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Aminoácidos y Péptidos
Aminoácidos
Análisis de Péptidos
Síntesis de Péptidos
AMINOÁCIDOS Y PÉPTIDOS
Pedro Antonio García RuizCatedrático de Escuela Universitaria Profesor Titular de Universidad
Area Química analítica Area Química Orgánica
Departamento de Química Orgánica - Universidad de Murcia
Aminoácidos y Péptidos
Aminoácidos
Análisis de Péptidos
Síntesis de Péptidos
Aminoácidos Propiedades iónicas
Identificación de aminoácidos
Producción de aminoácidos
Reacciones de los aminoácidos
Name Symbol Mass(-H2O) Side Chain Occurrence (%)Alanine A, Ala 71.079 CH3- 7.49
Arginine R, Arg 156.188 HN=C(NH2)-NH-(CH2)3- 5.22
Asparagine N, Asn 114.104 H2N-CO-CH2- 4.53
Aspartic acid D, Asp 115.089 HOOC-CH2- 5.22
Cysteine C, Cys 103.145 HS-CH2- 1.82
Glutamine Q, Gln 128.131 H2N-CO-(CH2)2- 4.11
Glutamic acid E, Glu 129.116 HOOC-(CH2)2- 6.26
Glycine G, Gly 57.052 H- 7.10Histidine H, His 137.141 N=CH-NH-CH=C-CH2- 2.23
|______________|Isoleucine I, Ile 113.160 CH3-CH2-CH(CH3)- 5.45
Leucine L, Leu 113.160 (CH3)2-CH-CH2- 9.06
Lysine K, Lys 128.17 H2N-(CH2)4- 5.82
Methionine M, Met 131.199 CH3-S-(CH2)2- 2.27
Phenylalanin eF, Phe 147.177 Phenyl-CH2- 3.91
Proline P, Pro 97.117 -N-(CH2)3-CH- 5.12
|_________|Serine S, Ser 87.078 HO-CH2- 7.34
Threonine T, Thr 101.105 CH3-CH(OH)- 5.96
Tryptophan W, Trp 186.213 Phenyl-NH-CH=C-CH2- 1.32
|_____________|Tyrosine Y, Tyr 163.176 4-OH-Phenyl-CH2- 3.25
Valine V, Val 99.133 CH3-CH(CH2)- 6.48
Aminoácidos
AminoácidosPunto isoeléctrico
pH en el punto isoeléctrico = pI = ½(pk1+pk2)
Dos grupos ácidos
Dos grupos amino
Tres pk
Aspártico, glutámico, tirosina, p-hidroxifenilalanina, cisteina
Lisina, arginina
H3O
HOHO
H3O
H2N CH COO
R
H3N CH COO
R
H3N CH COOH
R
H3O
HOHO
H3OH2N CH COO
COO
(CH2)3
H3N CH COO
COOH
(CH2)3
H3N CH COOH
(CH2)3
COOH
HO
H3OH3N CH COO
COO
(CH2)3
k1 k2 k3
pI = ½(pk1+pk2)
pH en el punto isoeléctrico = pI = ½(pk1+pk2)
Dos grupos ácidos
Dos grupos amino
Tres pk
Aspártico, glutámico, tirosina, p-hidroxifenilalanina, cisteina
Lisina, arginina
H3O
HOHO
H3O
H2N CH COO
R
H3N CH COO
R
H3N CH COOH
R
pI = ½(pk1+pk2)
H3O
HOHO
H3OH2N CH COO
NH2
(CH2)4
H3N CH COO
NH3
(CH2)4
H3N CH COOH
NH3
(CH2)4 HO
H3OH2N CH COO
NH3
(CH2)4
k1 k2 k3
pI = ½(pk2+pk3)
AminoácidosPunto isoeléctrico
AlaninaGlicina
Abundancia: 7.10
Símbolo: G, Gly
Abundancia: 7.49
Símbolo: A, Ala
CH3H
pK1=2,34pK2=9,60
pI=5,97
R hidrófobo
pK1=2,34pK2=9,69
pI=6,00
R =H
CH
C
OH
O
NH2
CH
C
OH
O
NH2
Asparragina
Abundancia: 5.22
Símbolo: R, Arg
Abundancia: 4.53
Símbolo: N, Asn
Arginina
C NH2
NH
NH
CH2 CH2
CH2
C NH2
CH2
O
pK1=2,02pK2=8,80
pI=5,41
pK1=2,17pK2=9,04
pK3=12,48pI=10,76
R polarR polar (+) a pH=7
CH
C
OH
O
NH2
CH
C
OH
O
NH2
Cisteina
Abundancia: 5.22
Símbolo: D, Asp
Abundancia: 1.82
Símbolo: C, Cys
Ácido aspártico
SH
CH2COOH
CH2
pK1=1,96pK2=8,18
pK3=10,28pI=5,07
pK1=1,88pK2=3,65pK3=9,60pI=2,77
R polar (-) a pH=R polar (-) a pH=7
CH
C
OH
O
NH2
CH
