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Guía para la presentación de proyectos en el marco de la “Convocatoria general para la financiación de proyectos de Investigación, Innovac ión y Creación de la

Universidad de Caldas 2015”

Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados

1

1. Información general

Título del proyecto1:

EVALUACIÓN DE INTRODUCCIONES DE TOMATE PRODUCIDO VIA MICROINJERTACION CONTRA

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc.) SNYDER Y HANSEN.

Nombre de la convocatoria en la cual presenta el proyecto:

Nombre de los Grupos de Investigación: (registre la información de los grupos que participan)

Nombre del Grupo: Grupo de Investigación en Proyección y Producción Agropecuaria

(GIPPA).

Facultad/Instituto/Departamento: Ciencia Agropecuarias/Sistemas de Producción

Agropecuarias.

Clasificación

__B__

Tipo de proyecto de I&D: Investigación Básica2: Investigación Aplicable

3:

Aplicación en curso4: Creación: Innovación Tecnológica

5:

Tipo de innovación:

Innovación tecnológica de producto Innovación tecnológica de proceso

Innovación organizacional

Área Estrátegica del Plan de Desarrollo

Biotecnología Artes, Cultura y Humanidades Problemática Social

Salud

Ambiental

No corresponde a ninguna de las

áreas estratégicas

INTEGRANTES DEL EQUIPO DE INVESTIGACIÓN

(indicar el investigador responsable con un asterisco)

NOMBRE/TIPO DE VINCULACIÓN EN LA

UNIVERSIDAD DE CALDAS

DEPARTAMENTO o

PROGRAMA

ÁREA DE

CONOCIMIENTO

(según COLCIENCIAS)

Nelson Ceballos Aguirre Director

Producción Agropecuaria

Agronomía, Veterinaria

y afines

1 Se recomienda que no exceda 15 palabras

2 Son estudios que tienen como propósito el trabajo experimental o teórico realizado principalmente con el objeto de

generar nuevos conocimientos sobre los fundamentos de fenómenos y hechos observables, sin prever ninguna

aplicación específica inmediata 3 Son proyectos de investigación original realizada para la adquisición de nuevos conocimientos, contextualizada

dentro de fines con potencialidad de ofrecer alguna contribución práctica 4 Son proyectos de investigación original, dirigida principalmente y de manera inminente hacia un fin u objetivo

práctico, determinado y específico 5 Se refiere a aquellos proyectos que tienen como objetivo el desarrollo de nuevos productos o procesos, así como las

modificaciones tecnológicas importantes en productos o procesos

x

x

x

x




2

Universidad de Caldas

Jairo Castaño Zapata Asesor evaluador

Producción Agropecuaria

Universidad de Caldas

Agronomía, Veterinaria

y afines

Lucía Atehortúa Garcés Asesora evaluadora

Biotecnología

Universidad de Antioquia

Ciencias Naturales y

afines

ESTUDIANTES DE POSTGRADO PROGRAMA

ÁREA DE

CONOCIMIENTO

(según COLCIENCIAS)

Dora Janeth García Doctorado en Ciencias Agrarias Ciencias Naturales y

afines

Lugar de Ejecución del Proyecto: (Municipio/Departamento)

Ciudad: Manizales Departamento: Caldas

Presupuesto. Valor total del proyecto: 645.170.017 (ver Anexo 1)

Duración total (meses): 36 meses

2. Resumen ejecutivo

El tomate, Solanum lycopersicum L. es una planta dicotiledónea perteneciente a la

familia de las solanáceas, nativa de Suramérica; se cultiva en más de 100 países dentro

de los que se destacan China, Estados Unidos, India, Turquía, y Egipto. En el año

2014 el tomate alcanzó una producción mundial de 145.751.507 toneladas de fruto,

convirtiéndose en una de las hortalizas con más demanda a nivel mundial (FAOSTAT,

2015). En Colombia los departamentos de Boyacá, Norte de Santander, Caldas,

Antioquia, Cundinamarca, Valle del Cauca, Santander y Nariño produjeron 683.538

toneladas de tomate, predominando las variedades Chonto y Milano con una

participación del 72,55% de la producción total para el año 2013.

Uno de los factores más limitantes de la producción a gran escala de tomate en

Colombia son los patógenos (hongos, bacterias, virus y nematodos) asociados a más

de 51 enfermedades reportadas. Sin embargo, la ausencia de genotipos comerciales

resistentes a enfermedades, la carencia de programas de mejoramiento genético, la

falta de prácticas culturales, los bruscos cambios climáticos, la ausencia de tecnología

apropiada para un mejor manejo de los sistemas de producción y el manejo post-

cosecha, hacen que enfermedades como la Marchitez vascular causada por Fusarium




3

oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder y Hansen cause grandes reducciones en

producción y afecte la calidad del cultivo. El cultivo de tomate demanda nuevas

estrategias a nivel biotecnológico como son el uso de cultivo de tejidos vegetales in vitro

y la microinjertación para la identificación e introducción de materiales promisorios

tolerantes o resistentes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.

