Aminoácidos y Péptidos

Aminoácidos

Análisis de Péptidos

Síntesis de Péptidos

AMINOÁCIDOS Y PÉPTIDOS

Pedro Antonio García RuizCatedrático de Escuela Universitaria Profesor Titular de Universidad

Area Química analítica Area Química Orgánica

Departamento de Química Orgánica - Universidad de Murcia

Aminoácidos y Péptidos

Aminoácidos

Análisis de Péptidos

Síntesis de Péptidos

Aminoácidos Propiedades iónicas

Identificación de aminoácidos

Producción de aminoácidos

Reacciones de los aminoácidos

Name Symbol Mass(-H2O) Side Chain Occurrence (%)Alanine A, Ala 71.079 CH3- 7.49

Arginine R, Arg 156.188 HN=C(NH2)-NH-(CH2)3- 5.22

Asparagine N, Asn 114.104 H2N-CO-CH2- 4.53

Aspartic acid D, Asp 115.089 HOOC-CH2- 5.22

Cysteine C, Cys 103.145 HS-CH2- 1.82

Glutamine Q, Gln 128.131 H2N-CO-(CH2)2- 4.11

Glutamic acid E, Glu 129.116 HOOC-(CH2)2- 6.26

Glycine G, Gly 57.052 H- 7.10Histidine H, His 137.141 N=CH-NH-CH=C-CH2- 2.23

|______________|Isoleucine I, Ile 113.160 CH3-CH2-CH(CH3)- 5.45

Leucine L, Leu 113.160 (CH3)2-CH-CH2- 9.06

Lysine K, Lys 128.17 H2N-(CH2)4- 5.82

Methionine M, Met 131.199 CH3-S-(CH2)2- 2.27

Phenylalanin eF, Phe 147.177 Phenyl-CH2- 3.91

Proline P, Pro 97.117 -N-(CH2)3-CH- 5.12

|_________|Serine S, Ser 87.078 HO-CH2- 7.34

Threonine T, Thr 101.105 CH3-CH(OH)- 5.96

Tryptophan W, Trp 186.213 Phenyl-NH-CH=C-CH2- 1.32

|_____________|Tyrosine Y, Tyr 163.176 4-OH-Phenyl-CH2- 3.25

Valine V, Val 99.133 CH3-CH(CH2)- 6.48

Aminoácidos

AminoácidosPunto isoeléctrico

pH en el punto isoeléctrico = pI = ½(pk1+pk2)

Dos grupos ácidos

Dos grupos amino

Tres pk

Aspártico, glutámico, tirosina, p-hidroxifenilalanina, cisteina

Lisina, arginina

H3O

HOHO

H3O

H2N CH COO

R

H3N CH COO

R

H3N CH COOH

R

H3O

HOHO

H3OH2N CH COO

COO

(CH2)3

H3N CH COO

COOH

(CH2)3

H3N CH COOH

(CH2)3

COOH

HO

H3OH3N CH COO

COO

(CH2)3

k1 k2 k3

pI = ½(pk1+pk2)

pH en el punto isoeléctrico = pI = ½(pk1+pk2)

Dos grupos ácidos

Dos grupos amino

Tres pk

Aspártico, glutámico, tirosina, p-hidroxifenilalanina, cisteina

Lisina, arginina

H3O

HOHO

H3O

H2N CH COO

R

H3N CH COO

R

H3N CH COOH

R

pI = ½(pk1+pk2)

H3O

HOHO

H3OH2N CH COO

NH2

(CH2)4

H3N CH COO

NH3

(CH2)4

H3N CH COOH

NH3

(CH2)4 HO

H3OH2N CH COO

NH3

(CH2)4

k1 k2 k3

pI = ½(pk2+pk3)