C
OH
O
NH2
Ácido glutámico
Abundancia: 4.11
Símbolo: Q, Gln
Abundancia: 6.26
Símbolo: E, Glu
Glutamina
C OH
CH2
O
CH2
C NH2
CH2
O
CH2
pK1=2,19pK2=4,25pK3=9,67pI=3,22
pK1=2,17pK2=9,13
pI=5,65
R polar R polar(-) a pH=7
CH
C
OH
O
NH2CH
C
OH
O
NH2
Isoleucina
Abundancia: 2.23
Símbolo: H, His
Abundancia: 5.45
Símbolo: I, Ile
HistidinaCH3
CH2
CH CH3N
NH
pK1=2,36pK2=9,68
pI=6,
pK1=1,82pK2=6,00pK3=9,17pI=7,59
R polar (+) a pH=7
R hidrófobo
CH
C
OH
O
NH2
CH
C
OH
O
NH2
Lisina
Abundancia: 9,06
Símbolo: L, Leu
Abundancia: 5.82
Símbolo: K, Lys
Leucina
CH3
CH CH3
CH2
NH2
CH2 CH2
CH2CH2
pK1=2,18pK2=8,95
pK3=10,53pI=9,74
pK1=2,36pK2=9,60
pI=5,98
R hidrófobo R polar (+) a pH=7
CH
C
OH
O
NH2CH
C
OH
O
NH2
Fenil alanina
Abundancia: 2,27
Símbolo: M, Met
Abundancia: 3,91
Símbolo: eF, Phe
Metionina
S
CH3
CH2
CH2 CH2
pK1=1,83pK2=9,13
pI=5,48
pK1=2,28pK2=9,21
pI=5,74
R hidrófobo R hidrófobo
CH
C
OH
O
NH2CH
C
OH
O
NH2
Serina
Abundancia: 5,12
Símbolo: P, Pro
Abundancia: 7,34
Símbolo: S, Ser
Prolina
CH
C
OH
O
NH
CH2
OH
CH2 CH2
pK1=2,21pK2=9,15
pI=5,68
pK1=1,99pK2=10,60
pI=6,30
R hidrófobo R polar
CH
C
OH
O
NH2
Triptofano
Abundancia: 5,96
Símbolo: T, Thr
Abundancia: 1.32
Símbolo: W, Trp
Treonina
CH3
CH OH
NH
pK1=2,83pK2=9,39
pI=5,89
pK1=2,09pK2=9,10
pI=5,60
R polar R hidrófobo
CH
C
OH
O
NH2
CH
C
OH
O
NH2
Valina
Abundancia: 3.25
Símbolo: Y, Tyr
Abundancia: 6.48
Símbolo: V, Val
Tirosina
OHCH3
CHCH3 pK1=2,32pK2=9,62
pI=5,96
pK1=2,20pK2=9,11
pK3=10,07pI=5,66
R hidrófoboR polar (-) a pH=
CH
C
OH
O
NH2
CH
C
OH
O
NH2
Aminoácidos Propiedades iónicas
Identificación de aminoácidos
Producción de aminoácidos
Reacciones de los aminoácidos
Identificación de aminoácidos
Técnicas espectroscópicas
Determinación de aminoácidos libres totales
Extracción de aminoácidos libres
Separación de aminoácidos
Disolventes
Purificación
Disolventes
Purificación
Extracción de aminoácidos libres
Identificación de aminoácidos
Método del N-formol
Método del ácido nitroso
Método de la ninhidrina
Método del N-formol
Técnicas espectroscópicas
Determinación de aminoácidos libres totales
Extracción de aminoácidos libres
Separación de aminoácidos
Extracción de aminoácidos libres
Método del N-formol
Para formar la imina y bloquear el grupo amino
CH
H
O + H2N CH
R
COOH N CH
R
COOHCH
H
Desaparece el carácter anfótero del aminoácido y puede valorarse con NaOH y fenolftaleina.
Este método de valoración de aminoácidos libres totales se emplea para valorarlos en piensos, hidrolizados de
proteínas y líquidos biológicos
Identificación de aminoácidos
Método del N-formol
Método del ácido nitroso
Método de la ninhidrina
Técnicas espectroscópicas
Determinación de aminoácidos libres totales
Extracción de aminoácidos libres
Separación de aminoácidos
Extracción de aminoácidos libres
Método del ácido nitroso
Con ácido nitroso los aminoácidos desprenden nitrógeno
La medida del volumen de nitrógeno desprendido permite calcular la cantidad de aminoácidos totales.
