1Cuantificacin en CG y HPLC Los detectores dan una respuesta que es proporcional a la cantidad de sustancia (m):

Respuesta = a m El coeficiente de proporcionalidad a es caracterstico de cada sustancia pero no es

posible predecirlo en forma sencilla

Como el componente atraviesa el detector en un perodo de tiempo, la respuesta debe ser evaluada en todo ese perodo

rea de la seal

Si el coeficiente a es igual para varios compuestos podemos determinar su A /A /compuestos podemos determinar su proporcin relativa en una mezcla

1 2 3

A1/A2 = m1/m2

Esto depender del tipo de detector y la similitud entre los compuestos

En cromatografa gaseosa con detector de ionizacin de llama, lasdiferencias de respuesta pueden ser muy grandes

mezcla de solventes conteniendo 1,5 mg/ml de cada uno

Chromatography Today, 2012, 52-56

Diferencias mucho mayores pueden darse en cromatografa lquida condetector UV-visible donde algunos componentes pueden tenerrespuesta nula y otros respuesta alta a una dada longitud de onda.

2En el caso ms general cada componente tendr un factor de respuesta caracterstico

El factor de respuesta ( f ) es la inversa del coeficiente a y corresponde a la cantidad de sustancia por unidad de rea

m1/m2 = f1A1/f2A2

Para conocer la relacin entre los componentes debo conocer los factores de respuesta individuales fi

1 2 3

Los factores de respuesta los determino experimentalmente midiendo el rea de la seal producida por una cantidad conocida (Mi) de cada componente

Solvente f (CG-FID)

metanol 0,151

isopropanol 0,234( i) p

f1 = M1/A1 , etc.1 2 3

Esto requiere tener patrones de referenciade pureza conocida de cada componente

acetato de etilo

0,196

cloroformo 0,039

tolueno 0,490

MTBE 0,303

acetonitrilo 0,212

Mtodo del estndar externo:

1) inyecto una masa conocida M1 del componente a cuantificar (solucin de calibrado de concentracin C1)

Mtodos de cuantificacin

M1 = C1 x (Vol de inyeccin)

de calibrado de concentracin C1)

f1 = M1/A1

1

2) mido el rea de la seal (A1) y calculo el factor:

3) inyecto la muestra problema y mido el rea de la seal del componente a

A1pcuantificar

1

4) usando el factor calculo la masa del componente en la muestra inyectada y/o la concentracin

m1 = f1A1 C1 = m1/(Vol de inyeccin)

Si el volumen de inyeccin es igual: C1 = C1A1/A1

3Ventajas Sencillo de implementar

Desventajas Requiere volmenes de inyeccin precisos y reproducibles

Requiere una gran estabilidad en el tiempo del sistema cromatogrfico (flujos, ancho de picos, etc.)

Si se pasan varias muestras, debe inyectarse la solucin de calibracin periodicamente (por ejemplo cada 3 o 5 muestras) para verificar que el sistema est estable

El mtodo es susceptible a errores introducidos al hacer diluciones, etc.

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del componente, debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de calibracin) y/o inyectar cantidad de estndar externo acorde a cada muestra

2) inyecto la solucin de calibrado (concentracin conocida C1 del componente a cuantificar)

Mtodo del estndar interno

A1ASI1) Se agrega una cantidad igual del estndar (SI) a la

solucin de calibrado y a las muestras de modo de tener la misma concentracin del estndar

F1 = C1ASI/CSIA13) mido el rea de las seales del componente a

cuantificar (A1) y del SI y calculo el factor de respuesta relativo:

4) inyecto la muestra problema (que contiene una cantidad conocida de SI) y mido el rea de la seal del componente a cuantificar y del SI

A1

1SI

ASI

(F1CSI) = C1ASI/A1

seal del componente a cuantificar y del SI

5) usando el factor F calculo la concentracin del componente en la muestra inyectada C1 C1 = F1CSIA1/ASI

