Electroforesis en protenas las tcnicas electroforticas fueron inducidas gracias a Tiselius. Este separo las protenas disueltas en una solucin de electrolitos mediante la aplicacin de una corriente elctrica a travs de un tubo de cuarzo en forma de U que contena la solucin proteica. Dado que se lograba su separacin en una solucin homognea sin medio de soporte solido , las fuerzas convectivas evitaban la resolucin en distintas zonas lo que se le llamo electroforesis frontal. el acetato de celulosa y de agarosa han predominado en el laboratorio clnico debido a la sencillez de empleo, su bajo coste y su disponibilidad comercial. cuando un medio de soporte electrofortico tiene una carga negativa, la fuerza electromotriz a la cual est sujeto tiende a desplazarlo hacia el nodo. sin embargo como el medio de soporte solido esta fijo y no puede desplazarse, hay , en vez de ello un flujo de tampn hacia el ctodo, este flujo se denomina endosmosis y tambin arrastra a las protenas con l hasta cierto punto. la distancia real discurrida por una protena determinada que migra en un campo elctrico viene determinada por las magnitudes combinadas de la fuerza electromotriz y la fuerza electroosmotica. Cuando la fuerza electroosmotica es superior a la fuerza electrofortica que acta sobre protenas poco anicnicas, estas protenas se mueven desde el punto de aplicacin al ctodo, si bien su carago en levemente negativa.

la poliacrilamida constituye un medio de soporte inerte cuya porosidad es fcilmente ajustable mediante modificaciones, previas a su polimerizacin, con la composicin de poliacrilamida es aplicable a separacin estndar de protenas en estado nativo puede utilizarse para separa protenas desacuerdo con su peso molecular cuando se encuentran desnaturalizadas. Actualmente esta es la tcnica mas usada en biologa molecular. sin embargo su poder de resolucin y separacin de protenas en multitud de subunidades ha dado lugar a que esta tcnica haya visto muy reducido su empleo en el laboratorio clnico Procedimientos: Se preparan de modo que sus poros sean de un tamao comparable al

de las protenas, de manera que produzcan un efecto de tamizado molecular; la separacin electrofortica depende entonces de la densidad de carga de las molculas y de su tamao, por lo que dos protenas con idntica densidad de carga, pero de tamao diferente pueden ser separadas, ya que el soporte dificulta ms el avance de la de mayor tamao. ENSAMBLAJE DE LA CMARA DE ELECTROFORSIS 4.3.1 El procedimiento para el ensamblaje de la cmara de electroforesis vara de acuerdo al modelo del equipo, en consecuencia el investigador deber seguir las instrucciones que recomienda el fabricante. 4.3.2 Debido a que la mayora de las cmaras de electroforesis parten del mismo principio tcnico. 4.3.3 En general, una cmara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes: - Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la altitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamao de los vidrios es variable, dependiendo de la dimensin de la cmara. -Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales dimensiones hechas de un material flexible pero resistente (generalmente poliestireno o tefln). La funcin de los espaciadores es determinar el grosor del gel. - Un peine, cuyos dientes pueden variar en nmero, tamao y grosor. Tiene el mismo grosor de los espaciadores y est confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde se colocarn las muestras. - Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los espaciadores, a travs de unas serie de prensas que ejercen presin y mantiene fijo todo el sistema 4.3.3.5 El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer de corrida superior e inferior. En algunos sistemas, este tanque contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listos para ser conectados. En otras cmaras existe una tapa que contiene los electrodos, de tal manera que el investigador ya no tiene contacto directo con el buffer durante el proceso de electroforesis. 4.3.3.6 Fuente de poder: aparato que tiene por funcin proveer de energa elctrica a la cmara de electroforesis. El voltaje, el amperaje y

el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las necesidades del investigador. Es importante sealar que la cmara de electroforesis ya ensamblada deber estar ubicada sobre una superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el momento en el que se vierte la solucin del gel dentro de la cmara, ya que se evita el derrame de la solucin y la generacin de matriz desnivelada. Esta ltima podra generar la distorsin del perfil de las bandas de las protenas al final de la electroforesis. 4.4 PREPARACIN DE LOS GELES DE POLIACRILAMIDA 4.4.1 La electroforesis de protenas corresponde al sistema discontinuo denaturante. Es discontinuo porque est conformado por dos geles de poliacrilamida de resolucin y empacamiento que presentan diferente concentracin, composicin y pH. Ambos geles se encuentran unidos pero limitados por una fase de separacin visible al trasluz. Debido a que en estado lquido ambos geles pueden mezclarse fcilmente, deben ser preparados por separado esperando la total polimeracin del primero para continuar con la polimerizacin del otro. El gel de empacamiento generalmente se localiza en la parte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarn las muestras. El gel de resolucin por su parte forma el cuerpo del gel por donde migrarn y se separarn las protenas.