NHO O + H2N CH
R
COOH N CH
R
COOHNHO
N2 HO CH
R
COOH+
Identificación de aminoácidos
Método del N-formol
Método del ácido nitroso
Método de la ninhidrina
Técnicas espectroscópicas
Determinación de aminoácidos libres totales
Extracción de aminoácidos libres
Separación de aminoácidos
Extracción de aminoácidos libres
Método de la ninhidrina
Los aminoácidos dan color azul-violeta con la ninhidrina
+ H2N CH
R
COOH
O
O
OH
OHO
O
O
O
O
COOH
R
CHN
O
O
RCH
N
HO
CO
O
CO
O
O
RCH
N
H
O
O
NH2
H
RCH
O
H2O
Cualquier aminoácido
al reaccionar origina el
mismo producto de reducción
de la ninhidrina
Hidratode triceto hidrindeno
Cualquier aminoácido al reaccionar origina el mismo producto de reducción de la ninhidrina
O
O
NH2
H
O
O
O
+
O
O
H
N
O
O
HO
O
N
O
O
Cualquier aminoácido da el aducto azul violeta
Método de la ninhidrina
Los aminoácidos dan color azul-violeta con la ninhidrina
Hidratode triceto hidrindeno
Identificación de aminoácidos
G.L.C.-M.S.
H.P.L.C.
G.L.C.-M.S.
H.P.L.C.-UV (I.R.)
OtrasOtras
Técnicas espectroscópicas
Determinación de aminoácidos libres totales
Extracción de aminoácidos libres
Separación de aminoácidos
Extracción de aminoácidos libres
Identificación de aminoácidos
R.M.N.
O.R.D.-C.D.
R.M.N.
O.R.D.-C.D.
OtrasOtras
Técnicas espectroscópicas
Determinación de aminoácidos libres totales
Extracción de aminoácidos libres
Separación de aminoácidos
Extracción de aminoácidos libres
Aminoácidos Propiedades iónicas
Identificación de aminoácidos
Producción de aminoácidos
Reacciones de los aminoácidos
Reacciones de los aminoácidos
Esteres bencílicos
Formación de amidas
Esteres metílicos y etílicos
Suspensión el el alcohol con HCl anhidro del
aminoácido.
El ester se aísla por cristalización como
clorhidrato
CH2 CHCOO
NH3 Cl
CH2 CHCO
NH3
OCH3CH3OH
HClFenil alanina 90%
Reacciones de los aminoácidos
Alcohol bencílico con bencenosulfonato o
tosilato como catalizador.
El agua se elimina por destilación azeotrópica
Glicina
H3N CH2 COO
SO3HCH2OH
SO3 H3N CH2 CO O CH2
90%
Esteres bencílicos
Formación de amidas
Esteres metílicos y etílicos
Reacciones de los aminoácidos
Los esteres bencilicos como grupos protectores
de fácil eliminación.
CH3Cl
ClH2/Pd
H3N CH2 COOH
H3N CH2 CO O CH2
Esteres bencílicos
Formación de amidas
Esteres metílicos y etílicos
Reacciones de los aminoácidos
Preferentemente en medio básico y con cloruros de ácido.
Por ejemplo cloruro de benzoilo y sosa
concentrada en agua.
H3N CH COO
CHCH3 CH3
COClHN CH COO
CHCH3 CH3
CO
HN CH COOH
CHCH3 CH3
CO
4ºC
2h H2O
HO
HCl
Esteres bencílicos
Formación de amidas
Esteres metílicos y etílicos
Reacciones de los aminoácidos
También por reacción con anhídrido acético
N
NH
CH2
COOCHH3N
N
NH
CH2
COOHCHHNC
O
CH3
C
O
CH3 O C
O
CH3100ºC
2h
Histidina
80%
Esteres bencílicos
Formación de amidas
Esteres metílicos y etílicos
Aminoácidos Propiedades iónicas
Identificación de aminoácidos
Producción de aminoácidos
Reacciones de los aminoácidos
Producción de aminoácidos
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Metionina -120.000 ton/año
Lisina -35.000 ton/año
Producción industrial
Otros entre
50 y 500 ton/año
Ácido glutámico -350.000 ton/año
Síntesis microbiológica o enzimática
Aminoácido L D RacematoAlanina 14.00 91.00 3.00
Producción industrial Precios en 1983 en $ por 100g
valina 13.25 89.00 5.00leucina 8.25 160.00 5.25
isoleucina 28.00 7500.00 18.00*metionina 7.25 65.00 1.40prolina 17.00 1430.00 168.00fenilalanina 13.50 76.00 12.75triptófano 22.00 62.00 15.00serina 22.00 100.00 8.75Treonina 29.00 100.00 20.00cisteina 15.00 1840.00* 210.00*tirosina 7.90 510.00 44.80asparragina 6.00 33.50 6.00glutamina 6.50 710.00 -Ac aspártico 2.95 47.00 2.85Ac glutámico 1.25 110.00 7.00Lisina 2.85 460.00 9.90Arginina 6.00 690.00 90.00