1SI

4Ventajas Es independiente del volumen de inyeccin

No requiere precisin en la preparacin de la solucin de SI ni conocer su pureza, solo agregar la misma cantidad a muestras y solucin de calibrado

Es independiente de los errores por diluciones una vez agregado el SI

E i d di t d i i l fl j l di i d id Es independiente de variaciones en el flujo o en las condiciones de corrida

Desventajas Requiere disponer de una sustancia (el SI) que no se superponga con

ninguno de los componentes de la muestra y que sea eluida en las mismas condiciones

La preparacin de muestras y soluciones de calibrado es ms laboriosa

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del componente, debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de calibracin) y/o utilizar soluciones calibradoras diferentes (de concentraciones similares a las muestras)

Los mtodos de estndar externo y estndar interno son de aplicacingeneral

Sin embargo debe tenerse cuidado con ciertos tipos de detectores que pueden tenermucha variabilidad de respuesta incluso dentro de una misma corrida, y respuesta nolineal, como por ejemplo los detectores selectivos de masa

En el caso de CG o HPLC acoplados a espectrmetros de masa, los cromatogramas de corriente inica total no son adecuados para cuantificar

La solucin ms conveniente es usar la misma sustancia como estndar interno

5En la prctica se usa como estndar interno la misma sustancia deuterada

TICSe agrega a la muestra una cantidad conocida de la sustancia a determinar (X) deuterada

X-Hn

M

X

El cromatograma de corriente inica total muestra todos los componentes y un nico pico para XH y XD

El cromatograma de los iones de m/z = M solomostrar algunos componentes

AX

X Hn

M+n

X-Dn

El cromatograma de los iones de m/z = M+n mostrar al componente X con n 1H reemplazados por 2H al mismo tiempo de retencin que puede usarse como SI

ASI

Como el componente a determinar y el SI son iguales y son detectados en el mismo momento (al mismo tiempo de retencin) la determinacin no se afecta por la variabilidad del detector.

En RMN cada grupo de ncleos idnticos dar una seal de complejidad variable pero inequivocamente asignable

el rea de cada seal es directamente proporcional a la magnetizacin de l l l dlos ncleos que la producen

en un espectro RMN las reas relativas de las distintas seales dependen solo del nmero de ncleos que les dan origen

existe una relacin sencilla y exacta entre las reas relativas de distintas seales en un mismo espectro

las reas relativas son independientes de la concentracin y se corresponden con la fraccin molar de cada grupo de ncleos

6Experimentos posibles

Cuantificacin relativa de componentessimilar a un CG pero el factor de respuesta es conocido en forma exacta

nx: moles del componente xNx: N de ncleos de x que contribuyen a la seal Ix

La fraccin molar de un componente en una mezcla puede determinarse en forma directa, si se requiere %P/P se deben conocer las masas molares.RMN es el mtodo ms usado para la determinacin relativa de ismeros, diastermeros y enantemeros (usando solventes o complejantes quirales), en ese caso no hace falta conocer la masa molar

Cuantificacin absoluta de componentesLa forma ms simple es agregar un estndar (gravimetra) a una masa conocida de cualquier mezcla: se obtienen resultados absolutoscualquier mezcla: se obtienen resultados absolutos

RMN es un mtodo primario de medicin relativoUn mtodo primario de medicin es un mtodo con la ms alta calidad metrolgica cuya operacin puede ser descripta y entendida en forma completa, para el cual puede escribirse un anlisis completo de incertidumbre en trminos de unidades SI y cuyos resultados son aceptados sin referencia a un estndar de la cantidad que se est midiendo

