31 proyecto de tesis 2010

PROYECTO DE TESIS

PROYECTO DE TESISPALABRAS CLAVES: Levadura productora de etanol, fenotipo killer, neutro y sensible.I. GENERALIDADES1. TTULOFenotipo killer en levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per.2. PERSONAL INVESTIGADOR2.1. Autor: Br. Cristian Enrrique Polo Zavala.Escuela Acadmico Profesional de Microbiologa y Parasitologa.Facultad de Ciencias Biolgicas.Universidad Nacional de Trujillo.

2.2. Asesora: Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona.Profesora Principal D.E.Dpto. Acadmico de Microbiologa y Parasitologa.Facultad de Ciencias Biolgicas.Universidad Nacional de Trujillo.3. TIPO DE INVESTIGACIN3.1. De acuerdo a la orientacin: Bsica.3.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin: Descriptiva.4. RGIMEN DE INVESTIGACIN: Orientada.

5. INSTITUCIN A LA QUE PERTENECE EL PROYECTOUniversidad Nacional de Trujillo, Facultad de Ciencias Biolgicas, Departamento Acadmico de Microbiologa y Parasitologa, Laboratorio de Microbiologa Industrial.6. LOCALIDAD E INSTITUCIN DONDE SE EJECUTAR EL PROYECTO6.1. Localidad: Trujillo.6.2. Institucin: Universidad Nacional de Trujillo, Facultad de Ciencias Biolgicas, Departamento de Microbiologa y Parasitologa, Laboratorio de Microbiologa Industrial.7. TAREAS DEL EQUIPO DE INVESTIGACIN Autor: Se encargar de la planificacin, implementacin y ejecucin del proyecto. Realizar el anlisis de los datos correspondientes, as como la bsqueda de informacin para redactar el informe final. Asesora: Coordinar con el autor las acciones necesarias para llevar a cabo la presente investigacin. Brindar las recomendaciones y directrices pertinentes para la marcha adecuada del proyecto.8. CRONOGRAMAETAPASTIEMPO (MESES)

a. Recoleccin de Datos12

b. Anlisis de Resultados4

c. Redaccin del Informe2

TOTAL18

9. FECHA DE INICIO Y TRMINO9.1. Fecha de Inicio: 27 de Febrero de 2009.9.2. Fecha de Trmino: 6 de Agosto de 2010.10. HORAS SEMANALES DEDICADAS AL PROYECTO10.1. Autor: 15 horas.10.2. Asesora: 2 horas.11. RECURSOS DISPONIBLES11.1. Personal Autor1 Asesora1 Tcnico de laboratorio1 Personal de servicio111.2. Equipos e instrumentos11.2.1. Equipos Autoclave Vertical1 unidad Balanza analticaAND1 unidad Cmara de Neubauer Ehartnack1 unidad Centrfuga Safeguard Centrifuge1 unidad Estufa Precisin Scientific C.O.1 unidad Horno Memmert1 unidad Microscopio binocular Micros Austria1 unidad Refrigeradora Electrolux 1 unidad11.2.2. Instrumento Micropipeta regulable de 1 - 100 L Brand1 unidad

11.3. Materiales y reactivos11.3.1. Material biolgico Levaduras productoras de etanol60 cultivos11.3.2. Material de vidrio Bagueta s/m1 unidad Baln de 1000 mL Duran1 unidad Beacker de 1000 mL Kimax1 unidad Lmina porta objeto Marienfeld30 unidades Laminilla cubre objeto Marienfeld30 unidades Matraz de 500 mL Boeco2 unidades Mechero s/m2 unidades Pipeta de 5 mL Marienfeld1 unidad Pipeta de 10 mL Marienfeld2 unidades Placa de Petri Pyrex30 unidades Set de coloracin Gram1 unidad Termmetro de -10 C a 110 C Boeco1 unidad Tubo de ensayo de 13 100 mm Pyrex50 unidades Vial s/m200 unidades11.4. Locales Laboratorio de Microbiologa Industrial. Facultad de Ciencias Biolgicas. Universidad Nacional de Trujillo.