El presente proyecto de investigación tiene como objetivo principal la evaluación y

producción de microinjertos de tomate comercial tipo Chonto utilizando como patrones

introducciones de tomate cereza tolerantes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Se

espera que la producción de las plantas vía microinjertación sirva como una alternativa

para la introducción de nuevos materiales genéticos como patrones tolerantes o

resistentes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici con miras al fortalecimiento e

incremento del sistema productivo del cultivo.

3. Conformación y trayectoria del equipo de investigadores

Grupo de Investigación y Proyección en Producción Agropecuaria –GIPPA-

Código Colciencias: COL0103988

El objetivo general del Grupo es formar investigadores con capacidad para diseñar,

construir y ejecutar acciones efectivas que propicien el mejoramiento de la producción

agropecuaria, desde sus dimensiones ambiental, social y económica. A través de sus

líneas de investigación y de las actividades de proyección y extensión universitaria,

GIPA busca respuestas a los problemas propios del sector agropecuario de la región y

del país. El grupo ha venido realizando proyectos de investigación aplicada y desarrollo

tecnológico para el crecimiento del sector rural colombiano tendientes a la generación

de conocimiento a través del mejoramiento genético animal y vegetal, la bioprospección

y la producción agropecuaria integrada, articulado a los diferentes postgrados y

proyectos institucionales.

Desde la fundación del Grupo (Enero de 2011) algunos de los principales logros han

sido: el aporte efectivo a través de cursos especializados a estudiantes de posgrado de




4

la Maestría en Sistemas de Producción Agropecuaria, Maestría en Fitopatología y

Doctorado en Ciencias Agrarias de la Universidad de Caldas. El grupo, a partir de su

potencial académico-científico, ha aunado sus esfuerzos investigativos en tres líneas de

investigación: Bioprospección, Genotecnia y Producción Integrada. Como resultado de

estos esfuerzos se ha logrado la consolidación y avance de diferentes convenios

interinstitucionales con entidades como Productos Químicos Andinos (P.Q.A),

Universidad de California Riverside EE.UU (UCR), Universidad Nacional de Colombia

sede Palmira y Universidad Católica de Manizales. Adicionalmente, GIPPA cuenta con

seis doctores y cuatro magísteres, tres de ellos adelantando estudios de Doctorado;

además de seis semilleros de investigación con 96 estudiantes de pre y postgrado con

trabajos de grado y tesis inherentes al quehacer de las diferentes líneas de

investigación del grupo. El grupo de investigación cuenta con los espacios académicos,

laboratorios y granjas para facilitar el desarrollo de los proyectos de investigación

propuestos.

4. Descripción del proyecto

4.1 Planteamiento de la pregunta o problema de investigación y su justificación.

El tomate se encuentra difundido en todos los continentes y representa unas de las

principales fuentes de vitaminas, minerales y fibra, importantes para la salud y nutrición

humana (Ceballos et al., 2012). Actualmente, debido al incremento de la población

mundial, se presentan altas demandas del cultivo a nivel de producción y

comercialización; lo cual explica su crecimiento, expansión y producción durante los

últimos años, permitiendo de esta forma; la generación de empleo rural, la estimulación

del empleo urbano, el aumento de las exportaciones, la mejora de la nutrición de los

humanos e incremento del ingreso de los agricultores. Sin embargo, el cultivo de

tomate es afectado por múltiples problemas fitosanitarios que limitan considerablemente

la producción (Parra y López, 1997; Vallejo-Cabrera, 1999; Guerrero, 2013). Muchos

de estos agentes fitopatógenos obligan a la aplicación de productos químicos de

elevada categoría toxicológica como benomil (categoría III), carbendazim (categoría III),

tiabendazol (categoria IV) (Jaramillo et al., 2013).




5

El uso indiscriminado de estos productos pueden ocasionar el desarrollo de nuevas

cepas patogénicas resistentes, la reducción de especies benéficas para el cultivo,

problemas de salud en el personal involucrado con sus aplicaciones, acumulación

residual en el suelo, fuentes de agua y alimentos (Espinoza et al., 2003; Castro y

Ramos 2005).