PREPARACIN DEL GEL DE RESOLUCIN: El gel de resolucin es la matriz de poliacrilamida donde las molculas de ADN o protenas, van a migrar generando un perfil de bandas o patrn electrofortico. Dicho patrn vara de acuerdo al peso molecular de cada una de las molculas y a la concentracin del gel mismo. Procedimiento: -Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones. - Marcar el lmite hasta donde la matriz de acrilamida ser vertida, trazando una lnea horizontal en el vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicacin exacta de la lnea, colocar el peine entre ambos vidrios y medir entre uno y cinco centmetros (dependiendo del tamao de la cmara) por debajo de los dientes del peine. - Realizar la preparacin del gel de resolucin a una concentracin de acuerdo a las necesidades, mezclando los componentes.

- Aproximadamente 5 mL de solucin debern ser preparados en caso de trabajar con geles pequeos de aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. La concentracin de poliacrilamida a usar depender de las necesidades del operador. - Una vez finalizada la preparacin de la solucin, aadir los catalizadores APS y TEMED uno por uno, tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen. Sistema de electroforesis vertical ensamblado Ctodo nodo Buffer de electroforesis Fuente de poder Tanque de electroforesis vertical -Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la lnea trazada. Posteriormente, aadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100 L) sobre la solucin de poliacrilamida para evitar el ingreso de molculas de oxgeno que retarden la polimerizacin. - Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerizacin la solucin de poliacrilamida remanente. - Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces co agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol. 4.6 PREPARACIN DEL GEL DE EMPACAMIENTO El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como caracterstica retener a las protenas mantenindolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolucin. Este proceso permite mejorar la resolucin de las protenas en la electroforesis.

Procedimiento: -Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones. - Mezclar los componentes del gel. -Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de asegurar que el TEMED y el APS se

distribuyan uniformemente en todo el volumen de la solucin. - Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cmara y sobre el gel de resolucin ya polimerizado. Inmediatamente despus, colocar el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos de poliacrilamida que lleguen a derramarse. - Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos usando como control de la polimerizacin la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el tubo. - Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con chorro suave de agua destilada.

Valores normales

Protena total: 6.4 a 8.3 g/dL Albmina: 3.5 a 5.0 g/dL Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL

Nota: g/dL= gramos por decilitro El principal uso de este test es para la deteccin de estados fisiopatolgicos tales como inflamacin, prdida de protenas, gammapatas monoclonales, que usualmente se encuentran asociadas con neoplasmas hematopoyticos, especialmente el mieloma mltiple y la macroglobulinemia de Waldenstrm. Esto tambin ocurre en otras condiciones malignas y benignas. Cualquier protena detectada deber ser identificada por una tcnica alternativa, tales como inmunofijacin o inmunoelectroforsis. Otras aplicaciones de la electroforesis en suero incluyen lo siguiente: *Evaluacin de protenas sricas, estado nutricional. *Estudio de enfermedades hepticas, incluyendo cirrosis y hepatitis crnica activa. En las enfermedades del hgado la albmina se disminuye. La alfa2 puede estar baja. Las gama son a menudo policlonales en muchos casos de cirrosis. La depresin normal entre el rea beta y gama puede estar ausente en la cirrosis heptica; esto es llamado puente beta-gama y son raramente encontrados juntos, an en pacientes quienes tienen una cirrosis heptica obvia. Las gammapatas policlonales ocurren en un amplio rango de entidades las cuales tienen en comn una estimulacin inmunolgica crnica (ejemplo: sarcoidosis, leishmanisis visceral y otras entidades). *Las gama globulinas pueden estar elevadas aisladas. Las fracciones incluyen Ig.G, Ig.A, Ig.M, Ig.D e Ig.E. El aumento policlonal difuso indica un proceso inmunolgico