AminoácidosPunto isoeléctrico

AlaninaGlicina

Abundancia: 7.10

Símbolo: G, Gly

Abundancia: 7.49

Símbolo: A, Ala

CH3H

pK1=2,34pK2=9,60

pI=5,97

R hidrófobo

pK1=2,34pK2=9,69

pI=6,00

R =H

CH

C

OH

O

NH2

CH

C

OH

O

NH2

Asparragina

Abundancia: 5.22

Símbolo: R, Arg

Abundancia: 4.53

Símbolo: N, Asn

Arginina

C NH2

NH

NH

CH2 CH2

CH2

C NH2

CH2

O

pK1=2,02pK2=8,80

pI=5,41

pK1=2,17pK2=9,04

pK3=12,48pI=10,76

R polarR polar (+) a pH=7

CH

C

OH

O

NH2

CH

C

OH

O

NH2

Cisteina

Abundancia: 5.22

Símbolo: D, Asp

Abundancia: 1.82

Símbolo: C, Cys

Ácido aspártico

SH

CH2COOH

CH2

pK1=1,96pK2=8,18

pK3=10,28pI=5,07

pK1=1,88pK2=3,65pK3=9,60pI=2,77

R polar (-) a pH=R polar (-) a pH=7

CH

C

OH

O

NH2

CH

C

OH

O

NH2

Ácido glutámico

Abundancia: 4.11

Símbolo: Q, Gln

Abundancia: 6.26

Símbolo: E, Glu

Glutamina

C OH

CH2

O

CH2

C NH2

CH2

O

CH2

pK1=2,19pK2=4,25pK3=9,67pI=3,22

pK1=2,17pK2=9,13

pI=5,65

R polar R polar(-) a pH=7

CH

C

OH

O

NH2CH

C

OH

O

NH2

Isoleucina

Abundancia: 2.23

Símbolo: H, His

Abundancia: 5.45

Símbolo: I, Ile

HistidinaCH3

CH2

CH CH3N

NH

pK1=2,36pK2=9,68

pI=6,

pK1=1,82pK2=6,00pK3=9,17pI=7,59

R polar (+) a pH=7

R hidrófobo

CH

C

OH

O

NH2

CH

C

OH

O

NH2

Lisina

Abundancia: 9,06

Símbolo: L, Leu

Abundancia: 5.82

Símbolo: K, Lys

Leucina

CH3

CH CH3

CH2

NH2

CH2 CH2

CH2CH2

pK1=2,18pK2=8,95

pK3=10,53pI=9,74

pK1=2,36pK2=9,60

pI=5,98

R hidrófobo R polar (+) a pH=7

CH

C

OH

O

NH2CH

C

OH

O

NH2

Fenil alanina

Abundancia: 2,27

Símbolo: M, Met

Abundancia: 3,91

Símbolo: eF, Phe

Metionina

S

CH3

CH2

CH2 CH2

pK1=1,83pK2=9,13

pI=5,48

pK1=2,28pK2=9,21

pI=5,74

R hidrófobo R hidrófobo

CH

C

OH

O

NH2CH

C

OH

O

NH2

Serina

Abundancia: 5,12

Símbolo: P, Pro

Abundancia: 7,34

Símbolo: S, Ser

Prolina

CH

C

OH

O

NH

CH2

OH

CH2 CH2

pK1=2,21pK2=9,15

pI=5,68

pK1=1,99pK2=10,60

pI=6,30

R hidrófobo R polar

CH

C

OH

O

NH2

Triptofano

Abundancia: 5,96

Símbolo: T, Thr

Abundancia: 1.32

Símbolo: W, Trp

Treonina

CH3

CH OH

NH

pK1=2,83pK2=9,39

pI=5,89

pK1=2,09pK2=9,10

pI=5,60

R polar R hidrófobo

CH

C

OH

O

NH2

CH

C

OH

O

NH2

Valina

Abundancia: 3.25

Símbolo: Y, Tyr

Abundancia: 6.48

Símbolo: V, Val

Tirosina

OHCH3

CHCH3 pK1=2,32pK2=9,62

pI=5,96

pK1=2,20pK2=9,11

pK3=10,07pI=5,66

R hidrófoboR polar (-) a pH=

CH

C

OH

O

NH2

CH

C

OH

O

NH2

Aminoácidos Propiedades iónicas

Identificación de aminoácidos

Producción de aminoácidos

Reacciones de los aminoácidos

Identificación de aminoácidos

Técnicas espectroscópicas

Determinación de aminoácidos libres totales

Extracción de aminoácidos libres

Separación de aminoácidos

Disolventes

Purificación

Disolventes

Purificación

Extracción de aminoácidos libres

Identificación de aminoácidos

Método del N-formol

Método del ácido nitroso

Método de la ninhidrina

Método del N-formol

Técnicas espectroscópicas

Determinación de aminoácidos libres totales

Extracción de aminoácidos libres

Separación de aminoácidos

Extracción de aminoácidos libres

Método del N-formol

Para formar la imina y bloquear el grupo amino

CH

H

O + H2N CH

R

COOH N CH

R

COOHCH

H

Desaparece el carácter anfótero del aminoácido y puede valorarse con NaOH y fenolftaleina.

Este método de valoración de aminoácidos libres totales se emplea para valorarlos en piensos, hidrolizados de

proteínas y líquidos biológicos

Identificación de aminoácidos

Método del N-formol

Método del ácido nitroso

Método de la ninhidrina

Técnicas espectroscópicas

Determinación de aminoácidos libres totales

Extracción de aminoácidos libres

Separación de aminoácidos

Extracción de aminoácidos libres

Método del ácido nitroso

Con ácido nitroso los aminoácidos desprenden nitrógeno

La medida del volumen de nitrógeno desprendido permite calcular la cantidad de aminoácidos totales.

