4. LA CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

4.1 PROPÓSITOS DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

4.2 FACTORES A CONSIDERAR EN LA ELECCIÓN DE UN ENSAYO

4.3 NO COLORIMÉTRICOS PROCEDIMIENTOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

4.4 PROCEDIMIENTOS COLORIMÉTRICOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

EXPERIMENTO 4-1

LOS REACTIVOS NECESARIOS PARA EL CAPÍTULO 4

4,1 PROPÓSITOS DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

A menudo es importante conocer la concentración de proteína en una muestra. Las situaciones más comunes, cuando tal información necesaria caída en tres categorías: caracterización y purificación de proteínas y enzimas, estudios fisiológicos de la expresión de la proteína, y el diagnóstico clínico de los niveles de proteína alterada en los fluidos corporales, indicativos de una variedad de enfermedades. Como se verá, no hay método de la proteína sola determinación es adecuado para todas las aplicaciones, y una variedad de métodos han sido desarrollados, con cada método tiene ventajas y desventajas. El investigador debe elegir el método apropiado para el problema particular que nos ocupa. Determinación de la concentración de proteína total es una herramienta importante entre los procedimientos utilizados en la enzima y la caracterización y purificación de proteínas.

Durante la purificación de una enzima, el progreso de la purificación puede ser seguido mediante la comparación de la cantidad total de la actividad enzimática deseada (o antígeno de la proteína, u otra medida específica de la proteína diana) y la cantidad total de proteína después de cada etapa de fraccionamiento. Si la purificación está avanzando adecuadamente, tal como, la enzima se vuelve más pura, la cantidad de actividad enzimática relativa a la concentración de proteína total se incrementará. La relación de la actividad enzimática a la cantidad total de proteína en una muestra que se conoce como la actividad específica y se mide en unidades por miligramo de proteína. La cantidad de actividad de la enzima en una muestra es generalmente designado en "unidades", con una unidad es la cantidad de enzima necesaria para provocar la formación de un micromol de producto / min bajo un conjunto definido de condiciones de ensayo. Se le determinar la actividad específica de las proteínas en algunos de los experimentos descritos en este

libro, utilizando métodos para la cuantificación de la proteína total que explorar en este capítulo.

Determinación de la actividad específica de las enzimas a menudo es una parte importante de los estudios fisiológicos de las células intactas. Un enfoque de la investigación básica para el estudio de la regulación de la actividad de la enzima es hacer crecer las células en condiciones cuidadosamente controladas y explorar cómo las condiciones afectan el nivel de actividad enzimática específica. Por ejemplo, un nutriente o de la hormona podrían ser añadido a las células, y en varios intervalos de tiempo, las muestras pueden ser procesadas para determinar la actividad específica de la enzima regulada. Como en la caracterización de proteínas puras, medición de la actividad específica requiere un método para la determinación de la concentración total de proteínas, así como los métodos para la determinación de las unidades de actividad.

La cuantificación de proteínas en los fluidos corporales humanos proporciona una herramienta importante en el diagnóstico de enfermedades. Suero y orina son con frecuencia filtrada; líquido cefalorraquídeo es a veces también examinados. Una variedad de trastornos de la sangre, trastornos renales, trastornos digestivos, y cánceres puede dar lugar a alteraciones en el nivel de proteína en el suero y en la orina. Una prueba típica para el suero implica la electroforesis de proteínas séricas (SPE), en el que se utiliza un gel de agarosa bastante crudo método de electroforesis para separar las proteínas totales en 5 picos anchos, que representan clases diferentes de proteínas, tales como albúmina y globulinas. (En los capítulos posteriores de este libro usaremos tanto electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida SDS-electroforesis en gel). Los resultados de la electroforesis se comparan con la cantidad de proteína total en el suero. Para ello, el colorante de Bradford-Binding método se utiliza habitualmente en la clínica, y vamos a explorar este método en nuestros ejercicios de laboratorio. Cuando la concentración total de proteína del suero se altera, pero las alturas relativas de los picos en el electroforetograma son normales, es diagnóstico de ciertas anormalidades en la función renal o varias otras posibilidades. Total: proteína de suero también se examinan para diagnosticar una serie de enfermedades, mediante el examen de los cambios después de la tensión muscular o cambios nutricionales. La proteína en la orina, una afección conocida como proteinuria, es indicativa de más de treinta enfermedades, muchas relacionadas con la función renal. El riñón normal muy eficaz en la prevención de la excreción de proteína en la orina. El ensayo clínico típico para proteinuria implica una prueba automatizada que es altamente específico para la albúmina, la proteína principal del suero. Sin embargo, el diagnóstico específico de las enfermedades implica otras pruebas, tales como electroforesis en gel y la determinación de la proteína total. Varios métodos de fijación de colorante están en la caracterización de proteínas en la orina, incluyendo el método de Bradford.