Histidina 12.00 250.00 30.00
Aminoácido L D RacematoAlanina 14.00 91.00 3.00valina 13.25 89.00 5.00leucina 8.25 160.00 5.25
isoleucina 28.00 7500.00 18.00*metionina 7.25 65.00 1.40prolina 17.00 1430.00 168.00fenilalanina 13.50 76.00 12.75triptófano 22.00 62.00 15.00serina 22.00 100.00 8.75Treonina 29.00 100.00 20.00cisteina 15.00 1840.00* 210.00*tirosina 7.90 510.00 44.80asparragina 6.00 33.50 6.00glutamina 6.50 710.00 -Ac aspártico 2.95 47.00 2.85Ac glutámico 1.25 110.00 7.00Lisina 2.85 460.00 9.90Arginina 6.00 690.00 90.00
Histidina 12.00 250.00 30.00
Producción industrial Precios en 1983 en $ por 100g
Aminoácido L D RacematoAlanina 14.00 91.00 3.00valina 13.25 89.00 5.00leucina 8.25 160.00 5.25
isoleucina 28.00 7500.00 18.00*metionina 7.25 65.00 1.40prolina 17.00 1430.00 168.00fenilalanina 13.50 76.00 12.75triptófano 22.00 62.00 15.00serina 22.00 100.00 8.75Treonina 29.00 100.00 20.00cisteina 15.00 1840.00* 210.00*tirosina 7.90 510.00 44.80asparragina 6.00 33.50 6.00glutamina 6.50 710.00 -Ac aspártico 2.95 47.00 2.85Ac glutámico 1.25 110.00 7.00Lisina 2.85 460.00 9.90Arginina 6.00 690.00 90.00
Histidina 12.00 250.00 30.00
Producción industrial Precios en 1983 en $ por 100g
Hasta años 50 glutámico por hidrólisis del gluten
Hoy mezclas de hidrolizados (poco importantes)
Poca importancia económica por difícil separación
Producción de aminoácidos
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
Vía síntesis de Gabriel
Via síntesis de Strecker
Acido L-glutámico
L-lisina
L-metionina
Producción de aminoácidos
Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
Es la forma más inmediata de introducir un grupo amino en a un ácido carboxílico
Válido para: glicina, alanina, serina, treonina, valina, leucina,
nor leucina.
Hell-Volhard-ZelinskyAminación de -halo ácidos
CH3
C
COOH
H H
CH3
C
COOH
H Br
H Br
Br2 + PBr3
CH3
C
COO
H NH3
25ºC
4 diasH2O
NH3
H Br
80%
56%
Rendimientos relativamente
bajos
Vía síntesis de Gabriel
Via síntesis de Strecker
Acido L-glutámico
L-lisina
L-metionina
Producción de aminoácidos
Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
2-bromomalonato de dietilo con ftalimida potásica
Vía síntesis de Gabriel
C
CO
CO
OEt
OEt
BrH
C
C
N
O
O
K
C
C
N
O
O
H
OEt
OEt
CO
CO
C
C
C
N
O
O
OEt
OEt
CO
CO
C Na
K Br
EtONa
C
C
N
O
O
OEt
OEt
CO
CO
C RRX
X Na
85%
2-bromomalonato de dietilo con ftalimida potásica
Vía síntesis de Gabriel
C
C
N
O
O
OEt
OEt
CO
CO
C R
H2O
H3O
C
C
N
O
O OH
H
CO
C R
C
C
O
O
OH
OH
H2O
H3O
Glicina (R=H)85%
CO2
Válido para muchos
aminoácidos.
H3N
O
H
CO
C R
C
C
N
O
O
OH
OH
CO
CO
C R
Vía síntesis de Gabriel
Via síntesis de Strecker
Acido L-glutámico
L-lisina
L-metionina
Producción de aminoácidos
Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
Aldehídos y cianuro en presencia de amoniaco
Via síntesis de Strecker
R CO
H
R CNH
H
R C
H
NH3
COO
NH3
H2O
H CN
H3O
Alanina (R=H)55%
R C
H
NH2
CN
Vía síntesis de Gabriel
Via síntesis de Strecker
Acido L-glutámico
L-lisina
L-metionina
Producción de aminoácidos
Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
Hidroformilación de acrilonitrilo y síntesis de Strecker
Síntesis del ácido L-glutámico
N
C
CH2
CHO
CH2
CH
CH2
C
N N
C
CH2
C
CH2
H NH2
C
N
H2O
NH3 H CN
C
CH2
C
CH2
H NH3
C
O
OH
O
OH
CO + H2
Cat = Co
H3O
Tiene sabor a carne y se dice que refuerza el sabor de los otros ingredientes
El ácido glutámico es el principal ingrediente de las “pastillas de caldo” y de sopas en polvo.
