AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y

EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora)

DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ LILIANA IBETH PEREZ PEREZ

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito

Para optar al título de

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIA

Bogotá, D.C. Enero de 2007

i

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el

anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

ii

AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y

EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora)

DIANA MARIA GAITÁN BOHORQUEZ LILIANA IBETH PEREZ PEREZ

APROBADO

Adriana Matiz Villamil Balkys Quevedo Hidalgo Bacterióloga M.Sc. Ingeniera Quimica M.Sc.

DIRECTORA CODIRECTORA

Andrea Aguirre Ivonne Gutierrez Bacterióloga M.Sc. Bacteriologa M.Sc.

JURADO JURADO

iii

AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS

CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO

(Dendranthema grandiflora)

DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ LILIANA IBETH PEREZ PEREZ

APROBADO

Angela Umaña Muñoz, M. Phil. David Gomez Mendez, M.Sc. Decana académica Director Carrera

Facultad de Ciencias Microbiología Industrial

i

A Dios por ser mi guía, a mi familia, en especial a mi mamá, mis abuelitos, Camila y Batty por su infinito amor y compañía.

A Gustavo por brindarme su amor y orientación como lo hace un padre. A Liliana por su constante dedicación, pero sobre todo por su amistad.

A Paulis, Pili y Memo por su amistad incondicional. A Mario A. por su continuo interés, apoyo y por hacerme reír siempre.

Diana Gaitán

ii

A Dios por permitirme finalizar este trabajo. A mis padres y hermanitos por su amor, interés, guía y continuo apoyo.

A mi Tía Nubia y Camilo por su apoyo incondicional. A Dianis por sus enseñanzas y confianza.

A la familia Bohórquez Galindo, por acogerme en su hogar.

Liliana Pérez

AGRADECIMIENTOS

A la Doctora Adriana Matíz, por sus conocimientos, dedicación, paciencia y

confianza.

A la Ingeniera Balkys Quevedo, por su continua orientación, interés y

paciencia.

Al Doctor David Gómez, por su asesoria y apoyo continúo.

A cultivos del Norte, por permitirnos hacer uso de sus instalaciones.

A Viviana Gutiérrez por su amistad, ayuda y conocimientos.

A Johanna Buitrago y Dolly Tenjo, por su amistad y colaboración

permanente.

A Marcela Quintero, Martha Hernández, Jhon Manosalva, Paula Sarmiento,

Erika Fajardo, Sandra Sarmiento, Angela Pinzón, Mónica Chávez, Sandra

Gómez, Leonardo Sastoque, Maritza López por su amistad y su apoyo.

A Carlos Roa, por su paciencia y disposición.

A todas las personas que de una u otra manera formaron parte de esta

investigación.

vii

TABLA DE CONTENIDO

Pag.

1. INTRODUCCIÓN 1 2. MARCO TEÓRICO 2 2.1 La Celulosa 2

2.2 Degradación de la celulosa 4

2.2.1 Enzimas implicadas en la degradación de la celulosa 4

2.2.2 Evaluación de la Actividad Enzimática 5

2.2.2.1 Endoglucanasas 5

2.2.2.2 Exoglucanasas 6

2.2.2.3 β-glucosidasas 6

2.2.2.4 Celulasas Totales 7

2.2.3 Microorganismos Celulolíticos 7

2.2.3.1 Degradación de la celulosa por microorganismos aerobios

y anaerobios 9

2.2.4 Factores ambientales que determinan la degradación

microbiológica de la celulosa 10

2.2.4.1 Concentración de Nitrógeno en el suelo 11

2.2.4.2 Temperatura 11

2.2.4.3 Aireación 11

2.2.4.4 pH 11

2.2.5 Factores que determinan la Actividad enzimática de las

Celulasas 12

2.2.5.1 Sinergismo 12

2.2.5.2 Adsorción 13

2.2.6 Alternativas en el bioprocesamiento de materiales

Lignocelulósicos 13

2.2.7 Productos de degradación de la celulosa y su utilidad industrial 13

2.2.8 Aplicación de la glucosa a nivel industrial 14

viii

2.2.9 Determinación de actividad celulolítica 15

2.2.9.1 Prueba cualitativa con Rojo Congo 15

2.2.9.2 Prueba cuantitativa por la técnica del Ácido

3,5- dinitrosalicílico (DNS) 16

2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora) 17

2.2.10.1 Disponibilidad y valor comercial del Residuo Vegetal

generado en cultivos de flores (Cultivos del Norte) 18

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 19

4. OBJETIVOS 20 4.1 Objetivo general 20

4.2 Objetivos específicos 20

5. MATERIALES Y MÉTODOS 21 5.1 Localización y condiciones de muestreo 21

5.2 Aislamiento e identificación de microorganismos celulolíticos 21

5.2.1 Aislamiento primario 21

5.2.2 Aislamiento secundario 22

5.3 Pruebas de antagonismo 22

5.4 Conservación de cepas 23

5.5 Caracterización y procesamiento del residuo vegetal 23

5.6 Proceso de fermentación en cultivo discontinuo 24

5.6.1 Utilización del sustrato vegetal por parte de los microorganismos

celulolíticos seleccionados 24

5.6.1.1 Pruebas preliminares de actividad celulolítica de las cepas

seleccionadas (Individualmente) 24

5.6.1.2 Evaluación de la actividad celulolítica de las

cepas seleccionadas (Consorcio) 25

5.7 Determinación de azúcares reductores 25

5.8 Determinación de actividad celulolítica 26

ix

5.8.1 Solución de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M

pH 7.0 26

5.8.2 Solución de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer ácido cítrico

0.1M pH 5 27

5.9 Identificación Bioquímica 27

5.10 Evaluación de azúcares fermentables en el extracto crudo 28

5.11 Análisis Estadístico 28

6. RESULTADOS Y DISCUSION 29 6.1 Aislamiento de microorganismos celulolíticos 29

6.2 Pruebas de Antagonismo 35

6.3 Pretratamiento del residuo vegetal 39

6.4 Evaluación preliminar de la actividad celulolítica de las cepas

aisladas 40

6.4.1 Evaluación preliminar de la actividad celulolítica del consorcio 41

6.5 identificación Bioquímica 44

6.6 Utilización del sustrato vegetal por parte del consorcio celulolítico 47

6.6.1 Condiciones de pH y temperatura durante la fermentación 50

6.7 Actividad enzimática y liberación de azúcares reductores

a partir del residuo vegetal de crisantemo 51

7. CONCLUSIONES 56

8. RECOMENDACIONES 57

9. LITERATURA CITADA 58

x

INDICE DE TABLAS

Pag

Tabla 1. Bacterias con alta Actividad Específica de celulasas 8 Tabla 2. Hongos con alta Actividad Específica de celulasas 9 Tabla 3. Caracterización macro y microscópica de las cepas

con actividad celulolítica aisladas en agar CMC 1%(p/v) 30

Tabla 4. Actividad celulolítica cualitativa de las cepas aisladas en agar CMC 1%(p/v) 30 Tabla 5. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v) 38 Tabla 6. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 2%(p/v) 38 Tabla 7. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 3%(p/v) 39 Tabla 24. Identificación Bioquímica cepa 8 44 Tabla 25. Identificación Bioquímica Actinomiceto 46

xi

INDICE DE FIGURAS

Pag.

Figura 1. Estructura Química de la celulosa 3 Figura 2. Estructura de la Celulosa: regiones cristalinas y amorfas 4 Figura 3. Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1%(p/v) 31 Figura 4. Zonas de aclaramiento, cepa 2 en Agar CMC 1%(p/v) 31 Figura 5. Zonas de aclaramiento, cepa 3 en Agar CMC 1%(p/v) 32 Figura 6. Zonas de aclaramiento, cepa 4 en Agar CMC 1%(p/v) 32 Figura 7. Zonas de aclaramiento, cepa 5 en Agar CMC 1%(p/v) 33 Figura 8. Zonas de aclaramiento, cepa 6 en Agar CMC 1%(p/v) 33 Figura 9. Zonas de aclaramiento, cepa 7 en Agar CMC 1%(p/v) 34 Figura 10. Zonas de aclaramiento, cepa 8 en Agar CMC 1%(p/v) 34 Figura 11. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1 35 Figura 12. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 2 35 Figura 13. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 4 36 Figura 14. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 5 36 Figura 15. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 6 36 Figura 16. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 7 36 Figura 18. Resistencia cepa 8 36 Figura 19. Residuo vegetal de crisantemo molido 40

xii

Figura 20. Azúcares reductores en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8) en SVS al 10% (p/v) 42 Figura 21. Actividad enzimática en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8) en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC 43 Figura 22. Azúcares reductores en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v) 43 Figura 23. Actividad enzimática en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC 43 Figura 24. Características macroscópicas cepa 8 en agar CMC 1%(p/v) 44 Figura 25. Características macroscópicas Streptomyces sp. en agar avena 5%(p/v) 45 Figura 26. Características microscópicas Streptomyces sp. 45 Figura 27. Azúcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v) 49 Figura 28. Azúcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v) 49 Figura 29. Variación de pH en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v) 50 Figura 30. Variación de pH en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v) 51 Figura 31. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v) bajo condiciones de pH7 37ºC 51 Figura 32. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV al 10%(p/v) bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC 52

xiii

Figura 33. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SVS al 10%(p/v) bajo condiciones de pH7 37ºC 52

xiv

LISTA DE ANEXOS

Pag.

ANEXO 1. Medios de cultivo y reactivos 64 ANEXO 2. Determinación de azúcares reductotes por el método del Acido 3,5- dinitrosalicílico 66 ANEXO 3. Pruebas preliminares: Determinación de Azúcares reductores y Actividad enzimática cepas 1, 3,4 y 7 68 ANEXO 4. Pruebas preliminares: Determinación de Azúcares reductores y Actividad enzimática de Bacillus sp. (cepa 8) y Streptomyces sp. por separado y en consorcio 71 ANEXO 5. Pruebas preliminares: Determinación de Azúcares reductores y Actividad enzimática del consorcio (Bacillus sp y Streptomyces sp.) en cultivo discontinuo en SV y SVS al 5 y 10%(p/v) 74 ANEXO 6. Análisis fisicoquímico del residuo vegetal de crisantemo 76 ANEXO 7. Perfil cromatográfico: Sobrenadante de la hora seis de fermentación en SV Y SVS al 10%(p/v) 77 ANEXO 8. Análisis estadístico (SPSS, versión 14) 79

xv

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y evaluar microorganismos

degradadores de celulosa a partir de residuos vegetales frescos y en

compost de crisantemo. Ocho cepas bacterianas mesofílicas con actividad

celulolítica a partir de residuos vegetales de crisantemo en compostaje. La

actividad celulolítica de estas cepas fue evaluada cualitativamente mediante

el revelado de halos de hidrólisis con rojo congo en medio

Carboximetilcelulosa (CMC) al 1%(p/v), posteriormente, con el objetivo de

establecer un consorcio bacteriano celulolítico se realizaron pruebas de

antagonismo para determinar si existía algún tipo de inhibición entre éstas.

La actividad celulolítica de las cepas escogidas fue evaluada mediante la

técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) a partir de la cual sólo una cepa

fue seleccionada para hacer parte del consorcio. Con el fin de potencializar la

actividad de dicha cepa se usó un actinomiceto aislado y evaluado en otro

estudio. Estos microorganismos fueron identificados como Bacillus sp. y

Streptomyces sp.. La capacidad degradadora del consorcio sobre el residuo

vegetal de crisantemo fue evaluada en dos medios: uno con sustrato vegetal

a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), suplementado con sales, llamado

medio sustrato vegetal suplementado (SVS) y otro, compuesto de sustrato

vegetal en las mismas concentraciones, extracto de levadura y peptona,

llamado medio sustrato vegetal (SV), determinando la concentración de

azúcares reductores liberados mediante la técnica de DNS y la actividad

enzimática en buffer fosfato pH7 37ºC y buffer ácido cítrico pH5 50ºC. Los

resultados obtenidos mostraron que la degradación del sustrato vegetal de

crisantemo fue mejor cuando las microorganismos actuaron en consorcio

demostrando una acción sinérgica entre sus enzimas, por otro lado, en el

medio SV en una concentración del 10%(p/v) se dió la mayor liberación de

azucares reductores con un valor de 1.665g/L y una actividad enzimática

de0.1056UC.

ABSTRACT The present investigation was with the aim of isolate and evaluate cellulose

degradation by microorganisms. Eight mesophilic bacteria with cellulolytic

activity were isolation and purified from vegetable wastes of a composting

system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism was

evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red and

carboximethylcellulose (CMC) 1%(w/v) as the substrate, afterwards with the

objective to create a cellulolytic bacterial association developed antagonism

test for determine if any type of inhibition existed between them. The

cellulolytic activity of the selected strain was evaluated with dinitrosalicyc acid

(DNS) method, only one microorganism was selected for the bacterial

association. With the aim of boost the bacteria activity, employed a cellulolytic

actinomycete previously isolated and evaluated in other investigation. This

microorganisms were identified as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The

degradation capacity of bacterial association using vegetable wastes of

crisantemo was evaluated employing two broths: one of this with vegetable

waste at different concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts

(SVS), the other only with vegetable waste with the same concentrations,

yeast extract and peptone (SV) the concentration of reducing sugars was

evaluated with DNS method and the cellulose activity using CMC phosphate

buffer pH7 37ºC and CMC citric acid pH5 50ºC. The obtained results

indicated that the best degradation of vegetable wastes was using the

bacterial association, showing a synergetic cellulose degradation,

furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed the best concentration of

reducing sugars (1.665 g/L) and cellulose activity of 0.1056 UC.

1. INTRODUCCION

La floricultura es una de las actividades más desarrolladas en Colombia, el

crisantemo ocupa el cuarto lugar en flores de exportación y genera durante

casi todas las etapas del proceso productivo, grandes cantidades de residuos

vegetales de difícil degradación en el medio ambiente. Dentro del programa

de gestión ambiental de este sector los residuos sólidos generados son

tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa biotecnológica

es la utilización de microorganismos celulolíticos capaces de degradar estos

residuos, con la consecuente producción de azúcares fermentables que a su

vez puedan ser usados como sustrato glicosídico natural.

Los microorganismos encargados de la degradación de la celulosa, principal

componente de la pared celular de las plantas incluyen bacterias, hongos y

actinomycetes, aerobios, anaerobios, mesofílicos y termofílicos, los cuales

cuentan con la maquinaria enzimática necesaria para dicho propósito, por tal

razón, su aislamiento e identificación representa un importante recurso para

lograr la disminución del impacto ambiental y la generación de un sustrato

fermentable cuya utilidad podría estar en la producción de etanol, obtención

de ácidos orgánicos, edulcorantes, productos farmacéuticos y alimentos,

entre otros.

2. MARCO TEÓRICO

2.1 La Celulosa

La celulosa es un importante constituyente carbonado de las plantas

superiores y probablemente el compuesto orgánico más abundante en la

naturaleza. Debido a que gran parte de la vegetación que pasa a formar

parte del suelo es celulósica, la descomposición de este carbohidrato tiene

una importancia muy especial en el ciclo biológico del carbono,

consecuentemente los microorganismos del suelo que catabolizan la

hidrólisis del material vegetal (40-60% de residuos de plantas) influencian el

flujo de energía desde éste hasta la formación de CO2 y su liberación a la

atmósfera. Como las bacterias y hongos del suelo son los microorganismos

mayormente involucrados en el ciclaje del material vegetal, cambios en el

número de estos pueden indicar modificaciones en el contenido de materia

orgánica del suelo. Cuando esto se corrobora con otros indicadores

ecológicos (biomasa y diversidad de especies encontradas) se obtiene

información acerca del estado del suelo y su productividad (Hendricks, et al,

1995). Como resultado, se ha prestado gran atención a los organismos que

participan en la descomposición de esta sustancia (Alexander, 1980).

Estructuralmente, la celulosa es un carbohidrato compuesto de unidades de

glucosa unidas en una larga cadena lineal por enlaces β en los átomos de

carbono 1 y 4 de la molécula de azúcar (Fig. 1)

2

Fig.1 Estructura Química de la celulosa (Heldt, 1997)

La celulosa existe en las plantas superiores, en las algas, en muchos tipos de

hongos y en los quistes de algunos protozoarios. El polisacárido está

localizado en la pared celular donde se encuentra como unidades

submicroscópicas de forma alargada conocidas como micelas. A su vez,

estas micelas se arreglan en estructuras más grandes, las microfibrillas, las

cuales están suficientemente empaquetadas para prevenir la penetración no

sólo de enzimas sino de pequeñas moléculas semejantes al agua (Lynd, et

al, 2002).

Una importante característica de la celulosa, relativamente inusual de los

polisacáridos es su estructura cristalina (Fig. 2), sin embargo, las fibras

individuales no son puramente cristalinas, lo que genera regiones amorfas

donde las fibras contienen torceduras y espacios en sus microfibrillas lo cual

permite la formación de microporos y capilares lo suficientemente espaciosos

para permitir la penetración de moléculas relativamente grandes incluyendo,

en algunos casos enzimas celulolíticas (Lynd, et al, 2002).

Las microfibrillas de celulosa están estabilizadas por enlaces de hidrógeno

intra e intermoleculares y rodeadas por polisacáridos hemicelulósicos

(manano y xilano) que se unen a la celulosa por puentes de hidrógeno y

enlaces covalentes, los cuales la hacen extremadamente resistente a la

3

hidrólisis química y biológica. Así mismo, las regiones amorfas de la

estructura cristalina de la celulosa tienen una composición heterogénea

caracterizada por una variedad de enlaces. Finalmente este arreglo

asimétrico que caracteriza las regiones amorfas es crucial para la

biodegradación de la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002)

Fig. 2 Estructura de la celulosa: regiones cristalinas y amorfas

(Guevara, et al, 2003)

2.2 Degradación de la celulosa

2.2.1 Enzimas implicadas en la degradación de la celulosa

El mecanismo ampliamente aceptado para explicar la hidrólisis enzimática de

la celulosa involucra la acción enzimática de tres enzimas: la endo β-1,4

glucanasa (β-1,4 glucano glucanohidrolasa), la exo β-1,4 celobiohidrolasa y

la β-1,4 glucosidasa (Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).

La endo β- 1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces β- 1,4

glucosídicos intramoleculares accesibles de cadenas de celulosa para

4

producir oligosacáridos de varias longitudes. La exo β-1,4 celobiohidrolasa

cliva los extremos no reductores del sustrato generando unidades de

celobiosa o glucosa y por último la β-1,4 glucosidasa, completa el proceso

hidrolítico convirtiendo los fragmentos de celobiosa a glucosa o removiendo

glucosa desde los extremos no reductores de pequeños celoligosacáridos.

(Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).

2.2.2 Evaluación de la Actividad Enzimática La actividad enzimática de las celulasas puede ser medida de dos formas

básicas:

• Medición de la actividad individual de cada celulasa (endoglucanasas,

exoglucanasas y β-glucosidasas).

• Medición de la actividad total de las celulasas (Zhang et al, 2006). 2.2.2.1 Endoglucanasas

Las endoglucanasas actúan al azar sobre los enlaces β- 1,4 glucosídicos y

su actividad es con frecuencia medida sobre celulosa soluble con alto grado

de polimerización, como es el caso de la carboximetilcelulosa CMC. La

acción de las endoglucanasas sobre este sustrato celulósico se caracteriza

por la disminución de la viscosidad realizando clivajes intramoleculares

(Zhang et al, 2006). Además la tasa de hidrólisis está condicionada a la

habilidad de las endoglucanasas para actuar en las regiones amorfas de la

matriz cristalina de la celulosa y crear nuevos extremos reductores en los

cuales las exoglucanasas puedan actuar (Malherbe y Cloete, 2002).

5

La medición de la actividad de endoglucanasa puede ser basada en la

reducción de la viscosidad del sustrato y/o en el incremento de extremos

reductores que se determinan por técnicas que permitan medir azúcares

reductores. Sin embargo, la actividad de las exoglucanasas también

incrementa el número de extremos reductores por lo cual, es recomendable

que la actividad de las endoglucanasas sea medida por ambos métodos

(viscosidad y extremos reductores) (Lynd et al, 2005).

