nuevas técnicas de detección de poblaciones minoritarias en infección por vih: posibles usos y...
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Nuevas técnicas de detección de poblaciones minoritarias en
infección por VIH: posibles usos y limitaciones
Rafael Delgado
Laboratorio de Microbiología Molecular
Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid
VIH: Mutaciones de Resistencia
• VIH evoluciona rápidamente: – Alta replicación– Alta tasa de mutación
• Reversión a WT en ausencia de ARV: – Frecuencia de mutaciones disminuye– Pueden no ser detectadas por Secuenciación
convencional
• Mutaciones minoritarias pueden rápidamente conducir a fallo terapéutico?
Información insuficiente sobre:
• Transmisión e inicio de la infección • Relación entre resistencia y transmisión
• Consecuencias de mutaciones de resistencia de bajo nivel
• Transmisión de resistencias por naïve?
377
Secuenciación poblacional solo detecta frecuencias > 20%
Nuevas técnicas de genotipado
• PASS: Parallel Allele-Specific Sequencing
• SGS: Secuenciación de genomas individuales
• AS-PCR: PCR alelo-específica
• Pirosecuenciación: Ultra-deep sequencing
SGS/SGA:SGS/SGA: Secuenciación de Genomas ÚnicosSecuenciación de Genomas Únicos
• ConcentraciónConcentración
• RT-PCR ultrasensibleRT-PCR ultrasensible
• Dilución límiteDilución límite
• Secuenciación individual de clones Secuenciación individual de clones
• Análisis filogenéticoAnálisis filogenético
377
1/3
1/9
1/27
~ 30%+
++
++
+-
-+
++
--
--
+
SGS/SGA
AS-PCR
Mutación Frecuencia convencional vs AS-PCR
Incremento
L90M 8% → 11% +25%
M41L 9% → 17% +70%
K70R 9% → 14% +60%
K103N 19% → 20% +5%
Y181C 3% → 8% +260%
M184V 8% → 10% +23%
T215Y 17% → 20% +20%
T215F 2% → 7% +340%
Mutaciones añadidas utilizando AS-PCR
Johnson J. 14th CROI, Los Angeles 2007, #61
N=155 nuevos diagnósticos
% Total con mutaciones
% con mutaciones a NNRTI
Mutaciones primarias por Genotipado convencional
10,4 3,9
+ AS-PCR (K103N) 13,6 7,1
Mutaciones añadidas utilizando AS-PCR
Marin L at al. Reunión SEIMC 2007
13
Importancia clínica de las mutantes resistentes minoritarias de VIH-1
• Clinicamente relevantes: Johnson J. 14th CROI, Los Angeles 2007, #61
– CNA 30021/30024: EFV/3TC + ABC or ZDV
– AS-PCR para K103N , Y181C and M184V
– Fracaso Virológico en 7/9 con variantes minoritarias
– Riesgo de fracaso con variantes minoritarias x 11 (p=0.004)
• Clínicamente NO relevantes: Peuchant et al. 14th CROI, Los Angeles 2007, #666
– AS-PCR: Las mutaciones mayoritarias pero no las minoritarias modifican la respuesta a ART
Kozal et al 16th Intl HIV Drug Resistance Workshop, Barbados 2007
Respuesta al tratamiento y mutaciones minoritarias
Estudio FIRST: NRTI + (PI)/(NNRTI)/(PI+NNRTI)
Mutaciones NNRTITrat: + NNRTI:Fallo virológico a los 12 meses:
72,7% con muts28,0% sin muts
Mutaciones RTTrat: + NNRTI:Fallo virológico a los 12 meses:
59,1% con muts24,8% sin mut
Nuevas técnicas de genotipado
Experiencia Sensibilidad Coste Linkage y Filogenia
PASS ? +++ $$$ +
PiroSeq + ++ $$$ ++
SGS +++ ++ $$ +++
AS-PCR ++ +++ $ +
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