Agentes como Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici causante del Marchitamiento

vascular, constituye uno de los patógenos más limitantes debido a las pérdidas que

ocasiona en las Solanáceas en el ámbito mundial (Guerrero, 2013). Como prueba de

ello, se reportan pérdidas del 60% hasta el 100% en los rendimientos del cultivo en

plantas afectadas por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Agrios, 2005). Una de las

medidas más efectivas para el control de patógenos, es el empleo de variedades

resistentes (Peteira et al., 2002), seguida por la utilización de agroquímicos, los cuales,

a pesar de su relativa eficiencia presentan varios efectos negativos como: inducción de

resistencia en patógenos por el inadecuado uso de los mismos, pérdida de especies

benéficas, contaminación del suelo, agua, aire y residuos en alimentos (Maniania et al.,

2008; Skirvin y Fenlon, 2001).

Una alternativa viable a los problemas derivados del uso excesivo de productos

sintéticos, es la implementación de métodos que garanticen el desarrollo sostenible de

los sistemas productivos a través de la intervención de los factores social, ambiental y

económico, mediante la apropiación de cultivo de tejidos vegetales in vitro

especialmente de la microinjertación. Esta técnica, requiere la selección de una base o

patrón y de una copa o injerto; las dos porciones vegetales son establecidas in vitro y

luego, por medio de cortes específicos se logra la ubicación de las dos porciones

vegetales y su posterior cicatrización y con ello la obtención de una plántula

microinjertada (Hussain et al., 2015; Niang et al., 2015; Nava et al., 2011; Onay et al.,

2004).

El uso de la microinjertación ha sido propuesto como una estrategia de manejo

integrado para el control de enfermedades que se originan en el suelo en el cultivo de




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tomate que reducen significativamente la productividad del cultivo (de Lima Coutinho et

al., 2009; do Rego et al., 2008; Rivar y Louws, 2006).

Así mismo, ha sido exitosamente usada en un amplio rango de plantas como un

método efectivo para la obtención de plantas resistentes a patógenos del suelo. Por

ejemplo, Daktulosphaira vitifoliae, causante de la Filoxera de la uva es considerada

como la plaga más destructiva de las uvas cultivadas en todo el mundo, se alimenta de

la savia de las raíces de uva, causando daños y con frecuencia la muerte de los

viñedos (Makee et al., 2004). Para ello, se desarrolló un microinjerto (Kim et al., 2015),

logrando a través del uso de cultivares resistentes a la plaga (portainjertos) y uvas de

mesa comerciales (copas), la producción de plantas resistentes a la Filoxera.

Adicionalmente, do Rego et al. (2008) y de Lima Coutinho et al. (2009), lograron

establecer la metodología de microinjertación como método para el control de Ralstonia

solanacearum en cultivos de tomate en Brasil.

Esta problemática asociada al cultivo de tomate, generó tópicos de estudio para el

grupo de investigación GIPPA, los cuales fueron enfocados en la caracterización del

banco de germoplasma de Solanum spp. y en la búsqueda de estrategias que permitan

mejorar las condiciones actuales de la producción de tomate en el país. Ello dio origen

a los trabajos realizados por Cardona (2015); Gonzáles y Marín (2015); Gómez (2014) y

Ceballos (2012), en los cuales se ha logrado la identificación de accesiones de tomate

tolerantes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, las introducciones IAC426, IAC391,

IAC412, LA1480 y LA2076. Estos trabajos, permitieron la selección de estas

introducciones por su tolerancia al patógeno causante de la Marchitez vascular, con

miras al desarrollo de plántulas tolerantes a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, que

puedan ser incorporadas en futuros programas de mejoramiento genético.

Los resultados de éstos proyectos de investigación, dieron origen a la presente

propuesta, la cual tiene como objetivo la producción de variedades de tomate tipo

chonto vía microinjertación en plantas de tomate cereza tolerantes a Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici. Para cumplir con el objetivo se están aprovechando tanto




7

las características benéficas del sistema radical (resistencia a enfermedades) de los

cultivares seleccionados, como las cualidades productivas de las variedades que

formarán la parte aérea de la planta (copa comercial). Se espera que las plantas

producidas por microinjertación muestren tolerancia o resistencia a Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici generando un impacto significativo en las pérdidas por

daño del patógeno, y aumento en el rendimiento promedio del cultivo. La producción de

nuevas líneas de tomate tolerantes o resistentes a Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici por microinjertos puede considerarse una valiosa contribución para el

manejo de la enfermedad para los productores de tomate.

La generación y divulgación de los resultados del proyecto mediante publicaciones

científicas y la interacción con diferentes grupos de investigación nacionales e

internacionales son compromisos primordiales para la formación de capital humano en

esta investigación.