Por otro lado, dicha actividad puede ser fácilmente detectada en medios con

CMC o celulosa y adición de varios colorantes como el rojo congo, debido a

que estos son adsorbidos sólo por largas cadenas de polisacáridos. Este

método es semi-cuantitativo y muy adecuado cuando se requiere procesar un

gran número de muestras (Ten et al, 2004).

2.2.2.2 Exoglucanasas Las exoglucanasas clivan los extremos accesibles de la molécula de celulosa

para liberar glucosa y celobiosa. La celulosa microcristalina (Avicel) es un

sustrato adecuado para la medición de la actividad por tener un bajo grado

de polimerización y una baja accesibilidad (Lynd et al, 2005; Zhang et al,

2006).

2.2.2.3 β-glucosidasas La β-glucosidasa hidroliza la celobiosa soluble y otras celodextrinas con un

grado de polimerización superior a 6 y la posterior producción de glucosa. La

tasa de hidrólisis disminuye con el incremento en el grado de polimerización

del sustrato. La actividad de esta enzima también puede ser medida usando

celobiosa, la cual no es hidrolizada por las endoglucanasas ni exoglucanasas

(Lynd et al, 2005).

6

2.2.2.4 Celulasas Totales El sistema de celulasas esta conformado por endoglucanasas,

exoglucanasas y β- glucosidasas, las cuales hidrolizan sinérgicamente la

celulosa cristalina. La evaluación de la actividad de las enzimas celulolíticas

es con frecuencia evaluada usando sustratos insolubles los cuales incluyen:

papel filtro Whatman Nº1 y celulosa microcristalina. La heterogeneidad de la

celulosa insoluble y la complejidad del sistema de celulasas causa problemas

en la medición de la actividad total. Resultados experimentales muestran que

la estructura heterogénea de la celulosa insoluble induce la disminución en la

tasa de hidrólisis en corto tiempo (menos de una hora) provocando la

desactivación de las celulasas (Zhang et al, 2006).

2.2.3 Microorganismos Celulolíticos Los microorganismos degradadores de celulosa incluyen hongos y bacterias,

aerobios y anaerobios, mesofílicos y termofílicos que ocupan una variedad

de habitats (Aubert, 1988). Entre los hongos celulolíticos se destacan:

Trichoderma reesei, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani,

Penicillum funiculosum, Trichoderma koningii, Sporotrix sp., Alternaria sp.,

Geotrichum sp., Rhizoctonia sp., Trametes sp., Paecilomyces sp. , Mucor

sp.,Cladosporium sp., Bulgaria sp., Chaetomium sp., Helotium sp.,

Aspergillus sp.. Las bacterias celulolíticas más abundantes y conocidas son

las aerobias entra las cuales se pueden citar: Cellulomonas sp., Microbispora

bispora, Thermomonospora sp. ,Cytophaga sp., Corynebacterium sp., Vibrio

sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp.,Thermobifida sp.. Además se encuentran

algunos anaerobios como: Acetivibrio cellulolyticus, Butirivibrio sp.,

Bacteroides cellulosolvens, Bacteroides succinogenes, Clostridium

cellulovorans, Clostridium thermocellum, Ruminococcus albus,

Ruminococcus flavefaciens (Lynd, et al, 2002). Entre los actinomicetes se

7

destacan: Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces cellulolyticus (Semedo,

et al., 2004; Grigorevski, et al., 2005; Li, 1997), Themomonospora curvata,

Thermomonospora chromogena, Thermomonospora alba y Thermomobifida

fusca (Ramírez y Coha, 2003).

El pH óptimo para la actividad de las celulasas producidas por bacterias

abarca un amplio rango, el cual incluye condiciones ácidas y alcalinas. (Tabla

1). Por otro lado, las celulasas producidas por hongos requieren

generalmente un pH ácido (Tabla 2).

Tabla 1. Bacterias con alta Actividad Específica de celulasas

Microorganismo

Actividad Específica (μmol.min-1.mg-1)

pH óptimo

Bacillus subtilis 514 5-7

Clostridium thermocellum 428 7

Streptomyces murinus 6.7 6

Bacillus macerans 5030 6

Bacillus sp. 369.6 9

(Howard et al., 2003)

8

Tabla 2. Hongos con alta Actividad Específica de celulasas. Microorganismo

Actividad Específica

(μmol.min-1.mg-1)

pH óptimo

Sclerotium rolfsii 475 3.3

Aspergillus niger 194 5

Achlya bisexualis 7840 6

Orpinomyces sp. 3659 5.8

Rizhopus chinensis 4800 ND

Penicillium

brefeldianum

405 4.2

(Howard et al., 2003)

N.D. No determinado

2.2.3.1 Degradación de la celulosa por microorganismos aerobios y anaerobios Existe una diferencia fundamental en el mecanismo de hidrólisis de la

celulosa entre bacterias y hongos aerobios y anaerobios. Los hongos y

bacterias aeróbicos característicamente cuentan con un sistema de celulasas

no complejo lo cual, conlleva a la secreción de enzimas hidrolíticas de

celulosa en el medio de cultivo. Sin embargo, bacterias anaeróbicas

especialmente Clostridium spp. y hongos del género Neocallimastix,

Piromonas y Sphaeromonas contienen un sistema de celulasas que forman

un complejo donde las enzimas que degradan la celulosa están contenidas

en una membrana llamada celulososoma. Esta fundamental diferencia tiene

implicaciones en el uso biotecnológico de estos microorganismos, pues las

basadas en bacterias y hongos anaerobios pueden tener ventajas sobre los

sistemas aeróbicos en términos de eficiencia hidrolítica. El sistema de

celulasas dispuestas en un complejo permite un alto grado de coordinación

entre las enzimas involucradas en la hidrólisis de la celulosa lo que permite

9

evitar la pérdida de los intermediarios durante la degradación por los cambios

en las condiciones ambientales (Malherbe y Cloete, 2002).

En los sistemas aeróbicos donde se requiere una agitación y aireación

continuas, la pérdida de las enzimas secretadas y de los intermediarios de

degradación puede afectar la eficiencia del proceso. Sin embargo, los

microorganismos aerobios ganan más energía de la glucosa que los

anaerobios (38 moles de ATP vs 2-4 moles de ATP por cada mol de glucosa)

por lo tanto, la aparente eficiencia hidrolítica de los microoganismos

aeróbicos es benéfica en cuanto a ganancia energética. Sin embargo, dado

los bajos requerimientos técnicos para la aplicación de microorganismos

anaeróbicos comparados con los sistemas aeróbicos (ausencia de agitación

vigorosa para facilitar la aireación y tecnologías para el control de flujo) el uso

de hongos y bacterias anaerobios en proyectos de biorremediación pueden

ser más atractivos por el bajo costo que requieren y la alta eficiencia de la

maquinaria hidrolítica sobre la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002).

2.2.4 Factores ambientales que determinan la degradación microbiológica de la celulosa

La tasa a la cual se metaboliza la celulosa está dada por varios factores del

medio ambiente, y los suelos que varían en sus características físicas y

químicas poseen marcadas diferencias en su capacidad celulolítica. Los

principales factores del medio ambiente que afectan la transformación son el

nivel de nitrógeno disponible, la temperatura, aireación, humedad, pH, la

presencia de otros carbohidratos y la proporción relativa de lignina en los

restos vegetales ( Alexander, 1980).

10

2.2.4.1 Concentración de Nitrógeno en el suelo

La aplicación de nitrógeno inorgánico aumenta la descomposición de la

celulosa en el suelo y tanto las sales de amonio como las de nitrato son

buenas fuentes de este elemento. La respuesta a éste indica que el nivel de

nitrógeno en el suelo es un factor limitante (Alexander, 1980).

2.2.4.2 Temperatura

La utilización biológica de la celulosa puede llevarse a cabo desde

temperaturas cercanas a la congelación hasta alrededor de los 65ºC. Cada

una de las variedades de organismos celulolíticos es afectada en forma

diferente por la temperatura. Los mesófilos dominan en temperaturas

moderadas mientras que la microflora termofílica puede degradar la celulosa

por arriba de los 45ºC. Debido a los cambios en la composición de la flora

inducidos por la temperatura, el calor aumenta la velocidad de transformación

del sustrato a causa del efecto directo de ésta sobre la acción enzimática

(Alexander, 1980).

2.2.4.3 Aireación

La aireación también rige la composición de la flora activa. A causa del

proceso anaeróbico, el metabolismo de la celulosa es reducido

significativamente en medios deficientes de oxigeno en comparación con

habitats aireados (Alexander, 1980).

2.2.4.4 pH

En medios con pH entre neutro y alcalino, muchos microorganismos son

capaces de crecer y liberar las enzimas apropiadas para la hidrólisis del

11

polisacárido; bajo condiciones ácidas la desaparición de la celulosa se debe

principalmente a los hogos filamentosos. Aunque el proceso es rápido a pH

menor de 5 y ocasionalmente por debajo de 4, los suelos con bajas

concentraciones del ion hidrógeno degradan la celulosa más fácilmente

(Alexander, 1980).

2.2.5 Factores que determinan la Actividad enzimática de las celulasas Diversos factores asociados con la naturaleza del sistema enzimático de las

celulasas ha sido sugerido por influenciar el proceso hidrolítico. Estos

incluyen: inhibición del complejo de celulasas por el producto final,

inactivación térmica, sinergismo e irreversible adsorción de las enzimas,

teniendo estos últimos la mayor influencia en la tasa de degradación del

polisacárido (Mansfield et al, 1999).

2.2.5.1 Sinergismo El sinergismo ocurre cuando la acción combinada de dos o más enzimas

aumenta la tasa de acción sobre el sustrato respecto a la acción individual.

Se han hecho estudios en los que se ha observado una actividad cooperada

de las celulasas de Trichoderma reseei en el que las endoglucanasas actúan

al azar a lo largo de las cadenas de celulosa generando sitios donde actúan

las exoglucanasas las cuales liberan celobiosa como producto principal, una

tercera enzima, la β-glucosidasa es necesaria para hidrolizar la celobiosa

previniendo de esta manera la inhibición de las exoglucanasas por

acumulación de producto y por tanto generando un aumento en la tasa

hidrolítica. (Mansfield et al, 1999)

12

2.2.5.2 Adsorción La hidrólisis de la celulosa difiere de otras reacciones enzimáticas en que el

sustrato es insoluble y requiere una previa adsorción de la enzima al

sustrato. La adsorción de las celulasas es facilitada por la presencia de

dominios en el sustrato los cuales son susceptibles al clivaje proteolítico

mediante uniones por fuerzas de van der waals y puentes de hidrogeno.

Además dichos dominios cuentan con aminoácidos aromáticos que confieren

una especificidad adicional y estabilidad al complejo enzima - sustrato

(Mansfield et al., 1999).

Existen dos teorías para explicar la interacción de los dominios con la

celulosa. La primera se basa en que los dominios incrementan la

concentración local de enzimas en la superficie de la celulosa, la segunda

propone que los dominios son un instrumento que permite el rompimiento de

cadenas de celulosa cristalina pero no de celulosa amorfa (Mansfield et al.,

1999).

2.2.6 Alternativas en el bioprocesamiento de materiales lignocelulósicos Los materiales lignocelulósicos pueden ser tratados aplicando estrategias

que incluyen: tratamiento anaeróbico, compostaje, producción de proteína

celular para la alimentación de animales rumiantes y cultivo de champiñón

(Howard et al., 2003).

2.2.7 Productos de degradación de la celulosa y su utilidad industrial

Las bacterias aerobias generalmente convierten la celulosa en dos productos

principales: CO2 y biomasa. No existen acumulaciones significativas de

intermediarios carbonados y la concentración de ácidos orgánicos raramente

13

alcanza un nivel apreciable. Por otro lado, en condiciones anaerobias las

bacterias son incapaces de metabolizar completamente dicho sustrato,

siendo los principales productos de acumulación, CO2, CH4, H2, etanol y

ácidos acético, fórmico, succínico, butírico y láctico (Alexander, 1980).

La celulosa es empleada a nivel industrial en la manufactura de papel y

cartón, telas, películas fotográficas, celofanes, explosivos, diluyentes,

jabones, aromas y alimentos (Alexander, 1980).

En Colombia se han adelantado diferentes investigaciones en búsqueda de

nuevas alternativas para la utilización de celulosa fibra, entre estas:

• Diseño, fórmula, elaboración y evaluación de un excipiente

coprocesado a base de celulosa fibra para la elaboración de formas

farmacéuticas sólidas (tabletas) por el método de compresión directa

(Sánchez y Zuluaga, 1999).

• Utilización de residuos vegetales generados en el sector floricultor

nacional en la elaboración de papel manual (Pérez, 1996).

• Obtención de etanol como biocombustible a partir de residuos

lignocelulósicos y amiláceos mediante ensayo de hidrólisis y

fermentación de azúcares (Tellez y Pava, 2003).

2.2.8 Aplicación de la glucosa a nivel industrial

La glucosa, por ser un producto que posee diferentes características, entre

ellas el ser edulcorante, preservativo de la humedad, inhibidor frente a

levaduras y mohos, estabilizador de la viscosidad, etc, tiene gran aplicación

en la industria farmacéutica y de alimentos. La característica reductora de la

14

glucosa referida a la capacidad de su grupo carboxilo para reaccionar como

tal, esta directamente relacionado con la capacidad de formar colores, y

aromas de tostado por la reacción con las proteínas (Forero, 1986).

• Industria de alimentos: En confitería como agente anti cristalizador, en

producción de jaleas y mermeladas previene la cristalización del azúcar,

en la elaboración de productos horneados de panadería se utiliza para

dar volumen, endulzar y prolongar la vida útil de los productos.

• Industria Farmacéutica: Es utilizada como excipiente en la elaboración de

jarabes y grageas, hace parte de la formulación de algunos sueros orales,

etc.

• Producción de etanol como biocombustible

• Producción de ácidos orgánicos (Forero, 1986).

2.2.9 Determinación de actividad celulolítica 2.2.9.1 Prueba cualitativa con Rojo Congo

Diferentes procedimientos utilizados en la identificación y enumeración de

los microorganismos capaces de utilizar la celulosa han sido descritos;

siendo la base de estos la hidrólisis de sustratos celulósicos. La utilización de

medios líquidos que contienen celulosa permiten estimar cualitativa y

cuantitativamente los microorganismos degradadores, los medios sólidos son

generalmente más usados pero en estos las colonias de microorganismos

que utilizan el sustrato son con frecuencia difíciles de diferenciar de otros

microorganismos que no lo hacen. Teather y Wood en 1982, observaron que

el rojo congo podía ser usado en los ensayos para evidenciar la hidrólisis de

15

polisacáridos debido a que el colorante forma complejos con las moléculas

aún no hidrolizadas, facilitando así la diferenciación entre microorganismos

celulolíticos y no celulolíticos por la formación de zonas de aclaramiento

alrededor de las colonias (Hendricks, et al., 1995).

2.2.9.2 Prueba cuantitativa por la técnica del Ácido 3,5- dinitrosalicílico (DNS)

La actividad del sistema enzimático en el complejo celulolítico puede medirse

determinando la cantidad de glucosa liberada mediante DNS. Esta técnica

demuestra la presencia del grupo carbonilo libre (C=O) de los azúcares

reductores que implica la oxidación del grupo funcional aldehído de la

glucosa (Miller,1959).

En este método el Ácido 3,5- dinitrosalicílico es reducido a ácido 3-amino-5-

nitrosalicílico, mientras que los grupos aldehídos son oxidados a grupos

carboxilos. La reducción del ácido genera un color amarillo el cual es

proporcional a la concentración del azúcar reductor presente y se evidencia

por medio de la lectura de absorbancias en el espectrofotómetro lo que

implica la aplicación de la ley de Beer Lambert (Miller,1959).

La lectura de la prueba de DNS es altamente influenciada por las mismas

condiciones de la prueba, como la temperatura del agua de calentamiento, la

transferencia de calor, el tiempo de reacción, la proporción de glucosa,

celobiosa y celodextrinas presentes y el tiempo de preparación del reactivo,

el cual con frecuencia es ignorado (Zhang et al., 2006).

16

2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)

Uno de los cultivos que actualmente genera el mayor número de divisas

dentro de las exportaciones no tradicionales colombianas es el de la

floricultura. En un período no superior a diez años, Colombia se ha

convertido en el segundo exportador mundial (después de Holanda) de flores

cortadas, con una participación del 10% sobre el total de las exportaciones

mundiales. Más de 50 tipos diferentes de flores, entre las cuales se destacan

el clavel, el pompón, la rosa y el crisantemo se cultivan principalmente en la

Sabana de Bogotá, el Oriente Antioqueño y el Valle del Cauca siendo sus

principales mercados Estados Unidos (80%) y la Unión Europea (14%).

(http://www.unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm).

El crisantemo (Dendranthema grandiflora) es un híbrido complejo

perteneciente a la familia Asteraceae y engloba flores de las más antiguas

cultivadas en Colombia. Las hojas pueden ser lobuladas o dentadas,

ligulosas o rugosas, de color variable entre el verde claro y oscuro,

recubiertas de un polvillo blanquecino que le da un aspecto grisáceo (Stace,

2003; Santana, et al, 2002).

La propagación se realiza por esquejes terminales que se obtienen de

plantas madre seleccionadas por su conformación a la progenie, capacidad

de cosecha y vigor mantenidas bajo condiciones de día largo para inhibir la

formación de botones finales. Los esquejes terminales de 8-10cm de longitud

pueden colocarse directamente en el medio para enraizamiento o

almacenarse a 0-3ºC durante unas seis semanas, en cajas de cartón

forradas con polietileno para evitar la deshidratación (Vidiale, 1983). Entre los

sustratos utilizados en el proceso de enraizamiento se destacan: perlita,

vermiculita, arena, turba o mezclas de estos. En la sabana de Bogotá se

17

emplean productos naturales como cascarilla de arroz o escoria (Santana, et

al,2002).

En cuanto a sus requerimientos nutricionales el crisantemo es un cultivo

bastante exigente en lo referido a las cantidades de nitrógeno, fósforo y

potasio necesarias para la obtención de flores y plantas de óptima calidad.

Cuando existen deficiencias, aplicaciones moderadas no logran remediar los

trastornos ocasionados, por lo cual, luego de la siembra de los esquejes se

recomienda utilizar fertilizantes con alto contenido en nitrógeno, potasio y

otros microelementos, manteniendo un pH entre 55.5 y 6.5 (Santana, et al.,

2002).

2.2.10.1 Disponibilidad y valor comercial del Residuo Vegetal generado en cultivos de flores (Cultivos del Norte). Durante la actividad de cosecha realizada en cultivo de flores (Cultivos del

Norte) se generan aproximadamente cuatro toneladas de residuos vegetales

al mes, dichos residuos son acumulados y posteriormente llevados en su

totalidad a pilas de compostaje; con el fin de obtener abono orgánico utilizado

en la adecuación de los suelos, por lo cual en este caso los residuos

vegetales no tienen ningún valor comercial. (comunicación verbal)

18

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN Actualmente una gran cantidad de residuos de celulosa que puede ser

medida en billones de toneladas son producidos en el mundo entero como

resultado de actividades en la agricultura y la industria.

En Colombia, el cultivo de flores representa una fuente importante de dichos

residuos, se cultivan más de 50 tipos diferentes, del total de las

exportaciones colombianas de flores para el año 2001 la participación fue de

24.7% de rosa, 21.4% de clavel estándar, 11.3% de mini clavel y 2.3% de

crisantemo. Actualmente este sector libera altos volúmenes de residuos

vegetales que dificultan su manejo y debido a su lenta degradación se

convierten en un problema de alto impacto ambiental (pérdida de espacio

físico, impacto paisajístico, generación de plagas, etc) (Asocolflores, 2001)

La utilización de microorganismos con actividad celulolítica representa una

de las opciones con mayor viabilidad en la solución de esta problemática ya

que el costo de inversión es bajo y se da un uso adecuado a dichos residuos

obteniendo un sustrato que puede ser aprovechado como fuente de carbono

en producción industrial.

