aislamiento demicroorganismos

7/28/2019 Aislamiento deMicroorganismos

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Trabajo Prctico N4

Aislamiento de Microorganismos

Diversidad Metablica


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Objetivo del Trabajo Prctico

Aislamiento de microorganismos partir dedistintos inculos (agua, ricota, arroz, tierra

y yogurt)

1)Enriquecimiento-Seleccin

2)Seleccin-Diferenciacin3)Obtencin de un cultivo puro (Tincin deGram y Pruebas Bioqumicas)


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Microorganismos a aislar:

Enterobacterias (agua) Pseudomonasspp. (agua) Staphylococcusspp. (ricota) Bacillusspp. (arroz)

Lactobacillusspp. (yogurt) Azotobacterspp. (tierra)


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Medios de Cultivo: caractersticas generales

Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgnicas,vitaminas)

Disponibilidad de oxgeno

pH

HumedadTemperatura

Esterilidad


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Medios Definidos o Complejos

Medios Mnimos (definidos) o Ricos(complejos).


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Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones)son conocidos.

Ejemplo de Medio DefinidoparaEscherichia coli:

Componente Gramos/litro

Glucosa 5 Fuente de C yenerga

Na2HPO4 6 Buffer, fuente de P

KH2PO4 3 Buffer, fuente de P

NH4Cl 1 Fuente de N

NaCl 0.5 Fuente de Na

MgSO47H2O 0.12 Fuente de Mg

CaCl22H2O 0.01 Fuente de Ca


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Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composicin exacta dedesconoce (extractos, peptonas, etc).

Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:Componente Gramos/litro

Extracto decarne

5 Fuente de aminocidos, nucletidos, vitaminas ymicronutrientes. Tambin fuente de C.

Peptona 6 Fuente de aminocidos, nucletidos, vitaminas ymicronutrientes. Tambin fuente de C.

Glucosa 5 Fuente de C y energa.

Na2HPO412H2O 4 Buffer y fuente de P.

FeSO47H2O 0.3 Indicador de produccin de H2S. Fuente de Fe

y S.IndicadorSulfito deBismuto

8 Inhibe el crecimiento de Gram positivos

Verde Brillante 0.025 Inhibe el crecimiento de Gram positivos

gar 20


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Peptonas: pptidos (aminocidos libres), carbono y nucletidos.

Peptona de casena (triptona): degradacin pancretica de lacasena.

Peptona de carne: degradacin pancretica de la carne.

Peptona de gelatina: degradacin pancretica de la gelatina.

Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporcinde pptidos de menor PM, aminocidos libres y factores de

crecimiento.

Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levaduraautolizada. Alto contenido de vitaminas.


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Medio Mnimo: posee la mnima cantidad de nutrientes requeridospara el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.

Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia(provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medioscomplejos.

Por ej: Luria-Bertani (LB):

Componente Gramos/litro

Triptona 10 Aminocidos, carbono, energa, macro y

micronutrientes.Extracto deLevadura

5 Vitaminas, macro y micronutrientes.

NaCl 10 Balance osmtico.


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Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el aislamiento

de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el cultivo enel organismo de inters.

Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de ungrupo de bacterias y queinhibenel desarrollo de otros grupos. Por ej:sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram

positivos.Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algncambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reaccinqumica. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillocuando el pH del medio es cido (permite distinguir a las bacterias

que fermentan lactosa).Medio Selectivo y Diferencial.


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1. Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en

un caldo de enriquecimiento.

2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados.

3. Estriar en medio selectivo (adems puede ser diferencial).Obtencin de colonias aisladas.

4. Tincin de Gram

5. Pruebas Bioqumicas: TP Nro. 5.

Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):


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Enterobacterias g-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Fermentadores de glucosa Anaerobios facultativos

Flagelos peritricos Escherichia coli (algunas cepas patgenas) Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella,

Proteus, entre otros. Todos con especies patgenas. Oxidasa negativos


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Aislamiento de Enterobacterias (agua)

1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento yselectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche.

Peptona de CasenaLactosaBilis de BueyPrpura de BromocresolpH= 7,40,2

Incubar por 48 hs a 37C

Si hay fermentacin de lactosa:

Slo cido Coliformes, sin E. coliGas + cido E.coli(junto a otras coliformes)


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Crecimiento en

Caldo Mac Conkey

Cambio de

color aamarillo

Formacin de

Gas

Escherichia coli

(lactosa +)Bueno S S

Enterobactercloacae

(lactosa +)

Bueno S S

Klebsiellapneumoniae

(lactosa +)

Bueno S S

Proteus mirabilis Bueno No No

Pseudomonasaeruginosa

Malo

Staphylococcusaureus

Malo

Si hay formacin de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, elsiguiente paso es estriar en gar Mac Conkey y gar EMB.



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2. gar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.