4.2 FACTORES A CONSIDERAR EN LA ELECCIÓN DE UN ENSAYO

Como ya se ha discutido en términos generales (Capítulo 1), los factores a considerar para decidir qué método de ensayo para utilizar incluyen el intervalo de respuesta útil, la sensibilidad y la especificidad del ensayo, la facilidad de realizar el ensayo, las consideraciones de seguridad en la realización del ensayo , y el coste del ensayo. La gama de respuesta útil se refiere a si el cambio en la respuesta a los cambios de muestra se puede medir a varias concentraciones del material (en este caso, la proteína). Una respuesta lineal que se aplica en un rango muy amplio de concentraciones de proteína es altamente deseable, aunque no es absolutamente necesario. Si el ensayo da una buena respuesta sólo en un estrecho rango de concentraciones de proteína, será necesario diluir las muestras apropiadamente para estar dentro de ese rango. La sensibilidad se refiere al nivel más bajo que la muestra se puede detectar. En general, es preferible tener una alta sensibilidad, pero además de esta propiedad, debería ser posible medir un amplio rango de concentraciones que es probable que se encuentren o se utiliza. La especificidad se refiere al ensayo de responder sólo al componente deseado (en nuestro caso, la proteína), y no a otros componentes que pueden estar presentes. Si no hay contaminantes presentes, un ensayo con baja especificidad aún podría ser útil, y otras ventajas del método puede hacer que sea convincente. Sin embargo, la posible presencia de contaminantes generalmente no puede ser ignorada. Soluciones de proteínas pueden estar contaminados con hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos y otros componentes celulares, así como con sustancias introducidas por el investigador (a sabiendas o no).

En general, un ensayo muy específico, donde sólo la señal verdadera da una respuesta, es generalmente deseable. La facilidad de realizar el ensayo es obviamente importante. Los ensayos que son pesadas no sólo limitar la productividad, sino que también afectan a los tipos de experimentos que se pueden realizar mediante la colocación de las limitaciones en el número de muestras que pueden ser procesados. Si un ensayo implica reactivos potencialmente peligrosos o procedimientos frente a uno que no lo hace, estas diferencias deben ser consideradas. Esto es especialmente cierto si el ensayo es uno que se realiza con frecuencia. Finalmente, el coste debe ser considerada, incluyendo el coste de los instrumentos necesarios para el procedimiento, el tiempo necesario para el ensayo, y el coste de la eliminación adecuada de los materiales de desecho generados por el ensayo. En nuestros ejercicios de laboratorio, vamos a evaluar el alcance de la respuesta, la sensibilidad, la especificidad y facilidad de llevar a cabo diferentes métodos de

determinación de proteínas. Los métodos elegidos son relativamente seguros y de bajo costo, y se utilizan comúnmente.

Nuestro enfoque básico a utilizar ensayos cromogénicos para construir una curva estándar de muestras que contienen cantidades conocidas de una proteína purificada, albúmina de suero bovino (BSA). A continuación, se determina la cantidad de proteína en muestras desconocidas utilizando los mismos ensayos, comparando los resultados con los de las curvas de calibración obtenidas con BSA. Así, los experimentos son análogas a la determinación de la concentración de la PNP en muestras desconocidas, que se realizan en el Experimento 3-3.

Sin embargo, existe una diferencia importante en estos dos experimentos. La medición de la PNP implicado la lectura de la concentración desconocida de PNP puro a partir de una curva patrón que se construyó utilizando cantidades conocidas de puro PNP. Por el contrario, cuando la determinación de una concentración desconocida de la proteína, rara vez tiene la proteína pura. En cambio, las mezclas que contienen diferentes proteínas y otras sustancias (hidratos de carbono, lípidos, detergentes, nucleiacids, etc) suelen examinarse. Por lo tanto, si las reacciones cromogénicas se ven afectados por la composición de las proteínas o por las otras sustancias presentes, entonces la respuesta resultante puede no ser una determinación exacta de la concentración de proteína total. La presencia de muchos compuestos, tales como derivados de sulfhidrilo, detergentes, hidratos de carbono, derivados de aminas, ácidos nucleicos, lípidos, sales, etc, se sabe que afectan a las reacciones cromogénicas que se va a utilizar en este ejercicio de laboratorio. Por lo tanto, los resultados obtenidos con estos procedimientos sólo será una estimación de la concentración de proteína verdadera. Sin embargo, estos métodos se utilizan comúnmente porque son reproducible, fácil de realizar y de bajo costo, y las respuestas que dan son útiles. Una parte de nuestro ejercicio de laboratorio será comparar los resultados obtenidos cuando varios métodos cromogénicos diferentes se utilizan para determinar la concentración de proteína en las muestras desconocidas.