4.2 Marco Teórico

El cultivo de Tomate:

El tomate tipo cereza es nativo de la región Andina de América del Sur, donde

posteriormente fue propagado hacia México y a Europa a mediados del siglo XVI, el

cual reporta gran cantidad de subespecies o variedades que a su vez aportan elevada

variabilidad genética (Nuez, 1999). En Colombia, la producción de tomate para el año

2014, fue de 683.538 toneladas/año con un rendimiento de 409.206,18 Kg/ha

destacándose los departamentos de Boyacá, Norte de Santander, Caldas, Antioquia,

Cundinamarca, Valle del Cauca, Santander y Nariño con una participación nacional total

de 72,55%, en los cuales se siembran las variedades Chonto y Milano (Minagricultura,

2012; FAOSTAT, 2015) haciendo de ésta la hortaliza más importante en Colombia y en

el mundo.

Sin embargo, en Colombia, los patógenos (hongos, bacterias, virus y nematodos)

constituyen uno de los factores más limitantes de la producción a nivel comercial de




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tomate, situación que se ve incrementada por la ausencia de cultivares comerciales con

resistencia genética específica, las prácticas inadecuadas de control empleadas por el

agricultor y el uso indiscriminado de pesticidas que inducen a cambios genéticos en los

patógenos, desarrollando razas más virulentas (Vallejo-Cabrera, 1999).

A pesar de su relativa eficiencia, el empleo de pesticidas de síntesis química, genera

varios efectos negativos como: la inducción de individuos resistentes debido al uso

inadecuado de los agroquímicos, la reducción o eliminación de especies benéficas, la

alta toxicidad de los productos para los operarios y la presencia de residuos en los

alimentos (Maniania et al., 2008), sin mencionar los costos indirectos generados como

la contaminación del aire, de las aguas subterráneas, la degradación del suelo y la

pérdida de diversidad biológica (Skirvin y Fenlon, 2001; Espinoza et al., 2003; Castro y

Ramos, 2005).

Debido a las condiciones climáticas de Colombia y por ser principalmente agrícola,

existe una alta dependencia hacia los pesticidas para favorecer el rendimiento en las

cosechas. Sin embargo, el uso indiscriminado de éstos ha generado serias

consecuencias que afectan los ecosistemas, a los agricultores y a los consumidores,

debido a su residualidad en agua, suelo, ambiente y alimentos como el tomate, papa,

espinaca y lechuga; vegetales que están reportados con mayor almacenamiento de

contaminantes (Badii y Landeros, 2015; Plenge-Tellechea et al., 2007; Castro y Ramos,

2005; Cárdenas et al., 2005).

Las principales enfermedades que se presentan en el cultivo de tomate en Colombia

son: Tizón tardío, (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary), Tizón temprano (Alternaria

solani (Ell. y Martin) Jones y Grout), Mildiú o Moho gris (Fulvia fulva Cooke

Cladosporium fulvum Cooke), Carate (Phoma andina var. crystalliformis Turkenst),

Mancha foliar (Stemphylium solani Weber.), Marchitez vascular [Fusarium oxysporum f.

sp. lycopersici (Sacc.) Snyder y Hansen], Verticilosis (Verticillium dahliae Kleb.),

Mancha bacteriana (Xanthomonas campestris var. vesicatoria Doidge), Peca bacteriana

(Pseudomonas syringae var. tomato Okabe) y la Peste negra o vira cabeza (virus




9

TSWV – Tomato Spotted Wilt Virus) (Castaño-Zapata, 2015; Jaramillo, 2007; Agrios,

2005; Vallejo-Cabrera, 1999).

Marchitez vascular:

Una de las enfermedades más devastadoras del cultivo de tomate es la Marchitez

vascular, cuyo agente causante, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder y

Hansen, es responsable de pérdidas hasta de un 60% en producción, afectando

también la calidad del producto (Agrios, 2005), inclusive cuando la planta se marchita,

la pérdida puede llegar al 100% ya que las plantas infectadas quedan pequeñas y sus

frutos maduran prematuramente (Kranz, 1982).

La Marchitez vascular, es una enfermedad que se encuentra distribuida en todo el

mundo causando grandes pérdidas en el cultivo de tomate, el agente causante es

transportado por el suelo. La Marchitez vascular fue descrita por primera vez en

Inglaterra en 1895 (Bewley, 1922), y se le llamó la enfermedad de los tomates

adormilados. La presencia de la enfermedad ha sido reportada al menos en 32 países

y particularmente se considera endémica en países con clima cálido; el uso de

variedades resistentes como por ejemplo los cultivares de tomate denominados KNVF y

KVF, híbridos inter-específicos que han ayudado a disminuir las pérdidas en producción

causadas por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 y Pyrenochaeta lycopersici

(Kuniyasu y Yamakawa, 1983). Los factores que favorecen el desarrollo del

marchitamiento son: la temperatura del suelo y del aire de 28°C, suelos ácidos y

arenosos, humedad en el suelo por encima de la capacidad de campo, baja

disponibilidad de nitrógeno y fósforo y alto en potasio, fotoperiodos cortos, y baja

intensidad de luz (Wong, 2003).