Vía síntesis de Gabriel
Via síntesis de Strecker
Acido L-glutámico
L-lisina
L-metionina
Producción de aminoácidos
Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
Cianoetilación de acetaldehido, síntesis de hidantoina e hidrogenación catalítica
Síntesis de L-lisina
H2C C
H
C N
CH3
HC O
CH2 C NCH2CH2
CH OH
CN CH2 C NCH2CH2
CH NH2
CONH2
CH2 C NCH2CH2
CH NH
CONH
C O
CH2 CH2CH2CH2
CH NH
CONH
C O
NH2 CH2 CH2CH2CH2
CH NH2
CO
NH2
OH
OR
H2O H2
H CN
NH3
CO2
H2
H2O
Industria solo 3 pasos
CH2 C NCH2CH2
HC O
NH3CO2
H CN
hidantoina
A partir de caprolactama o ácido -amino caproico vía halogenación en
Síntesis de L-lisina
NH2
CO
OH
NH
CO
OH
COCO
ClBr2
NH
CO
OH
CO
Br
NH3
NH
CO
OH
CO
NH2
NH3
CO
OHNH3H2O
H3O
Vía síntesis de Gabriel
Via síntesis de Strecker
Acido L-glutámico
L-lisina
L-metionina
Producción de aminoácidos
Aminación de -halo ácidosAminación de -halo ácidos
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
A partir de acroleína metanotiol a través de metilmercaptoetilhidantoina
Síntesis de L-metionina
H CN
CH3 CH CH2 CH CH CH2OCH3 SH
CH2 CH3SCH2
OCH
CH2 CH3SCH2
CH
O H
C N
CH2 CH3SCH2
CH
NH
C O
NH
C
O
CH2 CH3SCH2
CH
NH2
C O
OK
Oxid
NH3
CO2
hidantoina
H2O
CO3K2
L-metionina se consume a gran escala para enriquecer piensos compuestos
Producción de aminoácidos
Destrucción de un enantiómero
Conversión en diasteroisómeros
Transformación de un enantiómero
Conversión en diasteroisómeros
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
Proteger el grupo amino en forma de amida y tratar el producto resultante con un enantiómero de una amina quiral.
Los diasteroisómeros que se obtienen se separan por solubilidad o cristalización fraccionada
Conversión en diasteroisómeros
Rendimientos bajos
Recristalizaciones sucesivas
Difícil predecir que diasteroisómero será más soluble o que amina quiral interesa.
Reactivos caros que se consumen
Resolución de DL-valinaConversión en diasteroisómeros
H3N C COO
CHCH3 CH3
H
H3N C
COO
CHCH3 CH3
H HN C
COO
CHCH3 CH3
HHC
O
HN C COO
CHCH3 CH3
H
HC
O
HN C COO
CHCH3 CH3
H
HC
O
BH
HN C
COO
CHCH3 CH3
HHC
O BH
HCOOH
HN C
COO
CHCH3 CH3
HHC
O BH
HN C COO
CHCH3 CH3
H
HC
O
BH
Cristalización fraccionada
H3N C COO
CHCH3 CH3
H
H3N C
COO
CHCH3 CH3
H NaOH
OºC
H2O
NaOH
OºC
H2O
BH
B = Brucina
80%
70%
70%
Producción de aminoácidos
Destrucción de un enantiómero
Conversión en diasteroisómeros
Transformación de un enantiómero
Conversión en diasteroisómeros
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
Destrucción de un enantiómero
Se alimenta un animal o microorganismo con el racemato, metaboliza el L (normalmente) y se aísla el D del medio de
cultivo o orina del animal
Resolución enzimática
Resolución biológica
Poco útil y solo para preparar el D
D-aminoácido oxidasa del riñón
L-aminoácido oxidasa de la serpiente de cascabel
Destruyen un isómero y no el otro. También poco rentable
Producción de aminoácidos
Destrucción de un enantiómero
Conversión en diasteroisómeros
Transformación de un enantiómero
Conversión en diasteroisómeros
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
Transformación de un enantiómero
Una enzima convierte un enantiómero en otro producto y después de separados pueden recuperarse ambos.
Resolución cinética
Ejemplo: La acilasa renal del cerdo cataliza la hidrólisis de los enlaces amida pero es específica para las amidas de los
L-aminoácidos
DL-leucina N-acetil-DL-leucina
acilasa renal del cerdo
AcOAc
N-acetil-D-leucina L-leucina
Producción de aminoácidos
Resolución de racematos
Hidrólisis de proteínas
Síntesis química
Producción industrial
Síntesis microbiológica o enzimática
La fabricación de productos químicos mediante microorganismos es una de las ramas de la Biotecnología
Acido L-glutámico y L-lisina
Una cepa bacteriana se cultiva en un tanque con azúcar y se añade aire y amoniaco manteniendo el pH y temperatura en
rangos. fisiológicos
Con Corynebacterium Glutamicum, por cada kilo de glucosa se obtiene ½ kilo de ácido L-glutámico
L-lisina también se obtiene por fermentación
Biosíntesis de aminoácidos
A partir de amoniaco y carbohidratos (-cetoácidos) se sintetizan en el organismo en presencia de enzimas reductoras
Síntesis de glutámico
-cetoglutarato
C
C
O O
O
O
OC
CO
O
O
O
H3N
H
Ac. glutámico
NH3
L-glutamato deshidrogenasa
CR O
COOtransaminasaC
R
COO
HNH3
L-aminoácido -cetoácido
Síntesis de aminoácidos
Aminoácidos esenciales:
Arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, treonina, triptofano y valina.