En el presente trabajo se plantea el aislamiento e identificación de consorcios

microbianos con actividad celulolítica, a partir de residuos celulósicos

generados en un cultivo productor de crisantemo (Dendranthema

grandiflora), útiles en la degradación celulósica de residuos vegetales y

además generadores de sustratos glucosídicos que pueden ser empleados

en la obtención de etanol, ácidos orgánicos, edulcorantes, alimentos e

industria farmacéutica.

19

4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general

Aislar y evaluar microorganismos degradadores de celulosa a partir de

residuos vegetales frescos y en compost generados en un cultivo de

crisantemo (Dendranthema grandiflora).

4.2 Objetivos específicos

• Aislar e identificar microorganismos con actividad celulolítica a partir

de residuos vegetales frescos y en compost provenientes de un cultivo

de crisantemo (Dendranthema grandiflora).

• Seleccionar los microorganismos que presenten mayor actividad

celulolítica y realizar banco de cepas.

• Realizar pruebas de antagonismo entre las cepas que presenten

mayor actividad celulolítica.

• Evaluar actividad celulolítica del consorcio microbiano aislado

utilizando como sustrato residuo vegetal con y sin suplemento, a una

concentración del 5%(p/v) y 10%(p/v).

20

5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Localización y condiciones de muestreo El muestreo del residuo vegetal se realizó a partir de residuos frescos y en

compostaje de un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)

localizado en el municipio de Tocancipá, ubicado a 2606 m.s.n.m cuya

temperatura promedio es de 13ºC y una humedad relativa del 80%

(http:/www.alcaldiatocancipa.gov.co)

Se tomaron en forma aleatoria cinco submuestras de residuo fresco de 1

semana de almacenamiento, de 100g cada una, registrando una temperatura

de 18ºC; en el caso de los residuos en degradación se muestrearon

diferentes puntos de la pila de compostaje de 4 semanas de degradación,

registrando una temperatura de 50ºC y un pH de 8.6. Los residuos vegetales

fueron recolectados manualmente con ayuda de un barreno y depositados en

bolsas de polipropileno, que posteriormente fueron llevadas al laboratorio de

Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana y mantenidas

en nevera a 4ºC, mientras fueron procesadas.

5.2 Aislamiento e identificación de microorganismos celulolíticos 5.2.1 Aislamiento primario

Se pesaron 10g de las muestras de residuos vegetales frescos y en

compostaje, cada uno de los cuales fueron llevados a 90ml de agua

peptonada 0.1%(p/v). Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de

10-1 a 10-5 en agua peptonada a 0.1%(p/v). A partir de las diluciones

preparadas se realizó siembra en superficie en agar Carboximetilcelulosa

(CMC) al 1%(p/v) (Anexo 1). Las cajas fueron incubadas a 35oC por 48

21

horas. Transcurrido el tiempo de incubación se adicionó rojo congo al

1%(p/v) (Anexo 1) como revelador a las colonias presentes en los medios,

luego de quince minutos se retiró el exceso y se adicionó NaCl 0.1M (Anexo

1), dejando reposar por quince minutos más, para luego hacer el recuento de

las colonias que presentaron halos de hidrólisis (Teather y Wood, 1982).

5.2.2 Aislamiento secundario A partir de los microorganismos obtenidos en el aislamiento primario se

realizaron repiques en agar CMC al 1%(p/v) de las colonias que presentaron

actividad celulolítica, llevando a incubación y revelado bajo las mismas

condiciones del aislamiento primario.

5.3 Pruebas de antagonismo

Para llevar a cabo las pruebas de antagonismo se siguió el método de

Gauze, para lo cual se preparó una suspensión en solución salina 0.85%

(p/v) de 10ml de cada uno de los microorganismos seleccionados por

presentar mayor actividad enzimática, igualando la concentración al tubo uno

del patrón de Mc Farland (3x108 cel/ml) y llevando a incubación a 100 rpm,

35ºC durante 14h. (Moreno et al, 2000). Por triplicado se dispusieron sobre

agar CMC al 1%(p/v), 2%(p/v) y 3%(p/v) (con siembra masiva del

microorganismo a enfrentar), anillos plásticos estériles de un centímetro de

diámetro de tal modo que una parte del anillo quedó dentro del agar sin tocar

la base de la caja de petri. Dentro de los anillos se inoculó una suspensión de

50μl del microorganismo antagonista. Control negativo: anillo con agua

destilada estéril. Teniendo como criterio de selección halos mayores a 5mm

(Gauze, 1967).

22

5.4 Conservación de cepas

Las cepas seleccionadas en la pruebas de antagonismo fueron sometidas a

tinción de Gram y una vez definidas sus características microscópicas se

procedió a obtener cultivos axénicos en agar CMC 1%(p/v). Se llevaron a

cabo suspensiones de cada una de las cepas en caldo celulosa al 1%(p/v)

(composición igual a agar celulosa excepto agar) igualando la concentración

al tubo 1 del patrón de Mc. Farland (3*108 cel/ml). Estas suspensiones se

mezclaron con glicerol a una concentración final de 25% (v/v), posteriormente

las suspensiones celulares fueron distribuidas en tubos eppendorf, cada uno

conteniendo un volumen de un mililitro que luego fueron almacenados a –

20ºC (Poutou, et al., 1994).

5.5 Caracterización y procesamiento del residuo vegetal

Los residuos vegetales frescos provenientes del cultivo de crisantemo fueron

sometidos a una caracterización físico-química en AGRILAB, laboratorio de

análisis químicos e insumos agrícolas certificado como laboratorio de

referencia por el ICA. Para el procesamiento de dicho residuo se llevó a cabo

el siguiente protocolo: lavado con agua para retirar partículas de suelo,

reducción de tamaño mediante picado, lavado con SDS (Sodio Dodecil

Sulfato) al 1%(p/v) ebullición por un período de media hora con SDS al 1%

(p/v), secado a 55ºC y finalmente molienda en molino Industrial. (Guevara, et

al., 2003)

23

5.6 Proceso de fermentación en cultivo discontinuo 5.6.1 Utilización del sustrato vegetal por parte de los microorganismos celulolíticos seleccionados

Para la realización de este proceso se emplearon dos medios: uno con

sustrato vegetal a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) junto con los

componentes del caldo celulosa exceptuando la carboximetilcelulosa,

llamado medio sustrato vegetal suplementado (SVS) (Anexo 1) y otro,

compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de

levadura (2.5g/L) y peptona (2.5g/L) llamado medio sustrato vegetal (SV)

(Anexo 1).

5.6.1.1 Pruebas preliminares de actividad celulolítica de las cepas seleccionadas (Individualmente)

Las curvas preliminares para evaluar el comportamiento enzimático y la

subsecuente liberación de azúcares reductores utilizando las cepas aisladas

y seleccionadas en las pruebas de antagonismo, se llevaron a cabo en caldo

CMC al 1%(p/v), 3%(p/v) y 5%(p/v) y SVS al 10%(p/v).

Inicialmente estas cepas fueron reactivadas del banco en cajas de agar CMC

al 1%(p/v) e incubadas a 35ºC durante 48 horas. A partir de cada cepa se

hizo un raspado en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentración de 3 x

108 cel/ml e incubando a 35ºC y 120rpm durante 24 horas. Las

fermentaciones se llevaron a cabo por triplicado en un VET de 250ml

adicionando el 10% de inóculo, con un tiempo de duración entre 18 y 24

horas, a 35ºC y 120rpm, muestreando cada dos horas hasta completar el

tiempo de fermentación. En cada una de las horas de muestreo. En cada una

de las horas de muestreo se realizó la determinación de azúcares reductores

24

por triplicado mediante la técnica de DNS (Numeral 5.7). Además se evaluó

Actividad enzimática en CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37ºC y buffer

acido cítrico pH5 50ºC relación 1:1 (numeral 5.8) con tiempos de reacción

enzima-sustrato de 30’, 60’ y 120’, realizando cada una de estas

evaluaciones por triplicado.

5.6.1.2 Evaluación de la actividad celulolítica de las cepas seleccionadas (En consorcio) Para evaluar la actividad hidrolítica de las cepas en consorcio se realizaron

fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v), caldo SV y SVS en

concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), cada uno, con un VET de 1000ml, .

adicionando 10% de inóculo repartido en volúmenes iguales de cada cepa a

evaluar ; incubando a 35ºC y 120 rpm durante 18-24 horas. La biomasa

inicial fue determinada mediante recuento en placa, en el caso de bacterias y

recuento de conidios en cámara de Neubawer, para microorganismos

filamentosos. A partir de los muestreos realizados la determinación de

azúcares reductores mediante DNS (numeral 5.7) y actividad enzimática en

CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37ºC y CMC al 1%(p/v) en buffer ácido

cítrico pH5 50ºC, relación 1:1 (numeral 5.8) con tiempo de reacción enzima-

sustrato de 60 minutos.

5.7 Determinación de azúcares reductores Las muestras tomadas en cada hora de fermentación fueron inmediatamente

centrifugadas durante 20 minutos a 100rpm, a partir del sobrenadante

obtenido se tomó un volumen de 0.25ml, al cual se adicionó 0.25ml de DNS

(Anexo 2), esta mezcla se sometió a ebullición por 5 minutos, transcurrido

este tiempo, la mezcla se llevó a un recipiente con hielo durante 5 minutos y

posteriormente se adicionaron 2.5ml de agua destilada. Esta solución fue

25

leída en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm y sensibilidad

media, para registrar la absorbancia generada, la cual se reemplazó en la

ecuación de la línea recta arrojada por la curva patrón previamente realizada

(Anexo2), para la obtención de la concentración de glucosa residual en cada

hora de muestreo (Miller, 1959).

5.8 Determinación de actividad celulolítica Se prepararon dos soluciones de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer

fosfato 0.1M pH 7 y buffer ácido cítrico pH5 (Anexo 1).

5.8.1 Solución de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M pH7 Se tomó 1ml de extracto crudo correspondiente a cada tiempo de muestreo

en cada una de las fermentaciones para hacerlos reaccionar con 1ml de la

solución carboximetilcelulosa - buffer fosfato pH7. Dicha preparación se

realizó por triplicado para evaluar la reacción enzima-sustrato durante el

tiempo de reacción establecido para cada curva, incubando a 37ºC en baño

termostatado. Transcurrido el tiempo de incubación las muestras fueron

llevadas a un recipiente con hielo durante diez minutos para detener la

reacción enzimática, posteriormente se centrifugaron por 20 minutos a 100

rpm. A partir de los sobrenadantes se tomaron 0.25ml adicionando 0.25ml

de DNS, la mezcla fue puesta en ebullición por 5 minutos para luego

detener la reacción en hielo por 10 minutos luego, se adicionaron 2.5ml de

agua destilada y finalmente de hizo la lectura de las absorbancias

generadas en el espectrofotómetro a 540nm, sensibilidad media,

registrando los valores obtenidos para luego reemplazarlos en la curva

patrón de DNS (Anexo 2) (Dávila, et al, 2002).

26

5.8.2 Solución de carboximetilcelulosa celulosa al 1%(p/v) en buffer ácido cítrico 0.1M pH5

La determinación de la actividad enzimática con buffer ácido cítrico pH5. (se

llevo a cabo haciendo reaccionar 1ml de extracto crudo correspondiente a

cada hora de muestreo con 1ml de la solución de celulosa en buffer ácido

cítrico pH5. Esta preparación se realizó por triplicado para evaluar la reacción

enzima-sustrato durante 60 minutos a 50ºC. Transcurrido cada tiempo de

incubación se detuvo la reacción en hielo por 10 minutos para

posteriormente ser centrifugado por 20 minutos a 100rpm. A partir del

sobrenadante se tomó 0.25ml adicionando 0.25ml de DNS, la mezcla se llevó

a ebullición por 5 minutos, posteriormente se paso a hielo por 10 minutos y

por último se adicionaron 2.5ml de agua destilada realizando las lecturas de

absorbancia en el espectrofotómetro a 540nm, sensibilidad media registrando

los valores obtenidos para luego reemplazarlos en la curva patrón de DNS

(Anexo 2) (Adrado, et al, 2005).

5.9 Identificación Bioquímica La identificación bioquímica se realizó a los dos microorganismos que

finalmente fueron seleccionados para conformar el consorcio microbiano

celulolítico, por presentar la mejor actividad hidrolítica sobre el sustrato

evaluado. Las cepas fueron identificadas macroscópica y

microscópicamente, así mismo se realizó la evaluación del comportamiento

metabólico de acuerdo con el Manual de Bergey´s de Bacteriología

Sistemática.

27

5.10 Evaluación de azúcares fermentables en el extracto crudo

El extracto crudo correspondiente a la hora seis de fermentación en SV y

SVS al 10%(p/v), obtenido como resultado de la actividad hidrolítica del

consorcio celulolítico definitivo, fue evaluado mediante cromatografía líquida

en el laboratorio de Ingeniería Química de la Universidad Nacional de

Colombia, con el fin de determinar la concentración de azúcares reductores

presentes.

5.11 Análisis Estadístico El análisis estadístico de los datos obtenidos durante la prueba experimental

se realizó determinando inicialmente la distribución normal de los datos

mediante la prueba de Chapiro Wilk y como prueba paramétrica T student,

utilizando el programa estadístico SPSS versión 14.

28

6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 Aislamiento de microorganismos celulolíticos Los residuos vegetales frescos de crisantemo no permitieron el aislamiento

de microorganismos con actividad celulolítica, mientras que a partir de los

residuos vegetales en compostaje se logró el aislamiento de 8 cepas

bacterianas con dicha actividad (Tabla 3), esta diferencia probablemente se

debió a que en el proceso de compostaje la actividad metabólica microbiana

se incrementa, además, el tiempo de degradación transcurrido, la alta

temperatura y el pH alcalino permitieron el aislamiento de microorganismos

celulolíticos, pues dichas condiciones facilitan que bacterias esporógenas y

actinomicetes incrementen su actividad y por ende su población (Granados y

Valderrama, 2003).

La actividad celulolítica se evidenció mediante evaluación cualitativa con el

revelado de zonas de aclaramiento utilizando rojo congo al 1% (p/v) como ha

sido reportado por diferentes autores (Hendricks et al., 1995; Lu et al.,2005;

Zhang et al.,2006). El diámetro de los halos de hidrólisis generados no fue

establecido para la mayoría de las cepas, pues, se obtuvieron zonas de

aclaramiento que se difundieron en todo el medio; sin embargo, en el caso de

la cepas 2, 6 y 8 el diámetro del halo fue de 0.3, 0.2 y 0.35mm,

respectivamente (Tabla 4, figura 3-10), que comparados con el estudio

realizado por Lu et al. (2005), en el que los diámetros de hidrólisis de las

cepas aisladas de tallos de flores cultivadas en agar CMC e incubadas a una

temperatura de 30+/-2ºC durante 5 días, alcanzaron valores de 6.4cm,

demuestran una baja actividad celulolítica de las cepas 2, 6 y 8 en este

medio. Sin embargo, se debe resaltar que las demás cepas pueden poseer

una actividad superior a la reportada por este autor.

29

Tabla 3. Caracterización macro y microscópica de las cepas aisladas con actividad celulolítica en agar CMC 1%(p/v)

Cepa Morfología Gram Borde Color Textura

1 Bacilos esporulados Positivo Irregular Rosa pálido Cremosa

2 Bacilos esporulados Positivo Irregular Blanco Cremosa

3 Bacilos esporulados Negativo Irregular Incolora Cremosa

4 Bacilos esporulados Negativo Irregular Blanco Cremosa

5 Bacilos esporulados Positivo Irregular Blanco Cremosa

6 Bacilos esporulados Positivo Irregular Incolora Cremosa

7 Bacilos esporulados Positivo Irregular Incolora Cremosa

8 Bacilos esporulados Positivo Regular Beige Cremosa

Fuente: Autores

Tabla 4. Actividad celulolítica cualitativa de las cepas aisladas en agar CMC 1%(p/v)

Fuente: Autores

Cepa Figura Diámetro halo de hidrólisis

1 3 Indeterminado

2 4 0.3 mm

3 5 Indeterminado

4 6 Indeterminado

5 7 Indeterminado

6 8 0.2 mm

7 9 Indeterminado

8 10 0.35 mm

30

Fig 3 Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1% (p/v)

Fuente: Autores

Fig 4. Zonas de aclaramiento, cepa 2 en Agar CMC 1% (p/v)

Fuente: Autores

31

Fig 5. Zonas de aclaramiento, cepa 3 en Agar CMC 1% (p/v)

Fuente: Autores

Fig 6. Zonas de aclaramiento, cepa 4 en Agar CMC 1% (p/v)

Fuente: Autores

32

Fig 7. Zonas de aclaramiento, cepa 5 en Agar CMC 1% (p/v)

Fuente: Autores

Fig 8. Zonas de aclaramiento, cepa 6 en Agar CMC 1% (p/v)

Fuente: Autores

33

Fig 9. Zonas de aclaramiento, cepa 7 en Agar CMC 1% (p/v)

Fuente: Autores

Fig 10. Zonas de aclaramiento, cepa 8 en Agar CMC 1% (p/v)

Fuente: Autores

34

6.2 Pruebas de Antagonismo Con el fin de potencializar la actividad celulolítica de algunos de los

microorganismos aislados, se planteó la posibilidad de establecer un

consorcio microbiano para lo cual fue necesario realizar pruebas de

antagonismo que descartaran aquellas cepas que generaran algún tipo de

inhibición sobre las demás.

Durante las pruebas de antagonismo en agar CMC al 1%(p/v) la cepa 8 tuvo

la mayor actividad antagónica frente a las demás cepas evaluadas

generando el máximo halo de inhibición (7.5mm) frente a la cepa 1 (Figura

11), por lo que en un principio fue descartada como parte del consorcio

microbiano, debido a su antagonismo frente a las siete cepas restantes

(Tabla 5, Figura 11-18).

Fig 11 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1 Fig 12 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 2

Fuente: Autores Fuente: Autores

35

Fig 13 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 4 Fig 14 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 5

Fuente: Autores Fuente: Autores

Fig 15 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 6 Fig 16 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 7

Fuente: Autores Fuente: Autores

Fig 18 Resistencia cepa 8 Fuente: Autores

36

La mayor susceptibilidad se observó en las cepas 2, 5 y 6, cuyo crecimiento

se vió inhibido por las demás cepas, generándose halos con diámetros hasta

de 5.0mm (Tabla 5). Las pruebas de antagonismo también se realizaron en

concentraciones de CMC al 2%(p/v) y 3 %(p/v) con el fin de determinar si el

comportamiento antagónico y crecimiento de cada cepa se mantenía a pesar

del incremento en la concentración de la fuente de carbono y de alguna

manera evaluar la inhibición por sustrato de las cepas seleccionadas.

En la concentración de 2%(p/v) en agar CMC se confirmó la susceptibilidad

de las cepas 2, 5 y 6 (Tabla 6) pues los resultados fueron muy similares a los

obtenidos en agar CMC al 1%(p/v) por lo cual, quedaron descartadas para

ser parte del consorcio.

La actividad antagónica evidenciada durante el desarrollo de las pruebas en

CMC al 1%(p/v) y 2 %(p/v) demuestra que a pesar de tratarse de

microorganismos aislados de una misma fuente puede generarse inhibición

entre ellos, una posible explicación a este hecho es que existan diferencias

en la complejidad del sistema enzimático que les permite degradar el

sustrato, generando diferentes tasas de crecimiento y dando lugar a una

competencia por sustrato y espacio.

En los resultados obtenidos en agar CMC al 3%(p/v) las cepas 1, 3, 4 y 7, no

desarrollaron ningún efecto antagónico entre sí (Tabla 7), presentando un

crecimiento normal a dicha concentración, lo que demostró que estos

microorganismos contaban con una maquinaria enzimática adecuada para

degradar un sustrato celulósico, por lo cual, fueron escogidos inicialmente

para conformar el consorcio microbiano celulolítico.

