producciÓn de proteÍnas recombinantes

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNASRECOMBINANTES

ELECCIÓN DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN

Características Importantes a Tener en Cuenta en la Producción de proteínas

recombinantes

Complejidad de la molécula: estructura terciaria y cuaternaria, modificaciones postraduccionales

Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico, terapia

Cantidad de producto

Economía

Aspectos regulatorios

Convenientes para crecimiento en grandes fermentadores.

Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L).

En general las proteínas tendrán metioninaN-terminal.

Es frecuente la producción en forma de cuerpos de inclusión.

No produce eventos postraduccionales.

Endotoxinas

BACTERIAS

Conveniente para el crecimiento en grandes fermentadores.

Buenos rendimientos (0.01-1 g/L).

Introduce modificaciones postraduccionales.

La glicosilación es distinta de la de mamíferos: “high manosas”

La proteólisis suele ser un problema.

LEVADURAS

CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Los cultivos en grandes escalas son difíciles de realizar y muy costosos.

Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1 g/L).

Se producen modificaciones postraduccionales.

Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de expresión posible.

PLANTAS

Se producen modificaciones postraduccionales

Expresión localizada en diferentes órganos

Expresión en estadíos específicos del crecimiento

Crecimiento en campo barato

La glicosilación es distinta que la de mamíferos

Eficiencias bajas de transformación y expresión

Seguridad controvertida

Hay tres factores importantes que influencian la expresión de una proteína recombinante

Huésped

Condiciones de crecimiento

Vector

Por lo tanto la solución a los problemas de expresiónestará a nivel del vector, de las cepas y de las

condiciones de inducción.

EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN BACTERIAS

¿POR QUÉ BACTERIAS?

¿POR QUÉ BACTERIAS?

Simplicidad

Cultivo barato y de alta densidad en tiempos cortos

Genética bien conocida

Gran cantidad de herramientas disponibles para biotecnología (plásmidos, cepas mutantes…)

¿POR QUÉ NO BACTERIAS?

No producen modificaciones postraduccionales: glicosilación, puentes disulfuro (sólo en periplasma).

No secretan la proteína al medio de cultivo (E. coli)

Cuerpos de inclusión

Endotoxinas

Escherichia coli

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN BACTERIAS

2 Estrategias:

sirve para purificar

Proteína de fusión generalmente es más estable

más soluble

Expresión directa

VECTORES DE EXPRESIÓN PARA E. COLI

PLÁSMIDO

Secuencia Shine DalgarnoSecuencia en el ARNm, complementaria a una secuenciadel ARNr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma : posiciona el ARNm en el ribosoma

AAGGAGGUUUCCUCCA

AUG5’ 3’ARNm

3’ 5’16S rRNA

Subunidad pequeña ribosomal

Efecto de una estructura secundaria en el extremo 5’ del mRNA

Extremo 5’ del mRNA, en la región del codón de inicioAUG, NO debe ser autocomplementaria, ya quese podría bloquear el movimiento del ribosoma e impedir la traducción del mensaje.

Inicio

TERMINADOR DE LA TRADUCCIÓN

Codón STOP + base siguiente

El más eficiente en E. coli: UAAU

Fuertes

simple químicoInducibles: Inductor

barato térmico

Regulables: Baja o nula expresión basal

OPERÓN LACTOSA

Alolactosa : isómero de lactosa. Isomerizado por β galactosidasa

6-O-β-D-Galactopyranosyl-D-glucose; β-D-Galactopyranosyl (1→6)-D-glucose

galactosa-(β1-4)-glucosa

REGULACIÓN

Mecanismo dual de control

1- Regulación negativa: represor Lac, expresión constitutiva. Es secuestrado por alolactosa e IPTG

2- Regulación positiva: por AMPc que se une a CAP: proteína activadora por catabolito = CRP: proteína aceptora de AMPc, en respuesta a glucosa.

Curva bifásica de crecimiento de Monod: Diauxia

I: crecimiento por glucosa

II: crecimiento por lactosa

IPTGisopropil-β-D-tio-galactósido

No metabolizado por βgal. Y no usa la permeasa

ONPGorto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido

Sustrato de βgalproduce o nitro fenol (amarillo)

X-gal5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-

galactósidoSustrato de βgalproduce indoxil

(azul)

SISTEMA DE EXPRESIÓN pET

• Promotor híbrido T7/lac sólo funciona con ARN polimerasa del fago T7, no con la de E. coli

• Cepa bacteriana BL(DE3): E. coli lisogenizada con un fragmento del fagoDE3 que codifica para la ARN polimerasa T7

• Inductor: IPTG

• Los niveles basales de expresión pueden ser disminuídoscon lisozima T7, inhibidor de T7ARN pol. Plásmidos pLysSy pLysE

• La glucosa en el medio aumenta la represión del promotor.