crnico tal como aquel encontrado en las enfermedades del hgado (cirrosis, hepatitis crnica activa), enfermedades del colgeno (lupus, artritis reumatoidea), enfermedades infecciosas (osteomielitis, bronquiectasis, leishmaniasis visceral, lepra), otros estados inflamatorios (sarcoidosis), neoplasmas (algunos estados de la enfermedad de Hodgkin), y leucemia mielomonoctica crnica. Muchas pequeas bandas (oligoclonales) son observadas en pacientes con hepatitis, enfermedades del complejo inmune, sndrome de inmunodeficiencia adquirida y linfoadenopata angioinmunoblstica. *Gamapata Monoclonal (Protena M) los patrones pueden ser benignos, especialmente cuando son pequeos y aumentan, pero las gammapatas monoclonales, relatan, especialmente en el mieloma, amiloidosis primaria, macroglobulinemia de Waldenstrm y linfomas malignos ocasionales. Estos picos son altos, oscuros, con forma de agujas. Tambin pequeas gammapatas pueden encontrarse en enfermedades benignas, que pueden ser tambin detectadas tempranamente o desarrollar enfermedades linfoproliferativas malignas. Adems, tales gammapatas son consideradas como "gammapatas monoclonales de significado indeterminado". Todos los pacientes con Gammapata monoclonal debern tener un seguimiento con determinacin peridica de electroforesis de protenas para diferenciar el aumento de picos M. El aumento de protenas M requiere adems evaluacin de aspirado de medula, estudios de rayos X, electroforesis de protenas, estudios de inmunofijacin e inmunoelectroforticos. *Gammaglobulinas bajas: Tambin las gama globulinas pueden disminuir ligeramente con el aumento de la edad, cualquier disminucin mayor del rango normal sin explicaciones por causas obvias de prdida de protenas (tales como enfermedad renal conocida), adems se debe determinar inmunofijacin en orina para detectar posibles cadenas libres monoclonales (protenas de Bence Jones). La hipogamaglobulinemia es tambin observada en muchos pacientes con desordenes linfoproliferativos con clulas B tales como leucemia linfoctica crnica. Estas pueden disminuirse terapia citotxica o inmunosupresora (utilizando esteroides por tiempo prolongado, quimioterapia antineoplsica), enfermedades linfoproliferativas malignas, mieloma mltiple y sndrome de inmunodeficiencia variable en adultos. Si existe historia clnica familiar o en pacientes, de susceptibilidad a infeccin, la determinacin de cuantitativa de Ig.G, Ig.A e Ig.M por inmunodifusin o por nefelometra pueden ser de gran ayuda. Especial cuidado en los linfocitos en sangre perifrica, presencia o ausencia de hepatoesplenomegalia y pacientes mayores de 40 aos, presencia o ausencia de cadenas livianas en orina por inmunoelectroforsis o inmunofijacin pueden ser relevantes (enfermedad de cadenas ligeras). *Alfa 2 aumentada: Incluye fracciones reactivas-inflamatorias y pueden estar aumentadas en neoplasmas (carcinomas de clulas renales), infecciones agudas, fiebre reumtica, artritis, sndromes nefrticos y otros estados inflamatorios. La

macroglobulina alfa2 est aumentada en el embarazo y con la diabetes mellitus. Nios sanos tienen niveles ms altos que los del adulto. * Alfa2 disminuida: Una de las fracciones ms importantes es la Haptoglobina y su depresin puede indicar hemlisis. Adems pueden estar disminuidas cuando hay dao hepatocelular. Traumas y transfusiones pueden causar tambin su disminucin. *Alfa 1 globulinas: estn aumentadas en enfermedades inflamatorias activas o neoplasias. *Alfa 1 bajas o: la alfa1 antitripsina es responsable en un 90% de la actividad de la serina antiproteasa en el suero. Esta deficiencia es debida a una anormalidad gentica la cual deber ser investigada, porque causa enfisema y cirrosis. Si el paciente tiene enfisema, con historia familiar de enfisema, o enfermedad heptica desconocida, los ensayos de alfa-1 antitripsina y fenotipo son recomendados. *Albumina: es mejor determinarla por electroforesis que por mtodos qumicos. La electroforesis permite diagnosticar entidades raras tales como analbuminemia y bisalbuminemia. La albmina est aumentada en pacientes deshidratados y est disminuida en una amplia variedad de enfermedades subagudas, subcrnicas y crnicas hepticas, renales y gastrointestinales, adems en pacientes con desnutricin. *Disminucin total de las protenas con patrn normal esencial: puede indicar deficiencia en la dieta o hemodilucin. *Protenas totales significativamente elevadas con patrn normal esencial: puede ser debido a una deshidratacin secundaria. *Protenas totales y albmina significativamente baja, alfa2 aumentadas y gama disminuidas: es el prototipo tpico de sndrome nefrtico.