37

Tabla 5. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v)

Cepas en siembra masiva Cepa Antagónica 1 2 3 4 5 6 7 8

1 N.D. - - - 0.6 a 0.5 a 0.5 a -

2 - N.D. - - 1.0 a - - -

3 - 5.0 a N.D. - 1.8 a 2.0 a - -

4 - 5.0 a - N.D. - 2.0 a - -

5 - 4.0 a - - N.D. 2.5 a - -

6 - 3.2 a - - - N.D. - -

7 - - - - 0.7 a 1.0 a N.D. -

8 7.5 a 4.4 a 3.8 a 3.1 a 5.0 a 3.8 a 2.9 a N.D.

Fuente: Autores

a Promedio de tres repeticiones del diámetro del halo de inhibición (mm)

( - ) No hubo inhibición

ND No se determina

Tabla 6. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 2%(p/v)

Cepa en siembra masiva Cepa Antagónica 2 5 6

1 - - 0.8 a

2 N.D. - -

3 3.0 a 1.5 a -

4 4.5 a - 2.5 a

5 3.5 a N.D. 3.2 a

6 - 2.8 a N.D.

7 - 1.5 a 4.0 a

Fuente: Autores

a Promedio de tres repeticiones del diámetro del halo de inhibición (mm)

(-) No hubo inhibición

N.D. No se determino

38

Tabla 7. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 3%(p/v)

Cepa en siembra masiva

Cepa Antagónica 1 3 4 7

1 N.D. - - -

3 - N.D. - -

4 - - N.D. -

7 - - - N.D.

Fuente: Autores

( - )No hubo inhibición

ND No se determina

6.3 Pretratamiento del Residuo Vegetal

Un pretratamiento eficiente reduce el contenido de lignina y de celulosa

cristalina e incrementa el área superficial para las reacciones enzimáticas.

Los pretratamientos pueden ser clasificados en métodos mecánicos,

químicos y físicos (Mtui y Nakamura, 2005).

En este estudio los residuos vegetales de crisantemo fueron sometidos a un

pretratamiento mecánico el cual involucró la reducción de tamaño del

material celulósico por cortado, molienda y pulverización con el fin de

modificar la estructura cristalina de la celulosa (figura 19), pues la cantidad

de lignina que contiene este residuo no hizo necesario someter el sustrato a

otro tipo de tratamiento ya que los resultados de los análisis físico-químicos

indicaron un muy bajo porcentaje de esta (Anexo 6).

39

Fig 19. Residuo vegetal de Crisantemo molido

Fuente: Autores

El pretratamiento mecánico utilizado permitió la obtención de un tamaño de

partícula muy pequeño (menor a 850μ) que además de favorecer el acceso

de las enzimas hidrolíticas del consorcio facilitó la preparación de los medios

de producción y el seguimiento de los montajes realizados. Krishna (1999)

reportó la importancia de esta condición pues afecta la relación área/

volumen y la densidad de empaquetamiento que determina la fracción de

sustrato inicialmente accesible al microorganismo. Esta relación se

incrementa cuando el tamaño de partícula disminuye determinando así el

espacio vacío que es ocupado por el aire, y por ende la tasa de transferencia

de oxigeno que afecta directamente el crecimiento de los microorganismos.

6.4 Evaluación preliminar de la actividad celulolítica de las cepas aisladas

Con las cepas seleccionadas (1, 3, 4 y 7) en las pruebas de antagonismo se

realizaron pruebas preliminares para evaluar la capacidad celulolítica de

cada una de ellas determinando la liberación de azúcares reductores por la

técnica de DNS (Miller,1959) y utilizando como sustrato CMC al 1%(p/v),

3%(p/v) y 5%(p/v), los resultados indicaron una actividad celulolítica nula en

todas las cepas, en las tres concentraciones y durante las veinte horas de

40

fermentación (Anexo 3, Tablas 8-11), lo cual indicó la falta de concordancia

entre la evaluación cualitativa y cuantitativa de actividad, una posible

explicación de este hecho es que en la prueba cualitativa, el microorganismo

permaneció en contacto con el sustrato durante 48 horas de incubación,

aumentando así la probabilidad de liberar las enzimas necesarias para

degradar el polisacárido; mientras que en la técnica de actividad cuantitativa

por DNS, el extracto enzimático entró en contacto con la celulosa con un

tiempo de reacción de 60 minutos que probablemente no fue suficiente para

que se diera una reacción enzima-sustrato completa.

Otro posible factor a tener en cuenta es que la cantidad de enzima presente

en el sobrenadante no haya sido suficiente para hidrolizar la celulosa o para

obtener cantidades de azúcares reductores que pudieran ser detectados por

esta técnica, a pesar de que la prueba se realizó en condiciones de pH y

temperatura óptimos para la detección de las enzimas encargadas de la

degradación del sustrato.

6.4.1 Evaluación preliminar de la actividad celulolítica del consorcio

Al evaluar la actividad celulolítica de las cepas 1, 3, 4 y 7 en consorcio, los

resultados obtenidos tanto en la fermentación realizada en caldo CMC al 1%

(p/v) como en caldo SVS al 10%(p/v), mostraron que la cantidad de azúcares

reductores y la actividad enzimática del consorcio en los dos sustratos fue

nula. (Anexo 3, tablas 12-14). Con base en estos resultados se decidió

buscar una segunda opción que incluyó la evaluación de la cepa 8 que había

sido inicialmente descartada en las pruebas de antagonismo, para lo cual,

se realizaron fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)

determinando azúcares reductores y actividad enzimática, alcanzándose

valores mayores a los obtenidos con el consorcio propuesto (Anexo 2, Tablas

15-16).

41

Con el objetivo de potencializar la actividad enzimática de la cepa 8, teniendo

en cuenta que fue un microorganismo “nativo” del sustrato vegetal a evaluar

y, que durante la realización de las pruebas de antagonismo se caracterizó

por inhibir a las demás cepas, probablemente por tener una alta tasa de

crecimiento que lo hacía competitivo por espacio y nutrientes y basados en

que el sinergismo de las enzimas celulolíticas hacen posible la hidrólisis de

celulosa a glucosa (Lu, et al., 2005; Malherbe y Cloete, 2002) se evaluó el

efecto sinérgico entre la cepa 8 y un actinomiceto con buena actividad

celulolítica cualitativa en CMC al 1%(p/v) (halos de hidrólisis de 2.14cm de

diámetro) aislado de suelo de un cultivo de Stevia durante el desarrollo del

trabajo de investigación: “Estandarización de la técnica de detección de β-

1,4 Glucanasas con el uso de sustratos fluorógenos en suelos provenientes

de cultivos de Stevia Rebaudiana bertoni” (Gutierrez, et al, 2006).

Para lo anterior se realizaron curvas de cada microorganismo por separado

en caldo SVS al 10%(p/v) con el fin de evaluar la actividad enzimática sobre

dicho sustrato. Los dos microorganismos presentaron una degradación del

sustrato vegetal de crisantemo, lo que se evidenció con la cuantificación de

azúcares reductores y la actividad enzimática obtenida (Anexo 2, Tablas 15-

18) (Figura 20-23).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

12 14 16 18 20 22 24

Tiempo (h)

Azúc

ares

redu

ctor

es (g

/L)

Fig 20 Azúcares reductores en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8) en SVS al 10%(p/v)

42

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

12 14 16 18 20 22 24

Tiempo (h)

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a (U

C)

UC pH 7 37ºC UC pH 5 50ºC

Fig 21. Actividad enzimática en el cultivo de Bacillus sp. (Cepa 8) en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC

Fig 22. Azúcares reductores en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

12 14 16 18 20 22 24

Tiempo (h)

Azúc

ares

red

ucto

res

(g/L

)

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

12 14 16 18 20 22 24

Activ

idad

enz

imát

ica

(UC)

Tiempo (h)

UC pH 7 37ºC UC pH 5 50ºC

Fig 23. Actividad enzimática en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC

43

6.5 Identificación Bioquímica

El perfil bioquímico de la cepa 8 (Figura 24) indicó su capacidad para

asimilar la glucosa como fuente de carbono y la subsecuente producción de

ácidos, así mismo redujo sulfatos y nitratos, produjo la enzima catalasa y

mostró crecimiento en concentración de NaCl al 3%(p/v) (Tabla 24).

Teniendo en cuenta el perfil bioquímico obtenido según Bergey’s y que al

realizar la coloración de Gram se observaron bacilos Gram positivos

esporulados, la cepa 8 fue identificada como Bacillus sp.

.

Fig. 24 Características macroscópicas

cepa 8 en agar CMC 1%(p/v) Fuente: Autores

Tabla 24. Identificación Bioquímica cepa 8

Fuente: Autores

Característica Resultados (Cepa 8)

Motilidad Negativo

Reducción de sulfato a sulfito Negativo

Reducción de nitratos a nitritos Positivo

Oxidasa Negativo

Catalasa Positivo

Producción de ácido Positivo s a partir de glucosa

Crecimiento en concentració Positivo n de NaCl 3% (p/v)

Producción endosporas Positivo

44

La identificación mediante observación de

las características macro y microscópicas. En agar avena (Anexo 1) dicho

microorga io aéreo abundante inicia lanco y

con el transcurso del tiempo de color café, las colonias se observaron

pequeñas, de bord ar y aspecto pulverulento (Fig 25), al reverso de la

caja se observó la producción de un pigmento difusible de c

os lo húmedo. Micro mente el

microorganismo se tiñó como Gram positivo, en cuanto al número y

esporas –otra característica importante para distinguir los

del Actinomiceto se llevó a cabo

nismo desarrolló un micel lmente b

e irregul

olor amarillo

curo, generó un olor característico a sue scópica

disposición de

géneros de Actinomicetes- se presentaron esporas ovoides en cadenas

espiraladas y rectas (Fig 26).

Fig 25 Caract

S

erísticas macroscópicas Fig 26 Características microscópicas

treptomyces sp. en agar avena 5 %(p/v) Streptomyces sp.

Fuente: Autores Fuente: Autores

Como parte complementaria de la identificación se realizó el perfil bioquímico

del actino. (Tabla 25). El microorganismo hidrolizó galactosa, fructosa,

sucrosa, arabinosa, rafinosa, xilosa, celobiosa, ramnosa, esculina e inositol,

así mismo se evidenció la producción de la enzima catalasa y la reducción de

nitratos a nitritos.

45

Tabla 25. Identificación Bioquímica Actinomiceto

Característica Resultados (Actino)

Galactosa Positivo Fructosa Positivo Sucrosa Positivo

Arabinosa Positivo Rafinosa Positivo

Xilosa Positivo Urea Negativo

Celobiosa Positivo Ramnosa Positivo Melobiosa Negativo

Inositol Positivo Manitol Negativo

Fenilalanina Negativo Triptofano Negativo Esculina Positivo

Reducción de nitratos a nitritos Positivo Catalasa positivo Gelatina Negativo

Fuente: Autore

Con base en las características macro y microscópicas la cepa fue

identificada como presuntiva de Streptomyces sp. Lo que se corroboró con

los resultados obtenidos a partir del perfil bioquí l microorganismo

(Holt, et al, 2000).

Tanto Bacillus s Streptomyces sp. han sido reportados como

microorganismos con alta actividad celulolítica. Muchas especies del género

uelo y en la materia orgánica en

egradación, por lo que se considera que juegan un papel importante en la

y agua en la región amazónica (Heck et al, 2002), en

siduos de banano (Krishna,1999), y en fibras de palma (Apun et al, 2000),

s

mico de

p. como

Bacillus están normalmente presentes en el s

d

biodegradación y bioconversión de componentes de alto peso molecular. Se

ha realizado el aislamiento de Bacillus licheniformis a partir de residuos

vegetales de flores en compostaje (Lu et al, 2005) y Bacillus subtilis en

muestras de suelo

re

46

en los que dicho género bacteriano ha demostrado un alto potencial

celulolítico.

Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte

importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la

degradación y recirculación de biopolímeros como la celulosa, la

hemicelulosa y la lignina (Semedo et al, 2004). Los estudios realizados con

este microorganismo en cuanto a su capacidad hidrolítica en materiales

lignocelulósicos han reportado buenos resultados, como es el caso de

Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados de

muestras de suelo (Semedo et al, 2004; Grigorevski et al, 2005; Li, 1997).

amírez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celulolítcos

urante las curvas realizadas con el consorcio microbiano en SV y SVS al

y

.849g/L, respectivamente, en la hora 18 de fermentación, (Anexo 5, Tablas

cromatografía liquida realizada a los sobrenadantes obtenidos en la hora seis

R

entre los cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y además

mostró los más altos niveles de actividad enzimática en el estudio.

6.6 Utilización del sustrato vegetal por parte del consorcio celulolítico Teniendo en cuenta la actividad hidrolítica de Streptomyces sp. y Bacillus sp

en el residuo vegetal a evaluar (Anexo 4, Tablas 16 y 18 )(Figura 20-23); y

con el objetivo de potencializar la degradación del sustrato por una posible

acción sinérgica entre las enzimas de cada cepa, se realizaron curvas en las

que los microorganismos actuaron en consorcio.

D

5% (p/v) se obtuvieron valores máximos de azúcares reductores de 0.624

0

20 y 21) (Figura 27) mientras que, en SV y SVS al 10%(p/v) se alcanzaron

valores de 1.665 y 1.474g/L, (Anexo 5, Tablas 22 y 23) (Figura 28)

respectivamente, en la hora seis de fermentación. Los resultados de la

47

de las fermentaciones en los medios al 10%(p/v) mostraron la presencia de

glucosa y fructosa como azúcares reductores. En el medio SV la glucosa se

ncontró en una concentración de 0.475g/L, mientras que, en el medio SVS e

además de la glucosa en una concentración de 0.391g/L se detecto fructosa

en una concentración de 1.417 g/L (Anexo 7) estos resultados permitieron

inferir en primer lugar que el sustrato celulósico a concentración de 10%(p/v)

estimuló la actividad hidrolítica del consorcio microbiano, generándose

diferencias significativas (p<0.05) (Anexo 8) con la actividad hidrolítica al

5%(p/v), en segundo lugar que la adición de sales al medio de producción no

generó diferencias significativas (p>0.05) (Anexo 8) en la liberación de

azúcares reductores respecto al medio sin suplemento, como habría de

esperarse, pues los elementos traza en un medio de cultivo, juegan un papel

importante en la síntesis de ácidos nucleicos, fosfolípidos, pared celular,

enzimas y otros constituyentes celulares, lo cual incrementa la biomasa

celular responsable de la hidrólisis del sustrato vegetal. Esto demuestra que

el residuo vegetal de crisantemo provee una fuente de carbono, nitrógeno y

minerales que suplen los requerimientos nutricionales necesarios para el

crecimiento y la actividad metabólica de los microorganismos evaluados; lo

que puede corroborarse con los análisis fisicoquímicos realizados al sustrato

(Anexo 6), la composición de este residuo se presenta como una ventaja

para su utilización, pues, no se hace necesario suplementarlo con la adición

de compuestos químicos que generarían un costo adicional.

Finalmente, como pudo verse en los resultados obtenidos en la

cromatografía líquida se corroboró que la suplementación del medio sustrato

vegetal no generó un incremento en la conversión de celulosa a glucosa, por

el contrario la concentración de este azúcar fue mayor en el medio sin

suplemento.

48

Sin embargo, se esperaba una mayor concentración de azúcares reductores

teniendo en cuenta que el residuo vegetal de crisantemo contenía un alto

orcentaje de celulosa (65.3%) de acuerdo al análisis fisicoquímico realizado p

(Anexo 6).

00,10,20,3

0 6 12 16 18 20 22

Tiempo (h)

Azúc

ares

0,40,50,6

redu

c

0,70,80,9

tore

s (g

/L)

SV 5% (p/v) SVS 5% (p/v)

Figura 27. Azúcares reductores en el cultivo del consorcio ( Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)

Figura 28. Azúcares reductores en e cultivo del consorcio ( Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)

Por otro lado, al comparar la concentración de azúcares reductores obtenidos

en las pruebas preliminares en las que Bacillus sp y Streptomyces sp.

actuaron por separado en la degradación de SVS al 10% (p/v) (Anexo

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

0 6 12 16 18 20 22 25

Tiempo (h)

Azú

care

s re

duct

ores

(g/L

)

SV 10%(p/v) SVS 10%(p/v)

l

49

4,Tablas 16 y 18) con los obtenidos con el consorcio (Bacillus sp.-

Streptomyces sp.) en el mismo sustrato y a la misma concentración (Anexo 4

y 5,Tablas 19 y 23), demuestran que se estableció un sinergismo en el que

probablemente se logró una complementariedad entre las enzimas

celulolíticas que favorecieron la degradación del sustrato con el consecuente

aumento en la liberación de azúcares reductores.

6.6.1. Condiciones de pH y Temperatura durante la Fermentación Durante pH y la

temperatura se mantuvieron en un valor cercano a 6.0 y 35ºC,

las curvas d alizadas, el e degradación del residuo vegetal re

respectivamente (Figura 29 y 30). Krishna (1999), reportó que el pH y la

temperatura de la fermentación tienen una gran influencia en la producción

de enzimas celulolíticas, en su investigación la mayor producción se alcanzó

a un pH de 7.0 manteniendo una temperatura constante de 35ºC, sin

embargo, el autor reporta otros estudios donde a un pH de 6.0 se da la

mayor liberación enzimática, lo que permite afirmar que tanto el pH como la

temperatura de operación en esta investigación favorecieron la hidrólisis del

residuo vegetal.

66,1

6,36,2

5,55,65,75,85,9

0 6 12 16 18 20 22

Tiempo (h)

pH

SV 5% (p/v) SVS 5% (p/v)

Figura 29 Variación de pH en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)

50

5,4

5,6

5,8

6

6,2

6,4

6,6

pH

0 6 12 16 18 20 22 25

Tiempo (h)

SV 10% (p/v) SVS 10% (p/v)

Figura 30 Variación de pH en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. Y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)

6.7 Actividad Enzimática y liberación de azúcares reductores a partir del residuo vegetal de Crisantemo.

el más SV al 10%

(p/v) en la hora 6, pH 7 37ºC con un valor de 0.1056 UC (UC definida como

la cantidad de enzima capaz de liberar un micromol de glucosa por minuto)

(Anexo 5 Tablas 22 y 23) (Figura 31) valor que coincidió con la mayor

concentración de azúcares en el mismo sustrato. Sin embargo, no existieron

diferencias significativas (p>0.05) en la concentración de celulasas liberadas

en los medios SV y SVS en las concentraciones evaluadas.