El hongo impide la translocación de agua y nutrientes a través de los vasos del xilema

causando finalmente la muerte de la planta (Schumann y D’Arcy, 2006). Los primeros

síntomas de la enfermedad que se presentan en la planta son el amarillamiento de las

hojas más viejas, estrías longitudinales cloróticas en los tallos que luego se vuelven

pardas en el centro pero siempre rodeadas de un halo amarillo (Fig. 1). Si se levanta la




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corteza, bajo éstas manchas, se detectan los vasos de color pardo. El tejido vascular de

los frutos es afectado (González, 2012). La planta desmejora día a día, su tejido

vascular se torna pardo y por último la planta muere. Las respuestas en las alteraciones

vasculares de la planta son inducidas directamente por el patógeno, mientras que otras

las origina el hospedante en respuesta al patógeno. Básicamente el patógeno ataca el

tejido vascular afectando el flujo de agua en el xilema (Agrios, 2005), mientras que la

planta produce oligosacáridos como producto de la degradación de las paredes

celulares de los haces vasculares, éstos, en algún momento pueden tornarse en

inductores de respuestas de defensa por la planta.

Figura 1. Síntomas de la Marchitez vascular en plantas de tomate. A. Marchitez de la

planta. B. Clorosis. C. Necrosamiento vascular. Imágenes tomadas y modificadas de

Fernández-Herrera et al. (2013).

Fusarium oxysporum:

Fusarium oxysporum es un hongo filamentoso hialino de distribución universal que se

reproduce de manera asexual, causa la Marchitez vascular en cultivos de importancia

económica y sus aislamientos se han clasificado en formas especiales en función de la

especificidad de hospedante (Agrios, 2005). De acuerdo con Castaño-Zapata (2015),

Fusarium oxysporum pertenece a los hongos mitospóricos, orden Moniliales, familia

Moniliaceae, género: Fusarium. La mayoría de los hongos de este género que

producen Marchitamiento vascular pertenecen a Fusarium oxysporum. Dentro de la

especie oxysporum muchos de sus miembros presentan patogenicidad especifica por el

hospedante, lo que ha conllevado a una subdivisión de la especie en formas especiales




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que, a su vez, debido a la virulencia sobre variedades del mismo hospedante, se divide

en razas fisiológicas (Booth, 1970; Nelson y Plosser, 1982; González, 2012). Así, el

hongo que ataca al tomate se designa como F. oxysporum f. sp. lycopersici (Agrios,

2005), del cual se conocen actualmente las razas 1, 2 y 3 (Hernández-Martínez, 2014;

González, 2012; Pietro et al., 2003).

Adicionalmente, Fusarium oxysporum se caracteriza por la producción de hifas

tabicadas hialinas, conidióforos cortos y por lo general no septados, con monofialides

laterales cortas dispuestas en el micelio aéreo (Leslie y Summerell, 2006). Forma tres

tipos de esporas asexuales: 1. Microconidios: esporas unicelulares hialinas con forma

recta o curva, elipsoidal o cilíndricas y en la mayoría de los casos sin septos, de 5-12

µm de largo por 2,5–3,5 µm de ancho. 2. Macroconidios: esporas de forma alargada,

ligeramente curvas, por lo general con tres septos transversales, la célula apical en

forma cónica y la basal con extremo en forma de pie, de 27 a 46 µm de largo por 3–4.5

µm de ancho, y 3. Clamidosporas: esporas hialinas de apariencia lisa o rugosa, que

pueden presentarse en forma aislada, en pares, en racimos o en cadena, de acuerdo a

la posición que ocupan en la hifa pueden ser: intercalar, si están dentro de la hifa, sésil,

cuando están al lado de ésta y terminal, cuando están en su extremo; las clamidosporas

se caracterizan por su alta resistencia a condiciones ambientales desfavorables (Leslie

y Summerell, 2006).

Las colonias de Fusarium oxysporum son de crecimiento rápido, algodonosas o

vellosas con una coloración superficial rosada a roja distintiva y en el reverso una

pigmentación de blanco a violeta, con su centro de color purpura o azul oscuro (Leslie y

Summerell, 2006).