Limitaciones: La electroforesis de protenas en suero detecta algunas pero no todas las enfermedades del hgado. La electroforesis de protenas y la inmunoelectroforsis o la inmunofijacin en orina o en suero son utilizadas en estudios de pacientes con mieloma o macroglobulinemia de Waldenstrm. Los estudios en orina pueden ser tiles an si la electroforesis de protenas en suero no es notable. Hay varias formas de interpretar adecuadamente los resultados de una electroforesis. Una de ellas es por simple comparacin de los resultados del paciente con aquellas de patrones patolgicos que muestren los cambios caractersticos de las 5 protenas sricas bsicas en enfermedades especficas. Este mtodo ofrece gran ayuda al mdico, pero una mejor comprensin de las protenas que forman cada fraccin as como su funcin fisiolgica aumenta mucho la utilidad de la electroforesis. Se ha establecido que cada una de las 5 fracciones esta compuesta de

1-3 protenas especficas. Cmo un ejemplo, Alfa-2 est compuesta de 2 M y haptoglobina. Aumento o disminucin de la pendiente delantera (+) de ella refleja variaciones en contenido de 2 M mientras que cuando se altera el centro o la parte posterior (-) de esta curva, refleja variaciones en haptoglobina. El grfico muestra la localizacin de algunas protenas, alteraciones de forma en estas zonas se relacionan con cada una de ellas. Para evaluar los resultados apropiadamente usted debe familiarizarse con estos patrones y considerar el contenido en gm % que la grfica representa.

Resumen del Significado de los resultados anormales

La disminucin de la protena total puede indicar:

Desnutricin Sndrome nefrtico Enteropata por prdida de protenas gastrointestinal

El aumento de las protenas alpha-1 globulina puede indicar:

Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES) Enfermedad inflamatoria aguda Malignidad

La disminucin de las protenas alfa-1 globulinas puede indicar:

Deficiencia de alfa-1 antitripsina

El aumento de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:

Inflamacin aguda Inflamacin crnica

La disminucin de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:

Hemlisis

El aumento de las protenas beta globulinas puede indicar:

Hiperlipoproteinemia (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar)

Terapia de estrgenos

La disminucin de las protenas beta globulinas puede indicar:

Trastorno de coagulacin congnito Coagulopata de consumo Coagulacin intravascular diseminada

El aumento de las protenas gama globulinas puede indicar:

Mieloma mltiple Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES) Hiperinmunizacin Infeccin aguda Macroglobulinemia de Waldenstrom Enfermedad heptica crnica

TIPOS DE ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis capilar es una tcnica de separacin utilizada en distintas reas (qumica, bioqumica, etc.) para separar las diferentes molculas presentes en una disolucin de acuerdo con la relacin masa/carga de las mismas. La separacin se lleva a cabo en un tubo hueco de dimetro muy pequeo, de ah que reciba el nombre de

capilar. Esta separacin realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del lquido que contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin. La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a travs de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los mtodos ms utilizados para la purificacin, anlisis y caracterizacin de protenas. La tcnica permite separar molculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la accin de un campo elctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida (PAGE). En la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes de protenas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS), catropos (p.e. urea) y agentes reductores (2mercaptoetanol, DTT). Para la visualizacin de las protenas se utilizan diferentes mtodos de tincin, siendo el ms habitual el azul de coomassie. En la SDS-PAGE, la separacin es funcin del tamao (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las protenas. Para ello se compara la movilidad electrofortica (Rf) de la protena de peso molecular desconocido con el de protenas de referencia de peso molecular conocido. Formacin del gel de poliacrilamida

Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin vinlica del monmero acrilamida CH2=CH-CO-NH2 y del monmero entrecruzador N, N'-metilen-bis-acrilamida CH2 = CH- CO - NH - CH2 - NH - CO - CH = CH2. La polimerizacin se inicia con la formacin de radicales libres del monmero, que se producen por radicales libres de oxgeno, por causa de la accin de iones persulfato. Las aminas terciarias como el N, N, N, N -tetrametilen-diamina (TEMED) se emplean como catalizadores de esta reaccin, porque causan la formacin de radicales libres del

persulfato. Esta reaccin es fuertemente inhibida por altos niveles de oxgeno, por lo que la solucin debe ser desgasificada para lograr una formacin de gel reproducible. Hay muchos factores que desempean una funcin importante en la separacin electrofortica, como son pH, fuerza inica, gradiente de potencial, tiempo de corrida, concentraciones de acrilamida y bis-acrilamida, etc. Las condiciones ptimas de una buena separacin, en la prctica se determinan experimentalmente, con el anlisis de cmo influyen los diferentes factores en la electroforesis en cuestin. La naturaleza de la muestra sirve de gua para alcanzar las condiciones en la que se deben obtener los mejores resultados. ELECTROFORESIS EN PAPEL Se emplea en la separacin de sustancias de bajo peso molecular como aminocidos y pptidos. Es muy til en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y su rpido desarrollo. Pueden hacerse en tiras de acetato de celulosa, que son qumicamente ms homogneas y son transparentes. El acetato de celulosa se utiliza tambin para separar lipoprotenas. Proceso con electroforesis en papel. La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedeci con una disoluciones tampn, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampn. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolucin tampn y en los que se hayan colocado los electrodos. Se conectan los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las molculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de emigracin de una molcula, depende preferentemente de su carga ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA La electroforesis en agarosa permite separar molculas de DNA, cuando stas son sometidas a un campo elctrico y atradas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de accin opuesta que determinan la velocidad de la partcula. Primero, la fuerza elctrica atrae en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atraccin es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migracin y su intensidad depende del tamao y la forma de la partcula. El DNA est compuesto por cuatro nucletidos que tienen carga

negativa y peso molecular similar. Por lo tanto, la aceleracin impuesta por la fuerza elctrica es igual para cualquier molcula de cido nucledo. La diferencia en velocidad de migracin estar dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea por la forma y tamao de la molcula de DNA. En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molcula, entonces las distintas molculas tendrn una velocidad que slo depender de su tamao, es decir, de su longitud en pares de bases. Para lograr una separacin eficiente se utiliza un medio soporte que aumenta la friccin recibida por las macromolculas y reduce la difusin al mnimo. Este medio un polmero orgnico, conocida como gel, por su consistencia gelatinosa. Las mezclas de DNA de diferentes tamaos se hacen migrar a travs del gel durante cierto tiempo y se obtiene una separacin en el que la distancia migrada por una molcula es inversamente proporcional a su longitud en pares de bases (tamao). - Concentracin de agarosa Un fragmento de ADN de un tamao determinado migra a diferentes velocidades a travs de los geles segn la concentracin de agarosa. En funcin de la concentracin de agarosa o tampn, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a 50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % ISOELECTROENFOQUE Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas amfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir con su punto isoelctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas amfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el pH. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL La electroforesis bidimensional es una tcnica de alta resolucin cuyo

objetivo es la separacin de mezclas de protenas altamente complejas. La base de su elevado poder de resolucin est precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que las protenas son separadas secuencialmente por dos criterios fsicos. En primer lugar las protenas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoelctrico (isoelectroenfoque). Tras esta separacin por carga las protenas son separadas de acuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Tras la tincin del gel las protenas aparecen formando manchas circulares (spots). La interpretacin de resultados se realiza mediante numerosos programas especiales de anlisis de la imagen que permiten cuantificar protenas, calcular puntos isoelctricos, masas molares y correlacionar distintos patrones electroforticos para anlisis de fenotipos, taxonomas, etc.

Gammapata monoclonal Las gammapatas monoclonales representan un grupo diverso de trastornos caracterizados por la existencia de una clona (clulas genticamente idnticas) de linfocitos o clulas plasmticas que tienen capacidad de producir una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, que puede detectarse en sangre y/u orina en forma de una banda o componente monoclonal. El hallazgo de una banda monoclonal en un paciente no implica necesariamente presencia de una enfermedad maligna. la gammapatas monoclonales detectadas en el laboratorio con una prevalencia en la poblacin general es de 0.7 a 1.7 % pero en los individuos mayores de 70 aos alcanza hasta el 3%. Es una enfermedad asintomtica y por lo tanto los pacientes deben ser sometidos a un seguimiento clnico y analtico dada la posibilidad, a largo plazo, de progresin hacia una hemopata maligna. A un paciente que se le detecte esto se le debe practicar una serie de procedimientos como una exploracin fsica y pruebas de laboratorio, la presencia de anemia y dolores seos, insuficiencia renal o hipercalcemia