El niv alto de celulasas se produjo en la fermentación con

0

0,02

0,04

Act

ivid

ad e

n

0,06

0 6 12 16 18 20 22 25

zim

átic

a

0,08

0,1

0,12

(UC)

Tiempo (h)

UC SV 10% (p/v) UC SVS 10% (p/V)

Figura 31. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v),bajo condiciones de pH7 37ºC

51

Por otro lado, la actividad enzimática a pH ácido y una temperatura de 50ºC

(Figuras 32 y 33) fue menor, demostrando que dicha actividad varía de

acuerdo a las condiciones de pH y la temperatura en la que es evaluada

(p<0.05). Una explicación a este hecho puede ser que en condiciones

aturales la actividad hidrolítica de la celulosa se ve afectada cuando el pH

del suelo es ácido, como es el caso de Cellulomonas sp. cuyo

comportamiento metabólico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd

et al.,2002)

n

00 6 12 16 18 20 22 25

Tiempo (h)

Ac

0,02

tivi

0,04

dad

e

0,06

0,08

0,1

0,12

nzim

átic

a (U

C)

UC pH7 37ºC UC pH 5 50ºC

Figura 32. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV al 10%(p/v),bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC

00,010,020,030,040,050,060,070,080,09

0 6 12 16 18 20 22 25

Tiempo (h)

Activ

idad

enz

imát

ica

(UC

)

UC pH7 37ºC UC pH5 50ºC

Figura 33. Actividad enzimática en el cultivo del consorcio(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SVS al 10%(p/v), bajo condiciones de pH7 37ºC y pH5 50ºC

52

La actividad enzimática del consorcio evaluada en SV y SVS en

concentraciones de 5%(p/v) y 10%(p/v), no es comparable con los resultados

reportados por otros estudios en los que también se ha realizado la

evaluación de microorganismos celulolíticos en residuos celulósicos (Lu et al

2005), (Krishna, 1999), debido a que el material celulósico difiere en sus

características físico-químicas como son: el tamaño y la superficie de las

fibrillas, en las

regio ción

stereoscópica y la rigidez de las nidades de celulosa, el grado de

polimerización de la celulosa, la naturaleza de los componentes con los que

la celulosa esta asociada, la naturaleza, concentración y distribución de

grupos sustituyentes (Malherbe y Cloete, 2002; Petre et al., 1999; Zhang et

al., 2006). Dichos parámetros condicionan drásticamente la habilidad de los

microorganismos celulolíticos para degradar este tipo de sustratos, lo cual

explica que el comportamiento metabólico sea específico y por ende, la

acumulación del producto de hidrólisis difiera de un ensayo a otro.

s de

los cambios en las características del sustrato durante la hidrólisis han sido

imulados por modelos matemáticos aplicados a una variedad de materiales

el espacio entre las microfibrillas y las moléculas de celulosa

nes amorfas, el grado de cristalinidad de la celulosa, la conforma

e u

Por otro lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargada

hidrolizar la celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas ) y

s

lignocelulósicos teniendo en cuenta dos propiedades importantes: la fracción

de enlaces β-glucosidicos accesibles a las celulasas y el grado de

polimerización, dicho modelo sugiere que es casi imposible la predicción del

funcionamiento hidrolítico de una mezcla de celulasas de un sustrato a otro

debido a variaciones como la concentración de celulasas, la proporción

endo/exocelulasas, el tiempo de reacción y las características del sustrato

(Zhang et al., 2006). De esta manera, la actividad celulolítica de los

53

microorganismos va a ser específica para cada sustrato celulósico a evaluar,

como ha sido reportado en diferentes estudios, Lu et al (2005) obtuvo 7.9 y

28UC en una fermentación de residuos de tallos de flores con Bacillus

pasteuri y Bacillus cereus, dichos microorganismos crecieron en un medio

que contenía sulfato, fosfato y nitrato entre otros componentes, durante 7

días a 35ºC y un pH de 6.8-7.2; Krishna (1999) reportó 3.30UC a partir de

residuos de banano utilizando Bacillus subtilis durante 72 horas de

fermentación, pH7, 35ºC, y en este estudio la mayor actividad fue de 0.1056

UC a partir de residuos vegetales de crisantemo.

(En todos los casos la actividad celulolítica fue definida como la cantidad de

o de polimerización (Zhang

enzima necesaria para producir una micromol de glucosa por minuto).

Durante las pruebas realizadas se observaron marcadas diferencias entre la

actividad celulolítica cualitativa y cuantitativa evaluada, lo cual puede estar

directamente relacionado con el tipo de sustrato en el que se realizaron

dichas pruebas, pues, según Zhang et al.,(2006), es necesario tener en

cuenta la solubilidad o insolubilidad en agua del sustrato que se quiere

evaluar ya que determina los parámetros para realizar el screening y

determinación de la actividad enzimática de microorganismos con capacidad

celulolítica.

En esta investigación el screening se realizó en agar CMC al 1%(p/v)

(sustrato celulósico soluble), posteriormente la inducción de enzimas en

residuos vegetales de crisantemo (sustrato insoluble) y la cuantificación de

dichas enzimas fue llevada a cabo en CMC al 1%(p/v) buffer fosfato y buffer

ácido cítrico (pH7 y 5). La utilización de sustratos con diferente tipo de

solubilidad probablemente influyó en la variación de los resultados, pues la

relación existente entre la tasa de hidrólisis obtenida en sustratos solubles e

insolubles no es clara, principalmente porque existen diferencias en la

accesibilidad de las enzimas al sustrato y el grad

54

et al., 2006), lo cual explica la obtención de halos de diámetro incuantificable

y su baja correlación con los niveles de azúcares reductores obtenidos y la

actividad enzimática evaluada tanto para las cepas inicialmente aisladas

a enzima fue evaluada en celulosa insoluble.

como para el consorcio. Este mismo autor concluyó que los datos obtenidos

en la hidrólisis de sustratos solubles no pueden ser comparados con la

hidrólisis de sustratos insolubles. Un claro ejemplo de este concepto es el

reportado por Himmel et al.,(1999) quien en su estudio obtuvo una actividad

específica de endoglucanasas de Thermobifida fusca diez veces más alta

que la actividad de la endoglucanasa de Trichoderma reesei al ser evaluada

en CMC (sustrato soluble). Sin embargo, esta actividad no se mantuvo

cuando dich

Otro de los factores que pudo haber influido en la variación de los resultados

es el tiempo de fermentación y el de reacción enzima-sustrato durante las

pruebas de actividad enzimática. Teniendo en cuenta que la lignocelulosa

pretratada utilizada para evaluar la actividad enzimática de preparaciones

comerciales de celulasas, requiere un rango de tiempo que va de minutos a

horas para que inicie la hidrólisis y hasta varios días para obtener una

digestibilidad final (conversión de la celulosa) (Zhang et al, 2006), hace

pensar que probablemente las evaluaciones realizadas requerían un mayor

tiempo de reacción que diera lugar a la obtención de mejores resultados.

Finalmente se puede considerar la importancia de continuar realizando

screening de microorganismos celulolíticos pues la utilización de estos se

convierte en una alternativa viable para el tratamiento de residuos

celulósicos, pues tan solo se ha identificado y evaluado menos del 1% del

potencial de dichos microorganismos presentes en la biosfera (Howard et al,

2003)

55

7. CONCLUSIONES

Se logró el aislamiento de ocho cepas bacterianas con actividad

ar la actividad enzimática de los microorganismos evaluados por lo

ual no se hace necesario suplementar el residuo con sales

celulolítica en CMC 1%(p/v) a partir de residuos vegetales de crisantemo en

compostaje

Las pruebas de antagonismo en CMC (1%(p/v), 2% (p/v) y 3%(p/v))

permitieron seleccionar los microorganismos capaces de actuar en consorcio

en la degradación del residuo vegetal

Las enzimas de Bacillus sp. y Streptomyces sp. actuaron sinérgicamente

en la degradación del residuo vegetal

La mayor concentración de azúcares reductores y actividad enzimática se

obtuvieron en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV

10% (p/v)

El residuo vegetal de crisantemo aportó los nutrientes necesarios para

estimul

c

56

8. RECOMENDACIONES

nismos celulolíticos termófilos que

uedan ser aprovechados en el tratamiento de residuos agroindustriales

empleando sustratos de la misma naturaleza de donde fueron

islados

dio

Tener en cuenta el tamaño de partícula del sustrato vegetal, pues,

puede generar inconvenientes en la manipulación y seguimiento de las

fermentaciones

Establecer el tipo de interacción que ocurre entre Bacillus sp. y

treptomyces sp., durante el desarrollo de la biomasa

Evaluar actividad celulolítica cualitativa y cuantitativa en tiempos iguales

Determinar el tipo de e roorganismo, evaluando

la actividad de cada una de estas en sustratos específicos

ciones entre 5%(p/v) y 10%(p/v)

Realizar screening de microorga

p

Realizar el aislamiento y evaluación de microorganismos con actividad

celulolítica,

a

Evaluar la actividad hidrolítica de los microorganismos celulolíticos en

rangos de tiempo más amplios a los empleados en este estu

S

nzimas que libera cada mic

Evaluar el sustrato fermentable obtenido, en la producción de etanol

Lleva a cabo la determinación de azúcares reductores y evaluación de la

actividad enzimática utilizando residuo vegetal de crisantemo en

concentra

57

9. LITERATURA CITADA

• Adrado, B; Chpeborska, P; Galbe, M; Zacchi, G. 2005. Ethanol production

de Tocancipá.<http:/www.alcaldiatocancipa.gov.co>

Editor, S.A. México. Pág. 162-177

Apun, K; Jong, B; Salleh, M. 2000. Screening and isolation of a cellulolytic Bacillus from sago pith waste. J. Gen. Appl. Microbiol. 4:263-

•

Aubert, J.1988.Biochemistry and Genetics of Cellulose degradation. cademic press. USA. Pág 11.

Ayala, S.; Sánchez, D. 2001 Caracterización y evaluación de la actividad ectinolitica y celulolítica de microorganismos aislados a partir de desechos

ara el análisis de las ciencias de la alud. Ed. Limusa Wiley. México, D.F.. Pag. 41-46,161,321-327.

• Dávila, D; López, L; P n de diferentes soportes para la preformulación de un producto elerador de compostaje.

. 1986. Industrialización de la Glucosa en Colombia. Tesis de

from non-starch carbohydrate of wheat bran. Bioresource Technology. 96:843-850.

• Alcaldía [Consulta 27 Nov. 2005] • Alexander, M. 1980 .Introducción a la ,microbiología del suelo. AGT

•and amylolytic 267. Asocolflores. Florverde, el programa social y ambiental de la floricultura

Colombiana. Revista Asocolflores. 61:23 •A •pcítricos. Tesis de Pregrado. Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. • Daniel, W. 2002. Bioestadística, Base ps

edroza, A. 2002 Evaluació termofílico ac

Tesis de Pregrado. Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá • For ro, MePregrado. Facultad de Ingeniería Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. • Gauze, G. 1967.Conferencia de Antibióticos elaborados por hongos. La Habana. Cuba. Editorial Universitaria La Habana.

58

• Granados, L; Valderrama, J. 2003. Evaluación de la Actividad Proteolítica y Amilolítica de Actinomycetes termofílicos aislados a partir de pilas de compost. Tesis de Pregrado. Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias.

ontificia Universidad Javeriana. Bogotá

. 2003. Determinación de actividad elulolítica y establecimiento de un consorcio bacteriano aislado de diferentes

Javeriana. Facultad de ciencias. Bogotá.

ógenos en uelos provenientes de cultivos de Stevia Rebaudiana bertoni”. Tesis de

02. Cellulase and Xylanase production by olated amazon Bacillus strains using soybean industrial residue based solid-

H. 1997. Plant Biochemistry and Molecular Biology Oxford niversity Press Pág 7.

A New Solid Medium for numerating Cellulose-Utilizing Bacteria in Soil. Appl. Environ. Microbiol. 61:

nol 10:358-364

Howard, R ; Abotsi, E; Rensburg, J; Howard,S. Lignocellulose

P • Guevara, C; Paez, A; Zambnrano, Mcregiones y sustratos del país. Tesis de Pregrado. Carrera de Microbiología Industrial. Pontificia Universidad • Grigorevski, A; Nascimento, R;Bonb, E; Coelho, R. 2005. Streptomyces drozdowiczii cellulase production using agro-industrial by-products and its potential use in the detergent and textile industries. Enzyme and Microbial Technology. 37: 272–277. • Gutierrez, V y Pinzón, A. 2006. “Estandarización de la técnica de detección de β- 1,4 Glucanasas con el uso de sustratos fluorsPregrado. Carrera de Microbiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Bogotá. • Heck,J; Hertz, P; Ayub, M.20isstate cultivation. Brazilian journal of microbiology. 33: 213-218 • Heldt, U • Hendricks, C. Doyle, J and Hugley, B. 1995. E2016-2019. • Himmel, M; Ruth, M; Wyman, C.1999. Cellulase for commodity products from cellulosic biomass. Curr Opin Biotech • Holt, J; Krieg, N; Sneath, P; Staley, J; Williams, S. 2000.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Novena Edición. Lippincott Williams & Wilkins. Pág. 605-607. •Biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African Journal of Biotechnology. 2: 602-619

59

Krishna, C. 1999. Production of bacterial cellulases by solid state

d

51: 353-360.

cellulose-binding β-glucosidase from cellulose –egrading cultures of Phanaerochaete chrysosporium. Appl. Environ.

Weimer, P., Zyl, H., Pretorius, I. 2002. Microbial cellulose tilization : Fundamentals and Biotechnology. Microbiology and Molecular

Lynd, L; Van Zyl, W; MacBride, J; Laser, M.2005. Consolidated

Malherbe, S y Cloete, T. E. 2002. Lignocellulose Biodegradation:

Mansfield, S; Mooney, C y Saddler, J. 1999. Substrate and Enzime

Miller, G.1959.Use of Dinitrosalisyc Acid Reagent for determination of

arcía, M.; Menes,L.;Gutierrez, M.; Polledo,F. 2000. omisión Internacional de especificaciones microbiologicas alimentarias.

elected dumping sites in Dark es Salaam, Tanzania. Biodegradation.

•bioprocessing of banana wastes. Bioresource Technology. 69:231-239. • Li, X. 1997. Streptomyces cellulolyticus sp. nov., a New Cellulolytic Member of the Genus Streptomyces.International journal of systematic bacteriology. 47: 443-445 • Lu, W. Wang, H. Yang, S. Wang, Z. Nie, Y. 2005. Isolation ancharacterization of mesophilic cellulose-degrading bacteria from flower stalks-vegetable waste co-composting system. J.Gen. Appl. Microbiol. • Lymar, E. Li, B. And Renganathan, V. 1995. Purification and Characterization of a dMicrobial. 8 : 2976-2980. • Lynd, L.,uBiology Reviews. 16: 577-583. •bioprocessing of cellulosic on celulosic biomass: an update. Curr Opin Biotechnol. 66:506-577 •Fundamentals and applications. Re/Views in Environmental Science & Bio/Technology 1:105-114. •Characteristics that Limit Cellulose Hydrolysis. Biotechnol. Prog. 15:804-816 •reducing sugar. Analytical chemistry. 31:426-428 • Moreno, B.; Diez, V.; GCICMFS. Editorial Acribia. Zaragoza (España). Pag. 125-126 • Mtui, G y Nakamura, Y. 2005. Bioconversion of lignocellulosic waste froms16:493-499.

60

• Páez, A. Castro,D. Martinez, M. M , Pedroza, A. 2001. El manejo de los

vedo, B.; Gomez, D. 2003. Manual de aboratorio Introducción a la Biotecnología. Departamento de Microbiología.

Manual de Laboratorio cnología de las Fermentaciones. Departamento de Microbiología. Facultad

1996. Aislamiento y caracterización de cepas icrobianas para un proceso de compostaje de desechos de la palma de

. Universidad Nacional de olombia. Facultad de Ciencias. Bogotá

nd fungal cells mobilized in radiopolymerized hydrogels. Resourses, Conservation and

oyola, T; De la Torre, M. 1993. Interactions in a mixed cultura omponed of Cellulomonas flavigena and Xanthomonas sp. Growing in

. Sociedad eroamericana de Biotecnología. 11:55-59

y determinación de la ctividad celulolítica. Rev. Perú. Biol. 10: 67-77.

utica. Universidad Nacional de olombia. Facultad de Ciencias. Bogotá

residuos sólidos para la nutrición de suelos. Agricultura de las Américas . 301: 2630. • Pedroza, A.; Matiz, A.; QueLFacultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Pag 63. • Pedroza, A.; Matiz, A.; Quevedo, B.2003. tede Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Pag 5. • Peña, A. y Rivera, G.maceite. Tesis de Pregrado. Carrera de Bacteriología. Pontificia Universidad Javeriana . Facultad de Ciencias. Bogotá . • Pérez, J. 1996. Utilización de residuos florales en la elaboración de papel manual. Tesis de Pregrado. Carrera de QuímicaC • Petre, M; Zahareña, G; Adrian, P; Gheorghiu, E. 1999. Biodegradation and Bioconversion of cellulose wastes using bacterial aimRecycling 27:309-332 • Ponce- Nccontinuous cultura on sugar cane bagasse.Appl Microbial Biotechnol. 40: 531-534 • Poutou, R.; Amador, E.; Candelario,M. 1994. Banco de células primario (BCP): Caracterización y papel en la producción de proteínas recombinantes. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología AplicadaIb • Ramirez, P; Coha, J. 2003. Degradación enzimática de celulosa por actinomicetos termófilos: Aislamiento, caracterizacióna • Sánchez, G; Zuluaga, M. 1999. Propuesta y Elaboración de un prototipo de material para compresión directa a base de Celulosa fibra. Tesis de Pregrado. Carrera de Química FarmacéC

61

• Santana, M; Vasquez, C. 2002. Evaluación de cepas de Azotobacter sp. Y e bacterias solubilizadoras de fosfato (BFS), como biofertilizante mixto en

, C; Lindares, A; Duarte, G; Nascimento, R; Rosado, ; Pinheiro, M; Margis, R; Silva, K; Alviano, C; Manfio, G; Soares, M;

Mansfield, S; Mooney, C; Saddler, N. 1999. Substrate and Enzyme

Ten, L; Im, W; Kim, M; Kang, M; Lee, S. 2004. Development of a plate chnique for screening of Polisaccharide-degrading microorganism by using mixture of insoluble chromogenic substrates . J Microbiol Methods . 56:375-

005]

p. enzymes involved in degradation f plant cell wall polysaccharides. Microbiology and Molecular Biology

dun cultivo de crisantemo (Crysanthemum morifolium var. Regal suerte). Tesis de pregrado. Pontificia Universidad Javeriana.Facultad de Ciencias. Bogotá. • Semedo, L; GomesALindares, L; Coelho, R. 2004. Streptomyces drozdowiczii sp. nov., a novel cellulolytic streptomycete from soil in Brazi. Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54:1323-1328 •Characteristics that Limit Cellulose Hydrolysis. Biotechnol. Prog. 15: 804-816 • Stace, C. 2003. Plant taxonomy and biosistematics. Quinta edición. Cambridge University Press. Pag. 163 • Teather, R ; Wood, P.1982. Use of congo red – polysaccharide interaction in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Environ. Microbiol. 43: 777-780 • Téllez, A; Paba, J. 2003.Producción de Etanol a partir de residuos Amiláceos y Lignocelulósicos. Trabajo de Investigación. Universidad Autónoma de Bucaramanga (UNAB) •tea382 • Universidad Nacional de Colombia Comunicaciones de divulgación cultural.<http://www.unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm> [Consulta 27 Nov.2 • Vidiale, H. 1983. Producción de Flores y Plantas Ornamentales. Madrid, Mundi-Prensa 260 pag. 42-69. • Vries, R., Viser, J. 2002. Aspergillus soReviews. 65: 497-522.

62

• Zhang, Y. Himmel, M. Mielenz, J. 2006. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances.