Aminoácidos y Péptidos
Aminoácidos
Análisis de Péptidos
Síntesis de Péptidos
Análisis de Péptidos
Otros métodos de secuenciación
Degradación en una etapa
Esterificación
Degradación secuencial
Hidrólisis
Glutamina y asparragina dan amoniaco y ácidos glutámico y aspártico
Triptofano se destruye en la hidrólisis
Análisis: básicos (pH=5,3),neutros (pH=4,25), ácidos (pH=3,25),
HCl 6N a 105ºC (no bases por racemización)
Hidrólisis
Análisis de Péptidos
Se hidroliza el péptido marcado
Se identifica el aminoácido terminal
Se identifica el NH2 terminal ó el COOH terminal con un grupo identificable y no hidrolizable.
Otros métodos de secuenciación
Degradación en una etapa
Esterificación
Degradación secuencial
Hidrólisis Hidrólisis
FDNB Sanger
Degradación en una etapa
2,4-dinitrofluorbenceno
Análisis de PéptidosReactivos para identificar NH2 terminales
Después de la hidrólisis
F
NO2
NO2
NO2
NO2
CR
COOH
HNHAmarillo, se extrae con cloroformo (los demás productos de hidrólisis
ionizados no se extraen)
DNS-Cl Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo
Cloruro de dansilo
Después de la hidrólisis
CR
COOH
HNHAnálogo a FDNB pero fluorescente
(detecta cantidades mínimas)
S Cl
O
O
N
CH3
CH3
S
O
O
N
CH3
CH3
BH4LiReducción con borohidruro de litio
Reactivos para identificar COOH terminales
Después de la hidrólisis
Se separa el amino-alcohol en medio básico (los demás ionizados y él no)
CR
CH2OH
HNH2
BH4Li
Hidrazinolisis NH2-NH2
Después de la hidrólisis
El terminal queda libre y los demás como hidracidas
NH2-NH2CR
COOH
HNH2CR
CO
HNH2
NH NH2
Degradación en una etapa Análisis de Péptidos
Análisis de Péptidos
El método más utilizado es el de Edman
Identifica un amino terminal y deja el resto del péptido intacto para repetir el proceso
Permiten la identificación sucesiva de los aminoácidos, utilizando una sola muestra de péptido
Otros métodos de secuenciación
Degradación en una etapa
Esterificación
Degradación secuencial
Hidrólisis Hidrólisis
Degradación secuencial
Degradación de Edman
1ª) Adición en medio básico de isotiocianato de fenilo
CH CO NH CH
R3
COOH
R2
NHCOCH
R1
NHHN C
S
+
N
S
C
H
CH CO NH CH
R3
COOH
R2
NHCOCH
R1
NH
CH CO NH CH
R3
COOH
R2
NH2
NS
C
H
NH
CH R1
COHO +
N
S
CNH
CH R1
C
O
2ª) Hidrólisis suave solo del terminal con
HCl en CH3NO2 ó Acético
Tiohidantoina
Puede repetirse el proceso con el resto hasta 30 ó más
veces si el péptido es grandeMejora de este es soportar mediante el COOH a un polímero el péptido e ir
degradando secuencialmente
Análisis de Péptidos
Análisis de Péptidos
Resonancia magnética nuclear
Espectrometria de masas
Otros métodos de secuenciación
Degradación en una etapa
Esterificación
Degradación secuencial
Hidrólisis Hidrólisis
Aminoácidos y Péptidos
Aminoácidos
Análisis de Péptidos
Síntesis de Péptidos
Síntesis de Péptidos
Activadores del grupo carboxilo
Bloqueo del grupo amino
Bloqueo del grupo carboxilo
Síntesis en fase sólida
Introducción, dificultades y secuencia
Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia
Importancia científica
Importancia tecnológica
Facilidad aparente
R C
OH
OR C
Cl
OR C
NH
O
R´
La obtención de un enlace amida es fácil por ejemplo:
SOCl2 R´ NH2
No puede emplearse pues al ser un aminoácido polimeriza.
R C
OH
OR´ NH2+
Deshidratante R C
NH
O
R´
Tampoco puede emplearse por reacciones secundarias.
Importancia científica
Importancia tecnológica
Importancia científica
Importancia tecnológica
Facilidad aparente
Dificultades
1ª) Si entre dos aminoácidos
distintos cuatro dímeros posibles
CR´
COOH
HNH2
CR´
CO
HNH2
NHH
COOH
RC
CR
CO
HNH2
NHH
COOH
R´C
CR´
CO
HNH2
NHH
COOH
R´C
CR
COOH
HNH2
CR
CO
HNH2
NHH
COOH
RC
Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia
Importancia científica
Importancia tecnológica
Facilidad aparente
Dificultades
2ª) Hay que activar los grupos reaccionantes para condiciones suaves.