NHO O + H2N CH

R

COOH N CH

R

COOHNHO

N2 HO CH

R

COOH+

Identificación de aminoácidos

Método del N-formol

Método del ácido nitroso

Método de la ninhidrina

Técnicas espectroscópicas

Determinación de aminoácidos libres totales

Extracción de aminoácidos libres

Separación de aminoácidos

Extracción de aminoácidos libres

Método de la ninhidrina

Los aminoácidos dan color azul-violeta con la ninhidrina

+ H2N CH

R

COOH

O

O

OH

OHO

O

O

O

O

COOH

R

CHN

O

O

RCH

N

HO

CO

O

CO

O

O

RCH

N

H

O

O

NH2

H

RCH

O

H2O

Cualquier aminoácido

al reaccionar origina el

mismo producto de reducción

de la ninhidrina

Hidratode triceto hidrindeno

Cualquier aminoácido al reaccionar origina el mismo producto de reducción de la ninhidrina

O

O

NH2

H

O

O

O

+

O

O

H

N

O

O

HO

O

N

O

O

Cualquier aminoácido da el aducto azul violeta

Método de la ninhidrina

Los aminoácidos dan color azul-violeta con la ninhidrina

Hidratode triceto hidrindeno

Identificación de aminoácidos

G.L.C.-M.S.

H.P.L.C.

G.L.C.-M.S.

H.P.L.C.-UV (I.R.)

OtrasOtras

Técnicas espectroscópicas

Determinación de aminoácidos libres totales

Extracción de aminoácidos libres

Separación de aminoácidos

Extracción de aminoácidos libres

Identificación de aminoácidos

R.M.N.

O.R.D.-C.D.

R.M.N.

O.R.D.-C.D.

OtrasOtras

Técnicas espectroscópicas

Determinación de aminoácidos libres totales

Extracción de aminoácidos libres

Separación de aminoácidos

Extracción de aminoácidos libres

Aminoácidos Propiedades iónicas

Identificación de aminoácidos

Producción de aminoácidos

Reacciones de los aminoácidos

Reacciones de los aminoácidos

Esteres bencílicos

Formación de amidas

Esteres metílicos y etílicos

Suspensión el el alcohol con HCl anhidro del

aminoácido.

El ester se aísla por cristalización como

clorhidrato

CH2 CHCOO

NH3 Cl

CH2 CHCO

NH3

OCH3CH3OH

HClFenil alanina 90%

Reacciones de los aminoácidos

Alcohol bencílico con bencenosulfonato o

tosilato como catalizador.

El agua se elimina por destilación azeotrópica

Glicina

H3N CH2 COO

SO3HCH2OH

SO3 H3N CH2 CO O CH2

90%

Esteres bencílicos

Formación de amidas

Esteres metílicos y etílicos

Reacciones de los aminoácidos

Los esteres bencilicos como grupos protectores

de fácil eliminación.

CH3Cl

ClH2/Pd

H3N CH2 COOH

H3N CH2 CO O CH2

Esteres bencílicos

Formación de amidas

Esteres metílicos y etílicos

Reacciones de los aminoácidos

Preferentemente en medio básico y con cloruros de ácido.

Por ejemplo cloruro de benzoilo y sosa

concentrada en agua.

H3N CH COO

CHCH3 CH3

COClHN CH COO

CHCH3 CH3

CO

HN CH COOH

CHCH3 CH3

CO

4ºC

2h H2O

HO

HCl

Esteres bencílicos

Formación de amidas

Esteres metílicos y etílicos

Reacciones de los aminoácidos

También por reacción con anhídrido acético

N

NH

CH2

COOCHH3N

N

NH

CH2

COOHCHHNC

O

CH3

C

O

CH3 O C

O

CH3100ºC

2h

Histidina

80%

Esteres bencílicos

Formación de amidas

Esteres metílicos y etílicos

Aminoácidos Propiedades iónicas

Identificación de aminoácidos

Producción de aminoácidos

Reacciones de los aminoácidos

Producción de aminoácidos

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Metionina -120.000 ton/año

Lisina -35.000 ton/año

Producción industrial

Otros entre

50 y 500 ton/año

Ácido glutámico -350.000 ton/año

Síntesis microbiológica o enzimática

Aminoácido L D RacematoAlanina 14.00 91.00 3.00

Producción industrial Precios en 1983 en $ por 100g

valina 13.25 89.00 5.00leucina 8.25 160.00 5.25

isoleucina 28.00 7500.00 18.00*metionina 7.25 65.00 1.40prolina 17.00 1430.00 168.00fenilalanina 13.50 76.00 12.75triptófano 22.00 62.00 15.00serina 22.00 100.00 8.75Treonina 29.00 100.00 20.00cisteina 15.00 1840.00* 210.00*tirosina 7.90 510.00 44.80asparragina 6.00 33.50 6.00glutamina 6.50 710.00 -Ac aspártico 2.95 47.00 2.85Ac glutámico 1.25 110.00 7.00Lisina 2.85 460.00 9.90Arginina 6.00 690.00 90.00