que nos pueden hacer sospechar un mieloma. Gammapata monoclonal de significado incierto: La GMSI recibe este nombre por dos motivos: 1. En la mayora de los casos su origen es desconocido, aunque puede ser secundaria a hepatopatas vricas, enfermedades autoinmunes, polineuropatas, etc. 2. Su pronstico y evolucin es incierto, un porcentaje de los pacientes progresan al cabo de aos hacia una enfermedad maligna tipo mieloma o linfoma. En un serie de 241 casos de GMSI seguidos durante 20 aos, un 26% de los mismos desarrollaron una enfermedad hematolgica maligna (69% mieloma, 11% macroglobulinemia, 8% amiloidosis, 5% enfermedades linfoproliferativas). Los criterios diagnsticos de la GMSI son: Protena monoclonal en suero < 3 g/dl, clulas plasmticas en mdula sea < 10%. No hay evidencia de anemia, hipercalcemia, insuficiencia renal o lesiones seas. Es la causa ms frecuente de aparicin de una banda monoclonal en un EEF realizado a un paciente asintomtico. Los pacientes deben ser sometidos a un seguimiento clnico y analtico dada la posibilidad, a largo plazo, de progresin hacia una hemopata maligna. Actitud clnica ante la aparicin de una banda monoclonal en suero y/o orina: Ante un paciente al que se le detecta una banda monoclonal en suero y/o orina, se debe descartar mediante la anamnesis, exploracin fsica y pruebas de laboratorio la presencia de anemia, dolores seos (muy importante no confundir con dolores de tipo osteoarticular), insuficiencia renal o hipercalcemia que nos pueden hacer sospechar un mieloma. Del mismo modo, debe descartarse la presencia de adenopatas o sntomas B asociados a un sndrome linfoproliferativo (fiebre, sudoracin nocturna, prdida de peso), sobre todo en pacientes con bandas monoclonales de tipo IgM. Pruebas de laboratorio iniciales ante la aparicin de una banda monoclonal. Hemograma completo y VSG Repeticin de protenas totales y proteinograma Inmunofijacin y cuantificacin de inmunoglobulinas Proteinuria de Bence-Jones (orina de 24 horas)

Creatinina, calcemia Si la anamnesis y las pruebas de laboratorio reseadas en la tabla 2 resultan normales y la cuanta de la protena monoclonal es inferior a 3 g/dl, no ser preciso realizar un estudio de mdula sea para realizar el diagnstico de GMSI2. En este caso, el paciente no precisa tratamiento alguno. nicamente se debe realizar un seguimiento clnico y analtico semestral o anual.

Criterios de derivacin al Especialista en Hematologa: En la actualidad, la mayor parte de los pacientes a los que se detecta una banda monoclonal en suero y/u orina son derivados al especialista en Hematologa con la sospecha de un proceso hematolgico maligno. Sin embargo, se sabe que ms de la mitad no precisa de una evaluacin ni seguimiento especializados. La ausencia de sntomas (descritos previamente) y una banda monoclonal de cuanta inferior a 3 g/dl son criterios diagnsticos de GMSI suficientes. El seguimiento de los pacientes que cumplan estos criterios de GMSI consiste en una revisin clnica y analtica para detectar una posible progresin hacia una enfermedad hematolgica, que puede ser

realizada en el mbito de la atencin primaria siguiendo el algoritmo diagnstico y de seguimiento propuesto.

PCR: reaccin en cadena de polimerasa.

Tcnica de biologa molecular, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo. Consiste en la separacin por calor de las dos cadenas de DNA que se quieren amplificar y su copia simultnea a partir de un punto determinado por un DNA artificial llamado cebador, esto ocurre mediante la accin de una enzima llamada DNApol. El resultado de esta tcnica es la duplicacin del nmero de molculas de una secuencia completa de DNA.