4: 452-481. 2

63

ANEXO 1

Medios de cultivo y reactivos

MEDIO DE CULTIVO COMPOSICIÓN (g/L) Agar CMC 1%(p/v)

Carboximetilcelulosa Extracto de levadura

Peptona universal Sulfato de amonio Cloruro de calcio

Fosfato monobásico de potasio Fosfato dibásico de potasio

Agar-agar Ajustar pH 7.0+/-2

10 2.5 2.5 0.5 0.5 0.1 0.1 15

Caldo Sustrato vegetal (SV) 5%(p/v) ó 10%(p/v)

Residuo vegetal de Crisantemo Extracto de levadura

Peptona universal Ajustar pH 7.0+/-2

50-100 2.5 2.5

Caldo Sustrato vegetal suplementado (SVS) 5%(p/v) ó 10%(p/v)

Residuo vegetal de Crisantemo Extracto de levadura

Peptona universal Sulfato de amonio Cloruro de calcio

Fosfato monobásico de potasio Fosfato dibásico de potasio

Agar-agar Ajustar pH 7.0+/-2

50-100 2.5 2.5 0.5 0.5 0.1 0.1 15

Agar avena Avena molida NaCl

Agar-agar

50 10 15

REACTIVOS COMPOSICIÓN (g/L) Rojo congo 1%(p/v) go 10 Rojo con

NaCl 0.1 M Nacl 200

64

Prepar

1. P fosfato 0.1 M

Pesar 3.5 g de Na2 e agua des a Pesar 3.45 g de NaH l de agua d ada Mezclar lentamente las dos soluciones

7+/- 0.2 en balón aforado tar 500 ml

2. Preparación de Carboximetilcelu v) en buffer fosfa M

.0g de carboximetilce y disolver lentamente en 50ml de buffer fosfato 0.1M pH7

Calentar la solución en horno microondas por un minuto Ajustar pH a 7 +/-2 Enrasar a 100ml con el buffer fosfato 0.1M pH7 en balón

volumétrico

Preparación buffer ácido cítrico pH 5

1. Preparación buffer ácido cítrico 0.1M pH5

Pesar 5.37g de Na2PH4.7H2 Pesar 2.10g de ácido cítrico Pesar 1g de carboximetilcelulosa Disolver todos los componentes en 100 ml de agua destilada Ajustar a pH5

ación buffer fosfato pH 7

reparación buffer pH 7

HPO4 y disolver en 100 ml d tilad2PO4 y disolver en 100 m estil

Ajustar pH Enrasar hast plea com

losa al 1.0%(p/ to 0.1

Pesar 1 lulosa

O

65

ANEXO 2

rminación de azúcares reductores

por e NS)

re

Dete

l método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (D

P paración del reactivo de DNS Depos e agua destilada, adicionar 1.6g de Hidróx te agitación continua en plancha magné riormente adicionar lentamente 43.8g pleto. Recub 3,5-

initros con agua destilada hasta 100ml en balón aforado. eje en agitación toda noche en un frasco oscuro

reparación de la solución stock de glucosa 2g/L

itar en un beaker de 250ml, 50ml danido de sodio y disolver medi

tica a temperatura ambiente. Postede Tartrato de sodio y potasio hasta que se disuelva por com

papel kraft y agregar lentamente 1g de ácidorir el beaker con alicílico. Completed

D P

ese 2g de glucosa anhídrida y disuelva en 500ml de agua destilada tilizando un balón volumétrico de 1000ml, homogenice y complete hasta 00ml con agua destilada

reparación de las soluciones de concentración conocida 0.5- 2g/L

Pu1 P

mpleando la formula V1*C1 = V2*C2. Se preparan seis soluciones que ngan un volumen final de 2ml

Ete

Concentración g/L Solución concentrada de Agua destilada glucosa en ml ml

0.5 0.5 1.5 0.7 0.7 1.3 1 1 1

1.5 1.5 0.5 1.7 1.7 0.3 2 2 0

66

Curva patrón de glucosa Nº 1

Curva patrón de glucosa Nº 2

Concentración g/L

Absorbancia 540nm

0.5 0.271

0.7 0.353

1 0.484

1.5 0.774

1.7 0.827

2 0.995

Concentr acióng/L

Absorbancia 540nm

0.5

0.247

0.7

0.36

1

0.529

1.5

0.746

Curva patrón de cosa (g/L) Nº2

y = 0,4981x + 0,098R2 = 0,995

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0,5 0,7 1 1,5

Concentración glucosa (g/L)

Abs

orba

ncia

540

nm

Glu

Curva patrón de Glucosa (g/L) Nº1

y = 0,4883x + 0,0153R2 = 0,996

0,4

rban

00,2

0,6

1,2

0,5 0,7 1 1,5 1,7 2

Concentración glucosa (g/L)

Abs

oci

m

0,81

a 54

0n

67

ANEXO 3 Pruebas preliminares: Determinación Azúcares reductores y Actividad

enzimática cepas 1, 3,4 y 7

Tabla 8. Azúcares reductores (g/L) en el

Tabla 9. Azúcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 3 en diferentes concentraciones de caldo CMC

cultivo de la cepa 1 en diferentes concentraciones

de caldo CMC

Fuente: Autore

s

Tiempo (h)

Azúcares reductores (g/L), %(p/v) CMC 1

Azúcares reductores (g/L), CMC 3%(p/v)

Azúcares reductores (g/L), CMC 5%(p/v)

0 0.06 0.055 0.084 1 0.99 0.048 0.085 2 0.028 0.076 0.037 4 0.01 0.072 0.048 6 0.054 0.065 0.076 8 0.26 0.060 0.081 10 0.05 0.089 0.1 12 0.020 0.052 0.058 14 0.072 0.1 0.13 16 0.05 0.05 0.09 18 0.06 0.070 0.069

Fuente: Autores

Tiempo (h)

Azúcares reductores (g/L),CMC 1%(p/v)

Azúcares reductores Azúcares reductores (g/L), CMC 3%(p/v) (g/L), CMC 5%(p/v)

0 0.075 0.079 0.094 1 0.108 0.062 0.090 2 0.030 0.081 0.040 4 0.0076 0.075 0.049 6 0.063 0.069 0.079 8 0.32 0.061 0.088 10 0.049 0.093 0.104 12 0.028 0.055 0.067 14 0.083 0.106 0.11 16 0.062 - 0.10 18 0.065 0.079 -

68

Tabla 10 Azúcares reductores (g/L) en cepa 4 en diferentes concentraciones

Fuente: Autores

Tabla Azúcares red (g/L) en el cultivo de la cepa 7 en diferentes traciones

de caldo C

Fuente: Autores

el cultivo de lade caldo CMC

11. uctores c nonceMC

Tiempo (h)

Azúcares reductores (g/L), CMC 1%(p/v)

Azúcares reductores Azúcares reductores (g/L), CMC 3%(p/v) (g/L), CMC 5%(p/v)

0 0.071 0.074 0.07 1 0.046 0.051 0.065 2 0.049 0.06 0.081 4 0.05 0.068 0.05 6 0.06 0.07 0.054 8 0.07 0.06 0.06 10 0.058 0.075 0.043 12 0.07 0.077 0.062 14 0.072 0.069 0.053 16 0.065 0.06 0.068 18 0.063 0.07 0.068

Tiempo (h)

Azúcares reductores (g/L), CMC 1%(p/v)

Azúcares reductores Azúcares reductores (g/L), CMC 3%(p/v) (g/L) CMC 5%(p/v)

0 0.075 0.079 0.094 1 0.108 0.062 0.090 2 0.030 0.081 0.040 4 0.0076 0.049 0.075 6 0.063 0.069 0.079 8 0.32 0.061 0.088 10 0.049 0.093 0.104 12 0.028 0.055 0.067 14 0.083 0.106 0.11 16 0.062 - 0.10 18 0.065 0.079 -

69

Tabla 12. Azúcares reductores (g/L) en el cultivo del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)

Fuente: A

enzimática del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo CMC al 1%(p/v),a

pH7 37ºC y tiempos de reacción enzima –sustrato de 30’, 60’ y 120’

Fuente: Autores UC de a como la ca de enzima capaz d r una μmol de glucosa por minuto a pH 7 3

nz a del consorcio (cepaºC y tiempos de reacción enzima –sustrato de 30’,60’ y 120’

Fuente: Autores UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a pH7 37ºC

utores

Tabla 13 Actividad

finid ntidad e libera7ºC

Tabla 14 Actividad epH7 37

imátic s 1, 3, 4 y 7) en caldo SVS al 10%(p/v), a

Tiempo(h) Azúcares reductores (g/L) CMC 1%(p/v)

Azúcares reductores (g/L) SVS 10%( p/v)

0 0.0076 0.083 2 0.011 0.08 4 0.03 0.08 6 0.32 0.073 8 0.07 0.120 11 0.02 0.051 15 0 0.036 19 0 0.028 23 - 0.034

Tiempo (h) Actividad enzimática (UC) 30’

Actividad enzimática Actividad enzimática (UC) 60’ (UC) 120’

2 0.005 0.012 0.016 4 0.016 .022 43 0 0.06 0.002 .016 22 0 0.08 0.011 .026 18 0 0.011 0.029 0.015 14 0.015 - 0.004 0.004 19 - 0.023 0.008

Tiempo (h) Actividad enzimática (UC) 30’

Actividad enzimática Actividad enzimática (UC) 60’ (UC) 120’

2 0.031 0.024 0.023 4 0.032 0.028 0.023 6 0.003 0.025 0.032 8 0.002 0.025 0.036 11 0.003 0.034 0.013 15 - 0.017 0.017 19 - 0.025 0.023

70

rueba a vidad enzimática de Bacillus s Streptomy parado y en

nsorcio

Tabla 15. Azúcares reductores (g ctividad enzimática a ºC con tiempo de reacción enzi sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bac . en caldo CMC al

1%(p/v)

Fuente: Autores UC definida como dad de enzima c liberar una μmo cosa por minuto a pH 7 37ºC y pH5 50ºC

Tabla 16. Azúcares reductores /L) y Actividad enzi a pH7 37ºC, pH5 on tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bacillus sp. o SVS

al 10% (p/v)

Fuente: Autores UC definida como la cantidad ima capaz de lib μmol de glucos inuto a pH7 37ºC y pH5 50ºC

ANEXO 4

P s prelimin res: Determinación Azúp. (Cepa 8) y

cares reductores y Actices sp. por se

co

/L) y A pH7 37ma- illus sp

la canti apaz de l de glu

(g mática 50ºC c en cald

de enz erar una a por m

Tiempo (h) Azúcares reductores Actividad enzimática (g/L) (U 7 37ºC C) pH

12 0.26 0.025 14 0.23 0.028 16 0.19 0.043 18 0.23 0.033 20 0.20 0.024 22 0.15 0.023 24 1 020. 6 0. 5

Tiempo (h) Azúcares reductores (g/L)

Actividad enzimática Actividad enzimática (UC) pH7 37ºC (UC) pH5 50ºC

12 1.07 0.03 0.04 14 0.88 0.03 0.035 16 0.91 0.03 0.04 18 0.87 0.06 0.05 20 0.81 0.04 0.05 22 0.53 0.04 0.02 24 0.95 - -

71

Tabla 17. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, con tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos de Streptomyces sp. en caldo CMC al

Fuente: Autores UC definida como la cantidad de a capaz de libera de glucosa por minuto a pH7 37ºC

Tabla 18. Azúcar ductores (g/L) y Actividad enzimática a pH pH5 50ºC con tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 tos en el cultivo d tomyces sp. en

caldo SV 0%(p/v)

Fuente: Autores UC defin como la cantidad az de libe μmol de glucosa inuto a pH7 37 pH5 50ºC

en el cultivo1% (p/v)

Tiempo (h) Azúcares reductores

(g/L) Actividad enzimática

(UC) pH7 37ºC 12 0.29 0.05 14 0.28 0.05 16 0.26 0.04 18 0.27 0.04 20 0.25 0.03 22 0.24 0.02

24 0.15 0.02 enzim r una μmol

es re 7 37ºC, minu e StrepS al 1

Tiempo (h) Azúcares reductores

ida de enzima cap rar una por mºC y

(g/L) Actividad enzimática Actividad enzimática

(UC) pH7 37ºC (UC) pH5 50ºC 12 1.173 0.04 0.04 14 1.054 0.04 0.03 16 0.98 0.03 0.03 18 1.30 0.06 0.05 20 1.0 0.04 0.04 22 0.644 0.03 0.02 24 0.876 - -

72

Tabla 19. Azúcares reductores (g/L) y Actividad enzimática a pH7 37ºC, pH5 50ºC con tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo del consorcio (Bacillus sp.y

en caldoStreptomyces sp.) SVS al 10%(p/v)

capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a H7 37ºC y pH5 50ºC

Fuente: Autores UC definida como la cantidad de enzimap

Tiempo (h) Azúcares reductores (g/L)

Actividad enzimática Actividad enzimática (UC) pH7 37ºC (UC) pH5 50ºC

12 1.109 0.03 0.03 14 1.085 0.04 0.02 16 0.96 0.04 0.04 18 1.092 0.06 0.04 20 1.197 0.04 0.04 22 0.501 0.04 0.02 24 1.095 - -

73

ANEXO 5

azúcares reductores y Actividad enzimátDeterminación de ica del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en cultivo discontinuo en SV y SVS al

5%(p/v) y 10% (p/v)

Tabla 20. Azúcares reducto ctividad celulolítica en el cultivo del consorcio celulolítico con SV al 5%

uente: Autores C definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a H7 37ºC

Tabla 21. Azúcares reductores y Actividad celulolítica en el cultivo del consorcio celulolítico con SVS al 5%(p/v)

uente: Autores efinida como la cantidad de enzima capa erar una μmol de glucosa por minuto a

pH7 37ºC

res y A(p/v)

FUp

FUC d z de lib

Tiempo (h) pH Actividad celulolítica (UC) pH7

Azúcares reductores (g/L) 37ºC 0 6,18 0,437 6 6,15 0,591 0,0175

12 6,22 0,445 0,0149 16 5,95 0,535 0,0227 18 5,97 0,624 0,0258 20 6,1 0,296 0,0471 22 6,07 0,317 0,0178

Actividad celulolítica (UC) pH7 Tiempo (h) pH Azúcares reductores (g/L) 37ºC

0 5,78 0,378 6 5,82 0,435 0,01185

12 5,86 0,352 0,03027 16 5,88 0,589 0,0178 18 5,84 0,849 0,0357 20 5,81 0,423 0,035 22 5,8 0,419 0,0255

74

Tabla 22. Azúcares reductores y Acti ltivo del consorcio

Fuente: Autores UC d da como tidad de enzim erar una μmol de glucosa por minuto a pH ºC y pH5*Valo ados a partir de la curva p e Glucosa Nº 2

celulolítico con SVS al 10%(p/v)

Fuente: Autores o la cantidad de enzima capaz de liberar una μmol de glucosa por minuto a

vidad celulolítica en el cucelulolítico con SV al 10%(p/v)

efini la can a capaz de lib7 37res hall

50ºC atrón d

Tabla 23. Azúcares reductores y Actividad celulolítica en el cultivo del consorcio

UC definida com pH7 37ºC y pH5 50ºC *Valores hallados a partir de la curva patrón de glucosa Nº 2

Tiempo (h) pH Azúcares reductores*

(g/L) Actividad celulolítica*

(UC) pH7 37ºC Actividad celulolítica*

(UC) pH5 50ºC 0 6,27 1,38 6 5,88 1,665 0,1056 0,0394

12 5,87 1,145 0,05074 0,026 16 5,89 0,858 0,042 0,0279 18 5,99 0,02954 0,856 0,0387 20 6,24 0,9 0,0372 0,0291 22 6,31 0,0625 0,0321 1,27 25 6,23 0,647 _ _

Tiempo(h)

Azúcares reductores*

pH (g/L) Actividad celulolítica*

(UC) pH7 37ºC Actividad celulolítica* (UC)

pH5 50ºC 0 6,26 1,289 6 5,79 1,474 0,08555 0,0328

12 5,98 1,074 0,0502 02231 0,16 6,01 0,884 0,04426 16 0,01918 6,08 0,82 0,0465 42 0,01820 6,3 0,777 0,04574 77 0,0122 6,29 1,225 0,0575 92 0,03025 6,41 0,767 _ _

75

ANEXO 6

Análisis fisicoquímico del residuo vegetal de crisantemo

PARÁMETRO RESULTADO UNI DADES MÈTODO ANA LÍTICO

Humedad 7.92 GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO

%

Fracción Min GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO) eral 2,84 %

Pérdidas platilizac

GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

or Vo ión 89,2 %

CARACTERIZAC LA FRACCIÓN O ÁNICA (89.2 %) IÓN DE RG

Proteína 5,01 % MICRO-KJELDHAL (MET. INTERNO)

Celulosa 65,3 % SUMATORIA Hemicelulosa 2,03 % SUMATORIA

Carbohidratos no estructurales 16,6 % COLORIMÉTRICO

(MET. INTERNO)

Lignina 0,51 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

Fu

uente: Laboratorio de Análisis químicos e insumos agrícolas, AGRILAB

ente: Laboratorio de Análisis químicos e insumos agrícolas, AGRILAB

ELEMENTO RESULTADO UNIDADES MÉTODO ANALÍTICO

FRACCIÓN OR %) GÁNI (89.2CA

Gra 31 GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO) sa 0, %

Fibra C ,4 GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO) ruda 46 %

ExtracNitroge 7,5 % RIA to no

nado 3 SUMATO

ibra det te ,3 % GRAVIMÉTRICO

(MET. INTERNO) ergentra

F 68neuFibra detergente

ácida 66,3 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

NUTRIENTES

Fósforo (P2O5) 0,27 % COLORIMÉTRICO (NTC 234)

Calcio (CaO) 0,69 % ABS. ATÓMICA (MET. INTERNO)

Sílice (SiO2) 0,55 % ABS. ATÓMICA (MET. INTERNO)

F

76

ANEXO 7 Perfil cromatográfico

Sob p/v) renadante de la hora seis de fermentación en SV al 10%(

Fuente: Laboratorio de Ing uímica de la Un idad Nacion

eniería Q ivers al de Colombia

77

Perfil cromatográfico Sobrenadante de la ho n en SVS al 10%(p/v) ra seis de fermentació

Fuente: Laboratorio de Ingeniería Química de la Universidad Nacional de Colombia

78

ANEXO 8 Análisis estadístico (SPSS, versión 14.)

Distribución de datos Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic df Sig. AzR ,135 28 ,200(*) ,919 28 ,033 et

* This is a lower bound of the true significance. a Lilliefors Significance Correction Resultados arrojados (F28=0,919, p=0,033) Datos normalizados Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic df Sig. Log ,136 28 ,196 ,956 28 ,278

a Lilliefors Significance Correction

79

Comparación de l sustrato vegetal

concentraciones 5%(p/v) y 10%(p/v)

neway Analysis of Log A.R By Concentracion

a liberación de azúcares reductores entre

O

0,3

Log

A.R

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

10% 5%

entracionConc

square 0,7622dj Rsquare 0,742383oot Mean Square Error 0,120137ean of Response -0,14997bservations (or Sum gts)

14

Test Difference t-Test DF Prob > |t|

Oneway Anummary of Fit

ova SRARMOW t- Estimate 0,398255 6,202 12 <.0001Std Error 0,064216 Lower 95% 0,258341 Upper 95% 0,538170 Assuming equal variances

80

81

omparación de la liberación de azúcares reductores entre los medios SV y

neway Analysis of Log A.R By Medio

CSVS a concentración de 5%(p/v) y 10%(p/v)

OLo

g A

.R

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

SV SVS

Medio

neway Anova

0,000039re -0

uare Error

m

Test Difference t-Test DF Prob > |t|

stimate

u

OSummary of Fit Rsquare Adj Rsqua ,03842Root Mean Sq 0,230817Mean of Response -0,14859Observations (or SuWgts)

28

t- E -0,00277 -0,032 26 0,9750Std Error 0,08724 Lower 95% -0,18209 Upper 95% 0,17656 Assuming eq al variantes

Diana Gaitán, Liliana Pérez

AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS A PARTIR DE

Diana Gaitán, Liliana Pérez, Adriana Matiz, Balkys Quevedo dgaitan@javeriana.edu.co

RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora)

, liliana.perez @javeriana.edu.co, amatiz @javeriana.edu.co. bquevedo@javeriana.edu.co.

