2016 unidad 09 replic - wordpress.com · en 1952, a. hershey y m. chase realizaban experimentos...

OBJETIVOS: • Comprender la estructura del núcleo y su función

• Describir la estructura básica de la molécula de ADN

• Explicar el proceso de Replicación y sus Mecanismos de Regulación

• Conocer los Niveles de Enrollamiento del ADN

• Comprender el concepto de Cariotipo y su utilidad

CONTENIDOS:

• El Núcleo: estructura y función

• La Replicación del ADN

• Mecanismos de Regulación de la Replicación

• Niveles de Enrollamiento del ADN

• Tipos de Cromosomas

• Cariotipo

Hecho el depósito que marca la ley 11.723. Prohibida su reproducción total o parcial. 1

INTRODUCCIÓN

El ADN como material genético: análisis de la evidencia experimental

Los mecanismos de la herencia han sido objeto de estudio durante años. ¿Cómo se transmiten las características de una generación a otra? ¿Cuál es el material hereditario?

La idea de que el material genético se transmite de manera física, desde los

progenitores a sus descendientes, fue aceptada desde los inicios del concepto de herencia. La investigación de la estructura de las biomoléculas, que se inició a finales del siglo XIX, progresó considerablemente sentando las bases para la descripción del material genético en términos químicos.

Hasta la década de 1940 los genetistas consideraban que el material genético estaba

en las proteínas. Varios factores sustentaban esta creencia: - la alta complejidad química de las proteínas, ya que los aminoácidos pueden disponerse en una gran variedad de formas distintas - la enorme abundancia de proteínas en las células. Aunque el contenido en proteínas puede variar considerablemente, más del 50% del peso seco celular corresponde a estas moléculas - durante toda la primera mitad del siglo XX se acumularon datos que sugerían la relación entre herencia y proteínas, como ser que ciertas enfermedades hereditarias humanas se deben al bloqueo en el funcionamiento de determinadas proteínas con función enzimática.

Algunos investigadores, en cambio, comenzaron a relacionar la herencia con el ácido

desoxi-ribonucleico (ADN), componente del núcleo celular que había sido aislado por primera vez en 1869 por F. Miescher. Se apoyaban, además, en los trabajos de F. Griffith, quien en 1928 pudo demostrar que células bacterianas (Diplococcus pneumoniae), de una cepa virulenta y letal, inactivadas por calor, podían transformar a las bacterias de otra cepa relacionada, no virulenta y no letal, en bacterias letales. En 1944, se publicó un trabajo de Avery, Mc Leod y Mc Carty en el cual se reportaba al ADN como la sustancia responsable de la transformación que había descrito Griffith.

Experimento de F. Griffith (1928), que demuestra la transformación de cepas bacterianas No

Virulentas en cepas Virulentas, aún cuando éstas últimas habían muerto por calor.


En 1952, A. Hershey y M. Chase realizaban experimentos destinados a esclarecer el proceso por el cual la bacteria Escherichia coli es infectada por el virus bacteriófago (o fago) T2. El virus está compuesto en un 50% por proteínas y en un 50% por ADN. Uno de los componentes del fago penetra en la célula bacteriana, allí se replica utilizando materiales y energía de la célula y, tras el ensamble de muchos fagos nuevos, la célula se lisa y libera los nuevos virus.

Pero ¿es el ADN o son las proteínas del fago las que penetran a la célula y “dirigen” la reproducción viral? Para establecerlo, realizaron una serie de experimentos, cuyo diseño se esquematizan en la figura correspondiente.

Se utilizaron los radioisótopos 32P y 35S para poder seguir los componentes

moleculares de los fagos durante la infección, ya que el 32P marca específicamente el ADN, que contiene fósforo pero no azufre, y el 35S marca las proteínas, que contienen azufre pero no fósforo.

Se cultivaron las células de E. coli en presencia de 32P o 35S y se infectaron,

posteriormente, con el virus T2. Los nuevos fagos producidos durante la infección presentaron marcado radiactivamente el núcleo ADN o la cubierta proteica, respectivamente.

Los fagos marcados fueron aislados y se usaron para infectar bacterias no

marcadas. Al producirse el contacto fago-bacteria quedan formados los “complejos de adsorción”. Estos complejos se aislaron y se sometieron a una fuerte agitación para separar los fagos que estaban unidos la pared de las bacterias. Las partículas virales fueron separadas de las bacterianas mediante centrifugación, para proceder, luego, a la detección de radioisótopos.

La detección de radioisótopos, mostró que la mayoría del ADN marcado con 32P se

había transferido al interior de las células bacterianas después de la adsorción; por otro lado, la mayoría de la proteína marcada con 35S permanecía en las cubiertas vacías de los fagos ("fantasmas"), fuera de la célula bacteriana . Después de esta separación, las células bacterianas, que contenían ahora el ADN viral, se lisaron al producirse los nuevos fagos. Los fagos de la progenie contenían 32P pero no 35S.


Experiencia de Hershey y Chase

En las bacterias incubadas en 32P se producen virus activos con el fósforo incorporado. Como el fósforo forma parte del ADN pero no de las proteínas, éste sería el material genético necesario para la reproducción.


El núcleo de una célula eucarionte

El núcleo es la estructura más destacable de la célula eucarionte, es esférico u oval y ocupa una posición relativamente fija en las proximidades del centro de las células. Su función es el almacenamiento y utilización de la información genética, actuando como el centro de control primordial de la célula.

Durante la interfase, única etapa en la que se visualiza, dentro del núcleo podemos encontrar: a) los cromosomas, visibles como largas fibras, formados por ADN asociado a proteínas denominada cromatina, b) la matriz nuclear compuesta por una red fibrilar de proteínas, c) un nucleolo que es una zona más densa del núcleo donde se sintetizan ARNr y, que es la sustancia acuosa en la que se producto de la unión de estos con proteínas, se ensamblan las subunidades de los ribosomas, y d) el nucleoplasma disuelven los solutos del núcleo.