4.3 NO COLORIMÉTRICOS PROCEDIMIENTOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Uno de los primeros métodos para la determinación de proteínas fue ideado por Johan Kjeldahl en la década de 1880, este método implica la determinación de nitrógeno derivado de proteínas. El método consta de tres pasos:

Protein + H2SO4 → CO2 + (NH4)2SO4 + SO2 (4-1)

(NH4)2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O (4-2)

NH3 + H3BO3 ↔ NH4+ + H2BO- (4-3)

H2BO- + H+ ↔ H3BO3 (4-4)

En la primera etapa (4-1), átomos de nitrógeno son liberados de la proteína en forma de sulfato de amonio. Esta reacción implica el calentamiento de la proteína con ácido sulfúrico (a menudo con un catalizador) y produce vapores letales de óxido de azufre, por lo que debe llevarse a cabo en una campana de extracción. Después de la digestión es completa, la mezcla de reacción debe ser enfriado a temperatura ambiente para evitar una violenta explosión tras la adición de NaOH en el paso siguiente. La adición de NaOH a la digestión enfriado, y la destilación (que implican que hierve a una temperatura moderada) resulta en la formación de amoniaco (4-2), que es atrapado por reacción con ácido bórico en el destilado (4-3). El borato resultante que se formó en el destilado se valora después con ácido (4-4) en presencia de un indicador. La cantidad de ácido necesaria para titular el borato es equivalente a la cantidad de nitrógeno que estaba presente inicialmente. Tenga en cuenta que este método estima la totalidad del nitrógeno orgánico presente, no sólo a la contenida en la proteína. Considerar los temas discutidos en la sección anterior con respecto a este método y discutir en clase. Este método todavía está en uso en ciertas aplicaciones, tales como la cuantificación de proteínas en los productos alimenticios, ya que es muy reproducible, acomoda las muestras que son bastante grandes (lo que reduce la variabilidad en las mediciones de los materiales no homogéneos), y puede ser automatizado. Sin embargo, para la mayoría de aplicaciones en el laboratorio de investigación o clínico, este método no es práctico.

Una manera confiable para determinar la concentración de una proteína pura es llevar a cabo un análisis de aminoácidos de la proteína. Esto se realiza normalmente por hidrólisis ácida de la proteína seguida de separación de los aminoácidos y la determinación de su cantidad. Ciertos aminoácidos tales como triptófano y cisteína se destruyen parcialmente por hidrólisis ácida, hidrólisis ácida y convierte asparagina y glutamina en aspartato y glutamato. Por lo tanto, las concentraciones de los otros aminoácidos proporcionará la base para la evaluación de la concentración de proteína. No es necesario conocer la secuencia de aminoácidos de la proteína para que este método sea útil, pero es importante que la proteína sea puro. Desde un análisis preciso de aminoácidos requiere

un equipo especial, se hace generalmente por un mecanismo especial. Por lo tanto, no es realista utilizar este método para la determinación rutinaria de la concentración de proteínas. Sin embargo, si tiene una pequeña cantidad de proteína pura, entonces la determinación de su concentración por análisis de aminoácidos pueden ser útiles. A continuación, puede utilizar concentraciones conocidas de la proteína en las reacciones cromogénicas diferentes (ver más abajo) y comparar con los resultados obtenidos utilizando BSA. A partir de estos resultados, se puede calcular el factor apropiado para determinar la concentración real de la proteína con BSA como estándar en futuros experimentos.

Otra manera de determinar la concentración de proteína es determinar con precisión el contenido de materia seca después del secado a temperatura constante hasta peso constante. Obviamente, este método no es rápida, es sensible a la presencia de impurezas, y consume una gran cantidad de material. Por estas razones, este método no se utiliza con frecuencia.