Determinacin de grado de etoxilacin de lauril alcohol etoxilado

CH3(CH2)9CH2CH2O (CH2CH2O)n -1-CH2CH2OH

0,88 1,26 1,57 3,55-3,80 3,44

3( 2)9 2 2 ( 2 2 )n 1 2 2

AOX (4n+2)HAHC 23H

HC

OX

AAn

2324

50755 ,AA,n

HC

OX

7un patrn de referencia 50755 ,AA,n

HC

OX

AOX (4n+2)H

n = 8,1

CH3(CH2)9CH2CH2O (CH2CH2O)n -1-CH2CH2OH

0,88 1,26 1,57 3,55-3,80 3,44

AHC 23H

una muestra desconocida 50755 ,AA,n

HC

OX

AOX (4n+2)H

n = 8,9

CH3(CH2)9CH2CH2O (CH2CH2O)n -1-CH2CH2OH

0,88 1,26 1,57 3,55-3,80 3,44

AHC 23H

80.84

7

1.02

2

1.36

0 1.

374

1.38

8

1.62

4

1.81

4

3.60

0

4.33

0 4.

344

4.35

8 4.

373

6.62

4

7.06

1

Current Data ParametersNAME U06-110801

VP12185

C CCN

CO2 CH2CH3

H

H

7,061

6,624

4,351 (c) 1,374 (t)

EXPNO 1PROCNO 1F2 - Acquisition ParametersDate_ 2006-08-17Time 12.53INSTRUM Avance 500PROBHD 5 mm PABBI 1H/PULPROG zg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 32DS 2SWH 7500.000 HzFIDRES 0.114441 HzAQ 4.3691168 secRG 4DW 66.667 usecDE 6.00 usecTE 296.5 KD1 1.00000000 secTD0 1======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.00 usecPL1 0.00 dBSFO1 500.1327507 MHzF2 - Processing parametersSI 32768

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm

0.25

3.03

0.16

0.13

0.30

1.98

1.00

0.01

0.00

0.01

1.00

SI 32768SF 500.1300063 MHzWDW EMSSB 0LB 0.30 HzGB 0PC 1.00

espectro RMN 1H 500 MHz de adhesivo de base cianoacrilato (la gotita)

6.62

4

6.72

1

7.06

2

determinacin de contenido de hidroquinona en adhesivo de base cianoacrilato (la

C CCN

CO2 CH2CH3

H

H

7,061

6,624

4,351 (c) 1,374 (t)satlites de 13C

(0,56%)

OH

OH

H

6,725600 x AreaHQxMHQ

2x(AreaH1 + AreaH2)xMCNppm Hidroquinona =

6.556.606.656.706.756.806.856.906.957.007.057.107.157.207.257.307.357.407.45 ppm

0.992

0.004

0.006

0.005

1.000

0.84

8

1.02

2

1.36

11.

375

1.38

9

1.62

0

1.81

5

3.60

1

4.33

14.

345

4.35

94.

374

cianoacrilato ( la gotita)

1.01.52.02.53.03.54.04.5 ppm

9En RMN tambin podemos usar el mtodo de estndar interno (similar al usado en CG o HPLC)

En este ejemplo usamos RMN 13C

Muestra + SI diluida con D2O

No es necesario separar los componentes, ya que la informacin en un espectro RMN permite diferenciarlos e identificarlos

No debemos preocuparnos por condiciones especiales de medicin porque, como en GC y HPLC, el factor de respuesta se refiere al estndar interno

Solucin de calibracin

Pero en RMN la cuantificacin se hace respecto a los ncleos sin importar en que molcula estn, ya que su respuesta relativa (rea) es independiente de sta

La sustancia usada como referencia y nuestra muestra no tienen porqu ser la misma

No necesitamos patrones de referencia de cada analito a pcuantificar

No se requiere la separacin previa de los componentes

Que condiciones debe cumplir la sustancia de referencia? contener al menos un ncleo igual al de la muestra (1H, 13C, 31P,

19F, 29Si, etc.) ser soluble en el mismo solvente que la muestra q no dar seales prximas a las de la muestra preferentemente dar una nica seal (no imprescindible) obtenerse comercialmente con alto grado de pureza y ttulo

confiable ser estable, no voltil y preferentemente slida

10

Algunos patrones de referencia comunmente usados en QNMR:

ncleos solventesdimetilsulfona 1H, 13C agua, orgnicos

1,3,5-trioxano 1H, 13C orgnicos

acetato de sodio anhidro

1H, 13C agua

fosfato de sodio dodecahidrato

31P agua

trifenilfosfato 31P orgnicos

trifluoroacetato de etilo 19F orgnicos

ortosilicato de etilo 29Si orgnicos3.