El control de F. oxysporum f.sp. lycopersici se fundamenta principalmente en tres

estrategias: prácticas de manejo cultural, aplicación de agroquímicos y el uso de

variedades resistentes (Barone y Frusciante, 2007). Las variedades resistentes se

producen principalmente cruzando tipos silvestres resistentes y cultivares existentes

destacados por sus propiedades como el buen sabor, forma y color (Peteira et al., 2002;

Vallejo-Cabrera, 1999). Kuniyasu y Yamakawa (1983), tienen reportados dos cultivares




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resistentes de tomate denominadas KNVF y KVF, híbridos interespecíficos de Solanum

spp. y Solanum hirsutum, con resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3

y Pyrenochaeta lycopersici, los cuales son utilizados como patrones para injertos (porta-

injertos) (Fukuju y Walter, 1983).

Interacción plata-patógeno:

Debido a los ambientes complejos y el amplio rango de exposición e interacción a

factores tanto abióticos como bióticos, las plantas han adquirido diferentes estrategias

de defensa, dentro de las que se encuentra el reconocimiento de elicitores y efectores,

es decir, moleculas provenientes de diversas fuentes (bióticas/abióticas) que se

encargan de activar los sistemas de defensa de las plantas (Vasconsuelo y Boland,

2007).

El conocimiento de los mecanismos de defensa y resistencia de las plantas a la

enfermedad, se ha enfocado en entender la interacción entre el hospedante (la planta) y

el patógeno a partir del estudio de los genes de resistencia (R) y los genes de

avirulencia del patógeno (Avr) (Meng y Zhang, 2013; Guan, 2012; Gururani et al., 2012;

Campbell et al., 2002).

Sin embargo, es importante entender los tipos de interacción entre la planta y el

patógeno, considerando asi dos tipos de interacciones: interaccion incompatible e

interaccion compatible; la primera se determina cuando la planta tiene la capacidad

de activar los mecanismos de defensa y de esta manera impide o bloquea la

colonización del patógeno, definiendo asi la planta como resistente; dentro de las

respuestas de defensa en las interacciones incompatibles se encuentra la respuesta de

hipersensibilidad (HR), la cual se presenta como un sintoma visible de necrosis sobre el

tejido vegetal (Desender et al., 2007; Glazebrook, 2005; Panstruga, 2003).

Por otro lado, la interacción compatible se establece cuando las defensas de la planta

no son inducidas y el patógeno tiene la capacidad de desarrollarse e infectar por

completo la planta, en este caso la planta se considera susceptible (López, 2007;

Glazebrook, 2005; Panstruga, 2003).

https://scholar.google.es/citations?user=Uhd766gAAAAJ&hl=es&oi=sra




13

De acuerdo con el modelo de reconocimiento planta-patógeno, lo primero que debe

suceder es el reconocimiento que la planta hace de las moléculas producidas por el

patógeno dentro del mismo hospedante durante el ataque a la celula vegetal; estas

moléculas, altamente conservadas, son conocidas como elicitores, ellas son

responsables de inducir o activar las respuestas de defensa de las plantas

(Muthamilarasan y Prasad, 2013; Meng y Zhang, 2013; Desender et al., 2007).

Los elicitores que están asociados a la patogenesis se denominan PAMPS (Pathogen–

Associated–Molecular-Patterns) o MAMPS (Microorganism-Associated-Molecular-

Patterns), dentro de estas moleculas se encuentran lipopolisacáridos, la quitina de los

hongos, el peptidoglucano y la flagelina de las bacterias (Muthamilarasan y Prasad,

2013; Meng y Zhang, 2013; Mercado y Pineda, 2009; Boller y Felix, 2009).

El reconocimiento de PAMPS o MAMPS esta determinado por proteinas especificas de

reconocimiento a patógenos o PRRs, las cuales inician una respuesta de defensa activa

en la planta, denominada como inmunidad basal (Boller y Felix, 2009). La primera

etapa de esta inmunidad basal se denomina PTI (PAMP‐ Triggered‐ Immunity), ésta es

mediada por receptores de proteinas PRRs, quienes se localizan en la membrana de la

célula vegetal y se caracterizan por la presencia de dominios altamente conservados

como NBS (Nucleotide Binding Site) junto con un dominio LRR (Leucine Rich Repeat),

permitiendo translocar la respuesta al interior de la celula vegetal a traves de una

cascada de kinasas para activar factores transcripcionales específicos de la respuesta

de defensa (Jones y Dangl, 2006; Boller y He, 2009).

El reconocimiento a través de la PTI en patógenos como F. oxysporum que tienen la

capacidad de destruir completamente el tejido durante la infección (necrótrofo), no es

efectivo (Jones y Dangl 2006), debido a que el patógeno produce moléculas efectoras

que facilitan la muerte celular y evitan el reconocimiento por parte de las proteinas

PRRs, bloqueando así la PTI. Como consecuencia de esto, el patógeno puede iniciar la

colonización en la planta a traves de las raices (Muthamilarasan y Prasad, 2013; Meng

y Zhang, 2013; López, 2007).




