3 clase fijacion 09

Profesora T.M JIMENA LE ROY

Un nanómetro es la millonésima parte de un milímetro: 1nm = 10-9 metros.

Las muestras pueden ser obtenidas por:

� Frotis

� Aspiración y/o lavado

� punción aspiración con aguja fina

� impronta

� biopsia

� punción con trocar

� autopsia.

1. Fijación2. Deshidratación

Pasos a seguir

PROCESAMIENTO DEL TEJIDO

2. Deshidratación3. Inclusión4. Corte5. Coloración

Punción con aguja

FROTIS

Obtención de la muestra

biopsia

Para fijar las muestras se emplean dos procedimiento:

• FIJACIÓN POR INMERSIÓN :

muestra debe realizarse inmediatamente de ser extraida del ser vivo (biopsia)o inmediatamente después de la muerte (necropsia).

• FIJACION POR PERFUSIÓN:

técnica ideal para animales de experimentación

Consolidar una disposición

espacial existente creando

enlaces entre moléculasenlaces entre moléculas

vecinas que soporten la

manipulación posterior.

� Detener los procesos de autólisis. Especialmente la acción de proteasas y nucleasas

� Conservar la cito-histoarquitectura de la

La fijación debe …

� Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.

� Preparar al tejido para los procedimientos posteriores

� Agente Anti-microbiano

Laboratorio de Ciencias MorfológicasUniversidad de Valparaíso

� Métodos Físicos

� Métodos Químicos� Métodos Químicos

� Aplicación de calor

� Microondas� Microondas

� Aplicación de frío

MÉTODOS FÍSICOS DE FIJACIÓN

CONGELACIÓN

• CO2• NITRÓGENO• REFRIGERACIÓN DIRECTA

� Buena conservación de la morfología� Se conservan sustancias solubles en agua� Se conservan moléculas pequeñas� Permite post fijación

• REFRIGERACIÓN DIRECTAA-70º

CONGELACIÓN

Trozos pequeños

o Paso por isopentanoo Nitrógeno líquidoo Transporte a cámara fría

No es una fijación propiameteNo es una fijación propiameteNo hay insolubización de proteínasComplementar con vapores de formol

CALOR

• Coagulación de proteínas

• Disolución de lípidos

• Baja conservación del tejido

• Conservación de núcleos

• Conservación de microrganismos

� Identificación lípidos

� Para biopsia contemporánea

Es necesario congelar una biopsia

� Para técnicas de inmuno

fluorescencia

� Para identificar enzimas

� Algunas técnicas argénticas

� Identificación lípidos

� Estabilización de proteinas, lipoproteínas, ac nucleicos y mucosustanciasmucosustancias

� Producen dureza del tejido

� Convierte citoplasma en un gel insoluble

Conserva organelos

Métodos Químicos

� Conserva organelos

� Penetración + lenta de medios de inclusión

� Convierte citoplasma en un gel insoluble

� Formaldehído

Métodos Químicos

� Conserva organelos

� Penetración + lenta de medios de inclusión

� Glutaraldehído

� Tetróxido de Os

� Coagulación de prot. Citoplasmáticas

Destrucción o

Métodos Químicos

� Destrucción o distorsión de organelos

� mejor penetración de inclusión en parafina

� Coagulación de prot. Citoplasmáticas

Destrucción o

� Etanol

� Metanol, Acetona

Métodos Químicos

� Destrucción o distorsión de organelos

� mejor penetración de inclusión en parafina

� Metanol, Acetona

� A. Tricloroacético

� A. Pícrico

� Cloruro mercurio

INMUNOHISTOQUIMICA

Patrón nuclear

INMUNOHISTOQUIMICA

Patrón extracelularfijación de matriz

� Que induzca cambios los menores cambios conformacionales en nuestro tejido

� No enmascare estructuras

� provoque la menor difusión,

� Provoque la menor extracción o desplazamiento de� Provoque la menor extracción o desplazamiento de

� Permita la penetración tinciones posteriores

� Buena morfología

� Baja toxicidad,

� Estabilidad en su almacenamiento

� Sea económico.

Cualidades de un fijador:

1.- Fijar la células antes que aparezcan fenómenos post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)

2.- Poseer alto poder de penetración para fijación correcta en las capas profundas de la pieza en las capas profundas de la pieza


1.- Fijar la células antes que aparezcan fenómenos post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)

2.- Poseer alto poder de penetración para fijación correcta en las capas profundas de la pieza

3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo

4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para su observación ulterior


1.-Fijar la células antes de que aparezcan los fenómenos post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)


3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo

4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para su observación ulterior

5.- Impedir la desaparición de los elementos solubles durante o después de ella.

6.- No provocar la producción de estructuras artificiales.




3.- Conservar los detalles estructurales que presentaban in vivo

4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para 4.- Permitir el empleo de procedimientos necesarios para su observación ulterior

5.-. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante o después de ella. 6.- No provocar la producción de estructuras artificiales.