4534

2.89

332.

8687

Espectro RMN 1H (500 MHz) de glifosatosolvente: D2O - piridina-d5 (7:1)

HOD

CH2 PO3D2NCH2DO2CD

(ppm)0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0

piridina-d4

11

3.45

34

2.89

33

2.86

87

el 1,12% de las molculas tienen13C

J 1H-13C

J 1H-31P

Impureza

satlite 13Csatlite 13C

CH2 PO3D2N13CH2DO2CD

13CH2 PO3D2NCH2DO2CD

(ppm)2.652.702.752.802.852.902.953.003.053.103.153.203.253.303.353.403.453.503.553.603.653.703.75

J 1H-13C(0,56%)

Group Peak Start (ppm/Hz) End (ppm/Hz) Area Area %

1 3.89 1944.4 3.24 1621.0 2.4174E+005 100.00 1 3.89 1944.4 3.24 1621.0 2.4156E+005 99.93

3.49

39

2.92

472.

9006

1.63

15 Muestra: Pur-2Cdigo interno: U04-190803

agregando acetato de sodio:

CH3COO-

N CH COO-N-CH2PO3H2

2 3.41 1706.4 3.37 1687.8 1.8026E+002 0.07 2 3.16 1579.1 2.65 1326.6 2.4170E+005 100.00

1 3.16 1579.1 2.65 1326.6 2.4170E+005 100.00

3 1.86 930.1 1.35 673.4 1.1128E+005 100.00 1 1.86 930.1 1.35 673.4 1.1128E+005 100.00

moles(glifosato) = moles(estndar)Area(estndar)

Area(glifosato) Hestndar

Hglifosatox x

%glifosato =moles(glifosato) x M(glifosato)

W(muestra)

N-CH2COO

(ppm)1.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.8

W(muestra)

La concentracin no interviene! Los errores volumtricos no influyen en el resultado

12

3.50

03

3.39

55

3.07

403.04

99

2.94

382.91

97

2.83

502.81

04

2.56

59

Glifosato tcnico del mercado local

IDA CH2HO2C

NHCH2HO2C

CH2HO2CIDA

glicina

IMPA +satlite 13C

MAMPA

satlite 13CMAMPA

no ident.

NMG

H2NCH2 PO3H2

CH2 PO3H2NCH3

H

CH2 PO3H2NCH3

CH2 PO3H2NCH3

CH3NMG

NHCH2H2O3P

CH2H2O3P

(ppm)2.402.502.602.702.802.903.003.103.203.303.403.503.603.70

gAMPA

NMGno ident.satlite

13C

4.40

15

3.90

153.

8788

3.72

35

3.49

90

3.38

47

3.30

64

3.11

563.

0924

3.06

693.

0432

2.92

932.

9052

2.84

832.

8273

2.82

322.

8028

2.55

59

Otro glifosato local NMG

NHCH2HO2C

CH2 PO3H2NCH2HO2C

CH3

MAMPA

PMIDA N-xido

PMIDA

PMIDA

glicina

Satlite 13C + IMPAno ident. Satlite

13CAMPA

CH2 PO3H2NCH2HO2C

CH2HO2C

CH2HO2C

H2NCH2 PO3H2

CH2 PO3H2NCH3

H

(ppm)22.52.62.72.82.93.03.13.23.33.43.53.63.73.83.94.04.14.24.34.44.5

13

Group Peak Start (ppm/Hz) End (ppm/Hz) Area Area %

1 3.83 1917.6 3.26 1630.4 2.1654E+005 100.00 1 3.76 1879.4 3.69 1845.0 2.0670E+003 0.95

2 3.83 1917.6 3.31 1655.3 2.1347E+005 98.58 3 3.39 1697.4 3.37 1684.0 5.3871E+002 0.25 4 3.31 1655.3 3.26 1630.4 4.7055E+002 0.22