Una variedad de métodos están disponibles para las células que crecen en presencia de aminoácidos radioactivos que se incorporan en la proteína. Después de un número suficiente de generaciones de crecimiento en medio que contiene los aminoácidos radiactivos, las proteínas dentro de la célula será uniformemente marcado. El nivel de radiactividad se puede entonces utilizar como un

medida muy precisa y muy específico de la cantidad de proteína total presente en una muestra. Sin embargo, los ensayos con materiales radiactivos requieren procedimientos especiales de seguridad (ver capítulo 2), sumándose al esfuerzo y los costes asociados con los procedimientos. Por lo tanto, estos métodos están limitados a experimentos a pequeña escala en las que otros métodos no son prácticos, generalmente debido a muy bajas concentraciones de proteína en las muestras.

4.4 PROCEDIMIENTOS COLORIMÉTRICOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Los métodos colorimétricos dominar los métodos modernos para la determinación de proteínas, ya que estos métodos toman ventaja de la amplia disponibilidad de espectrofotómetros, la gran precisión de espectrofotometría, la relativa especificidad de los ensayos colorimétricos, y el costo generalmente bajo, la sencillez, y los aspectos de seguridad de estos ensayos.

Absorbancia a 280 y 260 nm

La concentración de proteína se puede calcular midiendo la absorbancia de la proteína que contienen soluciones a 280 nm (UV). Este método se usa comúnmente, ya que no destruye la muestra y es muy rápido. De hecho, en muchos casos la absorbancia a 280 nm del eluido de las columnas de cromatografía se controla continuamente para determinar cuando las proteínas se eluye de la columna (capítulo 5). La instrumentación mínima requerida para el procedimiento es un espectrofotómetro capaz de mediciones en la región UV del espectro y cubetas de cuarzo (cubetas de vidrio no transmitirá 280-nm de luz). La mayoría de las proteínas tienen un máximo de absorción a 280 nm, debido a la presencia de los aminoácidos aromáticos, triptófano (W), tirosina (T) y fenilalanina (F), con el triptófano proporciona la mayor parte de la absorbancia. Puesto que cada proteína tiene una composición única de aminoácidos, la absortividad molar puede variar mucho, dependiendo del contenido específico de tales aminoácidos aromáticos. Las proteínas que carecen totalmente de W, Y y F no tendrá ningún máximo de absorción a 280 nm, mientras que las proteínas que contienen muchos W, Y, y los residuos de F tendrá altos absortividades molares. Por lo tanto, el método no es muy preciso a menos que la proteína es puro y la absortividad molar es conocido, por ejemplo, mediante la calibración con una muestra de concentración conocida (por ejemplo, una parte alícuota del mismo material que había sido analizado por separado mediante análisis de aminoácidos) . La absortividad molar a 280 nm (coeficiente de extinción) de las proteínas se expresa generalmente como E1% (10 mg / ml) o E1mg/ml, y el segundo puede variar desde 0.0 hasta 10 cm-1. A menos que la proteína está libre de otros compuestos que: absorben luz a 280 nm, los resultados serán inexactos. Los ácidos nucleicos son particularmente problemático porque la purina y anillos de pirimidina tienen máximos de absorción cerca de 260 nm con una absorción considerable se extiende a 280 nm. Si los ácidos nucleicos son el único contaminante, la concentración de proteína se puede estimar mediante la fórmula siguiente, que corrige razonablemente bien para el contenido de ácido nucleico: proteína (mg / ml) = A280 1.55 ~ 0.76 A260

Muchos de los espectrofotómetros simples no son capaces de operar en el rango UV. Sin embargo, si un espectrofotómetro capaz de medir la luz UV está disponible, será instructivo para extender los ejercicios de laboratorio para incluir la estimación de la concentración de proteína usando sus propiedades de absorbancia de UV a 280 y 260 nm.

MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS BIURET

En condiciones alcalinas, el cobre (II) se cree que se une a los nitrógenos de péptidos de proteínas (Figura 4-1) y este complejo absorbe luz máxima a 550 nm (Gornall et aL, 1949). Además, se cree que en la reacción de Biuret algunos de los Cu2+ se reduce a Cu1+ en una reacción secundaria con proteínas: esta propiedad se utiliza en el ácido bicinconínico (BCA) la determinación de proteínas. Puesto que el cobre reacciona con el enlace peptídico, hay poca interferencia por aminoácidos libres, y la composición de aminoácidos de las proteínas no es muy importante. Ciertos tampones, tales como Tris y amoníaco, reaccionar con el cobre (II), de manera que interfiera con el ensayo. La interferencia por amoniaco hace que este ensayo práctico utilizar en muestras de proteínas obtenidos a partir de la precipitación con sulfato de amonio porque estas muestras contienen altas concentraciones de amoníaco. Lo más importante, el ensayo es bastante insensible, limitando su utilidad. Es útil para muestras de tejido enteros y de otras fuentes en las que la proteína está en una concentración elevada.