Histidina 12.00 250.00 30.00

Aminoácido L D RacematoAlanina 14.00 91.00 3.00valina 13.25 89.00 5.00leucina 8.25 160.00 5.25

isoleucina 28.00 7500.00 18.00*metionina 7.25 65.00 1.40prolina 17.00 1430.00 168.00fenilalanina 13.50 76.00 12.75triptófano 22.00 62.00 15.00serina 22.00 100.00 8.75Treonina 29.00 100.00 20.00cisteina 15.00 1840.00* 210.00*tirosina 7.90 510.00 44.80asparragina 6.00 33.50 6.00glutamina 6.50 710.00 -Ac aspártico 2.95 47.00 2.85Ac glutámico 1.25 110.00 7.00Lisina 2.85 460.00 9.90Arginina 6.00 690.00 90.00

Histidina 12.00 250.00 30.00

Producción industrial Precios en 1983 en $ por 100g

Aminoácido L D RacematoAlanina 14.00 91.00 3.00valina 13.25 89.00 5.00leucina 8.25 160.00 5.25

isoleucina 28.00 7500.00 18.00*metionina 7.25 65.00 1.40prolina 17.00 1430.00 168.00fenilalanina 13.50 76.00 12.75triptófano 22.00 62.00 15.00serina 22.00 100.00 8.75Treonina 29.00 100.00 20.00cisteina 15.00 1840.00* 210.00*tirosina 7.90 510.00 44.80asparragina 6.00 33.50 6.00glutamina 6.50 710.00 -Ac aspártico 2.95 47.00 2.85Ac glutámico 1.25 110.00 7.00Lisina 2.85 460.00 9.90Arginina 6.00 690.00 90.00

Histidina 12.00 250.00 30.00

Producción industrial Precios en 1983 en $ por 100g

Hasta años 50 glutámico por hidrólisis del gluten

Hoy mezclas de hidrolizados (poco importantes)

Poca importancia económica por difícil separación

Producción de aminoácidos

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

Vía síntesis de Gabriel

Via síntesis de Strecker

Acido L-glutámico

L-lisina

L-metionina

Producción de aminoácidos

Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

Es la forma más inmediata de introducir un grupo amino en a un ácido carboxílico

Válido para: glicina, alanina, serina, treonina, valina, leucina,

nor leucina.

Hell-Volhard-ZelinskyAminación de -halo ácidos

CH3

C

COOH

H H

CH3

C

COOH

H Br

H Br

Br2 + PBr3

CH3

C

COO

H NH3

25ºC

4 diasH2O

NH3

H Br

80%

56%

Rendimientos relativamente

bajos

Vía síntesis de Gabriel

Via síntesis de Strecker

Acido L-glutámico

L-lisina

L-metionina

Producción de aminoácidos

Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

2-bromomalonato de dietilo con ftalimida potásica

Vía síntesis de Gabriel

C

CO

CO

OEt

OEt

BrH

C

C

N

O

O

K

C

C

N

O

O

H

OEt

OEt

CO

CO

C

C

C

N

O

O

OEt

OEt

CO

CO

C Na

K Br

EtONa

C

C

N

O

O

OEt

OEt

CO

CO

C RRX

X Na

85%

2-bromomalonato de dietilo con ftalimida potásica

Vía síntesis de Gabriel

C

C

N

O

O

OEt

OEt

CO

CO

C R

H2O

H3O

C

C

N

O

O OH

H

CO

C R

C

C

O

O

OH

OH

H2O

H3O

Glicina (R=H)85%

CO2

Válido para muchos

aminoácidos.

H3N

O

H

CO

C R

C

C

N

O

O

OH

OH

CO

CO

C R

Vía síntesis de Gabriel

Via síntesis de Strecker

Acido L-glutámico

L-lisina

L-metionina

Producción de aminoácidos

Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

Aldehídos y cianuro en presencia de amoniaco

Via síntesis de Strecker

R CO

H

R CNH

H

R C

H

NH3

COO

NH3

H2O

H CN

H3O

Alanina (R=H)55%

R C

H

NH2

CN

Vía síntesis de Gabriel

Via síntesis de Strecker

Acido L-glutámico

L-lisina

L-metionina

Producción de aminoácidos

Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

Hidroformilación de acrilonitrilo y síntesis de Strecker

Síntesis del ácido L-glutámico

N

C

CH2

CHO

CH2

CH

CH2

C

N N

C

CH2

C

CH2

H NH2

C

N

H2O

NH3 H CN

C

CH2

C

CH2

H NH3

C

O

OH

O

OH

CO + H2

Cat = Co

H3O

Tiene sabor a carne y se dice que refuerza el sabor de los otros ingredientes

El ácido glutámico es el principal ingrediente de las “pastillas de caldo” y de sopas en polvo.