CR´
COOH
HNH2
CR
CO
HNH2
NHH
COOH
R´C
CR
COOH
HNH2
Condiciones enérgicas
Lenta
RápidaH
C
C
R´NH
NH H
C
RCO
O
2,5-dicetopiperazina
Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia
Importancia científica
Importancia tecnológica
Facilidad aparente
Dificultades
3ª) Hay que evitarla racemización de los centros quirales y por ello los medios fuertemente básicos que generan
oxazolonas.
CR´
COOH
HNH2
CR
COOH
HNH2
Medio básico
Enol no quiral
H
C
C
R´N
NH2 H
CRC
O
O
H
X
H
C
C
R´N
NH2 H
CRC
O
O
H
X
B
H
C
C
R´N
NH2 H
CRC
O
O
H
C
CR´
N
NH2 H
CRC
O
O
O
H
OC R
C
HNH2
NR´C
C
L-D-
Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia
Importancia científica
Importancia tecnológica
Facilidad aparente
Dificultades
Secuencia
1º) Proteger el COOH deseado
CR
COOH
HNH2
CR´
COOH
HNH2
Y
2º) Proteger el NH2 deseado
Z
3º) Activar el COOH como COX
4º) Realizar la reacción
X
CR
CO
HNH2
NHH
COOH
R´C
Y
Z
5º) Desproteger el NH2 del péptido
6º) Añadir un nuevo aminoácido activado y protegido en el grupo amino
CR
COOH
HNH2Z
X
Síntesis de Péptidos Introducción, dificultades y secuencia
Síntesis de Péptidos
Activadores del grupo carboxilo
Bloqueo del grupo amino
Introducción y dificultades
Bloqueo del grupo carboxilo
Síntesis en fase sólida
Introducción, dificultades y secuencia
Tosilo Ts Na en NH3
Bloqueo del grupo amino
Cloruro de p-toluenosulfonilo
Síntesis de PéptidosEliminarlo
CR
COOH
HNH
CH3 S Cl
O
O CH3 S
O
O
Tritilo Tt H2 (Pd)Cloruro de trifenilmetilo
CR
COOH
HNHCC Cl
Bloqueo del grupo amino
Tosilo Ts Na en NH3Cloruro de p-toluenosulfonilo
Tritilo Tt H2 (Pd)Cloruro de trifenilmetilo
Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)Cloroformiato de terbutilo
Eliminarlo
CR
COOH
HNHO
O C ClCCH3
CH3
CH3 O
O CCCH3
CH3
CH3
Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)
Monoazida del carbamato de terbutilo
CR
COOH
HNHO
O CCCH3
CH3
CH3O
O CCCH3
CH3
CH3
N N N
Síntesis de Péptidos
Tosilo Ts Na en NH3
Bloqueo del grupo amino
Cloruro de p-toluenosulfonilo
Tritilo Tt H2 (Pd)Cloruro de trifenilmetilo
Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)Cloroformiato de terbutilo
Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)
Monoazida del carbamato de terbutilo
Carbobenzoxi cbz H2 (Pd)Cloroformiato de bencilo
Eliminarlo
CR
COOH
HNH
CH2 ClCO
O CH2 CO
O
Síntesis de Péptidos
Tosilo Ts Na en NH3
Bloqueo del grupo amino
Cloruro de p-toluenosulfonilo
Tritilo Tt H2 (Pd)Cloruro de trifenilmetilo
Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)Cloroformiato de terbutilo
Butiloxicarbonil boc H2 (Pd)
Monoazida del carbamato de terbutilo
Carbobenzoxi cbz H2 (Pd)Cloroformiato de bencilo
Trifluoracetil tfa Bases débiles
Cloruro de trifluoracetilo
Eliminarlo
CR
COOH
HNH
O
CF3 CO
CF3 C Cl
Síntesis de Péptidos
Síntesis de Péptidos
Activadores del grupo carboxilo
Bloqueo del grupo amino
Introducción y dificultades
Bloqueo del grupo carboxilo
Síntesis en fase sólida
Introducción, dificultades y secuencia
Bases débiles
Bloqueo del grupo carboxilo
EsteresMetanol ó etanol
Eliminarlo
CH3 O HCH3 O C
R
C
H
NH2
O
CH2 O C
R
C
H
NH2
OCH2 O H
H2 (Pd)
Bases débilesAlcohol bencílico Esteres
terbutanol Esteres
C
R
C
H
NH2
OOCCH3
CH3
CH3
OCCH3
CH3
CH3
H
Síntesis de Péptidos
Síntesis de Péptidos
Activadores del grupo carboxilo