Figura 4-1 complejo cúprico Putativos con enlaces peptídicos de las proteínas

LOWRY MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

El procedimiento de Lowry es uno de los métodos más comúnmente utilizados de determinación de la proteína porque es barato, fácil de realizar, muy sensible, y altamente reproducible. De hecho, la publicación que describe el método de (Lowry et al., 1951) es una de las publicaciones más citados en la historia de la investigación bioquímica. En el momento de la preparación de la presente edición de este libro, este manuscrito ha sido citado en más de 80.000 otros documentos, de acuerdo con el Google Scholar (Capítulo

15). Sin embargo, el ensayo tiene ciertas limitaciones importantes: que es sensible a una variedad de contaminantes, las curvas estándar son sólo lineal a concentraciones bajas en proteína, y el tiempo y la mezcla de los reactivos con las muestras debe ser precisa. Es esencial para crear una curva estándar determinaciones de proteína vez que se hace.

La reacción de Lowry consiste en la reacción de Biuret (descrito anteriormente), seguido por la reducción en condiciones alcalinas del reactivo de Folin-Ciocalteu (phosphomolybdotungstate ácidos mixtos). Los iones de cobre facilitar el proceso de reducción. Los principales grupos cromogénicos son los enlaces peptídicos en complejo con el cobre (Biuret), y los molybdotungstates azul reducidas, que se reduce en gran medida por Tyr, Trp, y aminoácidos polares. Por lo tanto, la sensibilidad de la prueba depende de la composición de la proteína. El producto de la reacción, heteropolymolybdenum azul, es de color azul intenso con un máximo de absorción de - 750 nm. Esta longitud de onda es por lo general fuera de la gama de colores de interferencia.

BICINCONÍNICO ACIDO (BCA) PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

La reacción es similar a la reacción de Lowry, excepto que el ácido bicinconínico (BCA) se utiliza en lugar del reactivo de Folin-Ciocalteu (Figura 4-2). Cu2+ se reduce a Cu1+ por la proteína en solución alcalina (la reacción de Biuret). Dos moléculas de BCA quelato a un ion cuproso que resulta en un color púrpura intenso, con un máximo de absorbancia a 560nm. La sensibilidad del método es similar al método de Lowry (20 a 2000 g/ml de la muestra desconocida), pero no es tan sensible a ciertos contaminantes, tales como detergentes. Sin embargo, la reacción es más sensible a la interferencia de los hidratos de carbono que es la reacción de Lowry. El método BCA no es un método de punto final verdadero, porque el color sigue desarrollando lentamente con el tiempo. Sin embargo, después de una incubación de 30 min a 37 °C, el color es suficientemente estable para mediciones fiables (deriva ~ 2.5% por 10 min). Algunas de las sustancias informó que interfiere con el método BCA son: catecolaminas, triptófano, lípidos, rojo fenol, cisteína, tirosina sacarosa, impuro o glicerol, H2O2, ácido úrico, y hierro. ¿Por qué cree que estas sustancias interfieren con el ensayo?

Proteina + Cu2+ OH Y Cu1+

Figura 4-2 BCA reaction

DYE-enlace de método (método de Bradford) DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