Departamento de Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 Nº 43-88 RESUMEN El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y evaluar microorganismos degradadores de celulosa a partir de residuos vegetales frescos y en compost de crisantemo. Ocho cepas bacterianas mesofílicas con actividad celulolítica fueron aisladas y purificadas a partir de residuos vegetales de crisantemo en compostaje. La actividad celulolítica de estas cepas fue evaluada cualitativamente mediante el revelado de halos de hidrólisis con rojo congo en medio Carboximetilcelulosa (CMC) al 1% (p/v), posteriormente, con el objetivo de establecer un consorcio bacteriano celulolítico se realizaron pruebas de antagonismo para determinar si existía algún tipo de inhibición entre éstas. La actividad celulolítica de las cepas escogidas fue evaluada mediante la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) a partir de la cual sólo una cepa fue seleccionada para hacer parte del consorcio. Con el fin de potencializar la actividad de dicha cepa se usó un actinomiceto aislado y evaluado en otro estudio. Estos microorganismos fueron identificados como Bacillus sp. y Streptomyces sp.. La capacidad degradadora del consorcio sobre el residuo vegetal de crisantemo fue evaluada en dos medios: uno con sustrato vegetal a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), suplementado con sales (SVS) y otro, compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de levadura y peptona (SV), determinando la concentración de azúcares reductores liberados mediante la técnica de DNS y la actividad enzimática en CMC en buffer fosfato pH7 37ºC y CMC en buffer ácido cítrico pH5 50ºC. Los resultados obtenidos mostraron que la degradación del sustrato vegetal de crisantemo fue mejor

ando las microorganismos actuaron en consorcio demostrando una acción sinérgica entre sus en el medio SV en una concentración del 10%(p/v) se dió la mayor liberación

on un valor de 1.665g/L y una actividad enzimática de 0.1056 UC.

e: actividad celulolítica, ctores, celulosa, residuo vegetal

f isolate and evaluate cellulose degradation by ilic bacteria wi llulolytic activity were isolation and purified from

es of a composting system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism as evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red and carboximethylcellulose

%(w/v) as the substrate, afterwards with the objective to create a cellulolytic bacterial n devel tes rmin ibition existed between them.

tic a electe was e t osalicyc acid (DNS) method, oorga cted acterial associa the aim of boost the bacteria oyed a ctinomycete previously isolated and evaluated in other investigation.

ism fied as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The degradation capacity of tion ble wastes of crisantemo was evaluated employing two broths: one of

rent concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts ble waste with the same concentrations, yeast extract and peptone

(SV) the concentration of reducing sugars was evaluated with DNS method and the cellulose activity using CMC phosphate buffer pH7 37ºC and CMC citric acid pH5 50ºC. The obtained results indicated that the best degradation of vegetable wastes was using the bacterial association, showing a synergetic cellulose degradation, furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed the best concentration of reducing sugars (1.665 g/L) and cellulose activity of 0.1056 UC. Key words: cellulose, cellulolytic activity, reducing sugars, vegetable waste.

cuenzimas, por otro lado, de azucares reductores c Palabras clav azúcares redu ABSTRACT The present investigation was withmicroorganisms. Eight mesophvegetable wast

the aim oth ce

w(CMC) 1ssociatioa

Toped antagonismctivity of the s

t for deted strain

e if anvalua

y type of inhed with dinitrhe celluloly

only one micr nism was sele for the b tion. Withactivity, empl cellulolytic aThis microorgan s were identi

bacterial associa using vegetathis with vegetable waste at diffe(SVS), the other only with vegeta

1

Diana Gaitán, Liliana Pérez

INTRODUCCION

a de las actividades más desarrollad La floricultura es un as en Colombia. El crisantemo ocup ctor libera altos volúmenes de re bido a su lenta degradación se co iental; pérdida de spacio 2001).

programa de gestión ambiental los residuos vegetales generados son pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa biotecnológica es la

del residuo vegetal se realizó a partir de residuos frescos y en compostaje e un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora) localizado en el municipio

se adicionó rojo congo al 1%(p/v), ego de quince minutos se retiró el exceso y se adicionó NaCl 0.1M, dejando reposar

a el cuarto lugar en flores de exportación. Este sesiduos vegetales que dificultan su manejo y denvierten en un problema de alto impacto amb

e físico, generación de plagas, impacto paisajístico etc. (Asocolflores,Dentro del

atados entrutilización de microorganismos celulolíticos capaces de degradar estos residuos, con la consecuente producción de azúcares fermentables que a su vez puedan ser usados como sustrato glicosídico natural y permitan la reducción en el volumen de los residuos vegetales generados. Los microorganismos encargados de la degradación de la celulosa, principal componente de la pared celular de las plantas incluyen bacterias y hongos, aerobios, anaerobios, mesofílicos y termofílicos, los cuales cuentan con la maquinaria enzimática necesaria para dicho propósito (Lynd, et al., 2002), por tal razón, su aislamiento e identificación representa un importante recurso para lograr la disminución del impacto ambiental y la generación de un sustrato fermentable cuya utilidad podría estar en la producción de etanol, obtención de ácidos orgánicos, edulcorantes, productos farmacéuticos y alimentos, entre otros. METODOLOGIA Localización y condiciones de muestreo El muestreo dde Tocancipá cuya temperatura promedio es 13ºC, una humedad relativa del 80% y esta ubicado a 2606m.s.n.m. Se tomaron en forma aleatoria cinco submuestras de residuo fresco de 1 semana de almacenamiento, de 100g cada una, registrando una temperatura de 18ºC; en el caso de los residuos en degradación se muestrearon diferentes puntos de la pila de compostaje de 4 semanas de degradación, registrando una temperatura de 50ºC y un pH de 8.6. Aislamiento e identificación de microorganismos celulolíticos Se pesaron 10 g de las muestras de residuos vegetales frescos y en compostaje, cada uno de los cuales fueron llevados a 90ml de agua peptonada 0.1%(p/v). Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a 10-5 en agua peptonada al 0.1%(p/v). A partir de las diluciones preparadas se realizó siembra en superficie en agar Carboximetilcelulosa (CMC) al 1%(p/v). Las cajas fueron incubadas a 35oC por 48 horas. Transcurrido el tiempo de incubación lu

2

Diana Gaitán, Liliana Pérez

por quince minutos más, para luego hacer el recuento de las colonias que presentaron alos de hidrólisis (Teather y Wood, 1982).

e presentaron mayor actividad enzimática, en 10ml de olución salina 0.85%(p/v), llevando a incubación a 100 rpm, 35ºC durante 14h.

as cepas seleccionadas en la pruebas de antagonismo fueron sometidas a tinción de cedió a obtener cultivos axénicos en agar CMC 1%(p/v). Se

evaron a cabo suspensiones de cada una de las cepas en caldo celulosa al 1% (p/v). rol a una concentración final de 25%(v/v),

osteriormente fueron almacenados a –20ºC como banco de cepas de la Pontificia

cil Sulfato SDS al 1%(p/v), ebullición por n período de media hora con SDS al 1% (p/v), lavado con agua, secado a 55ºC y

.

a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) suplementado con sulfato de amonio

h Posteriormente se realizaron repiques en agar CMC al 1%(p/v) de las colonias que presentaron actividad celulolítica, llevando a incubación y revelado bajo las mismas condiciones del aislamiento primario. Realizando medición de los halos de hidrólisis generados. Pruebas de antagonismo Para llevar a cabo las pruebas de antagonismo se siguió el método de Gauze, para lo cual, se preparó una suspensión de cada uno de los microorganismos seleccionados a igual concentración celular, qus(Moreno et al., 2000). Por triplicado se dispusieron sobre agar CMC al 1%(p/v), 2%(p/v) y 3%(p/v) (con siembra masiva del microorganismo a enfrentar), anillos plásticos estériles de un centímetro de diámetro. Dentro de los anillos se inoculó una suspensión de 50μl del microorganismo antagonista y agua destilada estéril como control negativo. Teniendo como criterio de selección halos mayores a 5mm (Gauze, 1967). Conservación de cepas LGram y luego se prollEstas suspensiones se mezclaron con glicepUniversidad Javeriana (Poutou, et al., 1994). Caracterización y procesamiento del residuo vegetal Los residuos vegetales frescos provenientes del cultivo de crisantemo fueron sometidos a una caracterización físico-química. Para el procesamiento de dicho residuo se llevó a cabo el siguiente protocolo: lavado con agua, reducción de tamaño mediante picado, lavado con Sodio Dodeufinalmente molienda en molino Industrial. (Guevara, et al., 2003) Proceso de fermentación en cultivo discontinuo Utilización del sustrato vegetal por parte de los microorganismos celulolíticos seleccionados Para la realización de este proceso se emplearon dos medios: uno con sustrato vegetal

3

Diana Gaitán, Liliana Pérez

(0.5g/L), cloruro de calcio (0.5g/L), fosfato monobásico de potasio (0.1g/L), fosfato dibásico de potasio (0.1g/L), llamado medio sustrato vegetal suplementado (SVS) y

tro, compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de

as curvas preliminares para evaluar el comportamiento enzimático y la subsecuente ctores utilizando las cepas aisladas y seleccionadas en las

ruebas de antagonismo, se llevaron a cabo en caldo CMC al 1%(p/v), 3%(p/v) y

trico pH5 50ºc, evaluando tiempos de reacción enzima-sustrato de 30’, 60’ y 20’.

ruebas Consorcio

terias y recuento de conidios en cámara e Neubawer, para microorganismos filamentosos. A partir de los muestreos

mediante DNS y actividad nzimática en CMC al 1% (p/v) en buffer fosfato pH 7 37ºC y CMC al 1%(p/v) en

inmediatamente entrifugadas durante 20 minutos a 100 rpm, a partir del sobrenadante se tomó un olumen de 0.25 ml, al cual se adicionó 0.25 ml de DNS, esta mezcla se sometió a

la mezcla se llevó a un recipiente on hielo durante 5 minutos y posteriormente se adicionaron 2.5 ml de agua destilada.

trar la absorbancia generada, la cual se reemplazó en la cuación de la línea recta arrojada por la curva patrón previamente realizada, para la

olevadura y peptona llamado medio sustrato vegetal (SV). Pruebas preliminares cepas seleccionadas Lliberación de azúcares redup5%(p/v) y caldo SVS al 10%(p/v). Inicialmente, estas cepas fueron reactivadas del banco. A partir de cada cepa se preparó un inoculo en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentración de 3 x 108 cel/ml e incubando a 35ºC y 120 rpm. Transcurrido el tiempo de incubación, 25ml de inóculo fueron adicionados a cada uno de los caldos de fermentación, con un VET de 250ml y condiciones de operación de 35ºC y 120rpm. En cada una de las horas de muestreo se determinaron azúcares reductores mediante la técnica de DNS y actividad enzimática utilizando CMC en buffer fosfato pH7 37ºC y CMC en buffer ácido cí1 P Para evaluar la actividad hidrolítica de las cepas en consorcio se realizaron fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v), caldo SV y SVS en concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), cada uno; incubando a 35ºC y 120 rpm. Adicionando un inóculo de volúmenes iguales de cada cepa a evaluar. La biomasa inicial fue determinada mediante recuento en placa, en el caso de bacdrealizados la determinación de azúcares reductores ebuffer ácido cítrico pH 5 50ºC, relación 1:1 con tiempo de reacción enzima-sustrato de 60 minutos. Determinación de azúcares reductores Las muestras tomadas en cada hora de fermentación fueron cvebullición por 5 minutos, transcurrido este tiempo, cEsta solución fue leída en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm y sensibilidad media, para regiseobtención de la concentración de azúcares reductores en cada hora de muestreo (Miller, 1959).

4

Diana Gaitán, Liliana Pérez

Determinación de actividad celulolítica Se prepararon dos soluciones de carboximetilcelulosa al 1%(p/v), una en buffer

reparación de la Solución de CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M pH7.0

ha preparación se realizó para evaluar la reacción nzima-sustrato durante el tiempo de reacción establecido para cada curva, incubando

erminación de la actividad enzimática con buffer ácido cítrico pH 5.0 se llevó a abo haciendo reaccionar 1 ml de extracto crudo correspondiente a cada hora de

de la solución de CMC en buffer ácido cítrico pH 5.0. Esta reparación se realizó para evaluar la reacción enzima-sustrato durante 60 minutos a

hidrolítica sobre el sustrato evaluado. Las cepas fueron identificadas ediante evaluación de características macroscópicas, microscópicas y

on el Manual de Bergey´s de Bacteriología istemática.

fosfato 0.1M pH7.0 y otra en buffer ácido cítrico pH 5.0. P

Se tomó 1ml de extracto crudo correspondiente a cada tiempo de muestreo de cada una de las fermentaciones para hacerlos reaccionar con 1 ml de la solución de CMC 1%(p/v) en buffer fosfato pH7. Dicea 37ºC en baño termostatado. Transcurrido el tiempo de incubación las muestras fueron llevadas a un recipiente con hielo durante diez minutos para frenar la reacción enzimática, posteriormente se centrifugaron por 20 minutos a 100 rpm. A partir de los sobrenadantes se tomaron 0.25 ml para evaluar la concentración de azúcares reductores liberados, empleando la técnica de DNS (Dávila, et al., 2002). Solución de CMC al 1%(p/v) en buffer ácido cítrico 0.1M pH5.0

La detcmuestreo con 1ml p50ºC. Transcurrido cada tiempo de incubación se detuvo la reacción en hielo por 10 minutos para posteriormente ser centrifugado por 20 minutos a 100 rpm. A partir del sobrenadante se tomaron 0.25 ml para evaluar la concentración de azúcares reductores liberados, empleando la técnica de DNS (Adrado, et al., 2005). Identificación Bioquímica La identificación bioquímica se realizó a los microorganismos que finalmente fueron seleccionados para conformar el consorcio microbiano celulolítico, por presentar la mejor actividad mcomportamiento metabólico de acuerdo cS Evaluación de azúcares fermentables en el extracto crudo El extracto crudo correspondiente a la hora de fermentación en la que se presentó la mayor liberación de azúcares reductores fue evaluado mediante cromatografía líquida (HPLC) con el fin de determinar el tipo y concentración de los azúcares reductores presentes. Análisis Estadístico

5

Diana Gaitán, Liliana Pérez

El análisis estadístico de los datos obtenidos durante la prueba experimental se realizó ormal de los datos mediante la prueba de

hapiro Wilk y como prueba paramétrica T student, utilizando el programa

ADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento de microorganismos celulolíticos

or ende su oblación (Granados y Valderrama, 2003).

La actividad celulolítica se evidenció mediante evaluación cualitativa con el revelado

as en agar MC, alcanzaron valores de 6.4cm, demuestran una baja actividad celulolítica de las

determinando inicialmente la distribución nCestadístico SPSS, versión 14. RESULT

Los residuos vegetales frescos de crisantemo no permitieron el aislamiento de microorganismos con actividad celulolítica, mientras que a partir de los residuos vegetales en compostaje se logró el aislamiento de 8 cepas bacterianas mesofílicas con dicha actividad, esta diferencia probablemente se debió a que en el proceso de compostaje la actividad metabólica microbiana se incrementa, además, el tiempo de degradación transcurrido, la alta temperatura y el pH alcalino permitieron el aislamiento de microorganismos celulolíticos, pues dichas condiciones facilitan que bacterias esporógenas y actinomicetes incrementen su actividad y pp

de zonas de aclaramiento utilizando rojo congo al 1%(p/v) como ha sido reportado por diferentes autores (Hendricks et al, 1995; Lu et al, 2005; Zhang et al, 2006). El diámetro de los halos de hidrólisis generados no fue establecido para la mayoría de las cepas, pues, se obtuvieron zonas de aclaramiento que se difundieron en todo el medio; una alta actividad hidrolítica en CMC 1%(p/v); sin embargo, en el caso de la cepas 2, 6 y 8 el diámetro del halo fue de 0.3, 0.2 y 0.35 mm, respectivamente (figura 1), que comparados con el estudio realizado por Lu, et al. (2005), en el que los diámetros de hidrólisis de las cepas aisladas de tallos de flores cultivadCcepas 2, 6 y 8 en este medio.

Cepa 1 Cepa 2

Cepa 6 Cepa 8

1. Zonas de aclaramiento en agar CMC 1%(p/v) Fuente: Autores

Fig

6

Diana Gaitán, Liliana Pérez

Pruebas de Antagonismo Con el fin de potencializar la actividad celulolítica de algunos de los

icroorganismos aislados, se planteó la posibilidad de establecer un consorcio cesario realizar pruebas de antagonismo que

escartaran aquellas cepas que generaran algún tipo de inhibición sobre las demás. al 1%(p/v) la cepa 8 tuvo la mayor

ctividad antagónica frente a las demás cepas evaluadas generando el máximo halo de

mmicrobiano para lo cual fue nedDurante las pruebas de antagonismo en agar CMCainhibición (7.5 mm) frente a la cepa 1 (Figura 2), por lo que en un principio fue descartada como parte del consorcio microbiano.

Fig 2. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1

nciada durante el desarrollo de las pruebas en CMC al %(p/v) y 2 %(p/v) demuestra que a pesar de tratarse de microorganismos aislados de

una misma fuente puede generarse inhibición entre ellos, una posible explicación a este hecho es que existan diferencias en la complejidad del sistema enzimático que les permite degradar el sustrato, generando diferentes tasas de crecimiento y dando lugar a una competencia por sustrato y espacio Los resultados obtenidos itieron seleccionar a las cepas 1, 3, 4 y 7 como parte del consorcio m Pretratamiento del Residuo Vegetal En este estudio los residuos vegetales de crisantemo fueron sometidos a un pretratamiento mecánico el cual involuc año del material

de m la obtención e favorecer el

acceso de las enzimas hidrolíticas ilitó la preparación de los medios

Fuente: Autores Las pruebas de antagonismo también se realizaron en concentraciones de CMC al 2 y 3 % (p/v) con el fin de determinar si el comportamiento antagónico y crecimiento de cada cepa se mantenía a pesar del incremento en la concentración de la fuente de carbono y de alguna manera evaluar la inhibición por sustrato de las cepas seleccionadas. En la concentración de 2%(p/v) en agar CMC las cepas 2, 5 y 6 quedaron descartadas para ser parte del consorcio. La actividad antagónica evide1

en agar CMC al 3%(p/v), permicrobiano celulolítico.

ró la reducción de tamodificar la estructura celulósico por cortado, molienda y pulverización con el fin

cristalina de la celulosa. El pretratamiento mecánico utilizado permitióde un tamaño de partícula muy pe 50μ) que además dqueño (menor a 8

del consorcio fac

7

Diana Gaitán, Liliana Pérez

de producción y el seguimiento de las f rmentaciones realizadas. Krishna (1999) sta condición pues afecta la relación área/ volumen y la

ensidad de empaquetamiento que determina la fracción de sustrato inicialmente

uebas de antagonismo se realizaron ruebas preliminares para evaluar la capacidad celulolítica de cada una de ellas

determinando la liberación de azúcares reductores por la técnica de DNS (Miller,1959) y utilizando como sustrato CMC al 1%(p/v), 3%(p/v), y 5%(p/v), los resultados indicaron una actividad celulolítica nula en todas las cepas, en las tres concentraciones y durante las veinte horas de fermentación, lo cual indicó la falta de concordancia entre la evaluación cualitativa y cuantitativa de actividad, una posible explicación de este hecho es que en la prueba cualitativa, el microorganismo permaneció en conta bación, aumentando así la probabilidad de liberar las as para degradar el polisacárido;

ientras que en la técnica de actividad cuantitativa por DNS, el extracto enzimático

or esta técnica, a pesar de que la prueba se realizó en condiciones de H y temperatura óptimos para la detección de las enzimas encargadas de la

nula. Con base en estos resultados se ecidió buscar una segunda opción que incluyó la evaluación de la cepa 8 que había

VS al 10%(p/v) eterminando azúcares reductores y actividad enzimática, alcanzándose valores

io propuesto.

ereportó la importancia de edaccesible al microorganismo. Esta relación se incrementa cuando el tamaño de partícula disminuye determinando así el espacio vacío que es ocupado por el aire, aumentando la tasa de transferencia de oxigeno que afecta directamente el crecimiento de los microorganismos. Evaluación preliminar de la actividad celulolítica de las cepas aisladas Con las cepas seleccionadas (1, 3, 4 y 7) en las prp

cto con el sustrato durante 48 horas de incuenzimas necesari

mentró en contacto con la celulosa con un tiempo de reacción de 60 minutos que probablemente no fue suficiente para que se diera una reacción enzima-sustrato completa, o, la cantidad de enzima presente en el sobrenadante no era suficiente para hidrolizar la celulosa o para obtener cantidades de azúcares reductores que pudieran ser detectados ppdegradación del sustrato. Evaluación preliminar de la actividad celulolítica del consorcio Al evaluar la actividad celulolítica de las cepas 1, 3, 4 y 7 en consorcio, los resultados obtenidos tanto en la fermentación realizada en caldo CMC al 1%(p/v) como en caldo SVS al 10%(p/v), mostraron que la cantidad de azúcares reductores y la actividad enzimática del consorcio en los dos sustratos fuedsido inicialmente descartada en las pruebas de antagonismo, para lo cual, se realizaron fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v) y Sdmayores a los obtenidos con el consorc Con el objetivo de potencializar la actividad enzimática de la cepa 8, teniendo en cuenta que fue un microorganismo “nativo” del sustrato vegetal a evaluar y, que durante la realización de las pruebas de antagonismo se caracterizó por inhibir a las demás cepas, probablemente por tener una alta tasa de crecimiento que lo hacía competitivo por espacio y nutrientes y basados en que el sinergismo de las enzimas celulolíticas hacen posible la hidrólisis de celulosa a glucosa (Lu, et al., 2005;

8

Diana Gaitán, Liliana Pérez

Malherbe y Cloete, 2002) se evaluó el efecto sinérgico entre la cepa 8 y un actinomiceto aislado a partir de suelo, en cultivo de Stevia con buena actividad celulolítica cualitativa en CMC al 1% (p/v), (halos de hidrólisis de 2.14cm de diámetro) (Gutiérrez, et al., 2002) aislado de suelo. Para lo anterior se realizaron curvas de cada microorganismo por separado en caldo SVS al 10%(p/v) con el fin de evaluar la actividad enzimática sobre dicho sustrato. Los dos microorganismos presentaron una degradación del sustrato vegetal de crisantemo, lo que se evidenció on la cuantificación de azúcares reductores (Figura. 3)

juegan un papel importante en la biodegradación y do el aislamiento ompostaje (Lu et

an reportado buenos resultados,

c

Fig.3 Azúcares reductores en el cultivo de cepa 8 y actinomicete en SVS al 10% (p/v).