*** Current Data Parameters ***NAME : GLIFOSATOLOTE 10-04

PROCNO : U04-120703 A*** Acquisition Parameters ***AQ_mod : qseq

INSTRUM : AM-500NS : 8

En una muestra grado tcnico podemos adems cuantificar las impurezas (respecto al acetato o al glifosato)

2 1.80 900.3 1.45 724.7 1.1127E+005 100.00 1 1.80 900.3 1.45 724.7 1.1127E+005 100.00

3.72

08

3.49

68

3.38

20

2.92

352.

8993

1.62

34

O1 : 8177.00 Hz

O2 : 7700.00 HzSW : 14.9213 ppm

TD : 65536TE : 303 KCPULSE : 10.500 usec

SFREQ : 500.1354210 MHz*** Processing Parameters ***LB : 0.20 Hz

SI : 32768SR : 6700.07 HzAQ_time : 4.3908880 sec

NUCLEUS : H

SOLVENT : D2O (+piridina-d)

DDATE 2004/J l/26

glifosato (2H)acetato (3H)

(ppm)1.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.05.25.4

DDATE : 2004/Jul/26

PMIDA (4H)

Si queremos integrales con error menor al 1,1% debemos adoptar un criterio uniforme respecto a las seales satlite

Podemos incluir los satlites siempre o excluirlos siempre en la integracin de las seales de un espectro

La superposicin con otras seales dificulta incluirlosLneas muy anchas en la base dificulta excluirlosLneas muy anchas en la base dificulta excluirlos

Una alternativa es eliminar el acoplamiento 1H-13C. Esto tiene varias ventajas adicionales:

Desaparece el ensanchamiento de la base de las lneas al eliminar los acoplamientos 1H-13C a 2 y 3 enlaces

Se elimina el error de integracin provocado por superposicin de seales con satlites de seales vecinas

Se pueden identificar con mayor facilidad impurezas en concentraciones menores al 1%

14

3.49

39

2.92

472.

9006

1.63

15

Sin desacople de 13C

3.50

52

2.94

072.91

64

1.64

11

Con desacople GARP-1temperatura regulada a 303 K

(ppm)1.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.8

(ppm)1.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.8

Tambin es posible usar RMN 31P

12.4

288

10.5

103

8.96

19

7.96

84

2.99

41

glifosato

H2NCH2 PO3H2

CH2 PO3H2NCH2HO2CH2

CH2 PO3H2NCH2HO2C

CH2HO2C

CH2 PO3H2N

CH2HO2C

CH2HO2C O

+

-

(ppm)-101234567891011121314151617181920212223242526272829

fosfato

15

Espectro RMN 31P (202 MHz) de metamidofos tcnicosolvente metanol, sin efecto Overhauser Nuclear, escala vertical x20,

OO

PH3CO

SCH3

NH2

-18

.00

-10

.90

-10

.78

1.4

41.

58

1.64

9.3

39

.36

9.7

710

.67

10.7

210

.77

10.

85

10.9

61

2.7

4

19.1

81

9.2

51

9.3

51

9.4

21

9.4

620

.15

20.

27

21.9

32

2.2

7

25

.54

25.7

3

29.1

30.3

83

0.4

530

.93

32.

35

37.

34

39.1

6

Podemos hacer una cuantificacin absoluta agregando un estndar interno:

O

O P OP

H3COSCH3

NH2

O P O3

MolesMTD = MolesTPPO AreaMTDAreaTPPO

-20-15-10-540 35 30 25 20 15 10 5 0 ppm

1.0

00

1.2

05

16

1.2

01

1.2

51

1.9

13

1.9

30

2.0

77

2.9

85

6.3

75

6.6

90

6.7

07

7.0

24

7.0

40

7.1

42

7.1

677

.36

17.