Bloqueo del grupo amino
Introducción y dificultades
Bloqueo del grupo carboxilo
Síntesis en fase sólida
Introducción, dificultades y secuencia
BOCCloroformiato de isobutilo
Diciclohexilcarbodiimida DCCI
C
R
C
H
NH
O
BloqN NC
NH
C
N
O
C
R
C
H
NH
O
BloqOOCHCH2
CH3
CCH3
O
ClCH3 CH3
OCHCH2
CH3
CCH3
O
OO
Síntesis de Péptidos Activadores del grupo carboxilo
Otros grupos protectores
97.073 (ONSu OSu),
Protecting group Mass ChangeMethyl 14.027 (Me)Formyl 28.104 (CHO)
Ethyl 28.054 (Et)
Acetyl 42.037 (Ac)
t-Butyl 56.108 (t-Bu)
Anisyl 90.126Benzyl 90.126 (Bzl)
Trifluroacetyl 96.009 (Tfa)N-hydroxysuccinimide
t-Butyloxycarbony 100.117 (Boc)
Benzoyl 104.108 (Bz)
4-Methylbenzyl 104.152 (Meb)
Thioanizyl 106.191
Thiocresyl 106.191
Benzyloxymethy 120.151 (Bom)
4-Nitrophenyl 121.095 (ONp)
Benzyloxycarbonyl 134.134 (Z)
2-Nitrobenzoyl 149.106 (NBz)
2-Nitrophenylsulphenyl 153.161 (Nps)
4-Toluenesulphonyl 154.189 (Tosyl,Tos)
Pentafluorophenyl 166.050 (Pfp)
Diphenylmethyl (Dpm) 166.222 (Dpm)
2-Chlorobenzyloxycarbonyl 168.579 (Cl-Z)
2,4,5-trichlorophenyl 179.432
2-bromobenzyloxycarbonyl 213.031 (Br-Z)
9-Fluorenylmethyloxycarbonyl 222.243(Fmoc)
Tripheylmethyl 242.320 (Trityl, Trt)
2,2,5,7,8-pentamethyl-chroman-6-sulphonyl 266.361 (Pmc)
Síntesis de Péptidos
Síntesis de Péptidos
Activadores del grupo carboxilo
Bloqueo del grupo amino
Introducción y dificultades
Bloqueo del grupo carboxilo
Síntesis en fase sólida
Introducción, dificultades y secuencia
Síntesis de Merrifield
Cl CH2 O Et
Cl4Sn
FASE LIQUIDA
Preparación del soportePoliestireno
FASE SÓLIDA INSOLUBLE
Clorometilaciónelectrofílica
Cl CH2 O Et
Cl4Sn
FASE LIQUIDA
Preparación del soportePoliestireno
FASE SÓLIDA INSOLUBLE
Clorometilaciónelectrofílica
Síntesis de Merrifield
NHR´ CH
CO
O
CO
O
Cl
FASE LIQUIDA
Anclaje de un aminoácido protegido
Poliestireno funcionalizado 1 al 10 %
FASE SÓLIDA INSOLUBLE
CH2Cl
Síntesis de Merrifield
FASE LIQUIDA
CH2Cl2
CF3 COOH
Primer aminoácido anclado
FASE SÓLIDA INSOLUBLE
CH2O
CO
CHR NH CO
O
Desprotección del grupo amino
Síntesis de Merrifield
NHR´ CH
CO
O
CO
O
FASE LIQUIDA
Cl
FASE SÓLIDA INSOLUBLE
CH2O
CO
CHR NH2
Primer aminoácido anclado
Anclaje del segundo aminoácido protegido
Síntesis de Merrifield
FASE LIQUIDA
CH2Cl2
CF3 COOH
FASE SÓLIDA INSOLUBLE
CH2O
CO
CHR NH
NHR´ CH
CO
O
CO
Segundo aminoácido anclado
Desprotección del grupo amino
Síntesis de Merrifield
HF
FASE LIQUIDAFASE SÓLIDA INSOLUBLE
CH2O
CO
CHR NH
NH2R´ CH
CO
Segundo aminoácido anclado
Desanclaje del péptido del polímero
Síntesis de Merrifield
FASE LIQUIDA
Liberación del péptido
FASE SÓLIDA INSOLUBLE
CH2F
Péptido obtenido
OHC
O
CHR NH
NH2R´ CH
CO
OHC
O
CHR NH
NH2R´ CH
CO
Síntesis de Merrifield
Síntesis de MerrifieldCH2
Cl
NHR´ CH
CO
O
CO
O
NHR´ CH
CO
O
CO
O
CH2O
CO
CHR NH CO
OCH2
OC
O
CHR NH2
CH2O
CO
CHR NH
NHR´ CH
CO
O
CO
CH2O
CO
CHR NH
NH2R´ CH
CO
Cl CH2 O Et
Cl4Sn
Cl
CF3 COOH
CH2Cl2
HF
CH2F
Pedro Antonio García RuizCatedrático de Escuela Universitaria Profesor Titular de Universidad
Area Química analítica Area Química Orgánica
Departamento de Química Orgásnica - Universidad de Murcia
Ha finalizado la exposición
Muchas gracias por su atención
Aminoácidos y Péptidos
Aminoácidos y Péptidos
Aminoácidos
Análisis de Péptidos
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