12. RECURSOS NO DISPONIBLES Y PRESUPUESTOCDIGONATURALEZA DEL GASTOCOSTO S/.

5.3.11.20Viticos y asignaciones240.00

Movilidad local240.00

5.3.11.22Vestuario115.00

Guantes de ltex Top Glove 3 cajasMandil 2 unidadesMascarillas Hecos 2 cajas45.0050.0020.00

5.3.11.30Material de consumo2145.00

Material biolgico1436.40

S. cerevisiae killer CECT 1 cultivoS. cerevisiae sensible CECT 1 cultivo718.20718.20

Componentes de medios de cultivo y reactivos451.50

Agar Sabouraud Merck 500 g.Agua destilada 10 L.Alcohol yodado Aky 3 L.Azul de metileno Merck 25 g.Etanol de 96 Aky 3 L.220.0010.0016.50190.0015.00

Material de Escritorio23.00

Cinta adhesiva Masking Tape 2 unidades Papel bond A4 75g. Report 500 unidadesPlumn tinta indeleble Faber Castell 2 unidades4.0013.006.00

Material de limpieza59.60

Bolsas desechables 50 unidadesDetergente Opal de 360 g. 3 unidadesEscobilla para lavar tubos 3 unidadesFranela 1 metroHipoclorito de sodio Clorox 2 L.Jabn carblico Ronalds 2 unidades25.006.606.005.0010.007.00

Otros174.50

Algodn hidroflico Coppon 1Lb.Cinta de pH universal Albet 2 cajasEncendedor 2 unidadesMango y asa bacteriolgica 2 unidadesPabilo 1 conoPuntas para micropipetas Citoglas 500 unidades Ron de quemar 3 L.13.0090.002.0014.006.0045.00

4.50

5.3.11.39Otros servicios de terceros: Personas naturales173.00

Anillado 4 ejemplares Encuadernacin 7 ejemplaresFotocopiado 300 pginasTipeo e impresin en computadora 600 pginas8.00105.0030.0030.00

5.3.11.51Equipamiento y material duradero20.00

Cocina elctrica s/m20.00

RESUMEN DEL PRESUPUESTO:

CDIGONATURALEZA DEL GASTOCOSTO S/.

5.3.11.20Viticos y asignaciones240.00

5.3.11.22Vestuario115.00

5.3.11.30Material de consumo2145.00

5.3.11.39Otros servicios de terceros: Personas naturales173.00

5.3.11.51Equipamiento y material duradero20.00

TOTAL2693.00

13. FINANCIACIN13.1. Recursos disponibles: Laboratorio de Microbiologa Industrial.13.2. Recursos no disponibles: Autofinanciado.

II. PLAN DE INVESTIGACIN1. REALIDAD PROBLEMTICALas levaduras se hallan ampliamente distribuidas en el medio ambiente, en el suelo de los viedos, sobre la piel de algunas frutas, en la superficie de los vegetales, en el aparato digestivo de los animales, etc (Lee, 2000). La microflora natural de los frutos ricos en azcares fermentables est compuesta fundamentalmente por mohos y en menor nmero bacterias y levaduras, y vara con el clima y tipo de suelo; hay una gran variabilidad de los tipos microbianos encontrados en la flora natural de los frutos procedente de una regin a otra (Bourgeois y Larpent, 1995).Las levaduras son microorganismos fascinantes, porque sus actividades dinmicas y diversas afectan a muchas reas de la ciencia y la tecnologa. Algunas especies juegan un rol benfico en la produccin de alimentos, bebidas y frmacos, no obstante, otras son nocivas y pueden ocasionar importantes prdidas econmicas en la industria o ser causantes de enfermedades en el hombre (Buscott et al., 1996; Deak y Beuchat, 1996; Kurtzman y Mannarelli, 1998; Loureiro y Querol, 1999; Loureiro y Malfeito Ferreira, 2003).La chicha de jora, es un producto oriundo del Per, que se elabora artesanalmente y se consume adems en otros pases de Amrica del Sur, constituyendo un producto potencialmente industrializable. Se denomina chicha de jora, a la bebida alcohlica obtenida por fermentacin de la materia azucarada contenida en el mosto de malta de maz (Velsquez, 1979).La transformacin del mosto es consecuencia de un complejo conjunto de reacciones bioqumicas, producidas por distintas especies de levaduras y bacterias lcticas. Las levaduras son responsables de la biotransformacin de los azcares, principalmente glucosa y fructosa, en alcohol y CO2 (Pretorius, 2000). Desde Pasteur hasta la fecha se han realizado muchos estudios sobre fermentacin alcohlica; sin embargo, debido a su complejidad es un proceso an no entendido completamente (Ribreau-Gayon et al., 1975; Lafon-Lafourcade, 1983).