La envoltura nuclear

La envoltura nuclear es una barrera que separa los dos principales compartimientos de la célula: el núcleo y el citoplasma y controla el paso de materiales entre ellos.

Microfotografía de un núcleo celular donde se observa la envoltura nuclear, regiones de heterocromatina y eucromatina.

Esquema de la organización de la membrana nuclear y de la estructura proteica de los complejos del poro


La envoltura nuclear se compone de dos membranas separadas por un espacio intermembrana, llamado espacio perinuclear. La membrana interna se fusiona con la externa en distintos sitios formando poros nucleares, en ellos existe un conjunto de proteínas que componen una estructura llamada complejo del poro. Estos permiten el intercambio selectivo de materiales entre el núcleo y el citoplasma, ya que solo ciertas moléculas los pueden atravesar. Por ejemplo proteínas que cumplen su función dentro del núcleo se sintetizan en los ribosomas del citosol y luego ingresan al núcleo a través de los poros. Dentro de estas proteínas podemos nombrar las enzimas que catalizan la replicación y la transcripción, que ocurren dentro del núcleo, y las proteínas histonas, en las cuales el ADN se enrolla. Además es necesario el ingreso de desoxi y ribonucleótidos para los procesos de replicación y transcripción. Por otra parte, los ARNm, ARNt y las subunidades ribosomales salen del núcleo a través de los poros nucleares.

En la membrana externa se observan ribosomas adheridos y casi siempre se continua con la membrana del retículo endoplasmatico rugoso.

La superficie interna de la envoltura nuclear se halla revestida por una capa fibrilar de proteínas, importante en la resistencia mecánica del núcleo, denominada lámina nuclear. La integridad de esta última es regulada por fosforilación y desfosforilacion, y tendría una función importante en la disgregación y reensamblaje de la envoltura nuclear durante la división celular.

Eucromatina y Heterocromatina

La cromatina, durante toda la interfase, se encuentra dispersa permitiendo la acción de las enzimas. Estas catalizan en la etapa S la duplicación del ADN y durante toda interfase la transcripción del ADN en algún tipo de ARN.

Por ende, solo durante la interfase, podemos diferenciar dos tipos de cromatina: la eucromatina y la heterocromatina.

La eucromatina es la cromatina en estado mas laxo que posee el ADN transcripcionalmente activo, es decir el ADN a partir del cual se sintetizan moléculas de ARN y tiene una disposición central dentro del núcleo.

En cambio la heterocromatina es la cromatina mas compacta que contiene el ADN transcripcionalmente inactivo, por ende no se expresa en forma de ningún ARN. Esta cromatina silente tiene disposición periférica, anclándose en la lámina nuclear. La heterocromatina puede ser constitutiva o facultativa.

La heterocromatina constitutiva permanece condensado en todas las células y en todo momento de la vida de un organismo, no es convertible a eucromatina. El ADN de la heterocromatina constitutiva consta principalmente de secuencias altamente repetidas y al parecer esta desprovista de genes que codifican proteínas. La encontramos en el centrómero de cada cromosoma, en el brazo largo del cromosoma Y en mamíferos machos.

La heterocromatina facultativa presenta localización variable en los distintos tipos celulares y en las distintas etapas de diferenciación de una determinada célula, es interconvertible a eucromatina. Por ejemplo la porción del ADN que contiene información para la síntesis de una enzima digestiva (gen) se encontrara como eucromatina en una célula intestinal, pero como heterocromatina facultativa en una neurona. Otro ejemplo es el corpúsculo de Barr, el cual es uno de los cromosomas X que en la hembra de los mamíferos


se presenta compactado como heterocromatina facultativa. Esta in activación del X, por compactación, se inicia en etapas tempranas del desarrollo embrionario, cuando en cada célula uno de los dos X, de manera aleatoria, se desactiva.

La replicación del ADN

Una de las etapas del ciclo celular es la fase S, donde la célula duplica su material genético. Esta etapa es crucial para la reproducción celular, ya que las células hijas deben recibir una copia exacta del ADN de la célula de cual provienen. Una vez determinado el ADN como el material hereditario y descifrada su estructura, los científicos comenzaron a investigar acerca de los mecanismos a través de los cuales el ADN se duplica.

¿Cómo se duplica el ADN? Ya conocido el modelo estructural de la molécula de ADN, comenzaron a formularse hipótesis acerca de su duplicación, hecho fundamental que permite transmitir la información que contiene una célula a las dos células hijas resultantes luego de la división celular. Dentro de estas hipótesis que intentaban explicar la duplicación, mencionaremos tres: La conservativa, la dispersiva y la semiconservativa.

Según la hipótesis conservativa, luego de la duplicación se formaban dos moléculas hijas, una formada por ambas hebras de la molécula original y otra formada por ambas hebras nuevas.

El modelo dispersivo proponía el intercambio de fragmentos de ADN entre la molécula antigua (original) y la molécula nueva (la copia), de forma que a cada célula hija pasaran moléculas formadas por segmentos copia y segmentos originales de la doble hélice de la célula madre.

Esquemas correspondientes a las tres hipótesis propuestas para

explicar el mecanismo de replicación.


La discusión en el mundo científico continuó hasta que Watson y Crick propusieron la hipótesis semiconservativa, mas tarde demostrada por Meselson y Stahl (1957). Según esta hipótesis la molécula original se abre durante el proceso de duplicación, y cada una de las hebras que la forman sirve de molde para la síntesis de una nueva hebra complementaria. Al finalizar el proceso, las moléculas hijas así formadas contienen una hebra de la molécula original (que sirvió de molde) y una hebra sintetizada nucleótido a nucleótido, es decir, una hebra completamente nueva.

