métodos de estudio i microscopía.pdf
Post on 07-Jul-2018
219 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
1/33
Métodos de estudio en
Biología Celular I
BIO-002 s7-s8 1_2014MICROSCOPÍA
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
2/33
¿Qué es un microscopio?
Instrumento [óptico] que permite observar objetosextremadamente pequeños, generando imágenes deellos que nuestra vista puede percibir.
Todos los tipos de microscopios producen imágenes,pero los mecanismos empleados para generarlas sondiversos.
En los casos que nos ocuparán, los diferentes tipos demicroscopios se definen básicamente de acuerdo a laclase de radiación electromagnética que emplean paragenerar las imágenes.
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
3/33
Tipos de microscopios que nos ocuparán:
• Microscopios de luz que operan en el espectrovisible o en sus cercanías: microscopio ordinario,microscopio de contraste de fase, microscopio defluorescencia, microscopio confocal.
• Microscopios electrónicos:
- de transmisión (MET),
• - y de barrido (MEB).
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
4/33
0,1 - 0,2 mm
ESCALA
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
5/33
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
6/33
Hígado de rata observado en dos condiciones con el microscopio ordinario
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
7/33Microscopio de luz Microscopio electrónico de transmisión
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
8/33
Hepatocito de rata visto medianteel microscopio electrónicode transmisión, con aumentocercano a 15.000 X
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
9/33
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
10/33
RESOLUCIÓN (poder separador) DEL MICROSCOPIO
0,6P.R. = -------------
N sen /2
1) debe ser lo más pequeño posible, extremo azul del espectro, aprox. 500 nm.
2) N debe ser lo más grande posible: objetivos de inmersión. Límite aprox. = 1,6
3) 2 debe ser lo mayor posible, pero sen 2 tiene un valor máximo
Ojo humano 0,2 mmMicroscopio de luz visible 0,2 m Aumento: 1.000 xM. electrónico de transmisión 0,2 nm Aumento: 1.000.000 x
0,6 = constante= longitud de onda (luz)
N = índice de refracción (???)
N sen /2 = A.N. (apertura numérica)
Para que el valor P.R. sea lo más PEQUEÑO posible (máxima resolución) :
La distancia más pequeña entredos puntos que con el microscopiovemos como puntos separados.
(mide distancia,espacio, y seexpresa conunidades delongitud)
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
11/33
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
12/33
Cada una de las esferitas
(flecha roja) que parecenformar las estructurastubulares que se visualizancorresponde a una moléculade la proteína TUBULINA(masa molecular = 60 kDa)
Corte transversal por elaxonema de un cilio, MET
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
13/33
Músculo esquelético al MET
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
14/33
Preparación de especímenes
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
15/33
Rejilla portaobjetos del MET
¿Qué problema plantea el reducido tamaño del espécimen?
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
16/33
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
17/33
Esquema microscopio electrónico de barrido (MEB)
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
18/33
Coágulo sanguíneo
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
19/33
GRANOS DE POLEN Y TUBOS POLÍNICOS, (MEB)
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
20/33
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
21/33
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
22/33
Piel humana,teñida conhematoxilina(colorante básicoo catiónico) yeosina (coloranteácido o aniónico).El contrastegenerado poresta doble tinciónpermite visualizarestructuras que
de otro modoseríantranslúcidas.
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
23/33
Obtención de cortes
para microscopía deluz visible
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
24/33
Tejido exocrino
Tejidoendocrino
Ac
Colorantes básicos o catiónicos, que se unen a los aniones; colorantes ácidos oaniónicos, que se unen a los cationes.
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
25/33
La interacción entreondas fuera de fase sellama “interferencia”,
la que al crear zonasbrillantes y oscurasgenera contraste.Este contraste sellama “CONTRASTEDE FASE”.
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
26/33
GFP !
Para contrastarestructuras se puedeemplear también un tipode colorantes llamados“fluorocromos”, que secaracterizan por emitirluz de un color distinto alde la luz utilizada parailuminar la preparación.
La luz usada para iluminar(excitar) debe ser delongitud de onda máscorta (más energética)
que la luz que emitiráluego el fluorocromo.La microscopía que empleafluorocromos es lallamada microscopía defluorescencia.
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
27/33
Microscopio de fluorescencia (luz incidente)
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
28/33
Inmunomarcación indirecta
Anticuerpos primarios Anticuerpos secundarios
Anticuerpos primarios: dirigidos contra el antígeno de interés, y no marcados
Anticuerpos secundarios: dirigidos contra los anticuerpos primarios y marcados con fluorocromo
Esquema del libro de Alberts y colaboradores
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
29/33
Tubulogénesis en células gástricas de rata en cultivo
Inmunomarcaje indirecto con anticuerpos secundarios marcados con
FLUORESCEÍNA (verde).
Tubulogénesis en células gástricas de rata en cultivo
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
30/33
Tubulogénesis en células gástricas de rata en cultivo
Anticuerpos secundarios marcados con tetrametil rodamina (rojo)
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
31/33
Principio confocal
.. Todos los rayos que se originan en planosubicados por encima o por debajo del plano focalserán detenidos por la apertura confocal.
En consecuencia, la imagen se formará solo conrayos que provienen del plano focal.
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
32/33
Imágenes microscopio confocal
-
8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf
33/33
Non-ConfocalConfocal
Comparación de microscopía de fluorescencianormal y microscopía confocal
Non-Confocal Non-ConfocalConfocal Confocal
top related