7.- No retraer excesivamente los tejidos

8.- No volverlos friables o quebradizos.

Laboratorio de ciencias MorfológicasUniversidad de Valparaíso

3.- Conservar detalles estructurales que presentaban in vivo

4.- Permitir uso de procedimientos necesarios para observación ulterior

3.- Conservar detalles estructurales que presentaban in vivo

4.- Permitir uso de procedimientos necesarios para observación ulterior



5.-. Impedir la solubización de los elementos durante o después de ella.

5.-. Impedir la desaparición delos elementos solubles

durante o después de ella.

Laboaratorio Ciencias MorfológicasUniversidad de ValparaísoLaboaratorio Ciencias MorfológicasUniversidad de ValparaísoLaboaratorio Ciencias MorfológicasUniversidad de Valparaíso


� Temperatura / Tiempo de fijación

� Tamaño de la muestra

� Volumen de fijador

FIJADORES A BASE DE FORMOL

Formol neutro

Formol buffer

Histología en general

Estudios histológicos

Sistema nerviosoFormol buffer

Formol alcalino

Formol Ca etc

Impregnaciones argénticas

Tejido óseo

Identificación de fosfolípidos

proteínas

� Fijador de tipo coagulante, poco penetrante.

� Se emplea en mezclas fijadoras.

� La más usada es la mezcla de Bouin.� La más usada es la mezcla de Bouin.

� Provee buena morfología.

� Su uso se recomienda para estudio de inmunoglobulinas, filamentos intermedios y hormonas.

•ÁCIDO PÍCRICO

• Forma picratos:• Sales, uniéndose anión con grupos básicos de proteínas

• Los picratos son solubles en agua

• Se recomienda paso posterior en OH 80º

• El alcohol coagula finalmente picratos de las proteínas

• Hidroliza los ácidos nucleicos

• Fijaciones prolongadas destruyen el tejido

FIJADORES A BASE DE FORMOL Y ÁC PÍCRICO

•BOUIN

•HOLLANDE

•ALLEN

•DUBOSQ BRASIL

•GENDRE

•ROSSMAN

BOUIN HOLLANDE ALLEN

ESTUDIOS TOPOGRÁFICOSESTUDIOS TOPOGRÁFICOS

DA BUENAS COLORACIONES TRICRÓMICAS

HIDRATOS DE CARBONO EN GENERAL

ESTUDIOS CITOLÓGICOS

CONTRA INDICACIONES :

Tejidos hemorrágicos

BOUIN - HOLLANDE - ALLEN - DUBOSQ BRASIL

Tejidos hemorrágicos

Sistema nervioso

Reacción de Feulgen

Dubosq Brasil – Bouin alcohólico

Alcohol 80º…………………... 150 ccFormol………………………… 60 cc.AC. Acético glacial…………. 15 cc.AC. Pícrico……………………… 1 gr.AC. Pícrico……………………… 1 gr.

Tiempo de fijación de 4 a 24 horaslavado posterior en alcohol de 80º 3 horas.

DUBOSQ BRASIL

HISTOLOGIA EN GENERAL

MAS PENETRANTE QUE EL BOUIN

ESPECIAL PARA PUNCIONES

BIOPSIAS DE HÍGADO, RENALES Y TESTÍCULO

EN GENERAL PARA ESTRUCTURAS FINAS

GENDRE - ROSSMAN

HISTOLOGÍA DE POLISACÁRIDOS

IDEAL PARA GLICÓGENO

ÁCIDO ACÉTICO y MEZCLAS FIJADORAS

•No fija proteínas

•Coagula la cromatina nuclear

•Usado en mezclas fijadoras

Un agenta oxidante transfiere átomos de oxígeno al sustrato.

el agente oxidante puede ser descrito como un agente oxigenante o un agente de transferencia de átomos de oxígeno.

Algunos ejemplos son :

o anión permanganato MnO 4-

o cromato CrO4-

o tetróxido de osmio, OsO 4.

todos estos compuestos son óxidos, más concretamente polióxidos.En algunos casos, estos óxidos pueden utilizarse como aceptores de electrones, como en la reacción de conversión de permanganato MnO4

- a mangato MnO4

2-

o El ácido pícrico es explosivo en forma no hidratada.

o Cuando las soluciones que contengan ácida sódica sean eliminadas por desagüe lavaremos estedejando correr mucha agua para evitar que esta reaccione con el metal de las cañerías y lo haga explosivo.

Eliminación de residuos

y lo haga explosivo.• La formalina debe eliminarse en recipientes

para ser destruída

o Las soluciones de mercurio DEBEN tienen su propio contenedor: Si se tiran por el desagüe se forman resistentes amalgamas con el metal de las cañerías.

FIJADORES A BASE DE ALCOHOL

ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY – ALFAC - METACARN

Histología en general

citología

glicógeno

Mucopolisacáridos ácidos

R.N.A.


ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - ALFAC

GLICÓGENO

ETANOL

PIGMENTOS

PROTEÍNAS

SUSTANCIAS INORGÁNICAS

Altera morfología de lípidos

SISTEMA NERVIOSO

� Poco penetrante

� Fijador coagulante

� Buena penetración de inmunoreactivos

� Puede inducir a cambios conformacionales� Puede inducir a cambios conformacionales

� Endurece los tejidos

� Morfología regular

Acetona Histoquímica enzimática

Altera morfología


ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - ALFAC- METACARN

Altera morfología de lípidos

MetanolÁcido ribonucleico


ETANOL - METANOL - ACETONA - CARNOY - METHACARN - ALFAC

FRAGMENTOS TISULARES

BUEN FIJADOR NUCLEAR

CARNOY

BUEN FIJADOR NUCLEAR

CORPÚSCULOS DE NISSL

GLICÓGENO

Altera citoplasmaProduce lisis de glóbulos rojos

R.N.A.

se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados

• sangre,• médula ósea, • Ganglio

Alcohol metílico

• Ganglio • bazo, • líquidos de punción,

FIJACIÓN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

• es necesario evitar que se disuelvan en agua:extraer el agua mediante fijadores cuya avidez por el agua sea mayor que ellos

ALCOHOL E tílico al 70% ACETONAACETONA

Tienen el inconveniente que retraen los tejido y los endurecen para el procesamiento posterior.

CLORURO DE MERCURIO

HgCl2 + H2O HO Hg Cl + H+ + Cl-

Forma precipitado probablemente cloruro mercuriosoForma precipitado probablemente cloruro mercuriosoQue debe ser removido

Solución de yodoTiosulfato de Sodio

Tiempos excesivos de fijación provocan corrosion del tejido.

� Poco penetrante. Se emplea en mezclas fijadoras: ZENKER; FORMOL SUBLIMADO; B5, etc.

� Aditivo y coagulante

� Excelente morfología

� B5 recomendado especialmente para la fijación de ganglios linfáticos.

FIJ. A BASE DE METALES PESADOS

ZENKER - HELLY- FORMOL SUBLIMADO

Conserva morfología

Conserva histología

Tinción nuclear

Órganos hematopoyéticos

Necesario paso por alcohol yodado

No se recomienda para histoquímica

CONSERVA MORFOLOGÍA

HISTOLOGÍA FINA

CITOLOGÍA

FIJ. A BASE DE METALES PESADOS

ZENKER

CITOLOGÍA

Favorece tinción nuclear

FAVORECE TINCION FIBRAS COLÁGENAS

Recomendado para órganos hematopoyéticos

Acentúa tinción citoplasmática con colorantes ácidos

SUSA

ESPECIAL PARA GANGLIOS

(cloruro de mercurio)

ENDOMETRIO

ESTRUCTURAS FIBRILARES

AGENTE DESCALCIFICADOR

FIJADORES A BASE DE CROMO

ORTH - ZENKER - REGAUD

• Tejidos cromafines

• Citología : mitocondrias, mitosis

• Fosfolípidos

FIJ. a BASE DE TETRÒXIDO de Os

CITOLOGÍA

SISTEMA NERVIOSO

o Ácido ósmico

GRASAS NO SATURADAS

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Costo muy elevado

Reducción rápida a luz

Vapores irritantes

ACIDO ÓSMICO

• se usa siempre como tetróxido de osmio (OsO4)

• en solución acuosa al 1 o 2%• disolución demora de 6 a 12 horas, se conservará en oscuridad.

• poco capacidad de penetración por lo que el tejido será de 2 a 3 mm. `• poco capacidad de penetración por lo que el tejido será de 2 a 3 mm. `• TIEMPO DE FIJACIÓN:• de 6 a 24 horas• lavar con abundantemente en agua.

• Se reduce fácilmente con la luz y en contacto con impurezas,• por ello el material de vidrio usada debe necesita lavado químico.

• evitar sus vapores por lo que debe salvaguardar especialmente los ojos.

� es el fijador ideal para microscopía electrónica.

� pues se fija en los dobles enlaces de las cadenas laterales de los lípidos de las

ACIDO ÓSMICO

cadenas laterales de los lípidos de las membranas plasmáticas.

� además el Os es un metal opaco a los electrones (sirve de tinción).

FIJACIÓN DE LOS LIPIDOS :

• es necesario evitar su oxidación

bloqueando los lugares donde existen enlaces

- CH=CH –- CH=CH –

mediante sustancias como tetróxido de Osmio

TETRÓXIDO DE OSMIO

Para la FIJACIÓN DE LOS LIPIDOS es necesario evitar su oxidación (o enranciamiento) bloqueando los lugares donde existen enlaces - CH=CH -

ACIDO ÓSMICO

• Imprescindible para fijar mielina.

• Permite coloraciones complementarias con hematoxilina, safranina, fucsina.

A BASE DE URANIO - CADMIO - COBALTO

CAJAL - AOYANA - DE FANO

Aparato reticular de Golgi

Escasa penetración

JIMENA LE ROY BTECNÓLOGO MÉDICO

3 clase fijacion 09

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