En la hipótesis semiconservativa, la molécula bicatenaria de ADN se abre en forma de horquilla y se sintetizan dos hebras nuevas. Las hebras nuevas se forman por complementariedad de bases con la hebra “madre” u original que están copiando, lo cual asegura la preservación de la información genética. Al final del proceso se forman dos moléculas nuevas, formadas cada una de ellas por una hebra original (de la molécula vieja) y una hebra nueva. En otras palabras, las hebras existentes sirven de molde complementario a las nuevas. El nombre de “semiconservativa” proviene de que en la molécula recientemente formada se conserva una hebra de la molécula original.


La experiencia de Meselson y Stahl El experimento propuesto por estos científicos demostró de manera concluyente que la replicación del ADN seguía el modelo semiconservativo. En su experiencia, cultivaron varias generaciones de la bacteria Escherichia coli en un medio que contenía cloruro amónico como única fuente de nitrógeno y cuyo nitrógeno era el isótopo pesado N15 (recordemos que para la duplicación del ADN las células necesitan sintetizar nucleótidos y, por supuesto, bases nitrogenadas). Dado que el isótopo más frecuente en la naturaleza es el N14, todas las moléculas originales de ADN de estas bacterias contendrían N14, mientras que las que fueran sintetizadas en este nuevo medio contendrían N15. El peso de las moléculas de ADN según contengan N14 o N15 puede observarse luego de una centrifugación. Así, las moléculas formadas por N14 son más livianas que las formadas por N15.

En el experimento, las células que se colocaron en el medio de cultivo con N15 se dejaron replicar por varias generaciones, para asegurar que todo su material genético tuviera el isótopo pesado. Luego, se tomó una muestra de este cultivo y se colocó en un medio con N14, dejando que las células se dividan (y por lo tanto repliquen su ADN) por varias generaciones, tomando muestras a distintos intervalos. Cada muestra era centrifugada. En los resultados se observó que, después de la primera generación de bacterias en el medio con N14, la banda que marcaba el centrifugado de la muestra correspondía a una molécula “semipesada”, es decir, que contenía N14 y N15. Este resultado demostraba que la molécula de ADN duplicado contenía una hebra original (con N15) y otra nueva (con N14). En la segunda generación, siempre utilizando el mismo medio de cultivo con N14, se obtuvieron, luego de la centrifugación, moléculas livianas y

Esquema de la formación de la horquilla de replicación y la acción de algunas de las enzimas intervinientes.

Hebra original

Hebra nueva

Experiencia de Meselson y Stahl


moléculas semipesadas. Las moléculas livianas, formadas íntegramente por N14 y las semipesadas, constituidas por una hebra con N14 y otra con N15. Muestra de la centrifugación de la primera generación. El ADN presenta en sus dos hebras el isótopo pesado de N15. La banda negra representa el sitio donde se deposita el ADN “pesado”, en el sector inferior del tubo de ensayo.

Muestra de la centrifugación de la segunda generación. Las moléculas de ADN están formadas por una hebra pesada con N15 y otra liviana con N14. La banda negra, que representa la molécula de ADN se deposita más Arriba que en el 1° tubo.

Muestra de la centrifugación de la tercer generación. Se observan Moléculas semipesadas y livianas, estas últimas formadas íntegramente por N14. Aquí, las dos bandas negras se deposi- tan en posiciones que diferencian su peso, y, en consecuencia, su contenido de N14 o N15.

El Proceso de Replicación

El proceso de replicación es similar tanto en los organismos procariontes como en los eucariontes. Es un proceso complejo en el que intervienen más de 50 proteínas distintas agrupadas en complejos multienzimáticos. La replicación del ADN ocurre una sola vez en cada generación celular. La velocidad con que ocurre este proceso es variable; en la especie Homo sapiens , por ejemplo, se produce a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo, mientras que en procariontes la velocidad es de 500 nucleótidos por segundo.

Una vez que los mecanismos de regulación celulares disparan el inicio de la etapa S, comienzan a actuar sobre la molécula de ADN numerosas enzimas:

� Helicasa: rompe los enlaces puente de hidrógeno entre ambas cadenas complementarias del ADN, separando sectores de la molécula bicatenaria.

� Topoisomerasas: alivian la tensión de la molécula de ADN evitando su hiper-enrrollamiento.

� ADN polimerasa: polimeriza los nucleótidos utilizando la molécula original de ADN como molde. Hay tres tipos diferentes de ADN polimerasas llamadas I, II y III. Entre éstas, la ADN polimerasa III es la responsable de la síntesis de ADN.

� ARN polimerasa o primasa: sintetiza pequeños fragmentos de ARN que se utilizan como cebadores.

� Ligasa: Cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos de distintos fragmentos (de Okasaki, ver más adelante).

La replicación comienza en sitios específicos llamados sitios de origen de la replicación. A partir de este sector (que está determinado por una combinación específica de nucleótidos) actúan las enzimas helicasas separando

Para que la ADN-polimerasa

realice su actividad catalítica es necesario que existan en el medio iones de Mg2+ y los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfatados (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) que constituyen la molécula de ADN.

La ADN-polimerasa es también autocorrectora ya que después de unir cada nucleótido comprueba si se han producido errores antes de incorporar el nucleótido siguiente. Si detecta un error, elimina el último nucleótido colocado y lo sustituye por el correcto.


ambas hebras de la molécula. De este modo se forma un área conocida como "burbuja de replicación". En este punto actúan proteínas desestabilizadoras de la hélice o proteínas de unión de una sola cadena, que se acoplan a las hebras de ADN para mantenerla recta y abierta.

A partir de esta acción, la ADN polimerasa es capaz de reconocer las bases libres y colocar el nucleótido con su correspondiente base complementaria (recordemos que Adenina se combina con Timina y Citocina con Guanina). De esta forma se sintetiza una nueva hebra utilizando como molde cada una de las cadenas originales. La enzima ADN polimerasa efectúa los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos de la cadena nueva.