14

Aunque las celulas vegetales de las plantas tienen suficiente celulosa, hemicelulosa y

pectina para evitar ser atacadas por los patógenos, las hifas de F. oxysporum logran

penetrar la raiz a traves del apoplasto y el simplasto, causando asi daño del córtex

(Alabouvette et al., 2009). El complejo enzimatico producido por F. oxysporum implica la

secreción de enzimas como celulasas, poligaracturonidasas (PGs), pectatoliasas (PLs),

xilanasas y proteasas, de tal forma que, tan pronto la hipodermis de la raiz ha sido

invadida por el patógeno, este se ubica en el córtex de la raiz, con ello se evidencia que

las respuestas de defensa basal por parte de la planta en el interior del córtex no son

efectivas para detener el crecimiento del microorganismo en el primer reconocimiento.

Sin embargo, la planta continúa en su lucha por defenderse activando la segunda fase

de reconocimiento entre hospedante‐ patógeno: la inmunidad mediada por efectores

ETI (Effector‐ Triggered-Immunity). Este reconocimiento puede ser directo a partir del

modelo receptor‐ ligando (interacción proteina‐ proteina: un solo gen de resistencia

tiene la capacidad de reconocer un solo gen de avirulencia) o indirecto mediante el

modelo gen‐ guardian (la proteina de resistencia detecta el cambio conformacional en la

proteina guardian induciendo asi la respuesta de defensa) (Muthamilarasan y Prasad,

2013; Dodds y Rathjen, 2010).

ETI se considera una respuesta acelerada y mucho mas amplia que la respuesta PTI, lo

cual resulta en una resistencia por parte de la planta donde, usualmente, se evidencia

la producción de fitoalexinas (tóxicas para el patógeno) y ligninas (que fortalecen la

pared celular). Los primeros reportes sobre la participación de fitoalexinas en la

respuesta de defensa de las plantas, fueron descritos por Muller en 1956, mostrando

fuertes evidencias de la resistencia de la papa a Phytophtora infestans. A partir de esta

observación nace la idea de la presencia de las fitoalexinas en inmunidad vegetal (Kuc,

1995). Éstas, son metabolitos secundarios de bajo peso molecular, que han sido

definidas como compuestos producidos por la planta después de una infección bajo la

influencia de dos sistemas metabólicos (planta/patógeno) (Muller, 1956). Se conoce

además, que son metabolitos secundarios producidos por las plantas con actividad

inhibitoria contra bacterias, hongos, nematodos, insectos y efectos tóxicos tanto de




15

animales como de las mismas plantas (Arruda et al., 2016; García-Mateos y Pérez-Leal,

2003).

Los aspectos moleculares de las fitoalexinas fueron introducidos por Cruickshank y

Perrin desde 1971, quienes lograron la caracterización de diversas estructuras de las

primeras fitoalexinas identificadas y aisladas de frijol, zanahoria, papa y orquídea,

constituyéndose en el punto de partida para estudios químicos, bioquímicos y biológicos

en relación a la participación de éstas en la resistencia a enfermedades (García-Mateos

y Pérez-Leal, 2003). Las fitoalexinas se sintetizan inmediatamente después de la

infección o el daño en las células sanas adyacentes a las células infectadas ó dañadas

y se acumulan tanto en tejidos necróticos resistentes, como susceptibles, es decir, se

producen en el lugar de la infección, de tal forma que una o varias fitoalexinas alcanzan

una concentración suficiente para inhibir el desarrollo del patógeno por disfunción en la

integridad de la membrana celular, induciendo así la resistencia en la planta (Kuc, 1995;

García-Mateos y Pérez-Leal, 2003). A la fecha, diversas fitoalexinas han sido

identificadas en una amplia variedad de especies vegetales; por ejemplo, en

solanáceas, glicoalcaloides, sesquiterpenos, cumarinas entre otras han sido

identificadas (Arruda et al., 2016). La -tomatina es una fitoalexina producida por la

planta de tomate que induce la muerte celular programada por la posible activación de

las vias de señalización, a traves de la tirosina quinasa y la proteina G, ésta induce a

una acumulación intracelular de Ca++ y a la producción de especies reactivas de

oxígeno como el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Ito et al., 2004; González et al., 2012).

Actualmente gracias a los grandes avances en el conocimiento molecular de las

fitoalexinas se puede manipular a través de la ingeniería genética la producción de

éstas para modular y mejorar la respuesta de defensa de las plantas (Arruda et al.,

2016; Jeandet et al., 2013; Pieterse et al., 2012).