Vía síntesis de Gabriel

Via síntesis de Strecker

Acido L-glutámico

L-lisina

L-metionina

Producción de aminoácidos

Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

Cianoetilación de acetaldehido, síntesis de hidantoina e hidrogenación catalítica

Síntesis de L-lisina

H2C C

H

C N

CH3

HC O

CH2 C NCH2CH2

CH OH

CN CH2 C NCH2CH2

CH NH2

CONH2

CH2 C NCH2CH2

CH NH

CONH

C O

CH2 CH2CH2CH2

CH NH

CONH

C O

NH2 CH2 CH2CH2CH2

CH NH2

CO

NH2

OH

OR

H2O H2

H CN

NH3

CO2

H2

H2O

Industria solo 3 pasos

CH2 C NCH2CH2

HC O

NH3CO2

H CN

hidantoina

A partir de caprolactama o ácido -amino caproico vía halogenación en

Síntesis de L-lisina

NH2

CO

OH

NH

CO

OH

COCO

ClBr2

NH

CO

OH

CO

Br

NH3

NH

CO

OH

CO

NH2

NH3

CO

OHNH3H2O

H3O

Vía síntesis de Gabriel

Via síntesis de Strecker

Acido L-glutámico

L-lisina

L-metionina

Producción de aminoácidos

Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

A partir de acroleína metanotiol a través de metilmercaptoetilhidantoina

Síntesis de L-metionina

H CN

CH3 CH CH2 CH CH CH2OCH3 SH

CH2 CH3SCH2

OCH

CH2 CH3SCH2

CH

O H

C N

CH2 CH3SCH2

CH

NH

C O

NH

C

O

CH2 CH3SCH2

CH

NH2

C O

OK

Oxid

NH3

CO2

hidantoina

H2O

CO3K2

L-metionina se consume a gran escala para enriquecer piensos compuestos

Producción de aminoácidos

Destrucción de un enantiómero

Conversión en diasteroisómeros

Transformación de un enantiómero

Conversión en diasteroisómeros

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

Proteger el grupo amino en forma de amida y tratar el producto resultante con un enantiómero de una amina quiral.

Los diasteroisómeros que se obtienen se separan por solubilidad o cristalización fraccionada

Conversión en diasteroisómeros

Rendimientos bajos

Recristalizaciones sucesivas

Difícil predecir que diasteroisómero será más soluble o que amina quiral interesa.

Reactivos caros que se consumen

Resolución de DL-valinaConversión en diasteroisómeros

H3N C COO

CHCH3 CH3

H

H3N C

COO

CHCH3 CH3

H HN C

COO

CHCH3 CH3

HHC

O

HN C COO

CHCH3 CH3

H

HC

O

HN C COO

CHCH3 CH3

H

HC

O

BH

HN C

COO

CHCH3 CH3

HHC

O BH

HCOOH

HN C

COO

CHCH3 CH3

HHC

O BH

HN C COO

CHCH3 CH3

H

HC

O

BH

Cristalización fraccionada

H3N C COO

CHCH3 CH3

H

H3N C

COO

CHCH3 CH3

H NaOH

OºC

H2O

NaOH

OºC

H2O

BH

B = Brucina

80%

70%

70%

Producción de aminoácidos

Destrucción de un enantiómero

Conversión en diasteroisómeros

Transformación de un enantiómero

Conversión en diasteroisómeros

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

Destrucción de un enantiómero

Se alimenta un animal o microorganismo con el racemato, metaboliza el L (normalmente) y se aísla el D del medio de

cultivo o orina del animal

Resolución enzimática

Resolución biológica

Poco útil y solo para preparar el D

D-aminoácido oxidasa del riñón

L-aminoácido oxidasa de la serpiente de cascabel

Destruyen un isómero y no el otro. También poco rentable

Producción de aminoácidos

Destrucción de un enantiómero

Conversión en diasteroisómeros

Transformación de un enantiómero

Conversión en diasteroisómeros

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

Transformación de un enantiómero

Una enzima convierte un enantiómero en otro producto y después de separados pueden recuperarse ambos.

Resolución cinética

Ejemplo: La acilasa renal del cerdo cataliza la hidrólisis de los enlaces amida pero es específica para las amidas de los

L-aminoácidos

DL-leucina N-acetil-DL-leucina

acilasa renal del cerdo

AcOAc

N-acetil-D-leucina L-leucina

Producción de aminoácidos

Resolución de racematos

Hidrólisis de proteínas

Síntesis química

Producción industrial

Síntesis microbiológica o enzimática

La fabricación de productos químicos mediante microorganismos es una de las ramas de la Biotecnología

Acido L-glutámico y L-lisina

Una cepa bacteriana se cultiva en un tanque con azúcar y se añade aire y amoniaco manteniendo el pH y temperatura en

rangos. fisiológicos

Con Corynebacterium Glutamicum, por cada kilo de glucosa se obtiene ½ kilo de ácido L-glutámico

L-lisina también se obtiene por fermentación

Biosíntesis de aminoácidos

A partir de amoniaco y carbohidratos (-cetoácidos) se sintetizan en el organismo en presencia de enzimas reductoras

Síntesis de glutámico

-cetoglutarato

C

C

O O

O

O

OC

CO

O

O

O

H3N

H

Ac. glutámico

NH3

L-glutamato deshidrogenasa

CR O

COOtransaminasaC

R

COO

HNH3

L-aminoácido -cetoácido

Síntesis de aminoácidos

Aminoácidos esenciales:

Arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,

fenilalanina, treonina, triptofano y valina.