Es importante notar que en la molécula de ADN ambas hebras son antiparalelas (una se ubica en sentido 5´3´ y la otra en sentido 3´5´ ) y que las hebras nuevas, sintetizadas nucleótido a nucleótido, se ubican también en forma antiparalela a la hebra que están utilizando de molde.

En organismos procariotas, el inicio de la replicación se produce en un extremo de la molécula de ADN, por lo que se forma una horquilla de replicación que avanza desde un extremo al otro de la molécula. En eucariotas,

Una vez que la ADN-polimerasa localiza el nucleótido complementario, cataliza su hidrólisis separando un grupo pirofosfato (P-P) y uniendo el resto (desoxirribonucleótido-monofosfato) a la cadena de ADN que se está formando mediante un enlace fosfodiéster. La energía necesaria para esta unión se obtiene de la hidrólisis del grupo pirofosfato y de otrol enlace P . Ésta es la función polimerizadora de la ADN-polimerasa.

Esquema del origen de la replicación en una molécula de ADN

Considerando un solo origen de la replicación y la velocidad de este proceso, un cromosoma humano tardaría unas 800 horas en replicarse, pero esto no ocurre. Se ha comprobado que el ADN de células eucariontes posee varios sitios de origen de la replicación y a cada una de estas regiones se las denomina replicón. Los replicones tienden a formar grupos denominados unidades de replicación (20-80 replicones). A lo largo de la fase S del ciclo celular, a medida que unas unidades de replicación van finalizando la replicación, se activan otras nuevas, siempre por grupos, hasta que todo el DNA se haya replicado.


se abren varias burbujas de replicación, lo que genera “varios” sitios de origen de la replicación por cada molécula. El ADN se replica en toda su longitud por confluencia de estas "burbujas".

En este sector ambas hebras de ADN se separan y se inicia la síntesis de una nueva hebra complementaria. Es importante notar que una de las hebras crece en la dirección de apertura de la horquilla (cadena adelantada), mientras que la otra lo hace en dirección opuesta (cadena atrasada). La enzima ADN polimerasa posee algunas restricciones para poder cumplir con su actividad catalítica. Una de ellas es que sólo es capaz de realizar la síntesis de ADN en el sentido 5´3´, motivo por el cual opera en direcciones opuestas en cada hebra.

Otra restricción de la enzima ADNpolimerasa es que no puede iniciar la síntesis de las nuevas hebras si no cuenta con un extremo 3´ libre. Por esta razón es necesario que, antes del inicio de cada hebra nueva, actúe otra enzima, la ARN polimerasa o primasa, que sintetiza

Como se muestra en el esquema, la síntesis de ADN avanza de manera continua sobre la hebra molde que tiene libre el extremo 3´. La hebra molde complementaria, que posee libre su extremo 5´, inicia su síntesis en sentido opuesto a la apertura de la horquilla de replicación. Esta última, llamada hebra rezagada, se sintetiza por fragmentos. Cada vez que la horquilla de replicación separa un tramo de la molécula de ADN, se inicia una nueva cadena , siempre utilizando la dirección de síntesis 5´3´. De este modo, se produce una hebra líder o continua que avanza en el sentido que avanza la horquilla de replicación y una hebra discontinua o rezagada, formada por fragmentos y también sintetizada en sentido 5´3´. Estos fragmentos se denominan Fragmentos de Okasaki en honor al científico que las descubrió.

El ARN cebador o primer, corta molécula de ARN (10 pares de bases) hace que empiece a actuar la ADN polimerasa. El ARN cebador es generado por la enzima ARN primasa. Esta enzima se une directamente a la ADN helicasa, formando un complejo llamado primosoma, que se va desplazando con la cadena en formación. A medida que se producen fragmentos de cadena abiertos de suficiente longitud, se va sintetizando la cadena discontinua formando pequeños fragmentos, Fragmentos de

Okazaki, cada uno de unos 1000 nucleótidos. Se utiliza un ARN cebador por cada fragmento de Okazaki. La ARN primasa, sintetiza los ARN cebadores que son incorporados a la copia en el inicio de cada fragmento de Okazaki.

Esquema de una horquilla de replicación.

Dirección de las cadenas líder y rezagada


un corto fragmento de ARN que actúa como cebador.

De este modo, antes del inicio de cada hebra rezagada se sintetiza un pequeño fragmento de ARN cebador o primer. Luego, la ADN polimerasa continúa la síntesis de ADN.

Características de la duplicación

La síntesis de ADN presenta las siguientes características:

� Semiconservativa: las moléculas nuevas conservan una de las hebras de la molécula original.

� Bidireccional: a partir de un punto de origen, la molécula se duplicará en ambas direcciones.

� Discontínua: la síntesis se produce a través de fragmentos en la hebra rezagada.

En síntesis, la replicación del ADN consta de los siguientes pasos: � Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice de ADN. La separación de

las cadenas comienza en puntos concretos llamados puntos de iniciación. A partir de ellos se van separando las dos hebras de ADN formando la burbuja de replicación. Los dos extremos de la burbuja por donde continua la separación reciben el nombre de horquillas de replicación.

� La síntesis de las cadenas complementarias comienza con la síntesis del ARN cebador que es una corta cadena de ARN con una secuencia complementaria de una de las porciones de las hebras del ADN. En la hebra que tiene el sentido 3'--5' la ADN-polimerasa va colocando nucleótido tras nucleótido a continuación del ARN cebador. Esta hebra complementaria que va creciendo en sentido 5'--3' es la hebra adelantada o líder. En la hebra opuesta del ADN original, a continuación del ARN cebador, se coloca un fragmento de Okasaki y, después de éste, un nuevo ARN cebador seguido de otro fragmento de Okasaki.

� Luego, actúa una ribonucleasa que elimina el ARN cebador que está entre dos fragmentos de Okasaki. El sector que ocupaba el ARN cebador es rellenado por la ADN-polimerasa, que ubica desoxiribonucleótidos complementarios.