377

7.3

78

7.3

94

7.4

11

cuantificacin de deltametrinaestndar de referencia: dimetilsulfona (CH3)2SO2

ttulo 98,1%(por CG 98,1%)

DMSO2

OO

Br

BrO H

CN

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

6.1

1

1.0

2

1.0

2

18.5

3

1.0

0

1.0

2

3.0

92

.06

1.0

3

3.07

Group Peak Start (ppm/Hz) End (ppm/Hz) Area Area %

1 6.46 3230.5 6.09 3045.8 1.4219E+009 100.00

1 6.46 3230.5 6.20 3100.2 9.2275E+008 64.902 6.20 3100.2 6.09 3045.8 4.9830E+008 35.05

6.19

306.17

876.17

566.16

13

5.64

765.63

135.62

575.60

94

2.98

17

Estndar de cipermetrina Lote 080125P1U08-130301

cuantificacin de cipermetrina (mezcla de 4 diastermeros)estndar de referencia: dimetilsulfona (CH3)2SO2

DMSO2ttulo 93,1%

2 6.20 3100.2 6.09 3045.8 4.9830E 008 35.05

3 6.14 3070.7 6.09 3047.6 8.3154E+005 0.06

2 5.69 2844.5 5.57 2783.8 3.9989E+008 100.00 1 5.68 2842.2 5.66 2828.4 6.5241E+005 0.16

2 5.69 2844.5 5.57 2783.8 3.9819E+008 99.58 3 5.59 2793.4 5.57 2784.4 1.0422E+006 0.26

3 3.22 1611.0 2.79 1393.0 1.3766E+010 100.00

1 3.22 1611.0 2.79 1393.0 1.3759E+010 99.95 2 2.92 1460.9 2.79 1396.6 6.8632E+006 0.05

OO

Cl

ClOH CN

(ppm)2.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.05.25.45.65.86.06.26.4

desacople GARP centrado a 100 ppmregulacin de temperatura a 303 K

17

anlisis de excipientes en un producto farmacutico

Polietilenglicol (PEG 400) 1%propilenglicol 0,4%Alcohol polivinlico 2%agua

H(O CH2CH2 )nOH CH2OHCH2OHCH3

1 030

3,52-3,65

CHCH2( )n

Verificacinsoluciones acuosas de cada excipiente conteniendo 1mg/ml de dimetilsulfonaMedicinproducto farmacutico conteniendo 1 mg/ml de dimetilsulfona

1,030OH 1,30-2,10

Tabla de datos: 32K Llenado de ceros a 128KAncho espectral: 0 - 4,1 ppmTiempo de adquisicin: 7,99 segTiempo de repeticin: 8,99 segAngulo de pulso: 30Temperatura 297 KNmero de espectros acumulados (NS): 16Equilibracin (DS): 2

ventana exponencial; LB: 0,30 HzCorreccin de fase y de lnea de base automtica con ajuste fino manualReferencia: 10% D2OIntegracin de seales manual,