Aminoácidos y Péptidos

Aminoácidos

Análisis de Péptidos

Síntesis de Péptidos

Análisis de Péptidos

Otros métodos de secuenciación

Degradación en una etapa

Esterificación

Degradación secuencial

Hidrólisis

Glutamina y asparragina dan amoniaco y ácidos glutámico y aspártico

Triptofano se destruye en la hidrólisis

Análisis: básicos (pH=5,3),neutros (pH=4,25), ácidos (pH=3,25),

HCl 6N a 105ºC (no bases por racemización)

Hidrólisis

Análisis de Péptidos

Se hidroliza el péptido marcado

Se identifica el aminoácido terminal

Se identifica el NH2 terminal ó el COOH terminal con un grupo identificable y no hidrolizable.

Otros métodos de secuenciación

Degradación en una etapa

Esterificación

Degradación secuencial

Hidrólisis Hidrólisis

FDNB Sanger

Degradación en una etapa

2,4-dinitrofluorbenceno

Análisis de PéptidosReactivos para identificar NH2 terminales

Después de la hidrólisis

F

NO2

NO2

NO2

NO2

CR

COOH

HNHAmarillo, se extrae con cloroformo (los demás productos de hidrólisis

ionizados no se extraen)

DNS-Cl Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo

Cloruro de dansilo

Después de la hidrólisis

CR

COOH

HNHAnálogo a FDNB pero fluorescente

(detecta cantidades mínimas)

S Cl

O

O

N

CH3

CH3

S

O

O

N

CH3

CH3

BH4LiReducción con borohidruro de litio

Reactivos para identificar COOH terminales

Después de la hidrólisis

Se separa el amino-alcohol en medio básico (los demás ionizados y él no)

CR

CH2OH

HNH2

BH4Li

Hidrazinolisis NH2-NH2

Después de la hidrólisis

El terminal queda libre y los demás como hidracidas

NH2-NH2CR

COOH

HNH2CR

CO

HNH2

NH NH2

Degradación en una etapa Análisis de Péptidos

Análisis de Péptidos

El método más utilizado es el de Edman

Identifica un amino terminal y deja el resto del péptido intacto para repetir el proceso

Permiten la identificación sucesiva de los aminoácidos, utilizando una sola muestra de péptido

Otros métodos de secuenciación

Degradación en una etapa

Esterificación

Degradación secuencial

Hidrólisis Hidrólisis

Degradación secuencial

Degradación de Edman

1ª) Adición en medio básico de isotiocianato de fenilo

CH CO NH CH

R3

COOH

R2

NHCOCH

R1

NHHN C

S

+

N

S

C

H

CH CO NH CH

R3

COOH

R2

NHCOCH

R1

NH

CH CO NH CH

R3

COOH

R2

NH2

NS

C

H

NH

CH R1

COHO +

N

S

CNH

CH R1

C

O

2ª) Hidrólisis suave solo del terminal con

HCl en CH3NO2 ó Acético

Tiohidantoina

Puede repetirse el proceso con el resto hasta 30 ó más

veces si el péptido es grandeMejora de este es soportar mediante el COOH a un polímero el péptido e ir

degradando secuencialmente

Análisis de Péptidos

Análisis de Péptidos

Resonancia magnética nuclear

Espectrometria de masas

Otros métodos de secuenciación

Degradación en una etapa

Esterificación

Degradación secuencial

Hidrólisis Hidrólisis

Aminoácidos y Péptidos

Aminoácidos

Análisis de Péptidos

Síntesis de Péptidos

Síntesis de Péptidos

Activadores del grupo carboxilo

Bloqueo del grupo amino

Bloqueo del grupo carboxilo

Síntesis en fase sólida

Introducción, dificultades y secuencia

Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia

Importancia científica

Importancia tecnológica

Facilidad aparente

R C

OH

OR C

Cl

OR C

NH

O

R´

La obtención de un enlace amida es fácil por ejemplo:

SOCl2 R´ NH2

No puede emplearse pues al ser un aminoácido polimeriza.

R C

OH

OR´ NH2+

Deshidratante R C

NH

O

R´

Tampoco puede emplearse por reacciones secundarias.

Importancia científica

Importancia tecnológica

Importancia científica

Importancia tecnológica

Facilidad aparente

Dificultades

1ª) Si entre dos aminoácidos

distintos cuatro dímeros posibles

CR´

COOH

HNH2

CR´

CO

HNH2

NHH

COOH

RC

CR

CO

HNH2

NHH

COOH

R´C

CR´

CO

HNH2

NHH

COOH

R´C

CR

COOH

HNH2

CR

CO

HNH2

NHH

COOH

RC

Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia

Importancia científica

Importancia tecnológica

Facilidad aparente

Dificultades

2ª) Hay que activar los grupos reaccionantes para condiciones suaves.