Lisogenizada con un fragmento de fago DE3 que codifica para la T7 RNA polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 inducible por IPTG. También posee una copia del gen lacI.

Células huésped para expresión

IPTG

Genoma de E.coli

lacI monómero

LacI tetrámero

LacI tetrámero

Plásmido pET

Transcripción

pET

SISTEMA DE EXPRESIÓN pET (plasmid for expression by T7 RNA pol)

Promotor: T7 RNA polimerasa o promotores híbridos (T7-lac) Gen lacI o lacIqSitios de clonadoPéptidos de fusión (cola de poliHis)Sitios de corte para proteasasGen βlactamasa

pET-11 aVendor:StratageneVector Type: BacterialPromoter: T7/lacOExpression Level: Tightlycontrolled (use IPTG toactivate)Backbone size: 5700Sequencing Primer: T7 FwdBacteria Resistance: AmpicillinComments:Tighter control ofexpression level than pET-3; a,b,c,d vary by MCS

Plasmid map of pET-11_a

pET-22b(+)-HpENRGene/insert name: noyl-acyl carrier protein reductaseAlternative names: ENRInsert size (bp): 825GenBank/Entrez ID of insert: AAD05765Gene/insert aliases: fabISpecies of gene(s): Helicobacter pyloriVector backbone: pET-22b(+) (Search Vector Database)Backbone manufacturer: NovagenType of vector: Bacterial expressionBackbone size (bp): 6238Cloning site 5': NdeISite destroyed during cloning: NoCloning site 3': BamHISite destroyed during cloning: No5' Sequencing primer: T7 (List of Sequencing Primers)3' Sequencing primer: T7Bacteria resistance: AmpicillinHigh or low copy: Low CopyGrow in standard E. coli @ 37C: YesPlasmid Provided In: DH5aPrincipal Investigator: Se Won SuhArticle: Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis ofenoyl-acyl carrier protein reductase from Helicobacter pylori. Lee HH et al. (Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2002 Jun . 58(Pt 6 Pt 2):1071-3. Pubmed)

Plasmid map of pET-22bPlus

SISTEMA DE EXPRESIÓN pBAD

Expresión muy regulada Arabinosa: niveles altos de expresiónSin arabinosa + glucosa: no expresión

Inducción dosis dependiente (aumento lineal en la expresión con el incremento del inductor)

Buen rendimiento proteico

Cepas de E. coli con genes ara mutados, alta expresión con bajos niveles de arabinosa (no metabolizan la arabinosa)

OPERÓN ARABINOSA

O1 I

SISTEMA DE EXPRESIÓN pBAD

ArabinosaDímero AraC

Transcripción

Dímero AraCpBAD

Para la máxima activación de la transcripción se requieren dos eventos

Unión de arabinosa a araC

Unión de AMPc a CRP que estimula la unión de araC a O1 (I1)

La glucosa puede reprimir la expresión basal al disminuir el AMPc

Otros promotores

• Promotor tac: Promotor híbrido: región -35 del promotor trp + región -10 del promotor/operador lacUV5.La expresión es reprimida por lacI (inactivado por IPTG).Más fuerte que promotor lac (5-10 x) y trp (3x)

• Promotores de fagos: Promotor lambda PL regulado por el represor cI. cI857: temperatura sensible 30ºC 42ºCcI: bajo el control del promotor lac (regulado por IPTG)

Regulación del promotor λpL

La temperatura induce genes de heat shock (proteasas)Desnaturalización térmica de la proteína expresada Desventajas

Los niveles de expresión de un gen son determinados fundamentalmente por:

La eficiencia de transcripción

La estabilidad del ARNm

La frecuencia de la traducción del ARNm

ESTABILIDAD DEL ARNm

RNasa II exonucleasas

Los ARNm son degradados por PNPasa

RNasa E endonucleasa (cepa BL21 star)

La protección del ARN de las RNasas depende de:

Plegamiento del ARN

Protección por ribosomas: Imp. iniciación de la traducción eficiente, evitar estructuras 2as

inhibitorias en RBS

Modulación de la estabilidad por poliadenilación PAPI y PAPII poliadenilación polimerasas

facilita la degradación por RNasaII y PNPasa

FRECUENCIA DE TRADUCCIÓN

Diferentes organismos pueden usar losdiferentes codones a una frecuencia

distinta.