Sobre el origen de las levaduras existen dos teoras. La primera sostiene que los frutos daados sirven de "depsito" para microorganismos, entre los que se incluye Saccharomyces cerevisiae, y que por tanto, desarrollan en las fermentaciones espontneas (Mortimer y Polsinelli, 1999). La segunda teora afirma que proceden de las bombas, tuberas, depsitos de fermentacin etc. de la bodega; aunque no se descarta una presencia minoritaria de S. cerevisiae en los frutos (Martini, 1993; Fleet y Heard, 1993; Vaughan-Martini y Martini, 1995).Las fermentaciones espontneas son aqullas que se producen de forma natural, es decir, las realizan las levaduras provenientes de los frutos y del material de bodega, sin inoculacin externa. Esto hace que las fermentaciones espontneas no sean producto de la accin de una nica especie o cepa de levadura, sino una sucesin de especies y cepas de levaduras diferentes a lo largo del proceso (Kunkee y Amerine, 1970; Ribreau-Gayon et al., 1975; Lafon-Lafourcade, 1983; Zambonelli, 1988).As, en los primeros das de fermentacin, los gneros mayoritarios son Hanseniaspora/Kloeckera, Candida y en menor medida Hansenula, Pichia, Rhodotorula y Metschnikowia (Querol et al., 1990; Longo et al., 1991; Fleet y Heard, 1993; Schtz y Gafner, 1994). Despus de los 2 3 primeros das, estos gneros reducen su nmero, dando paso al crecimiento de otras especies ms tolerantes al etanol como Saccharomyces; controlando finalmente la fermentacin S. cerevisiae; como resultado de una seleccin natural (Frezier y Dubourdieu, 1992; Vezinhet et al., 1992; Fleet y Heard, 1993; Versavaud et al., 1993).Durante la seleccin natural en una fermentacin espontnea, se generan interacciones levadura-levadura de tipo antagnico; esa interaccin denominada fenmeno killer fue descubierto en 1963 por Bevan y Makower (Radler, 1980; Shimizu, 1993; Nguyen y Panon, 1998). Implica la secrecin por parte de ciertas levaduras de una protena txica de bajo peso molecular denominada toxina killer (Wickner, 1996; Woods y Bevan, 1968). Este fenmeno ha sido observado en Saccharomyces, Debaryomyces, Pichia, Zygosaccharomyces, Hanseniaspora, Candida y Cryptococcus (Fleet, 1997). La distribucin del fenotipo killer vara en funcin de la zona y su frecuencia de aislamiento es relativamente baja (Angulo et al., 1993; Hidalgo y Flores, 1994).Las levaduras que producen la toxina killer son inmunes a dicha toxina, pero tienen la capacidad de ser letales para las clulas denominadas sensibles, las cuales pueden ser del mismo o de diferente gnero; existen adems cepas neutras que no producen dicha toxina ni son sensibles a ella (Woods y Bevan, 1968; Wickner, 1996; Epifanio, 2005). Existen por lo tanto, tres fenotipos killer: killer (K+R+), sensible (K-R-) y neutro (K-R+) (Epifanio, 2005).La capacidad de producir la toxina killer por especies del gnero Saccharomyces como de resistir a su accin, est asociada a la presencia de partculas vricas citoplasmticas virus like particle (VLP) y algunos genes nucleares (Tipper y Bostian, 1984; Reyes et al., 1999). Estas VLP estn formadas por dos cadenas de ARN de doble hlice, L y M, siendo esta ltima la que codifica la toxina y el factor inmune de autoresistencia a la misma (Pretorius y Van der Westhuizen, 1991; Barre, 1992). La naturaleza de esta toxina permite distinguir cinco tipos de actividad killer entre las cepas de esta especie: K1, K2, K3, KT28 y K3 (Shimizu, 1993).As tambin se han encontrado al menos tres grupos de actividad (K1, K2 y K3) y cinco de resistencia (Young, 1987). Sin embargo, los grupos ms estudiados son el K1 y K2. El pH ptimo para la produccin de la toxina K1 se encuentra entre 4,6 y 4,8 (Woods y Bevan, 1968). Por el contrario, el rango de pH para el grupo de actividad K2 se encuentra entre 2,9 y 4,9 (Shimizu et al., 1985). En chicha de jora los valores de pH encontrados fluctan entre 3,5 y 5,4 , siendo en su mayora inferiores a 3,9 (Manrique, 1978).En Saccharomyces cerevisiae las VLP se transmiten a las clulas hijas mediante mecanismos distintos de los descritos por la gentica clsica (heredabilidad citoplasmtica). La persistencia de estas partculas vricas en las clulas es asintomtica, en contraste con algunos virus fngicos que se asocian con efectos adversos en su portador. Estos tipos de partculas vricas son consideradas no infectivas, ya que no se ha identificado, hasta el momento, ningn tipo de va de transmisin extracelular (Schmitt y Breinig, 2002).