La unión del colorante, Coomassie ® Brilliant Blue G-250 (Figura 4-3), a las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante de 465 nm (rojo) a 595 nm (azul) en soluciones ácidas (Bradford, 1976; Sedmark y Grossberg, 0.1977). Este colorante forma complejos fuertes, no covalentes con proteínas a través de interacciones electrostáticas con los grupos amino y grupos carboxilo, y por fuerzas de van der Waals. Dado que la respuesta de color no mantener la linealidad en un amplio intervalo de concentración de proteína, se recomienda que una curva estándar se ejecuta con cada ensayo. El colorante se prepara como una solución madre en ácido fosfórico. El método es un sencillo procedimiento de un solo paso en el que se añade el reactivo colorante a las muestras y la absorbancia se mide a 595 nm. El método es muy sensible y precisa, pero las manchas de las cubetas y de reactivos es un tanto difícil de eliminar. Dye ensayos de unión de proteínas son compatibles con los tampones más comunes, reactivos caotrópicos tales como 6 M de guanidina-HCl, y 8 M de urea, y conservantes tales como azida de sodio. Sin embargo, altas concentraciones de detergentes pueden interferir con este ensayo. Un tinte muy similar, con Coomassie Brilliant Blue R-25G se utiliza para teñir bandas de proteínas en electroforesis en gel (Capítulo 6), Además de la Azul Brillante de Coomassie G-250 ensayo de unión (método de Bradford), una variedad de otros ensayos de unión de colorante tienen han desarrollado o están en desarrollo. Estos incluyen ensayos basados

en tintes diferentes, tales como verde de bromocresol (Spencer et al., 1977), rojo de pirogalol (Watanabe et al., 1986), y Eosina Y (Hong et al., 1999). La unión de estos colorantes (o complejos de molibdeno con estos colorantes) a las proteínas es sensible a una variedad de contaminantes y muestra grados variables de especificidad, como en el método de Bradford, y por lo tanto estos ensayos pueden tener una ventaja en circunstancias particulares (Durgawale et al. , 2005).

Figure 4-3 Coomassie Brilliant Blue G-250

REFERENCES

Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye-binding. Anal. Biochem. 72:248-54.Durgawale, P., S. Kanase, Shukla, P. S., & Sontakke, S. (2005). A sensitive and economical modified method for estimation of cerebrospinal fluid proteins. Indian Journal of Clinical Biochemistry 20:174-77.Gomall, A. G., Bardawill, C. J., & David, M. M. (1949). Determination of Serum Proteins by means of the Biuret Reaction. J. Biol. Chem. Ill: 751-66.Hong, H.-Y., Yoo, G. S., & Choi, J. K. (1999). An eosine Y method for protein determination in solution. Analytical Letters 32:2427-42.Lowry O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. (1951 ). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol Chem. 193: 265-75.Pierce Chemical Co., Instructions for Coomassie® Protein Assay Reagent # 23200.Peterson, G. L. (1979). Review of the Folin phenol quantitation method of Lowry, Rosebrough, Farr and Randall. Anal. Biochem. 100:201- 20. Sedmark, J. J, & Grossberg S. E. (1977). A rapid, sensitive and versatile assay for protein using Coomassie brilliant blue G250. Anal Biochem. 79:544-52.Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J. & Klenk, D. C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150:76-85.Spencer, K., &. Price, C. P. (1977). Influence of reagent quality & reaction condition on the determination of serum albumin by bromocresol green dye binding method. Ann. Clin. Biochem. 14:105-15.Watanabe, M., Kamei, S., Ohkubo, A., Yamanaka M., Ohsawa, S., & Tokuda, K. (1986). Urinary protein as measured with a pyrogallol red-molybdate complex, manually and in a Hitachi 726 automated analyzer. Clin. Chim. 32:1551-54.

EXPERIMENTO 1.4 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

OBJETIVOS

Se le proporcionará con una proteína estándar (BSA) a una concentración conocida (10 mg / ml) y varias muestras que contienen proteínas a concentraciones desconocidas. Algunas de estas muestras pueden contener BSA pura, mientras que otros pueden contener diferentes proteínas o mezclas de proteínas diferentes. Además, algunas de las muestras puede ser enriquecida con compuestos que contienen sulfhidrilo, detergentes, hidratos de carbono, etc, que puedan interferir con uno o más de los ensayos. Su objetivo será medir la concentración de proteína por el biuret, Lowry, BCA, y los métodos de Bradford para cada una de estas muestras. Al comparar los resultados de estos experimentos, puede ser capaz de deducir que las muestras eran mezclas de proteínas, y que las muestras contenían sustancias interferentes.