Síntesis de la hebra rezagada

Síntesis de la hebra líder

Cadenas hijas

Dirección de crecimiento de la burbuja

Fragmentos de Okasaki

Síntesis de nuevas hebras de ADN y crecimiento de la burbuja de replicación


¿Cómo sintetiza la ADN polimerasa ambas hebras de forma conjunta?

El ADN sintetizado en la cadena retrasada y su cadena molde sufren un plegamiento, esto posibilita que la ADN polimerasa pueda formar un complejo único y así sintetizar ambas hebras de ADN (la adelantada y la rezagada). Las topoisomerasas mantienen esta estructura y evitan que el ADN se super-enrrolle, cortando un enlace fosfodiéster (a este corte se lo denomina nick). Además, existe una proteína llamada SSB, que estabiliza la forma monocatenaria de la hebra que se está replicando, para que no se pliegue y acople por complementariedad de bases con ella misma. Luego de la intervención de las ADNpol actúan las enzimas ligasas, que “reparan” los nicks en el momento en el que se sustituyen los ARN cebador por segmentos ADN y se unen con los fragmentos de Okazaki previamente sintetizados.

Esquema de la duplicación del ADN que muestra a acción de cada enzima.

Las diferencias en la replicación entre las celulas procariontes y eucariontes

Si bien el proceso básico de la duplicación es el mismo remarcaremos algunas diferencias:

- En cuanto a las enzimas que catalizan el proceso:

En las células procariontes existen tres tipos de ADN-polimerasa. Entre ellas, la ADN polimerasa I participa principalmente en la reparación del ADN y también es la encargada de degradar el cebador, por lo que actúa como una enzima exonucleasa, y lo sustituye por ADN. Esta enzima es capaz de agregar o eliminar nucleótidos. La ADN polimerasa III es la que realiza la síntesis propiamente dicha tanto de la cadena continua como de los fragmentos de Okazaki. Se desconoce con certeza la función de la ADN polimerasa II, pero actuaría en mecanismos de reparación de errores en el ADN.


En el siguiente esquema se puede observar la secuencia de pasos de la duplicación del ADN. Observe la síntesis continua en la hebra líder, catalizada por la ADN polimerasa III. En la hebra rezagada se indican con números las diferentes etapas de la síntesis.

Duplicación del ADN. Las helicasas y topoisomerasas se asocian en un extremo de la horquilla de replicación, separando las hebras complementarias. Las proteínas SSB impiden que ambas hebras se replieguen sobre sí mismas. 1. La primasa sintetiza el cebador. 2. La ADN polimerasa III sintetiza la hebra complementaria al molde, originando la cadena líder y

los fragmentos de Okasaki (en la hebra rezagada). 3. La ADN polimerasa I elimina el cebador (actividad de exonucleasa) y completa el sector con

nucleótidos de ADN en la cadena rezagada. 4. La ligasa une finalmente los fragmentos de Okasaki. En las células eucariontes también existen distintas ADNpolimerasas, entre ellas la ADNpol delta es la enzima que cataliza la síntesis de la cadena continua, la ADNpol ß reemplaza con ADN las secuencias de los ARN-cebadores removidos y participa de la reparación del ADN, la ADNpol alfa sintetiza los fragmentos de Okazaki de la hebra rezagada. - En cuanto al numero de sitios donde comienza la replicación denominados orígenes de replicación: En las células procariontes la replicación progresa a partir de un único origen de replicación y avanza bidireccionalmente hasta obtener dos moléculas de ADN circulares, cada una formadas por una cadena original y otra nueva.


En cambio en las células eucariontes la replicación comienza simultáneamente en varios orígenes de replicación formando replicones, como se explico anteriormente, que avanzan bidireccionalmente hasta fusionarse entre ellos y finalmente obtenerse a partir de cada molécula de ADN que comienza la replicación dos moléculas, cada una formada por una hebra original y una nueva.

- En cuanto a la velocidad de acción de las ADNpol: En las células procariontes la velocidad de incorporación de nucleótidos por las ADNpol es mucho mayor que en las células eucariontes. Pero esta diferencia se compensa con la existencia de múltiples orígenes de duplicación en células eucariontes que poseen un ADN mucho más largo.

¿En qué momento se organizan los nucleosomas? Recordemos que el ADN eucarionte está asociado a proteínas histónicas formando los nucleosomas. Existe evidencia experimental para inferir que las histonas se acoplan a las nuevas moléculas de ADN a medida que se va replicando. Estas proteínas son las únicas que son sintetizadas en la etapa S del ciclo celular y se asocian rápidamente a la hélice en crecimiento.


En el esquema se observa cómo el octámero de histonas se asocia a la molécula bicatenaria que se está sintetizando, formando los nucleosomas. Se propone que las histonas pertenecientes a la molécula original pasan a formar parte de la molécula sobre la que se forma la hebra líder o continua. Sobre la otra hebra del ADN, donde se sintetiza la hebra rezagada o discontinua, se asocian histonas nuevas. La replicación llevada a cabo por la ADN-polimerasa es un proceso muy exacto, sobre todo por su actividad autocorrectora. Sin embargo, aún así se produce un error de apareamiento por cada 107 pares de bases. En una bacteria esto podría resultar suficiente debido a que su cromosoma sólo posee 3·103 pares de bases. Sin embargo en el ADN humano existen 3·109 pares de bases y durante el desarrollo embrionario, a partir del zigoto, el ADN humano se duplica 1015 veces, por lo que la información genética pronto se perdería.

Para aumentar más todavía la perfección de la replicación del ADN existen mecanismos de reparación del ADN que detectan nucleótidos cuyas bases no están correctamente apareadas, los eliminan y regeneran la secuencia correcta. De este modo se logra bajar esta tasa de errores en uno por cada 1010 pares de bases. Este proceso se conoce con el nombre de corrección postreplicativa.