Existen otras especies portadoras del carcter killer en los cuales los determinantes genticos para la toxina difieren del descrito para S. cerevisiae. En el caso de Kluyveromyces lactis son plsmidos constituidos por DNA, mientras que en Hanseniaspora uvarum, la protena txica est codificada a nivel cromosomal (Wickner, 1996).En Latinoamrica, se han hecho revelamientos de flora killer en bodegas de Brasil, Uruguay y Argentina. En este ltimo pas, tras el anlisis de las levaduras aisladas de mostos en distintos estados de fermentacin procedentes de bodegas de las provincias de Salta, La Rioja, San Juan y Mendoza, el fenmeno killer mostr una distribucin heterognea. Desde su total ausencia en la provincia de Salta hasta un 33.34% de cepas killer aisladas en bodegas de la provincia de San Juan, a partir de mostos que no haban sido sembrados con levaduras seleccionadas (Vazquez y Toro, 1994).Desde el punto de vista industrial, si una cepa killer posee buenas caractersticas de fermentacin, esta propiedad en s es favorable. Por el contrario, si una cepa killer posee propiedades no deseables puede originar dificultades en el proceso de fermentacin, aun si ste ha sido sembrado con cepas seleccionadas (Castellanos et al., 2008).Independientemente del gnero al cual pertenezcan, las cepas salvajes de levadura killer pueden interferir en la fermentacin y subsecuentemente en la calidad del producto. Su multiplicacin y actividad pueden potencialmente retardar el inicio de una fermentacin o dar un producto con niveles altos de acetaldehdo, cido lctico, cido actico u otras caractersticas sensoriales no deseadas (Bisson, 1999). A partir del descubrimiento de cepas killer de S. cerevisiae en bodegas y viedos europeos, se estimul el inters en develar el significado y alcances de esta propiedad en la industria vitivincola. As, las levaduras killer con buenas caractersticas de fermentacin han sido seleccionadas para la fermentacin de la cerveza, vino o sake, y por lo tanto, pueden usarse como cultivos iniciadores en la industria del vino y prevenir el desarrollo de levaduras salvajes sensibles (Hara et al., 1980 y 1981; Seki et al., 1985; Longo et al., 1990; Van Vuuren y Jacobs, 1992).Una cepa killer correctamente seleccionada ofrece las ventajas adicionales, en comparacin con las cepas convencionales, de matar determinado tipo de cepas nativas que producen efectos negativos en el proceso fermentativo; y de resultar inmune a las toxinas killer producidas por cepas nativas, garantizando su dominancia en la fermentacin y protegiendo al producto de contaminantes (Sangorrn et al., 2002), eliminando de este modo las cepas sensibles en el transcurso de la fermentacin (Coratza et al., 1992; Perez et al., 1995).Estas ventajas han permitido que, en los programas de seleccin de levaduras, el fenotipo killer se considere un criterio imprescindible para asegurar el xito de la inoculacin (Van Vuuren y Jacobs; 1992), principalmente en aquellas regiones donde este fenotipo se encuentra extendido entre las levaduras autctonas (Hidalgo y Flores, 1994; Perez et al., 1995).Debido a que en el Per no existen estudios publicados sobre la distribucin del fenotipo killer en levaduras aisladas de chicha de jora, la presente investigacin se enfoca en solucionar esta falta de conocimiento hallando el porcentaje del fenotipo killer en levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per. Esto permitir valorar la importancia del fenotipo killer como una caracterstica adicional para los programas de seleccin de levaduras productoras de etanol como es el caso de Saccharomyces cerevisiae.

2. PROBLEMACul es el porcentaje del fenotipo killer en 60 cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per durante al ao 2009 - 2010?3. HIPTESISImplcita.4. OBJETIVO El objetivo de la presente investigacin es conocer el porcentaje del fenotipo killer en 60 cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per.5. DISEO DE EXPERIENCIAS5.1. Universo muestralCultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per durante el ao 2009 - 2010.5.2. Muestra poblacionalCultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per y proporcionados por el Laboratorio de Microbiologa Industrial de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.5.3. Muestra60 cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per y proporcionados por el Laboratorio de Microbiologa Industrial de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.