COMPONENTES ESENCIALES PARA LA TCNICA ADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores (primers) Desoxiribonucletidos trifosfatados (dNTPs) Cationes divalentes Buffer (para mantener el pH) ADN molde (Templado)

CONDICIONES DE LA MUESTRA

Integridad del ADN: este no puede estar fragmentado en trozos ms pequeos de lo que queremos amplificar. Origen de la muestra y proceso de extraccin: la muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentracin de iones de Mg, tampoco debe haber determinados factores sanguneos, fenol, detergentes que inhibiran la actividad de la polimerasa. Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificacin de ADN genmico de copia nica se usan cantidades de 100-500ng en el caso de zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50ng. El mnimo oscila entre 10-100ng y el mximo entre 400500ng. ETAPAS La reaccin en cadena de la polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que se repite durante un nmero determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el nmero de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificndolos podemos optimizar la reaccin. A) Desnaturalizacin Se trata de una etapa crtica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente.Es un calentamiento para la separacin de las dos hebras del DNA, mediante la incubacin breve (30-120 s) a una temperatura entre 68 y 97C, que debe ser superior a la de fusin (Tm) de la regin de DNA que se quiere amplificar. B) Templado o hibridacin Enfriamiento rpido por debajo de Tm, de forma que se permite la hibridacin de las hebras sencillas del DNA de inters con los oligos cebadores. Generalmente se usan temperaturas de 37 a 65C que se mantienen entre 10 y 120s. C) Elongacin Etapa de amplificacin propiamente dicha (72-75C, 13 min), en la que la DNA polimerasa termoestable elongacin los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La replicacin transcurre en direccin 5-3 a partir del extremo 3-OH de cada cebador.

APLICACIONES Por su alta sensibilidad, esta tcnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificacin de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el anlisis de muestras del nio y de su abuela materna. Entre las aplicaciones mdicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recin nacidos de madres seropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos impide obtener resultados confiables, con los mtodos convencionales, durante el primer ao de vida. Tambin ha facilitado el diagnstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis qustica, e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncolgicas. Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de clulas cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con una antelacin en extremo valiosa, un nuevo avance de la enfermedad. Existen ya modos de evaluar a travs de la PCR el riesgo de padecer enfermedades tales como diabetes de tipo I y la enfermedad celaca.

ELECTROFORESIS DEL ADN EN GELES DE AGAROSA La concentracin e integridad del ADN extrado, as como el tamao de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separacin de molculas (protenas, isoenzimas, cidos nucleicos) a travs de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidn). La matriz funciona como un filtro, separando las molculas en un campo elctrico, de acuerdo al tamao y la carga neta que poseen. En el caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en

condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (nodo) durante la electroforesis (Posso y Ghneim 2008). La resolucin y velocidad de separacin de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a travs de la concentracin de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamao migran ms rpidamente hacia el nodo que aquellos de mayor tamao. Al aumentar la concentracin de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolucin en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migracin de los fragmentos en el gel (Posso y Ghneim op cit.). Los cidos nucledos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tincin con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentracin mediante un anlisis comparativo con patrones de concentracin conocida. Los colorantes fluorescentes actan mediante insercin entre las pares de bases que conforman el cido nucleco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualizacin de ADN y ARN. Sin embargo, ste es un reactivo altamente txico, con propiedades mutagnicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados especficamente para reducir los riesgos potenciales de mutagnesis. La tcnica para la cuantificacin de ADN consiste simplemente en la utilizacin de una secuencia de concentraciones de solucin patrn de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentracin desconocida. El clculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta segn la fluorescencia. Debe evitarse la exposicin prolongada a la luz ultravioleta, incluso con mscara de proteccin. La estimacin de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre una fotografa digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imgenes (Posso y Ghneim op cit.). La concentracin de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamao del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamao, el del ADN total 2 (proveniente de una extraccin de ADN), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a voltajes de 60V para evitar la fragmentacin del mismo. Los segmentos de 1500pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2% y los pequeos segmentos de de 100pb a 500pb (los microsatlites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el ADN, a voltajes elevados ms rpido corren las muestras. La pureza de la agarosa y de la solucin tampn (TAE o TBE) puede variar segn la finalidad del ensayo. Es posible reutilizar una solucin de

agarosa para fines de una simple visualizacin de algn producto de PCR. No se debe reutilizar cuando con se va a cuantificar ADN ni a extraer bandas a partir del gel. Para reutilizar la solucin de agarosa se recomienda guardar el gel en un envase con tapa, esto evita la evaporacin y la entrada de polvo. En caso dado de que se evapore algo de la solucin se puede completar el volumen con solucin tampn limpia.