Peptona de CasenaPeptona de CarneCloruro de SodioLactosaSales biliaresCristal violetaRojo Neutro

pH= 7,10,1Incubar por 24 hsa 37C

Apariencia de las

colonias

Microorganismo

Grandes, rojas, conhalo

Escherichia coli(lactosa +)

Grandes, rosadas,mucoides

Enterobacter spp., Klebsiellaspp. (lactosa +)

Incoloras,transparentes Salmonella spp., Shigella spp.,Proteus spp.Pequeas, opacas,aisladas

Enterococci, Staphylococci



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Escherichia coli Salmonella typhimurium

gar Mac Conkey

Lactosa + Lactosa -


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2.gar EMB: medio selectivo y diferencial(enterobacterias patgenas).

Peptona de CarneHidrgenofosfato dipotsicoLactosa

SacarosaEosina AmarillentaAzul de MetilenopH=7,00,2

Incubar por 24 hsa 37C

Apariencia de lascolonias Microorganismo

Transparentes, de colormbar

Salmonella spp., Shigella spp.

Verdosas con brillometlico a la luz

reflejada, con el centronegroazulado a la luztransmitida

Escherichia coli(lactosa +,sacarosa +)

Ms grandes que las deE. coli, mucosas,confluentes, con el

centro pardo-grisceo ala luz transmitida

Enterobacter spp., Klebsiellaspp. (lactosa+, sacarosa-)



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Escherichia coli Enterobacterspp.

gar EMB

Lactosa + Lactosa +


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Pseudomonasspp. g-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Aerobios estrictos Con flagelos polares

Producen pigmentos No fermentadores Oxidasa positivos Patgenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos


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Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa(agua)

1. Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42C:enriquecimiento y seleccin.

2. Estriar en gar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonasaeruginosa

Peptona de Gelatina MgCl2 Cetrimida Glicerina SO4K2

Incubar por 48 hs a 37C.

Pseudomonas aeruginosa


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Staphylococcusspp.

Cocos Gram positivos Anaerobios facultativos

Fermentan glucosa (ac. lctico) Asociados a piel y mucosas Patgenos (S. aureus) Resisten altas concentraciones salinas


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Aislamiento de Staphylococcus aureus(ricota)

1. Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento(2 hs a temperaturaambiente)

2. Mezclar con Caldo Cerebro Corazn (con NaCl 13%): medio selectivopara Estafilococos patgenos.

Infusin de cerebro Infusin de corazn Proteosa peptona D(+) Glucosa NaCl (7.5% final) Hidrgenofosfato disdico

pH=7,40,2


Si hay crecimiento, estriar en gar manitol salado-rojo fenol y gar azida


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Aislamiento de Staphylococcus aureus

3. gar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite

distinguir entre S. aureusy otras especies no patgenas). Peptona de carne Extracto de carne NaCl 7.5% D(-)Manitol Rojo fenol

pH=7,40,2


3. gar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp.Incubar por 48 hs a 37C

Apariencia de las colonias Microorganismo

Con halo amarillo,luminoso; crecimientointenso

Manitol-positivos: S.aureus

Sin cambio de color; pococrecimiento Manitol-negativos: S.epidermidisy otros.

1. S. aureus 2. S. epidermidis3. Micrococcus luteus


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Bacillusspp. Bacilos Gram positivos Forman endosporas Generalmente mviles con flagelos peritricos

Aerobios (facultativos) B. cereus(alimentos) B. anthracis


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Aislamiento de Bacillus cereusy Bacillus subtilis(arroz)

1. Arroz en PBS (80C por 5 min.): seleccin.2. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento.3. Incubar por 48 hs a 37C.4. Estriar en gar Mossel con emulsin de yema de huevo: selectivo y

diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereusy B. subtilis)

Peptona de carne Extracto de carne D(-)Manitol NaCl Rojo Fenol Emulsin de yema de huevo/Polimixina B

Incubar por 48 hs a37C.Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado

blanco (Manitol y lecitinasa +).

Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).


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Lactobacillusspp. Bacilos o cocobacilos Gram positivos Fermentadores lcticos Aerobios facultativos o microaerfilos


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Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)

1. gar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimientoselectivo.Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso.pH = 5.7.Incubacin en microaerobiosis.

gar MRS-Lactobacillus casei

2. gar Rogosa: medio ms selectivo que elanterior, con mayores concentraciones deacetato y pH = 5.5 que inhiben floraacompaante.Incubacin en microaerobiosis.


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Azotobacterspp. Bacilos o cocos Gram negativos Habitan en el suelo y en el agua Fijan nitrgeno atmosfrico (N2 a NH3) Vida libre Forman quistes (similar a endosporas)

Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente denitrgeno. Contiene manitol (azcar fermentable).

Crecimiento a 28C.


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Microorganismo Enriquecimiento-Seleccin

Seleccin-Diferenciacin

Agua Enterobacterias Caldo Mc

Conkey

gar Mc Conkey

y gar EMBAgua Pseudomonas Caldo M9-42C gar Cetrimida

Ricota Staphylococcus Caldo cerebro-corazn con7.5% NaCl

gar manitolsalado rojofenol y gar

azidaArroz Bacillus 80C y caldo

nutritivogar Mossel conemulsin de

yema de huevo yPmB.

Yogurt Lactobacillus gar MRSMicroaerobiosis

gar RogosaMicroaerobiosis

Tierra Azotobacter Caldo Fred&Waskman-28C

gar Fred &Waskman-28C

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