UsoUso de de codonescodones en en E. coliE. coli y y humanoshumanos

Uso de codones poco frecuentes

errores traduccionales

Sustitución de aminoácidos Terminación de la traducción prematura

Uso de Codones: Estrategias de Optimización

Uso de cepas que sobreexpresan tRNAs de bajaabundancia (ej cepas Rossetta de Invitrogen).

Co- transformación del huésped con plásmidos queexpresen tRNAs de los codones problemáticos

Síntesis química de un nuevo gen.

Mutagénesis.

Destino de la proteína recombinante

Citoplasma

Periplasma

Medio extracelular

¿Por qué citoplasma?

Mayor producción

CUERPOS DE INCLUSIÓN

Agregados proteicos amorfos

Se generan como respuesta al estrés debido a la alta expresión de proteínas recombinantes

Figure 2. Transmission electron microscopic photographs of (a) R. sphaeroides ES16; (b) R. sphaeroides N20; and (c) R. sphaeroides U7 in GM medium containing malate as a carbon source at the stationaryphase (72 hrs). Bacterial cells packed with poly-β-hydroxybutyrate inclusion bodies. Bar = 2.0 μm.

Mecanismo de generación ¿?

Alta velocidad de síntesis impide el plegamientoapropiado ?.

Ambiente citoplasmático en E. coli más reductor queoxidante, lo que desfavorece la formación de puentesdisulfuro apropiados??

LA AGREGACIÓN PUEDE MINIMIZARSE

Temperatura….20-25ºC

Velocidad de expresión

Metabolismo del huésped

Ingeniería de la proteína recombinante………proteínasde fusión

Co- expresión de chaperonas

Uso de cepas huésped deficientes en tioredoxina y/otioredoxina reductasa para mantener un potencial redoxfavorable (cepas de E. coli “Origami”).

Sorensen, Mortensen. J. Biotechnol. 115 (2005) 113-128

Ventajas de los cuerpos de inclusión

Se acumulan en el citoplasma en mayor nivel (> del 25%) que la proteína en su forma soluble.

Son purificados por un procedimiento de centrifugación.

No tienen actividad biológica. En la producción de proteínas tóxicas en E. coli, ésta puede ser la únicaestrategia posible.

Son agregados amorfos resistentes a proteasas de E. coli.

Fotografías hechas al microscopio confocal de bacterias recombinantes que producen una proteína verde fluorescente que agrega. La zona más fluorescente corresponde a los cuerpos de inclusión (imagen izquierda). El gradiente de colores indica la intensidad de fluorescencia que presentan estas células, siendo el color lila la zona menos fluorescente y la blanca la que lo es más (imagen derecha

02/2007 -Los cuerpos de inclusión bacterianos tienen proteínas funcionalesUn grupo de investigadores de la UAB acaba de hacer un descubrimiento importante en el campo biotecnológico: han localizado proteínas funcionales en el interior de los cuerpos de inclusión bacterianos, lo que permite utilizarlos como biocatalizadores cuando están formados por enzimas y aumentar el espectro de producción de estas proteínas.-Garcia-Fruitos, E., A. Aris, and A. Villaverde. "Localization of functional polypeptides in bacterial inclusion bodies". Appl.Environ.Microbiol. 73.1 (2007): 289-94.- Garcia-Fruitos, E., et al. "Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes andfluorescent proteins". Microb.Cell Fact. 4 (2005): 27.

Activador de plasminógeno en E. coli

Desnaturalización: 6 M clorhidrato de guanidinio/urea

Remoción de los agentes desnaturalizantes:diálisis, dilución, cromatografía

Separación de restos celulares por Filtración del flujo tangencial o normal

¿Por qué periplasma?

Disminución de proteínas contaminantes en el material a purificar

Mayor probabilidad de tener la PR con N terminal auténtico

Menor proteólisis

Fácil liberación de la proteína por shock osmótico

Disminución de efectos negativos de proteínas tóxicas sobre el crecimiento celular.

Proteínas solubles, activas: por formación de puentes S-S facilitadapor ambiente menos reductor.

