo.

Nota: durante todo el tiempo en que se añade la solución de glucosa, la soluciónde Fehling debe mantenerse en ebullición.

B.- Preparación de la solución clarificada de azúcares:

1. Pesar una cantidad de muestra tal que en la solución final clarificada, la concentración de azúcares reductores sea de 2 a 5 mg/ml (para gastar entre 10 y 25 ml de dicha solución por cada 10 ml de solución de Fehling).2. Homogeneizar la muestra con 50 ml de etanol al 80% (v/v) y traspasar

cuantitativamente a un matraz aforado de 250 ml; aforar con etanol (80%), mezclar bien y filtrar.3. Tomar una alícuota de 25 ml de la solución filtrada y colocarla en una

matraz aforado de 250 ml. Diluir con 50 ml de agua destilada y añadir unos pocos mililitros de solución de acetato de plomo (30%), hasta lograr la precipitación completa (en el caso de jugos, pulpas y mermeladas de frutas es suficiente añadir 1 o 2 gotas de la solución de acetato de plomo al 30%). Mezclar bien y filtrar.4. Agregar al filtrado oxalato en polvo en pequeñas porciones (una cantidad

muy pequeña tomada con la punta de una espátula para evitar el profusión de oxalato) hasta eliminar el exceso de acetato de plomo. Mezclar y filtrar descartando los primeros mililitros. El filtrado debe quedar perfectamente transparente.

C.- Determinación de azúcares reductores (originalmente presentes):

1. Tomar una alícuota de 25 ml, colocarla en un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua, mezclar bien y colocar la solución en una bureta. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solución de Fehling A y 5 ml de solución de Fehling B.2. Añadir 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de

agua destilada y agregar perlas de vidrio. Llevar a ebullición la solución de Fehling y proceder igual a como se hizo durante la estandarización de la solución de Fehling.

D.- Determinación de azúcares totales:

1. En un vaso de precipitados de 100 ml, colocar una alícuota de 25 ml de solución clarificada.2. Agregar 5 ml de solución de HCl (1:1) y calentar a 70 °C durante 5 minutos.3. Enfriar a temperatura ambiente y con ayuda de un potenciómetro llevar a pH 8,2 utilizando

una solución 6N de NaOH (en caso de no disponer de un potenciómetro, añadir 2 o 3 gotas de fenolftaleína y titular lentamente con la solución de hidróxido de sodio hasta el cambio de viraje del indicador, luego añadir lentamente, gota a gota HCl (1:1) hasta la desaparición del color rosado). Una vez alcanzado el pH indicado, pasar la solución cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua, mezclar bien y colocar la solución en una bureta.

4. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml de solución de Fehling A y 5 ml de solución de Fehling B. Añadir 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas de vidrio. Llevar a ebullición la solución de Fehling y proceder igual a como se hizo durante la estandarización de la solución de Fehling.

Nota: los azúcares no reductores son calculados restando al contenido de azúcares totales, el contenido de azúcares reductores. Para convertir este valor en contenido de sacarosa, se debe considerar la suma de los pesos moleculares de la glucosa y la fructosa (360 g/mol) y el de la sacarosa (342 g/mol).

Cálculos:

PROTEINA (Micro-Kejendhal)

azucar (mg ) por100ml dedisolucion= factor x100valoracion(ml)

TECNICAS DE ANALISIS PARA DETERMINAR PROPIEDADES FISICOQUIMICAS.

DENSIDAD

Lactodensímetro

Determina la densidad de la leche en g/mL y oscila entre 1.028 – 1.034 g/mL

PH (POTENCIONETRO)

Se basa en la medición electrométrica de la actividad de los iones hidrogeno presentes en

una muestra.

ACIDEZ (TITULACION)

Consiste en determinar la acidez por medio de una titulación acido-base con una solución

de álcali estandarizado, expresando los resultados de la acidez titulable como el

equivalente en masa de ácido cítrico.

Acidez titulable

La acidez titulable corresponde al número de mililitros de solución 0.1N de NaOH, necesarios para neutralizar 100ml de muestra. El grado de acidez corresponde a la suma de todas las sustancias de reacción ácida contenidas en la leche.

TECNICAS DE ANALISIS PARA DETERMINAR PROPIEDADES TERMODINAMICAS DEL MANGO.

ACTIVIDAD DE AGUA (HIGROMETRO)

El primer higrómetro fue inventado por el físico francés Guillaume Amontons. Éste lo

presentó en 1687 en la Academy of Sciences,

Se determina a partir del contenido de humedad de la muestra en equilibrio (bajo

condiciones de vacio).

Cálculos:

AW= pp0

Donde:p: presión de vapor de agua en la sustancia p₀: presión de vapor del agua pura a la misma temperatura.