CR´

COOH

HNH2

CR

CO

HNH2

NHH

COOH

R´C

CR

COOH

HNH2

Condiciones enérgicas

Lenta

RápidaH

C

C

R´NH

NH H

C

RCO

O

2,5-dicetopiperazina

Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia

Importancia científica

Importancia tecnológica

Facilidad aparente

Dificultades

3ª) Hay que evitarla racemización de los centros quirales y por ello los medios fuertemente básicos que generan

oxazolonas.

CR´

COOH

HNH2

CR

COOH

HNH2

Medio básico

Enol no quiral

H

C

C

R´N

NH2 H

CRC

O

O

H

X

H

C

C

R´N

NH2 H

CRC

O

O

H

X

B

H

C

C

R´N

NH2 H

CRC

O

O

H

C

CR´

N

NH2 H

CRC

O

O

O

H

OC R

C

HNH2

NR´C

C

L-D-

Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia

Importancia científica

Importancia tecnológica

Facilidad aparente

Dificultades

Secuencia

1º) Proteger el COOH deseado

CR

COOH

HNH2

CR´

COOH

HNH2

Y

2º) Proteger el NH2 deseado

Z

3º) Activar el COOH como COX

4º) Realizar la reacción

X

CR

CO

HNH2

NHH

COOH

R´C

Y

Z

5º) Desproteger el NH2 del péptido

6º) Añadir un nuevo aminoácido activado y protegido en el grupo amino

CR

COOH

HNH2Z

X

Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia

Síntesis de Péptidos

Activadores del grupo carboxilo

Bloqueo del grupo amino

Introducción y dificultades

Bloqueo del grupo carboxilo

Síntesis en fase sólida

Introducción, dificultades y secuencia

Tosilo Ts Na en NH3

Bloqueo del grupo amino

Cloruro de p-toluenosulfonilo

Síntesis de PéptidosEliminarlo

CR

COOH

HNH

CH3 S Cl

O

O CH3 S

O

O

Tritilo Tt H2 (Pd)Cloruro de trifenilmetilo

CR

COOH

HNHCC Cl

Bloqueo del grupo amino

Tosilo Ts Na en NH3Cloruro de p-toluenosulfonilo

Tritilo Tt H2 (Pd)Cloruro de trifenilmetilo

Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)Cloroformiato de terbutilo

Eliminarlo

CR

COOH

HNHO

O C ClCCH3

CH3

CH3 O

O CCCH3

CH3

CH3

Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)

Monoazida del carbamato de terbutilo

CR

COOH

HNHO

O CCCH3

CH3

CH3O

O CCCH3

CH3

CH3

N N N

Síntesis de Péptidos

Tosilo Ts Na en NH3

Bloqueo del grupo amino

Cloruro de p-toluenosulfonilo

Tritilo Tt H2 (Pd)Cloruro de trifenilmetilo

Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)Cloroformiato de terbutilo

Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)

Monoazida del carbamato de terbutilo

Carbobenzoxi cbz H2 (Pd)Cloroformiato de bencilo

Eliminarlo

CR

COOH

HNH

CH2 ClCO

O CH2 CO

O

Síntesis de Péptidos

Tosilo Ts Na en NH3

Bloqueo del grupo amino

Cloruro de p-toluenosulfonilo

Tritilo Tt H2 (Pd)Cloruro de trifenilmetilo

Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)Cloroformiato de terbutilo

Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)

Monoazida del carbamato de terbutilo

Carbobenzoxi cbz H2 (Pd)Cloroformiato de bencilo

Trifluoracetil tfa Bases débiles

Cloruro de trifluoracetilo

Eliminarlo

CR

COOH

HNH

O

CF3 CO

CF3 C Cl

Síntesis de Péptidos

Síntesis de Péptidos

Activadores del grupo carboxilo

Bloqueo del grupo amino

Introducción y dificultades

Bloqueo del grupo carboxilo

Síntesis en fase sólida

Introducción, dificultades y secuencia

Bases débiles

Bloqueo del grupo carboxilo

EsteresMetanol ó etanol

Eliminarlo

CH3 O HCH3 O C

R

C

H

NH2

O

CH2 O C

R

C

H

NH2

OCH2 O H

H2 (Pd)

Bases débilesAlcohol bencílico Esteres

terbutanol Esteres

C

R

C

H

NH2

OOCCH3

CH3

CH3

OCCH3

CH3

CH3

H

Síntesis de Péptidos

Síntesis de Péptidos

Activadores del grupo carboxilo

Bloqueo del grupo amino

Introducción y dificultades

Bloqueo del grupo carboxilo

Síntesis en fase sólida

Introducción, dificultades y secuencia

BOCCloroformiato de isobutilo

Diciclohexilcarbodiimida DCCI

C

R

C

H

NH

O

BloqN NC

NH

C

N

O

C

R

C

H

NH

O

BloqOOCHCH2

CH3

CCH3

O

ClCH3 CH3

OCHCH2

CH3

CCH3

O

OO

Síntesis de Péptidos Activadores del grupo carboxilo

Otros grupos protectores

97.073 (ONSu OSu),

Protecting group Mass ChangeMethyl 14.027 (Me)Formyl 28.104 (CHO)