Definicin La electroforesis de cidos nucleicos es el mtodo habitual para separar, identificar y purificar molculas o fragmentos de DNA y RNA. En los tampones habitualmente utilizados, los cidos nucleicos estn cargados negativamente y migran hacia el nodo. Cada molcula aporta una carga negativa (procedente del grupo fosfato), por lo que la relacin carga/tamao es prcticamente constante e idntica para todas las molculas, independientemente de su tamao (un nucletido tendr la misma movilidad que un fragmento de doble cadena de 800pb o uno de 5kb). La electroforesis de DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida. Ambos soportes son restrictivos para los cidos nucleicos, de modo que los diferentes fragmentos (al tener la misma relacin carga/tamao), migran en funcin de su tamao y/o conformacin (tabla II). Los geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean para fragmentos pequeos de DNA (5-500pb), as como para la mayora de los RNA. Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos grandes de DNA (500pb-10Mb); utilizando agarosas de distintas concentraciones (distinto grado de reticulacin) pueden separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo elctrico constante; para separar fragmentos de tamao superiores a 50kb se utiliza la electroforesis de campo pulsante en la que la direccin del campo elctrico cambia peridicamente

Electroforesis en geles de agarosa. Se trata del mtodo ms comn para el anlisis, purificacin y obtencin de DNA. Las agarosas disponibles comercialmente presentan una amplia

gama de grados de pureza y especificaciones. La presencia de polisacridos sulfatados, contaminantes en algunas agarosas, puede ser perjudicial, ya que son inhibidores de las enzimas con las que va a tratarse el DNA purificado en la electroforesis (polimerasas, ligasas, endonucleasas de restriccin, etc.). Un aspecto importante de las agarosas es su estado fsico. La agarosa estndar gelifica a 35C y funde a 80-90C, aunque las hay modificadas por adicin de grupos hidroxietilo, que gelifican a menos de 30C y funden a 65C. Estos datos son importantes, ya que finalizada la electroforesis, el gel se puede licuar a temperatura superior a la de fusin y as separar el DNA en disolucin. Tambin es importante tener en cuenta la fragilidad del gel. Su resistencia mecnica se expresa en gr/cm2, que representa el peso que puede soportar 1 cm2 de un gel de agarosa al 1%. La agarosa estndar tiene una resistencia de 1000-2000gr/cm2, las de bajo punto de fusin alrededor de 200gr/cm2 y las de alta resistencia llegan hasta 6000gr/cm2. Hay agarosas de gran reticulado para fragmentos de pequeo tamao molecular; utilizadas a concentraciones de 2.0-4.5% (y mantenidas a 4C) separan eficazmente fragmentos de DNA de 700-3000pb. Adems, algunas son transparentes lo que facilita enormemente el proceso de deteccin. En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto molculas de ADN como protenas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros mtodos electroforticos que presentan ciertas modificaciones, as tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN (ADN genmico), la electroforesis bidimensional para un anlisis ms sofisticado de las protenas etc. El material biolgico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genmico y los productos de amplificacin pueden ser almacenados a 4C, mientras que el ADN plasmdico a - 20C. Las protenas deben ser conservadas a -80C o en su defecto a -20C. Todas las muestras biolgicas deben ser repartidas en alcuotas y en volmenes pequeos para evitar

etapas de descongelamiento o congelamiento drsticos que ocasionaran un eventual deterioro de las molculas. Materiales 5.2.2.1 Cmara de electroforesis vertical y accesorios. 5.2.2.2 Micropipetas de 20 , 200 L y 1 000 L. 5.2.2.3 Lmina extensible de parafina. 5.2.2.4 Puntas de polipropileno con capacidad para 20 , 200 y 1 000 l. 5.2.2.5 Buffer de resolucin stock TBE 5X (Anexo A). 5.2.2.6 Buffer de resolucin TBE 1X (Anexo A). 5.2.2.7 Poliacrilamida al 30%. 5.2.2.8 APS al 10%. Procedimiento a. Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones. b. No ser necesario marcar el lmite hasta donde ser vertida la poliacrilamida, debido a que el gel usado es continuo. c. Realizar la preparacin del gel siguiendo el orden que se indica en el Anexo A. d. Aproximadamente 5 mL de la solucin debern ser preparado en caso de trabajar con geles pequeos (aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm). La concentracin de poliacrilamida para ADN depender de los objetivos de trabajo del operador. e. Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen. f. Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el tope. Inmediatamente despus, colocar el peine de tefln entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos de poliacrilamida que se lleguen a derramar. g. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 30 minutos, usando como control la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el tubo. h. Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con chorro suave de agua destilada.