El primer paso en el análisis será preparar diluciones del patrón de BSA y BSA construir una curva estándar para cada método de ensayo. Entre las pautas generales para esto son que para los métodos de Biuret y Lowry, que va a utilizar una serie de muestras con diferentes cantidades conocidas de proteínas, que son 0,5 ml cada una. Para los métodos de BCA y Bradford, se utiliza una serie de muestras para la curva estándar que son 0,1 ml cada una. Las cantidades de proteínas utilizadas en el ensayo de Biuret debe ser mucho mayor que la cantidad utilizada en los otros ensayos, ya que este ensayo no es tan sensible como los otros. Asegúrese de tener un buen número de puntos dentro del rango de sensibilidad de cada método de ensayo (véase más adelante). Para determinar las concentraciones de proteína aparentes en las incógnitas, usted debe examinar varias diluciones de cada uno. Este paso es necesario para asegurar que al menos una de las diluciones se utilizaron los resultados en un valor que cae dentro de la porción lineal de la curva estándar. Además de las muestras no diluidas, las diluciones de 3 veces y 10 veces son suposiciones razonables. Es un buen diseño experimental para realizar los ensayos sobre los estándares y los desconocidos lado a lado al mismo tiempo. Esto asegura que las variables tales como temperatura, tiempo, etc están controladas internamente. Además, es útil para realizar los ensayos en duplicado, de modo que los errores grandes de pipeteo puede ser fácilmente reconocido y error experimental puede ser comprobada. Vamos a discutir los resultados obtenidos por los diferentes métodos y comparar los resultados de diferentes grupos utilizando las diferentes técnicas. Esto nos dará algunos resultados reales para entender mejor las diferencias entre precisión, exactitud y reproducibilidad.

En experimentos adicionales, usted puede decidir directamente cómo probar sustancias como detergentes afectará la validez de las pruebas. Deje que los instructores conozcan y se puede diseñar experimentos para llevar a cabo tales investigaciones. Estos experimentos deben ser diseñados por usted y su compañero de laboratorio utilizando los principios aprendidos en el experimento colorimetría, así como expuso en el Capítulo 1.

BIURET MÉTODO

MATERIALES

1. El reactivo de Biuret se prepara disolviendo 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 6 g de sodio tartrato de potasio en 500 ml de H2O. Añadir 300 ml de 10% (w / v) de NaOH, y llevar el volumen final a 1 L. almacenar el reactivo en un recipiente de plástico en la oscuridad. Se mantendrá indefinidamente si 1 g de yoduro de potasio se añadió para inhibir la reducción del cobre.

PROCEDIMIENTO

1. Componen un conjunto de normas utilizando BSA o alguna otra fuente de proteínas en el rango de 20-3000 mg / ml. En el procedimiento de Biuret, se utiliza 0,5 ml de cada muestra.

2. A 0,5 ml de las muestras desconocidas (y diluciones de las muestras), y a 0,5 ml de las normas de añadir 2,5 ml de reactivo de Biuret. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 min. Las incógnitas y las normas deben medirse en el mismo experimento.

3. Medir la absorbancia a 550 nm. El blanco para el instrumento debería ser 0,5 ml de tampón o agua (en lugar de la solución de proteína) + 2,5 ml de reactivo de Biuret.

4. Determinar su concentración de proteína (s) a partir de una curva estándar.

Método de Lowry.

MATERIALES 

1. Reactivos de archivo: Solución A: 1% w / v de sulfato de cobre (CuSO4 · 5H2O) Solución B: 2% w / v tartrato sódico potásico Solución C: 0,2 M NaOH Solución D: 4% de carbonato de sodio 

Lowry reactivo II (Folin-Ciocalteu 2x) 

2. Para 49 ml de solución C agregar 49 ml de Solución D. A continuación, añadir 1 ml de solución A y 1 ml de la solución B. Este es el reactivo de cobre alcalino (Reactivo Lowry I), que debe ser recién preparado para cada sesión de laboratorio. 

3. Diluir el reactivo de Folin-Ciocalteu 2 veces (es decir, diluir con un volumen igual de agua). Esto es Lowry reactivo II 

PROCEDIMIENTO 

1. Componen un conjunto de normas utilizando BSA o alguna otra fuente de proteínas en el intervalo de 5-500 mg / ml. En el procedimiento de Lowry, se utiliza 0,5 ml de cada muestra. 

2. A 0,5 ml de las muestras desconocidas (y diluciones de las muestras), y a 0,5 ml de las normas de añadir 2,5 ml de reactivo de Lowry I.  Mezclar bien y dejar reposar durante 10 minutos. Las incógnitas y las normas deben medirse en el mismo experimento. 

3. Para cada muestra, añadir 0,25 ml de reactivo de Lowry II y mezclar bien inmediatamente. Mezcla de inmediato es muy importante para obtener resultados satisfactorios. No agregue el reactivo a todos sus tubos y luego la mezcla, debido a que el pH local se degradará el reactivo de Lowry II si no mezclarse inmediatamente. Deje reposar durante 30 minutos. 