¿Cuándo comienza la etapa S?

El control de la fase S y el inicio de la replicación

Los mecanismos de replicación del material genético y su regulación presentan factores que determinan su inicio y control. El Modelo del Replicón, inicialmente propuesto para la bacteria Escherichia coli, propone la existencia de secuencias de ADN que determinan el inicio de la replicación.

Los cromosomas de eucariontes son demasiado largos

Esquema de la horquilla de replicación de una molécula de ADN perteneciente a un organismo eucarionte.

Estas secuencias fueron identificadas en S. cerevisiae y se conocen como Secuencias de Replicación Autónoma (SRA), las cuales coinciden con los orígenes de replicación.


por ello poseen múltiples orígenes de replicación en cada cromosoma.

Las proteínas que indican el sitio de origen de la replicación (CRO) permanecen unidas a los orígenes de replicación durante todo el ciclo celular, pero el resto de las proteínas iniciadoras forman o no parte del complejo, dependiendo de la etapa del ciclo celular.

De este modo, se determina un estado post-replicativo durante las fases S, G2 y M (sólo permanecen unidas a los orígenes las proteínas CRO únicamente) y un estado pre-replicativo, durante G1 (cuando el resto de las proteínas iniciadoras forman parte del complejo). El inicio de la replicación del material genético marca la transición entre el estado de complejo pre-replicativo (pre-RC) a complejo post-replicativo (post-RC).

Relación entre el inicio de la fase S y el ciclo celular

Tomada la decisión de dividirse la célula deja atrás la fase G1 e ingresa en la fase S, es decir comienza a replicar su ADN. Esto ocurre cuando aumenta la concentración de una proteína, que comienza a sintetizarse hacia el final de la fase G1, llamada ciclina G1. Esta ciclina al alcanzar una alta concentración se une a una quinasa (Cdk2) formando un complejo (SPF) que promueve el comienzo de la etapa S al iniciar una cadena de fosforilaciones que culminan con la activacion de las moléculas responsables de la replicación del ADN.

Además, como se aclaro anteriormente, es necesario para que se inicie la replicación la presencia del complejo pre-replicativo sobre los orígenes de replicación.

Enrollamiento del ADN eucarionte

En las células eucariontes, el ADN se encuentra asociado a moléculas proteicas, las histonas, formando los nucleosomas, que actuan como unidad minima de compactacion de la cromatina.(ver Unidad 8, Ciclo Celular, Interfase). El nucleosoma esta formado por un octamero de histonas rodeado por dos vueltas de ADN.

Los trabajos de Bell y Stillman de 1993 describieron un complejo de 6 proteínas que reconocen los orígenes de replicación, denominado Complejo de Reconocimiento del Origen (CRO). Estas proteínas son esenciales para la viabilidad celular y necesarias para iniciar la replicación del ADN. Posteriormente, se han descubierto otras proteínas iniciadoras.

ADN asociado a histonas


Durante la interfase, el ADN unido a las histonas se presenta como largos y delgados filamentos, de aspecto difuso y granulado, formando la cromatina. Una vez concluida la fase S, el ADN duplicado (y unido a las histonas) se condensa gradualmente y comienza a formar estructuras más compactas, de menor longitud, que pueden observarse al microscopio óptico: los cromosomas. Existen sucesivos niveles de enrollamiento del ADN que culminan con la formación de los cromosomas observables durante la etapa de división celular (mitosis o meiosis).


Cromosoma

La molécula de ADN se enrolla alrededor de las histonas y forma los nucleosomas. Después de la etapa S, el enrollamiento continúa, formando estructuras cada vez más compactas y de mayor diámetro. Finalmente, la molécula super-enrollada forma una cromátida. Como el ADN se ha duplicado en la etapa S, la cromátida, con su duplicado, forma el cromosoma, observable durante la división celular.

Solenoide (30 nm de diámetro)


Durante las etapas G1 y S, el ADN permanece enrollado a nivel de nucleosomas, y es el estado en el cual son posibles los procesos de Transcripción y de Replicación. El enrollamiento permite que grandes cantidades de ADN puedan caber en el pequeño espacio que posee el núcleo. El empaquetamiento del ADN tiende a impedir la expresión de la información genética pues, ya a nivel de los nucleosomas, parte de las histonas del core del nucleosoma deben separarse para que pueda producirse la transcripción, así como la replicación. Los distintos niveles de empaquetamiento del ADN reciben nombres diferentes. El primer nivel, como ya se ha indicado, lo constituyen los nucleosomas, las unidades de enrolamiento de la cromatina. Están formados por un centro o core de histonas H2A, H2B, H3 y H4, y poseen dos copias de cada una. Alrededor de ese centro se enrollan dos vueltas de ADN. Una quinta histona, la H1, sella la unidad y permite la conexión entre nucleosomas formando una estructura conocida como fibra de 11 nm. El siguiente nivel de empaquetamiento lo constituyen los solenoides o fibras de 30 nm que se distribuyen alrededor de un eje imaginario.

Las histonas H1 contribuyen a mantener juntos a los nucleosomas, formados por dos copias de histonas H2A, H2B, H3 y H4 (octámero) y dos vueltas de ADN cada uno.


El nivel que sigue es el de los bucles o lazos, que consiste en una serie de asas de unos 300 nm de diámetro. Finalmente, éstos se super-enrollan y forman los cromosomas, que consisten en dos moléculas de ADN (idénticas, ya que ocurrió la replicación en la etapa S), unidas por una estructura llamada centrómero o constricción primaria. En algunos cromosomas pueden observarse otras constricciones que unen una pequeña porción del cromosoma llamada satélite, relacionada con las regiones donde se forma el nucleolo (organizadores nucleolares).

1

2

3

4

5

6

Niveles de enrollamiento de la cromatina.