U09-010403PHE 03904

Group Peak Start (ppm/Hz) End (ppm/Hz) Area Area %

3.93

423.87

84

3.63

793.62

933.61

953.60

093.59

733.54

533.53

543.52

683.45

163.44

353.42

843.42

03

3.35

243.33

883.32

933.31

57

3.03

82

2.00

181.98

46

1.60

241.59

001.54

52

1.03

751.02

46CH2OHCH2OHCH3

DMSO2

%P/V

Propilenglicol 0,90

PEG 400 (n = 8 o 9) 0,36

Alcohol polivinlico 1,87

1 3.67 1833.3 3.50 1751.1 5.2618E+010 100.00 1 3.67 1833.3 3.50 1751.1 5.2618E+010 100.00

2 3.09 1544.1 2.96 1482.3 2.0914E+010 100.00 1 3.09 1544.1 2.96 1482.3 2.0914E+010 100.00

3 2.20 1099.6 1.19 596.7 1.4652E+011 100.00 1 2.20 1099.6 1.19 596.7 1.4652E+011 100.00

4 1.10 551.5 0.87 435.0 5.9783E+010 100.00 1 1.10 550.9 1.05 527.4 1.7317E+008 0.29 2 1.10 551.5 0.87 435.0 5.9319E+010 99.22

3 1.00 498.0 0.87 435.6 2.9107E+008 0.49

H(O CH2CH2 )nOH

CHCH2( )n

2

(ppm)1.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.0

2

OH

( )n

18

Algunas fuentes de error intrnsecas a mtodos cromatogrficos y RMN cuantitativo

fuente de error RMN HPLC / GCdiferente factor de respuesta entre sustancia a cuantificar y estndar d f i

Para ncleos distintos de 1H, medir espectros sin NOEMedir T1 previamente y usar

usar como estndar de ref. un patrn de ttulo conocido de la sustancia a cuantificar (no siempre disponible)

de referencia tiempos de repeticin > 9T1ttulo incorrecto o dudoso del estndar de referencia

Cambiar por otro estndar (otro proveedor u otra sustancia de referencia), determinar ttulo contra otro estndar diferente

Buscar otro proveedor del mismo estndar (no siempre posible)

superposicin de pico de sustancia a cuantificar con una impureza desconocida

Hacer el clculo con ms de una seal de la muestra o con ms de un ncleo presente en la muestraUtilizar RMN 2D homo o heteronuclear para confirmar

Cambio de condiciones (columna, solvente, temperaturas)Acoplar a espectrometra de masa y determinar el espectro en distintas partes del mismo pico (no siempreheteronuclear para confirmar

pureza de picopartes del mismo pico (no siempre posible en HPLC)Acoplar a RMN (solo para HPLC)

Detector contaminado, sangrado de columnas, picos fantasmas

--------No se aplica---------- Cambiar/acondicionar columnalimpiar detector, inyector, etc.

RMN cuantitativo (QNMR)

Ventajas No requiere estndares del compuesto principal ni de las impurezas No requiere separar el compuesto principal ni las impurezas Puede identificar y cuantificar impurezas nuevas o inesperadas En general no hay impurezas invisibles Es simple, preciso y econmico No es destructivo (la muestra una vez preparada puede reanalizarse) No hay desgaste o deterioro de columnas, etc.

Desventajas Se requieren espectrmetros de RMN de alto campo que son costosos (20 a 30 veces

el precio de un GC o HPLC)

La operacin de los espectrmetros requiere personal especialmente entrenado y con buenos conocimientos de la teora del mtodo

El mantenimiento de los espectrmetros requiere insumos cuyo consumo es permanente e independiente del uso (helio y nitrgeno lquidos)

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Seleccin de bibliografa de RMN cuantitativo

U. Holzgrabe et al, J. Pharm. Biomed. Anal., 1998, 17, 557-616 (review)G. F. Pauli, Phytochem. Anal., 2001, 12, 28-42 (review)R. J. Wells et al, J. Agric. Food. Chem., 2002, 50, 3366-3374T. S. Al-Deen et al, Anal. Chim. Acta, 2002, 474, 125-135T. S. Al-Deen, et al, Accred. Qual. Assur., 2004, 9, 5563R J Wells et al Accred Q al Ass r 2004 9 450 456R. J. Wells et al, Accred. Qual. Assur., 2004, 9, 450456G. F. Pauli et al, J. Nat. Prod., 2005, 68, 133-149 (review)G. F. Pauli et al, J. Nat. Prod., 2007, 70, 589-595NMR Spectroscopy in Pharmaceutical Analysis 2008, Elsevier