Secuencia de exportación o secuenciaseñal de exportación

Secuencia de un péptido Señal en la PR, para ir a la membrana plasmática y pasar a través de ella. Se agrega al extremo NH2 de la proteína (extremo 5’ del gen).

signal protein of interestNH2 COOH

Secuencias señal de genes ompA , pelB, βlactamasa, malE…

Secuencia señal

NH2 COOH

aa. hidrofóbicos: ala, val, leu.aa.q+ aa menos hidrofóbicosAla-X-Ala box

Dominio N Dominio H Dominio C

aa 1: debe tener una cadena lateral pequeña neutra: ser, ala, gly

Signal sequences Amino acid sequences

PelB (pectate lyase B) from Erwinia carotovora MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAOmpA (outer-membrane protein A) MKKTAIAIAVALAGFATVAQAStII (heat-stable enterotoxin 2) MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYAEndoxylanase from Bacillus sp. MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASAPhoA (alkaline phosphatase) MKQSTIALALLPLLFTPVTKAOmpF (outer-membrane protein F) MMKRNILAVIVPALLVAGTANAPhoE (outer-membrane pore protein E) MKKSTLALVVMGIVASASVQAMalE (maltose-binding protein) MKIKTGARILALSALTTMMFSASALAOmpC (outer-membrane protein C) MKVKVLSLLVPALLVAGAANALpp (murein lipoprotein) MKATKLVLGAVILGSTLLAGLamB (λ receptor protein) MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMAOmpT (protease VII) MRAKLLGIVLTTPIAISSFALTB (heat-labile enterotoxin subunit B) MNKVKCYVLFTALLSSLYAHG

Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Jun;64(5):625-35. Epub 2004 Feb 14.

Secreción de la proteína al medio extracelular

Post cosecha: shock osmóticocongelamieto/descongelamientolisozimashock con cloroformo

Durante el crecimiento: agregar glicina o tritón X100 al mediofusión a proteína transportadora como hemolisina o de membrana como OmpFuso de cepas defiecientes en pared

Estrés en E coli recombinantes

Causas

•Mantenimiento del plásmido: Nº de copias……..genes constitutivos (R a ATB)

•Expresión elevada de la proteína recombinante

gasto E x sint. Proteína rec.

vel. de crecimiento biomasa. Sint. de proteínas de estrés

respiración

RESPUESTA AL ESTRÉS

•“Stringent response”: reprogramación en el patrón de expresión de genes y disminución en la expresión de genes de transcripción, traducción y síntesis de aa. como consecuencia de la disminución en la disponibilidad de nutrientes, fundamentalmente aa.

Adición de aminoácidos

RESPUESTA AL ESTRÉS

•Proteólisis de la proteína recombinante

cepas deficientes en proteasasIngeniería cepas deficientes en proteínas heat shock del huésped coexpresión de chaperonas

coexpresión de inhibidores de proteasas

síntesis de proteína de fusiónIngeniería mutagénesis dirigida al sitio de corte de proteasadel producto redireccionamiento por péptido señal

Los sistemas de chaperonas son cooperativos y las estrategias más favorables involucran la co expresión de combinaciones de chaperonas pertenecientes a las familias de GroEl, DnaK, ClpB y del factor disparador asociado a ribosoma (trigger factor)

Reducción de estrés: x adaptación de las células

¿Cómo?

gradual del inductor

lento del Nº de copias del plásmido durante el cultivo

La formación de los puentes disulfuro en E. coli es catalizada activamente en el periplasma por el sistema Dsb

La mutación de los genes trx y gor en E coli permite la formación de puentes disulfuro en citoplama

Cepa trxB - AD494 Novagen

Cepa trxB-/gor- Origami Novagen

Proteínas de Fusión y purificación de PR

Fusión a fragmentos polipeptídicos o “tags” (etiquetas) que confieren a la PR una cierta marca.

La unión incluye el sitio de reconocimiento específicopara una proteasa

¿Para qué?Purificación por afinidadProtección de proteólisisAumento de solubilidadDetección de expresión

ETIQUETAS = TAGs

Secuencias de antígenos, reconocidas poranticuerpos específicos.

Moléculas con afinidad a resinas cromatográficas: His, GST (glutatión transferasa), MBP (maltosabinding protein)

Proteínas que aumentan la solubilidad: MBP, NusA, IF2 (www.biotech.ou.edu)

“Colas” de 6 histidinas, fusionadas a la proteína, ya sea en el extremo amino o carboxilo

H-H-H-H-H-HH2N

IMAC: Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography

H-H-H-H-H-H COO-

Elución

ImidazolBajo pHEDTA

MetalNiCoCu

Proteasas

Factor Xa IEGR/X (X cualquier aa menos P o R)

Trombina LVPR/G

Enteroquinasa DDDDK/X (cualquier aa menos P)

HSPP (Amersham) LEVLFQ/GP

TEV ENLYFQ/G

Corte con Factor Xa

Es la cepa de Escherichia coli más comunmenteusada para la producción de proteínas recombinantes