Un fragmento de ADN (1) se enrolla alrededor de histonas y forma nucleosomas (2). Luego, éstos se organizan en solenoides (3), que se compactan en lazos o bucles (4) y, finalmente, forman un cromosoma.


Clasificación de los cromosomas Los cromosomas se pueden agrupar según el tamaño, que depende del numero de nucleótidos, y de acuerdo a la posición del centrómero. Según estas variables, los cromosomas pueden agruparse en:

- metacéntricos: el centríolo se encuentra en la mitad del cromosoma, determinando brazos de igual longitud. El brazo es la porción de cada cromátida que se extiende desde el centrómero hasta la región terminal del cromosoma, llamada telómero.

- submetacéntricos: un par de brazos es ligeramente más corto que el otro - acrocéntricos: un par de brazos es mucho más corto que el otro. Ellos presentan

constricciones secundarias constituidos por regiones de ADN que codifican para ARNr denominadas organizadores nucleolares, a partir de los cuales en la interfase se organizan los nucleolos. Estas constricciones secundarias aíslan una porción del brazo de los cromosomas denominado satélite.

- telocéntricos: el centrómero se encuentra en un extremo, observándose un solo par de brazos.


¿Qué es el cariotipo? En la naturaleza, cada especie posee, en sus células somáticas, un número característico de cromosomas de diferentes tipos. La representación gráfica de ese número se llama cariotipo. El análisis del cariotipo constituye una de las técnicas utilizadas en la investigación científica y en el diagnóstico de enfermedades genéticas humanas.

Para realizar el cariotipo, se procede a teñir células y, como resultado de esa tinción, pueden observarse bandas en los cromosomas, que corresponden a regiones ricas en pares Adenina-Timina. Dichas regiones de color oscuro se denominan “bandas G” y son características de cada especie.

Bandas en un cromosoma

Cariotipo

Cariotipo de un individuo humano de sexo masculino (contiene un cromosoma Y). Consta de 23 pares de cromosomas. Los pares 1 a 3 son metacéntricos; el 4 y 5 submetacéntricos; el 6 a

12 y el X, submetacéntricos; el 13 a 15, acrocéntricos; el 16 a 18 submetacéntricos a acrocéntricos; el 19 y 20 submetacéntricos y el 21, 22 y el Y, acrocéntricos.

En 1968 se obtuvo el primer éxito en el intento de visualizar diferencias de tinción en los cromosomas. Esta técnica, denominada bandeo, fue desarrollada por Casperson en la década de 1970, y demostró que los cromosomas se tiñen a lo largo de manera irregular. Existen distintos tipos de bandeo según el colorante y el procedimiento empleado . Mediante esta técnica se pueden distinguir la eucromatina y la heterocromatina, y otras características estructurales.


Los cromosomas de un cariotipo humano se obtienen a partir de células de la médula ósea, fibroblastos o glóbulos blancos, que, con la droga colchicina, son bloqueadas durante la división celular, el período de la metafase. Luego se analizan las células en el microscopio óptico y se las fotografía, recorta y ordenan los cromosomas de a pares según su tamaño. También se pueden obtener cromosomas del líquido amniótico del útero para realizar un diagnóstico prenatal. Los cromosomas humanos se clasifican en seis grupos según el alfabeto, de A a G, de acuerdo con su tamaño y la ubicación del centrómero.

GRUPO CROMOSOMAS Nº TAMAÑO

A 1 a 3 GRANDE

B 4 - 5 GRANDE

C 6 a 12 y X MEDIANO

D 13 a 15 MEDIANO

E 16 a 18 MEDIANO - PEQUEÑO

F 19 – 20 PEQUEÑO

G 21 – 22 - Y PEQUEÑO

EI cariotipo también permite reconocer anormalidades en el número de cromosomas, como excesos o defectos. Un ejemplo de exceso en el número de cromosomas se manifiesta en el Síndrome de Down, donde los individuos que presentan un cromosoma de más en el par 21, sufren retraso mental, entre otras anomalías.


El Proyecto Genoma: la investigación del ADN humano

El proyecto GENOMA HUMANO tiene como objetivo último la determinación de la secuencia de todos los nucleótidos que componen el genoma de la especie humana. Este proyecto, iniciado en el año 1990, se dividió en tres subproyectos específicos. El primero de dichos subproyectos fue el mapa genético humano, consistente en la obtención de marcadores o variables en la población, regularmente espaciados a lo largo de los distintos cromosomas. El segundo fue la obtención del mapa físico humano o colección ordenada de clones de ADN (copias de fragmentos genómicos) que abarcaran todos y cada uno de los cromosomas. El tercero y último subproyecto consistían en la secuenciación del genoma humano y caracterización estructural de todos los genes que lo componen. Los mapas genético y físico han sido realizados de acuerdo a los objetivos inicialmente propuestos. No obstante, el mapa físico completo, si bien ha proporcionado una colección de secuencias únicas que constituyen excelentes marcas genómicas, consta de clones no aptos para su secuenciación directa debido a su gran tamaño y a la presencia de deleciones en los mismos. Por ello, la secuenciación del genoma humano se inició a partir de clones más pequeños (llamados cósmidos) de localización conocida, pero ha sido sólo tras el desarrollo de unos nuevos vectores, denominados cromosomas artificiales de bacteria (BACs), y se prevé la finalización de este objetivo último para el año 2005. Asimismo, se ha llevado a cabo un proyecto encaminado a determinar la totalidad de las secuencias de ADN expresadas (ESTs), lo que ha permitido marcar los genes humanos y estimar su número. La información proporcionada por el proyecto GENOMA HUMANO permitirá abordar el estudio de las distintas funciones del ADN, y, en particular de todos sus genes.