5.4. Unidad de muestraUna asada de cada uno de los 60 cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per y proporcionados por el Laboratorio de Microbiologa Industrial de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.5.5. Diseo de contrastacin5.5.1. Material biolgicoSe emplearn 60 cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per y proporcionados por el Laboratorio de Microbiologa Industrial de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.5.5.2. Medios de cultivo empleados en la reactivacin, evaluacin de la pureza y el desarrollo de las levaduras (Anexo 1) Agar Extracto de Malta (AEM). Agar Sabouraud (AS). Caldo Yeast Peptone Dextrose (YPD). Agar YPD-MB tamponado a pH 4,2 con buffer citrato-fosfato.5.5.3. Reactivacin y evaluacin de la pureza de los cultivos de levaduraA partir de los cultivos de levadura conservados en AS, se sembrarn en tubos conteniendo AEM; luego sern incubados entre 20 C a 22 C por 24 a 48 horas, cumplido el tiempo de incubacin, se harn coloraciones Gram para determinar su pureza. Los cultivos puros sern conservados en refrigeracin y los que estuviesen contaminados sern sometidos a purificacin mediante diluciones en agua destilada y siembra en AS.

5.5.4. Deteccin de actividad killer, neutra sensiblePara evaluar el fenotipo killer de las levaduras productoras de etanol, estas sern sembradas por estra en placas conteniendo agar YPD-MB, tamponado con buffer citrato-fosfato a pH 4,2 y se incubarn por 10 das a 22 C. Luego se sembrar junto a las estras anteriores el cultivo Saccharomyces cerevisiae CECT 1443 con fenotipo sensible y se incubar por 48 horas a 22 C. Las levaduras que inhiban el crecimiento del cultivo CECT 1443 sern consideradas con fenotipo killer.Para evaluar el fenotipo neutro sensible se sembrar por estra el cultivo Saccharomyces cerevisiae CECT 1387 con fenotipo killer en placas conteniendo agar YPD-MB, tamponado con buffer citrato- fosfato a pH 4,2 y se incubarn por 10 das a 22 C. Luego se sembrarn junto a dichas estras las levaduras productoras de etanol que no inhibieron el crecimiento del cultivo CECT 1443 en la evaluacin del fenotipo killer y se incubar por 48 horas a 22 C. Las levaduras que desarrollen sern consideradas con fenotipo neutro y las que no desarrollen sern consideradas con fenotipo sensible.5.5.5. Anlisis de resultadosEl anlisis estadstico de los distintos fenotipos respecto al carcter killer en los 60 cultivos de levaduras productoras de etanol evaluadas, se realizar mediante la prueba Ji-Cuadrado usando el programa estadstico SPSS versin 15.0 para Windows.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICASANGULO, L.; FREIRE, M.L.; LEMA, C.; VICENTE, J.A.; LPEZ, E. 1993. Presencia de levaduras killer durante la fermentacin de mostos de O Baixo Mio. En: XV Jornadas de viticultura y enologa de Tierra de Barros. Edit. Junta de Extremadura. Zafra. Badajoz. 215-224.BARRE, P. 1992. Le facteur killer. En: Les acquisitions rcentes en microbiologie du vin. Editor Doneche, B. Pars. 63-69.BISSON, L. 1999. Stuck and sluggish fermentations. American Journal of Enology and Viticulture. 50: 107-19.BOURGEOIS, C; LARPENT, J. 1995. Microbiologa Alimentaria, Tomo 2: Fermentacin Alimentaria. Zaragoza (Espaa): Editorial Acribia SA.BUSCOTT, F; WIPF, D; DI BATTISTA, C; MUNCH, J.C; BOTTON, B; MARTIN, F. 1996. DNA polymorphism in morels: PCR/RFLP analysis of the ribosomal DNA spacers and microsatellite-primed-PCR. Mycol Res. 100: 63-71.CASTELLANOS, L.; TORO, M.; VZQUEZ, F. 2008. Actualidad microbiolgica en vinos. 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ANEXOS

Anexo 1. Medios de cultivo empleados en la reactivacin, evaluacin de la pureza y el desarrollo de las levaduras.Agar Extracto de Malta (AEM).ComponentesCantidad

Extracto de malta35 g.

Agar20 g.

Agua destilada1000 mL.

pH final 5.6 0.2

Autoclavar durante 15 min a 121 C y 15 lb/in2 de presin.

Agar Sabouraud (AS).ComponentesCantidad

Glucosa40 g.

Mezcla de peptonas10 g.

Agar15 g.


pH final 5.6 0.2


Caldo Yeast Peptone Dextrose (YPD).ComponentesCantidad

Extracto de levadura10 g.

Peptona20 g.

Dextrosa20 g.


pH final 4.2 0.2


Agar YPD-MB.ComponentesCantidad

Extracto de levadura10 g.

Peptona20 g.

Glucosa20 g.

Agar20 g.

Azul de metileno0.03 g.


pH final 4.2 0.2


Solucin tampn.ComponentesCantidad

cido ctrico21 g.

K2PO428 g.


pH final 4.5 0.2

Ajustar el pH con cido fosfrico.

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31 proyecto de tesis 2010

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