Identificación Bioquímica

Los resultados del perfil bioquímico y la observación de las características macro y microscópicas realizadas a la cepa 8 y el actimomicete permitieron identificarlos como Bacillus sp. y Streptomyces sp. Tanto Bacillus sp. como Streptomyces sp. han sido reportados como microorganismos con alta actividad celulolítica. Muchas especies del género Bacillus están normalmente presentes en el suelo y en la materia orgánica en degradación, por lo ue se considera que

00,20,40,60,8

11,2

12 14 16 18 20 22 24Tiempo (h)

Azú

care

s re

duct

ores

(g/L

)

1,4

CEPA 8 EN SVS 10%(p/v) ACTINO EN SVS 10%(p/v)

qbioconversión de componentes de alto peso molecular. Se ha realiza

e Bacillus licheniformis a partir de residuos vegetales de flores en cdal., 2005) y Bacillus subtilis en muestras de suelo y agua en la región amazónica (Heck et al., 2002), en residuos de banano (Krishna, 1999), y en fibras de palma (Apun et al., 2000), en los que dicho género bacteriano ha demostrado un alto potencial celulolítico. Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la degradación y recirculación de biopolímeros como la celulosa, la hemicelulosa y la lignina (Semedo et al., 2004). Los estudios realizados con este microorganismo en cuanto a su apacidad hidrolítica en materiales lignocelulósicos hc

como es el caso de Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados de muestras de suelo (Semedo et al., 2004; Grigorevski et al., 2005; Li, 1997). Ramírez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celulolítcos entre los cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y además mostró los más altos niveles de actividad enzimática en el estudio.

9

Diana Gaitán, Liliana Pérez

10

urante las curvas realizadas con el consorcio microbiano en SV y SVS al 5% (p/v) e obtuvieron valor

respectivamente en la h ción, (Figura 4) mientras que, en SV y SVS al 10% (p/v) se alcanzaron valores de 1.665 y 1.474g/L, respectivamente en la hora seis de fermentación (Figura 5). Los resultados de la cromatografía liquida realizada a los sobrenadantes obtenidos en la hora seis de las fermentaciones en los medios al 10% (p/v) mostraron la presen ia de glucosa y fructosa como azúcares reductores. En el medio SV la glucosa se ncontró en una concentración de 0.5g/L, mientras que, en el medio SVS además de a glucosa en una concentración de 0.4g/L se n inferir en primer lugar que el sustrato vegetal de crisantemo a concentración de

dad hidrolítica del consorcio microbiano, generándose

una fuente de carbono, nitrógeno y minerales

Utilización del sustrato vegetal por parte del consorcio celulolítico Teniendo en cuenta la actividad hidrolítica de Streptomyces sp. y Bacillus sp. en el residuo vegetal a evaluar (Figura 3); y con el objetivo de potencializar la degradación del sustrato por una posible acción sinérgica entre las enzimas de cada cepa, se realizaron curvas en las que los microorganismos actuaron en consorcio. Ds es máximos de azúcares reductores de 0.624 y 0.849g/L,

ora 18 de fermenta

c e l

detectó fructosa en una concentración de 1.4g/L. Estos resultados permitiero

10%(p/v) estimuló la actividiferencias significativas (p<0.05) con la actividad hidrolítica al 5% (p/v), en segundo lugar, que la adición de sales al medio de producción no generó diferencias significativas (p>0.05) en la liberación de azúcares reductores, lo que demuestra que l residuo vegetal de crisantemo provee e

que suplen los requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento y la actividad metabólica de los microorganismos evaluados, así mismo, los resultados de la cromatografía líquida corroboraron que la suplementación del medio sustrato vegetal no generó un incremento en la conversión de celulosa a glucosa, por el contrario la concentración de este azúcar fue mayor en el medio sin suplemento. Sin embargo, se esperaba una mayor concentración de azúcares reductores teniendo en cuenta que el residuo vegetal de crisantemo contenía un alto porcentaje de celulosa (65.3%) de acuerdo al análisis fisicoquímico realizado.

00,10,20,30,40,50,60,7

0 6 12 16 18 20 22

Tiempo (h)

Azú

care

s re

duct

ores

(g

0,80,9

/L)

SV 5% (p/v) SVS 5% (p/v)

Fig. 4 Azúcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp. en SV y SVS al 5% (p/v)

Diana Gaitán, Liliana Pérez

Fig. 5 Azúcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp.) en SV y SVS al 10% (p/v)

Por otro lado, al comparar la concentración de azúcares reductores obtenidos en las pruebas preliminares en las que Bacillus sp. y Streptomyces sp. actuaron individualmente en la degradación de SVS al 10%(p/v), con los obtenidos con el consorcio (Bacillus sp.- Streptomyces sp.) el mismo sustrato y a la misma concentración, demuestran que se estableció un sinergismo en el que probablemente se logró una complementariedad entre las enzimas celulolíticas que favorecieron la degradación del sustrato con el consecuente aumento en la liberación de azúcares reductores (Figura 6).

00,20,40,60,8

11,21,41,6

0 6 12 14 16 18 20 22 24 25

Tiempo (h)

Azúc

ares

redu

ctor

es (g

/L)

Bacillus sp. Streptomyces sp. consorcio

ig 6. Azúcares reductores en los cultivos de Bacillus sp.y StreptomyceF s sp.(individual y en consorcio) en SVS al 10%(p/v)

Condiciones de pH y Temperatura durante la Fermentación Durante las curvas de degradación del residuo vegetal realizadas, el pH y la temperatura se mantuvieron en un valor cercano a 6.0 y 35ºC, respectivamente. Krishna (1999), reportó que el pH y la temperatura de la fermentación tienen una gran influencia en la producción de enzimas celulolíticas, en su investigación la mayor producción se alcanzó a un pH de 7.0 m nteniendo una temp atura constante de

temperatura de operación en esta in drólisis del residuo vegetal.

a er35ºC, sin embargo, el autor reporta otros estudios donde a un pH de 6.0 se da la mayor liberación enzimática, lo que permite afirmar que tanto el pH como la

vestigación favorecieron la hi

00,20,40,60,8

11,2

0 6 12 16 18 20 22 25

Tiempo (h)

Azú

care

s re

duct

ore

1,4s (g

1,61,8

/L)

SV 10%(p/v) SVS 10%(p/v)

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Diana Gaitán, Liliana Pérez

Actividad Enzimática y liberación de azúcares reductores a partir del residuo egetal de Crisante

El nivel má con SV al 10%(p/v) en

o la cantidad de enzima capaz de liberar un m nuto) (Figura 7) valor que coincidió con la ma o sustrato. Sin embargo,

li Por otro lado, la actividad enzim e 50ºC fue menor, demostrando que dicha actividad varía de acuerdo a las condiciones de pH y

v mo.

s alto de celulasas se produjo en la fermentaciónla hora 6, pH7 37ºC con un valor de 0.1056 UC (UC definida com

icromol de glucosa por miyor concentración de azúcares en el mism

no existieron diferencias significativas (p>0.05) en la concentración de celulasasberadas en los medios SV y SVS en las concentraciones evaluadas.

ática a pH ácido y una temperatura d

la temperatura en la que es evaluada (p<0.05). Una explicación a este hecho puede ser que en condiciones naturales la actividad hidrolítica de la celulosa se ve afectada cuando el pH del suelo es ácido, como es el caso de Cellulomonas sp., cuyo comportamiento metabólico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd et al.,2002)

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

UC

)

0 6 12 16 18 20 22 25

Tiempo (h)

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a (

UC pH7 37ºC UC pH 5 50ºC Fig.7 Actividad enzimática en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en

SV al 10% (p/v), bajo condiciones de pH7 37ºC y pH 5 50ºC La actividad enzimática del consorcio evaluada en SV y SVS en concentraciones de 5%(p/v) y 10%(p/v), no es comparable con los resultados reportados por otros

aterial celulósico difiere e icas como son: el tamaño y las moléculas de de la celulosa, la

lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargadas de hidrolizar celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas ) y los cambios en las

estudios en los que también se ha realizado la evaluación de microorganismos celulolíticos en residuos celulósicos (Lu et al 2005), (Krishna, 1999), debido a que el

n sus características físico-químmy la superficie de las fibrillas, el espacio entre las microfibrillaselulosa en las regiones amorfas, el grado de cristalinidad c

conformación estereoscópica y la rigidez de las unidades de celulosa, el grado de polimerización de la celulosa, la naturaleza de los componentes con los que la celulosa esta asociada, la naturaleza, concentración y distribución de grupos sustituyentes (Malherbe y Cloete, 2002; Petre et al., 1999; Zhang et al., 2006). Dichos parámetros condicionan drásticamente la habilidad de los microorganismos celulolíticos para degradar este tipo de sustratos, lo cual explica que el comportamiento metabólico sea específico y por ende, la acumulación del producto de hidrólisis difiera de un ensayo a otro. (Zhang et al., 2006).

or otro Pla

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Diana Gaitán, Liliana Pérez

características del sustrato durante la hidrólisis han sido simulados por modelos matemáticos aplicados a una variedad de materiales lignocelulósicos, dicho modelo ugiere que es casi imposible la predicción del funcionamiento hidrolítico de una

urante las pruebas realizadas se observaron marcadas diferencias entre la actividad

n esta investigación el screening se realizó en agar CMC al 1%(p/v) (sustrato celulósico soluble), posteriormente la inducción de enzimas en residuos vegetales de crisantemo (sustrato insoluble) y la cuantificación de dichas enzimas fue llevada a cabo en CMC al 1% (p/v) en buffer fosfato pH7 y en buffer ácido cítrico pH5. La utilización de sustratos con diferente tipo de solubilidad probablemente influyó en la variación de los resultados, pues la relación existente entre la tasa de hidrólisis obtenida en sustratos solubles e insolubles no es clara, principalmente porque existen diferencias en la accesibilidad de las enzimas al sustrato y el grado de polimerización (Zhang et al., 2006), lo cual explica la obtención de halos de diámetro incuantificable y enzimática ev omo para el onsorcio. Este mismo autor concluyó que los datos obtenidos en la hidrólisis de

ichos microorganismos resentes en la biosfera (Howard et al., 2003)

smezcla de celulasas de un sustrato a otro debido a variaciones como la concentración de celulasas, la proporción endo/exocelulasas, el tiempo de reacción y las características del sustrato (Zhang et al, 2006). De esta manera, la actividad celulolítica de los microorganismos va a ser específica para cada sustrato celulósico a evaluar. Dcelulolítica cualitativa y cuantitativa evaluada, lo cual puede estar directamente relacionado con el tipo de sustrato en el que se realizaron dichas pruebas, pues, según Zhang et al., (2006), es necesario tener en cuenta la solubilidad o insolubilidad en agua del sustrato que se quiere evaluar ya que determina los parámetros para realizar el screening y determinación de la actividad enzimática de microorganismos con capacidad celulolítica. E

su baja correlación con los niveles de azúcares reductores obtenidos y la actividadaluada tanto para las cepas inicialmente aisladas c

csustratos solubles no pueden ser comparados con la hidrólisis de sustratos insolubles. Otro de los factores que pudo haber influido en la variación de los resultados es el tiempo de fermentación y el de reacción enzima-sustrato durante las pruebas de actividad enzimática, si se tiene en cuenta que la lignocelulosa pretratada utilizada para evaluar la actividad enzimática de preparaciones comerciales de celulasas, requiere un rango de tiempo que va de minutos a horas para que inicie la hidrólisis y hasta varios días para obtener una digestibilidad final (conversión de la celulosa) (Zhang et al., 2006), las evaluaciones realizadas requerían un mayor tiempo de reacción que diera lugar a la obtención de mejores resultados. Finalmente, se puede considerar la importancia de continuar realizando screening de microorganismos celulolíticos pues la utilización de estos se convierte en una alternativa viable para el tratamiento de residuos celulósicos, pues tan solo se ha identificado y evaluado menos del 1% del potencial de dp

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Diana Gaitán, Liliana Pérez

CONCLUSIONES

Se logró el aislamiento de ocho cepas con actividad celulolítica en CMC 1% (p/v) a partir de residuos vegetales de crisantemo en compostaje

No se estableció una relación directa entre la actividad celulolítica cualitativa

y cuantitativa de los microorganismos evaluados durante el estudio.

La mayor concentración de azúcares reductores y actividad enzimática se

necesario suplementar el residuo con sales.

Dávila, D; López, L; Pedroza, A. 2002 Evaluación de diferentes soportes para

ctividad Proteolítica y Amilolítica de Actinomycetes termofílicos aislados a partir de pilas de

g agro-industrial by-products and its potential use in the detergent and textile industries. Enzyme and Microbial Technology. 37: 272–277.

obtuvieron en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV 10% (p/v).

El residuo vegetal de crisantemo aportó los nutrientes necesarios para

estimular la actividad enzimática de los microorganismos evaluados por lo cual no se hace

LITERATURA CITADA

Adrado, B; Chpeborska, P; Galbe, M; Zacchi, G. 2005. Ethanol production from non-starch carbohydrate of wheat bran. Bioresource Technology. 96:843-850.

Apun, K; Jong, B; Salleh, M. 2000. Screening and isolation of a cellulolytic

and amylolytic Bacillus from sago pith waste. J. Gen. Appl. Microbiol. 4:263-267.

Asocolflores. Florverde, el programa social y ambiental de la floricultura

Colombiana. Revista Asocolflores. 61:23

la preformulación de un producto termofílico acelerador de compostaje. Tesis de Pregrado. Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá

Gauze, G. 1967. Conferencia de Antibióticos elaborados por hongos. La Habana. Cuba. Editorial Universitaria La Habana.

Granados, L; Valderrama, J. 2003. Evaluación de la A

compost. Tesis de Pregrado. Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá

Grigorevski, A; Nascimento, R;Bonb, E; Coelho, R. 2005. Streptomyces

drozdowiczii cellulase production usin

14

Diana Gaitán, Liliana Pérez

Guevara, C; Paez, A; Zambrano, M. 2003. Determinación de actividad

icrobiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Bogotá.

écnica de

detección de β-1,4 glucanasas con el uso de sustratos fluorόgenos en suelos

ciencias. Bogotá.

Heck,J; Hertz, P; Ayub, M.2002. Cellulase and Xylanase production by

Hendricks, C. Doyle, J and Hugley, B. 1995. A New Solid Medium for

se-Utilizing Bacteria in Soil. Appl. Environ. Microbiol.

Bacteriology. Novena Edición. Lippincott Williams & Wilkins. Pág. 605-607

chnology: issues of bioconversion and enzyme production. African Journal of Biotechnology. 2: 602-619.

cterial cellulases by solid state

bioprocessing of banana wastes. Bioresource Technology. 69:231-239.

g bacteria from flower stalks-vegetable waste co-composting system. J.Gen. Appl. Microbiol. 51:

logy. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 16: 577-583.

celulolítica y establecimiento de un consorcio bacteriano aislado de diferentes regiones y sustratos del país. Tesis de Pregrado. Carrera de M

Gutiérrez, V; Martinez, M; Pinzón, A. 2007. Estandarización de la t

provenientes de cultivos de Stevia “Rebaudiana bertoni”. Tesis de Pregrado. Carrera de Microbiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de

isolated amazon Bacillus strains using soybean industrial residue based solid-state cultivation. Brazilian journal of microbiology. 33: 213-218.

Enumerating Cellulo61: 2016-2019.

Holt, J; krieg, N; Sneath, P; Staley, J; Williams, S. 2000. Bergey’s Manual of Determinative

Howard, R ; Abotsi, E; Rensburg, J; Howard,S. Lignocellulose Biote

Krishna, C. 1999. Production of ba

Li, X. 1997. Streptomyces cellulolyticus sp. nov., a New Cellulolytic Member of the Genus Streptomyces. International journal of systematic bacteriology. 47: 443-445.

Lu, W. Wang, H. Yang, S. Wang, Z. Nie, Y. 2005. Isolation and characterization of mesophilic cellulose-degradin

353-360.

Lynd, L., Weimer, P., Zyl, H., Pretorius, I. 2002. Microbial cellulose utilization: Fundamentals and Biotechno

Malherbe, S y Cloete, T. E. 2002. Lignocellulose Biodegradation: Fundamentals and applications. Re/Views in Environmental Science & Bio/Technology 1:105-114.

15

Diana Gaitán, Liliana Pérez

Miller, G.1959. Use of Dinitrosalisyc Acid Reagent for determination of

reducing sugar. Analytical chemistry. 31:426-428

Moreno, B.; Diez, V.; García, M.; Menes,L.;Gutierrez, M.; Polledo,F. 20

00. Comisión Internacional de especificaciones microbiológicas alimentarías.

ls. Resourses, Conservation and Recycling 27:309-332.

ombinantes.

Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología Aplicada. Sociedad

oha, J. 2003. Degradación enzimática de celulosa por

actinomicetos termófilos: Aislamiento, caracterización y determinación de la

omes, C; Lindares, A; Duarte, G; Nascimento, R; Rosado, A;

Pinheiro, M; Margis, R; Silva, K; Alviano, C; Manfio, G; Soares, M;

28.

bovine rumen. Appl Environ. Microbiol. 43: 777-780

nd selection strategies. Biotechnology Advances. 24: 452-481.

ICMFS. Editorial Acribia. Zaragoza (España). Pág. 125-126

Petre, M; Zahareña, G; Adrian, P; Gheorghiu, E. 1999. Biodegradation and Bioconversion of cellulose wastes using bacterial and fungal cells immobilized in radiopolymerized hydroge

Poutou, R.; Amador, E.; Candelario,M. 1994. Banco de células primario (BCP): Caracterización y papel en la producción de proteínas rec

Iberoamericana de Biotecnología. 11:55-59

Ramírez, P; C

actividad celulolítica. Rev. Perú. Biol. 10: 67-77.

Semedo, L; G

Lindares, L; Coelho, R. 2004. Streptomyces drozdowiczii sp. nov., a novel cellulolytic streptomycete from soil in Brazil. Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54:1323-13

Teather, R; Wood, P.1982. Use of congo red – polysaccharide interaction in

enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the

Zhang, Y. Himmel, M. Mielenz, J. 2006. Outlook for cellulase improvement: Screening a

16