Estos proyectos no sólo son importantes en el estudio biológico de dichos organismos, sino que además permitirán acelerar el análisis de la función de genes humanos. Asimismo, cabe destacar los proyectos de secuenciación de determinados virus por su contribución al desarrollo de terapias y al conocimiento del sistema inmune. La aplicación por excelencia del proyecto GENOMA HUMANO se encuentra dentro del campo de la Medicina. Consideremos, por ejemplo, una familia en la que algunos de sus miembros padecen o presentan predisposición a cierta enfermedad. La existencia del mapa genético humano proporciona la herramienta necesaria para asociar el fenotipo de la enfermedad con un marcador polimórfico y determinar la región genómica donde se encuentra el gen responsable de la alteración genética observada. El conocimiento de los genes existentes en esa región, obtenido tras la secuenciación del genoma, permitirá disponer de genes candidatos, entre los cuales se podrá distinguir fácilmente el causante de la enfermedad; una vez determinado dicho gen, se podrá llevar a cabo el diagnóstico inequívoco de la enfermedad asociada, así como analizar la función del gen para futuros ensayos de terapia farmacológica y génica.

Independientemente de su contribución a los campos biológico y clínico, este proyecto ha impulsado el desarrollo de una serie de tecnologías y programas informáticos que permiten la generación y análisis de un gran número de datos con la precisión y eficacia requeridas. En este sentido, cabe destacar la creación de secuenciadores automáticos, estaciones robóticas, ordenadores y, recientemente, equipos que cuantifican la expresión génica. Esto ha desembocado en la puesta a punto de Servicios de Secuenciación de ADN y Análisis Genéticos, que realizan de forma rutinaria una serie de técnicas de genética y biología molecular, facilitando así la labor de la comunidad científica y médica.


1. indique en que etapa del ciclo celular ocurre:

a. Replicación de las regiones heterocromatínicas. b. Regulación del Ciclo Celular. c. Empaquetamiento del ADN. d. Sintesis de las histonas.

2. Ubique los siguientes sucesos en el orden cronológico correcto:

a. Unión de d-ribonucleótidos por complementariedad de bases. b. Acción de las helicasas. c. Formación de enlaces fosfodiester entre d-ribonucleótidos. d. Acción de las ligasas. e. Formación de los fragmentos de Okasaki.

3..Indique si la siguiente afirmación es correcta o no y justifique su elección:

“El nucleolo es una región del núcleo que no contiene información genética” 4. Compare los Complejos Pre y Post-replicativos en cuanto a:

a. Momentos del Ciclo Celular en que actúan b. Proteínas que los forman c. Función de cada uno

5. Compare la función de la Topoisomerasa con la de la Proteína SSB. 6. Complete el siguiente texto:

La nueva cadena de ADN siempre comienza a sintetizarse por su extremo___, los siguientes nucleótidos_________ a la hebra molde se agregan al extremo___ en crecimiento. Estos desoxirribonucleótidos adicionados contienen ___ grupos fosfatos y para comenzar a ser incorporados requieren la presencia de ___________ sintetizados previamente a partir de __________________. Los cromosomas procariontes poseen _________ origen de replicación, en cambio los eucarióticos tienen ________ orígenes de replicación.

PROBLEMAS de APLICACIÓN


1.En el nucleoplasma: a. se sintetizan las histonas. b. Se sintetizan las proteínas

ribosomales c. Se sintetizan las enzimas ADN

polimerasa y ARN polimerasas. d. Se sintetiza ADN Y ARN. 2.En el nucleolo se sintetizan:

a. ARNt b. ARNm c. ARNr d. Proteínas.

3.Los poros nucleares: a. permiten el intercambio

indiscriminado de sustancias entre el núcleo y el citoplasma.

b. Constituyen una barrera selectiva de transporte entre el núcleo y el citoplasma.

c. están constituidos solo por la fusión de las dos membranas de la envoltura nuclear.

d. son los lugares de salida del ADN.

4.Señale la opción correcta respecto de a la síntesis de proteínas y la replicación del ADN: a. El primer proceso ocurre en G1 y G2 y

el segundo en la etapa S b. El primer proceso ocurre en G1 y el

segundo en S c. Ambos procesos ocurren durante toda

la interfase d. El primer proceso ocurre durante toda

la interfase y el segundo en la etapa S 5. El nucleosoma es: a. un conjunto de proteínas capaces de

unir una molécula de ADN b. un conjunto de proteínas capaces de

unir ARN pequeño nuclear c. la unidad de enrollamiento de la

cromatina d. ADN super-enrollado

6. Durante la replicación del ADN, todos los segmentos de ARN: a. corresponden a cebadores

sintetizados por la ADNpolimerasa b. aportan el extremo 3´-oH para que

pueda actuar la ADNpolimerasa c. son los llamados fragmentos de

Okazaki d. se encuentran únicamente en la

cadena nueva de la molécula de ADN hija

7. La cromatina y los cromosomas se diferencian en : a. los genes que los componen. b. la cantidad de ADN. c. en el grado de empaquetamiento. d. en sus componentes básicos. 8. El ADN, en su estado de máxima condensación : a. no podrá expresarse pero si duplicarse. b. podrá expresarse pero no duplicarse. c. podrá expresarse y duplicarse d. no podrá expresarse (transcribirse) ni

duplicarse 9..La helicasa abre la cadena de ADN: a. rompiendo los enlaces covalentes entre las bases nitrogenadas. b. rompiendo los enlaces débiles entre las bases nitrogenadas. c. al mismo tiempo que disminuye el super-enrollamiento de las cadenas. d. al mismo tiempo que se liga a ambas hebras impidiendo que se unan. 10..Las ligasas: a. reemplazan al cebador por ADN y luego lo unen a la cadena de ADN contigua b. unen las cadenas nuevas de ADN de la hebra rezagada. c. unen un cebador a un fragmento de Okasaki. d. contribuyen a unir las cadenas complementarias tras la duplicación.

AUTOEVALUACIÓN

2016 unidad 09 replic - wordpress.com · en 1952, a. hershey y m. chase realizaban experimentos...

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