4. Medir la absorbancia a 750 nm (o con el Spec 20, a 650 nm) frente a un blanco que consiste en 0,5 ml de tampón de muestra (o agua) como las muestras procesadas. 5. Determinar su concentración de proteína (s) a partir de una curva estándar.

Método BCA

MATERIALES

1. Soluciones de archivo:

BCA Solución A: 1% de sodio BCA, 2% Na2CC) 3 * H20, 0,16%

tartrato de sodio, 0,4% de NaOH, y 0,95% NaHCOs, y suficiente bicarbonato sódico sólido para ajustar el pH a 11,25 (estable a temperatura ambiente)

BCA solución B: 4% de sulfato de cobre-5H20

Reactivo de Trabajo: Mezclar 50 volúmenes de la solución A con 1 BCA

volumen de la solución B. BCA

PROCEDIMIENTO

1. Componen un conjunto de normas utilizando BSA o alguna otra fuente de proteínas en el intervalo de 5-2000 mg / ml. En el procedimiento de BCA, se utiliza 0,1 ml de cada muestra.

2. Hasta 01 mL de las muestras desconocidas (y diluciones de las muestras), y 0,1 ml de las normas añadir 3 ml de reactivo BCA trabajando en tubos de ensayo etiquetados. Mezclar bien. Incubar los tubos a 37 ° C durante 30 min. Las incógnitas y las normas deben medirse en el mismo experimento.

3. Enfriar a temperatura ambiente y se leyó la absorbancia a 560 nm frente a un blanco de tampón de muestra procesada como anteriormente.

4. Determinar su concentración de proteína (s) a partir de una curva estándar.

MÉTODO DE BRADFORD

MATERIALES

Reactivo colorante: Use homogeneización vigorosa o agitación para disolver 100 mg de Coomassie ® Brilliant Blue G-250 en 50 ml de etanol al 95%. Esta solución se mezcla con 100 ml de ácido fosfórico al 85%, se diluyó con agua hasta 1 litro, y se filtró. El reactivo es estable durante 2 semanas a temperatura ambiente (el reactivo mezclado puede ser comprado de Pierce como reactivo de proteínas Coomassie ® de BioRad o como mezcla de ensayo de proteínas BioRad.

PROCEDIMIENTO

1. Componen un conjunto de normas utilizando BSA o alguna otra fuente de proteínas en el intervalo de 5-2000 mg / ml. En el procedimiento de Bradford que va a utilizar 0,1 ml de cada muestra.

2. A 0,1 ml de las muestras desconocidas (y diluciones de las muestras), y a 0,1 ml de las normas de añadir 3 ml de reactivo de Bradford. Mezclar bien y dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min. Las incógnitas y las normas deben medirse en el mismo experimento.

3. Medir la absorbancia a 595 nm frente a un blanco que consiste en 100 l de tampón de muestra o agua y 3 ml de reactivo de tinte.

4. Determinar su concentración de proteína (s) a partir de una curva estándar.

REACTIVOS NECESARIOS PARA EL CAPÍTULO 4

• Sulfato de cobre, Sigma C6283, 250 g

• Sodio tartrato de potasio: Sigma S6170, 500 g

• El yoduro de potasio: Sigma P2963, 100 g

• carbonato de sodio: Sigma S7795, 1 kg

• Hidróxido de sodio: Sigma S0899, 500 g

• 2N Folin-Ciocalteu: Sigma F9252, 500 ml

• BCA (4, 4 '-dicarboxi-2, 2'-biquinolina): Sigma D8284, 10 g

• Bicarbonato de sodio: Sigma S6297, 1 kg

Nota: En lugar de preparar la solución de BCA, este reactivo se pueden comprar Sigma o Pierce (ver más abajo), en ese caso, BCA y bicarbonato de sodio no será necesario.

• BCA solución premezclada: Sigma B6943 o Pierce 23225

• Azul Brillante de Coomassie G-250: Sigma B5113, 100 mg / L de solución de trabajo

• 95% de etanol

• Ácido fosfórico

Nota: En lugar de preparar el reactivo colorante, este reactivo puede ser adquirido de Sigma, Pierce, o BioRad (ver más abajo). En ese caso, Azul Brillante de Coomassie G-250, 95% de etanol, y ácido fosfórico no será necesario.

• Bradford reactivo (premezclado): Sigma B6916, Pierce 23200, o 500-0006 BioRad