Ethyl 28.054 (Et)

Acetyl 42.037 (Ac)

t-Butyl 56.108 (t-Bu)

Anisyl 90.126Benzyl 90.126 (Bzl)

Trifluroacetyl 96.009 (Tfa)N-hydroxysuccinimide

t-Butyloxycarbony 100.117 (Boc)

Benzoyl 104.108 (Bz)

4-Methylbenzyl 104.152 (Meb)

Thioanizyl 106.191

Thiocresyl 106.191

Benzyloxymethy 120.151 (Bom)

4-Nitrophenyl 121.095 (ONp)

Benzyloxycarbonyl 134.134 (Z)

2-Nitrobenzoyl 149.106 (NBz)

2-Nitrophenylsulphenyl 153.161 (Nps)

4-Toluenesulphonyl 154.189 (Tosyl,Tos)

Pentafluorophenyl 166.050 (Pfp)

Diphenylmethyl (Dpm) 166.222 (Dpm)

2-Chlorobenzyloxycarbonyl 168.579 (Cl-Z)

2,4,5-trichlorophenyl 179.432

2-bromobenzyloxycarbonyl 213.031 (Br-Z)

9-Fluorenylmethyloxycarbonyl 222.243(Fmoc)

Tripheylmethyl 242.320 (Trityl, Trt)

2,2,5,7,8-pentamethyl-chroman-6-sulphonyl 266.361 (Pmc)

Síntesis de Péptidos

Síntesis de Péptidos

Activadores del grupo carboxilo

Bloqueo del grupo amino

Introducción y dificultades

Bloqueo del grupo carboxilo

Síntesis en fase sólida

Introducción, dificultades y secuencia

Síntesis de Merrifield

Cl CH2 O Et

Cl4Sn

FASE LIQUIDA

Preparación del soportePoliestireno

FASE SÓLIDA INSOLUBLE

Clorometilaciónelectrofílica

Cl CH2 O Et

Cl4Sn

FASE LIQUIDA

Preparación del soportePoliestireno

FASE SÓLIDA INSOLUBLE

Clorometilaciónelectrofílica

Síntesis de Merrifield

NHR´ CH

CO

O

CO

O

Cl

FASE LIQUIDA

Anclaje de un aminoácido protegido

Poliestireno funcionalizado 1 al 10 %

FASE SÓLIDA INSOLUBLE

CH2Cl

Síntesis de Merrifield

FASE LIQUIDA

CH2Cl2

CF3 COOH

Primer aminoácido anclado

FASE SÓLIDA INSOLUBLE

CH2O

CO

CHR NH CO

O

Desprotección del grupo amino

Síntesis de Merrifield

NHR´ CH

CO

O

CO

O

FASE LIQUIDA

Cl

FASE SÓLIDA INSOLUBLE

CH2O

CO

CHR NH2

Primer aminoácido anclado

Anclaje del segundo aminoácido protegido

Síntesis de Merrifield

FASE LIQUIDA

CH2Cl2

CF3 COOH

FASE SÓLIDA INSOLUBLE

CH2O

CO

CHR NH

NHR´ CH

CO

O

CO

Segundo aminoácido anclado

Desprotección del grupo amino

Síntesis de Merrifield

HF

FASE LIQUIDAFASE SÓLIDA INSOLUBLE

CH2O

CO

CHR NH

NH2R´ CH

CO

Segundo aminoácido anclado

Desanclaje del péptido del polímero

Síntesis de Merrifield

FASE LIQUIDA

Liberación del péptido

FASE SÓLIDA INSOLUBLE

CH2F

Péptido obtenido

OHC

O

CHR NH

NH2R´ CH

CO

OHC

O

CHR NH

NH2R´ CH

CO

Síntesis de Merrifield

Síntesis de MerrifieldCH2

Cl

NHR´ CH

CO

O

CO

O

NHR´ CH

CO

O

CO

O

CH2O

CO

CHR NH CO

OCH2

OC

O

CHR NH2

CH2O

CO

CHR NH

NHR´ CH

CO

O

CO

CH2O

CO

CHR NH

NH2R´ CH

CO

Cl CH2 O Et

Cl4Sn

Cl

CF3 COOH

CH2Cl2

HF

CH2F

Pedro Antonio García RuizCatedrático de Escuela Universitaria Profesor Titular de Universidad

Area Química analítica Area Química Orgánica

Departamento de Química Orgásnica - Universidad de Murcia

Ha finalizado la exposición

Muchas gracias por su atención

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