aislamiento de plásmidos. conocer los fundamentos para la purificación del dna plasmídico y su...
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Transferencia de material genético II
Aislamiento de plásmidos
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Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA
Realizar el aislamiento de DNA plasmídico
Objetivos
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Estructura del ADNJames Watson y Francis Crick en 1953
demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice formada por dos cadenas.
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DNA
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La extensión de DNA que tiene cada organismo no es la misma.
El DNA a pesar de su extensión tiende a formar una estructura helicoidal compacta.
DNA
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Doble hélice Estabilizada por
puentes de hidrógeno
En la célula generalmente superempacada o superenrollada
Estructura del DNA
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Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez.
Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas
DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado.
Superenrrollado: Covalentemente cerrado y muy empacado
Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado
Conformaciones de un plásmido
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Conformaciones distintas del DNA: Superenrollamiento
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El superenrollado es más compacto y por tanto migra más rápido en el gel
Pero como vemos el superenrollamiento?
Abierto Relajado
Superenrollado
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1. Induce cambios locales en el DNA que desestabilizan la doble cadena y esto afecta la transcripción o cambia la unión de proteínas al DNA.
2. Induce cambios globales en el DNA, los cual hace que secuencias de DNA distantes se acerquen y facilita la compactación del DNA y la recombinación sitio específica
¿Cómo afecta el superenrollamiento del DNA a la función de la célula?
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DNA estructura helicoidal◦ Estructura estabilizada
por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (A=T; G≡C)
Superenrollamiento Desnaturalizar-
Renaturalizar: Romper y rehacer puentes de hidrógeno
Puentes de hidrógeno en el DNA
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DNA se puede desnaturalizar
Calor, pH,↑ iones
se eliminan sus puentes de hidrógeno.
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EFECTO HIPERCRÓMICO
Al monitorear su absorbencia a 260 m se observa que hay un aumento en está conforme alteramos o despegamos la doble hélice EFECTO HIPERCRÓMICO
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Tm Temperatura
a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.
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El DNA se puede volver a re-naturalizar.
Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea el correcto.
De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables.
La re-naturalización
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Paso 1: Lisis celular
Generalmente se realiza con detergentes lleva detergentes para solubilizar la membrana
Obtención del plásmido
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Paso 2: Precipitación de proteínas y desnaturalización del DNA
Se perturban los puentes de hidrógeno entre cadenas
Se añade generalmente NaOH
Obtención del plásmido
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Paso 3: Renaturalización del DNA
Se neutraliza el pH de la solución y se renaturaliza el DNA, PERO NO TODO!!!
Obtención del plásmido
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Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA plasmídico circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente.
En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución y la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para ambas macromoléculas.
Fundamento Lisis alcalina
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Continuación... Paso 4: Separación del
DNA cromosomal del DNA plasmídico y su purificación
El DNA cromosomal está agregado y al centrifugar se queda en el botón
El DNA renaturalizado se queda en la solución, el sobrenadante
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El experimento
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Una vez que se tenga el plásmido purificado entonces:
A. Correr una muestra en un gel de agarosaB. Medir la absorbancia a 260 nm.C. Estimar la concentración.D. Guardar a –20°C para usar en la próxima
sesión
Cuantificación
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Ensayo de restricción (2 h incubación de DNA con enzimas)
Corrimiento electroforético: Gel de agarosa (aprox 45 min)
Inducción de proteína recombinante (Alcanzar DO 0.6 en 1.5h; inducción 1.5h)
Corrimiento electroforético: Gel de poliacrilamida (45 min)
Siguiente sesión experimental
Continuamos con:
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Preparación de un gel de agarosa para el corrimiento electroforético del plásmido y los productos de restricción