BL21

Produce mayor biomasa que que E.coli K12 con menor producción de acetato

Deficiente en proteasas Lon y OmpT

E. coli B F- dcm ompT lon hsdS(rB- mB-) gal

Estrategias para reducir la formación de acetato en E. coli

Biochemistry, Geneticsand Molecular Biology"Advances in AppliedBiotechnology", 2012

Tightly regulated gene expression from T7 promoter

pLysS is normally plasmid borne. It harbors T7 lysozyme, whichdestroys T7 polymeraseproduced from DE3. Used toreduce basal expression in T7-driven expression systems by inhibiting basal levels of T7 RNA polymerase

pLysS

Required for expressionfrom the T7 promoter in E.coli

Lysogen that encodes T7 RNA polymerase. Used to induce expression in T7-drivenexpression systems

DE3

Tightly regulated gene expression from lacpromoter

This mutated version of LacIgives high levels of lac repressorexpression. This allows tighterregulation of gene expressionfrom the lac promoter

lacIq

BenefitDescriptionGenotype

CEPAS BACTERIANAS PARA EXPRESIÓN PROTEICA

Improves folding ofheterologous proteinsrequiring disulphide bonds

Mutation in glutathione reductase, which enhances disulphide bondformation

gor

Improves folding of someheterologous proteins

dnaJ encoded chaparonin isinactivated

dnaJ

Enhances expression fromaraB promoterCannot metabolize arabinosearaD/ara

-14

Reduced degradation ofrecombinant proteins

Defficiency in an outer membraneprotease.ompT

Reduced degradation ofrecombinant proteins

Defficiency in the Lon ATPase-dependent protease. Decreasesthe degradation of recombinantproteins; all B strains carry thismutation

lon

No sólo Escherichia coli

Bacilli: bacterias Gram positivas

Secretan proteínas directamente al medio

No tienen LPS en la membrana externa no ENDOTOXINAS

Expresión en cepas de Bacilli

No / Low Protein Production

•Start from freshly transformed bacteria

•Add Glucose to suppress leaky expression

•Use recA- strains

(HMS174; BLR)

•Tightly suppress gene expression prior to induction•Use low-copy origin of replication plasmid

Your gene induces

rearrangement and loss of the DE3 lysogen

RNA degradation

Rare codons

Initiationproblems

Toxic protein

Reason

Use RNAse deficient strain (BL21Star)

Change vector to structured RNA vector

Slow translation by reducing temperature or grow in poor media

Use stains supplementing rare codons (Rosetta, Codon +)

Mutate gene for codonoptimization

•Start induction at higher OD •Shorten induction time

•Add Glucose to suppress leaky expression

•Use BL21AI orBL21(DE3)pLysS/E

•Use T7 promoter-based vectors (also arabinose)•Tightly regulate induction with lac operator

•Re-clone with more A residues at 5’

•Shorten distance between RBS and first ATG (2-8 nt )

Growth ConditionsHost StrainVector

Membrane rich (C41/C43)

Use mistic fusion protein.

Generate truncated forms of protein (soluble domains)

Membrane proteins

Induce at low temp. Membrane rich(C41/C43)

Replace with bacterial signals (secretion) or omit signals

Sub-cellular localization signals

Protein is part of a complex

No appropriate chaperones

Hydrophobic protein

Protein is misfolded due to lack of correct disulfide bond formation

Reason

Heat shock with

chemical chaperones

Transform with a partner :combination of 2-4 vectors for max 8 proteins

Heat shock with chemical chaperones

Screen various expressing strains

Add vectors for various chaperone co-expression

Lowaring induction temperature usually helps

Use Trx(-)/gor(-) strains (e.g. Origami) for creating oxidative conditions in cytosol

Use thioredoxin, DsbA, DsbCfusion partners

Clone in a vector containing secretion signal to the periplasm (pelB, OmpA)

Slow expression rate (low temp; low [inducer]; short induction time; poor media)

Heat shock with

chemical chaperones

Membrane rich strains(C41/C43)

Solubility enhancing fusion proteins (MBP, NusA, GST, etc.)

Growth ConditionsHost StrainVector

Aggregation

Truncated protein

Degradation

Faster, uncoordinated-translation of fusion protein

Rare codons

Reason

Grow and induce at low temp, useprotease inhibitors when breaking the cells on ice

Induce at higher OD and reduce induction time

Low protease strains (BL21 derivatives, M15)

Detect and replace specific protease sites

Slow elongation by low temp.; low inducer; poor media

Use rare codonstrains (rosetta , codonPlus)

Optimize codonusage

Slow expression rate with low temp.; low inducer; short harvest; poor media

Sub-clone with another fusion partner or avoid N-terminus fusion protein

Growth ConditionsHost StrainVector