Además de la activa participación de las fitoalexinas en la defensa de la planta, se

activa la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que inducen la respuesta

de hipersensibilidad, la cual consiste en una muerte celular programada en el sitio de la

colonización para evitar la movilidad del patógeno a otros tejidos; finalmente se da la




16

activación y expresión de los genes de defensa que generarán las proteínas de

resistencia (PR) responsables de identificar los efectores generados por el patógeno

con el objetivo de controlar el avance del patógeno (Muthamilarasan y Prasad, 2013;

Gururani et al., 2012; Jones y Dangl 2006).

Los efectores contribuyen con la virulencia del patógeno y son el producto de los genes

Avr, quienes codifican proteinas que son “presentadas” a las celulas vegetales durante

la infección (López, 2007), y que podrán interactuar con los productos de los genes R,

(las proteínas R), generadas por la planta en su respuesta de defensa. Ademas, estos

efectores pueden mimetizar o inhibir funciones de las celulas eucarioticas (Jones y

Dangl 2006).

En el caso de las interacciones incompatibles, la función de los efectores es activar las

respuestas de defensa; mientras que en las interacciones compatibles, su función es

suprimir las respuestas de defensa basales desencadenando en la planta la ETS

(Effector‐ Triggered-Susceptibily).

Algunos efectores o genes Avr de los hongos han sido ampliamente descritos; para F.

oxysporum, se conoce que secreta las proteinas efectoras SIX‐ 1 (Secreted in Xylema‐

1) codificada por el gen Avr3, la proteina SIX-3 codificada por el gen Avr2 y la proteina

efectora SIX‐ 4, codificada a partir del gen Avr1, secretada en el xilema de plantas de

tomate afectadas por F. oxysporum fs. lycopersisci. Las proteínas SIX-1 y SIX-3 son

necesarias para la completa virulencia del patógeno; mientras que la proteina efectora

SIX‐ 4, no es totalmente necesaria para generar la Marchitéz vascular en plantas de

tomate (Rep et al., 2005; Houterman et al., 2008; Houterman et al., 2009; Michelse y

Rep, 2009).

Para F. oxysporum f. sp. lycopersici, la respuesta ETI se da a partir de los genes

efectores Avr2 y Avr3 los cuales son expresados durante la colonización del patógeno

desde la raíz hasta alcanzar el xilema de las plantas de tomate, son reconocidos por los

genes de resistencia I2 (Immunity 2) e I3 respectivamente. El gen efector Avr1 no es

reconocido por parte de los genes R encargados del reconocimiento de efectores en




17

plantas de tomate I2 e I3 (Michelse y Rep 2009), favoreciendo la colonización en el

xilema, hasta causar marchitamiento vascular. Aunque, es posible que algunos

patógenos tengan una mayor cantidad de efectores disminuyendo la respuesta ETI y

continuando con la respuesta ETS.

Como producto de la activación de la respuesta ETI se induce la resistencia sistémica

en las plantas, encontrando, dependiendo del estímulo al cual están sometidas: la

Resistencia Sistémica Inducida (ISR) y Resistencia Sistemica Adquirida (SAR). La

primera es mediada por el reconocimiento de elicitores bióticos no patógenos, por

ejemplo cuando hay colonización de las raíces por microorganismos de la rizósfera

como bacterias promotoras de crecimiento vegetal, quiénes además de facilitar el

crecimiento en la planta, también tienen la capacidad de protegerla contra patógenos;

esta resistencia es independiente de la acumulación de proteínas R y es mediada por

las vías de señalización del ácido masónico (AJ) y el etileno (ET). La resistencia SAR

responde a elicitores bióticos patógenos o abióticos (Shah et al., 2014; Díaz-Puentes,

2012; Buonaurio et al., 2002), y depende de la expresión y acumulación de proteinas

PR inducidas como resultado de la señalización principalmente de acido salicilico (SA)

(Shah et al., 2014; Díaz-Puentes, 2012; Hammerschmidt, 2004).

Recursos fitogenéticos:

Los recursos fitogeneticos para la alimentación y la agricultura estan formados por la

diversidad del material genetico que contienen las variedades tradicionales y los

cultivares modernos que cultivan los agricultores, asi como las plantas silvestres afines

de las cultivadas y otras especies de plantas silvestres que se pueden utilizar para

obtener alimentos, fibras, ropa, cobija, madera de distintos tipos, energia, etc. (Thornton

et al., 1996); estos recursos fitogenéticos tienen un gran valor en la seguridad

alimentaria de la humanidad gracias a la presencia de materiales silvestres que poseen

un patrimonio genetico invaluable. Por tal motivo, las especies cultivadas pueden

beneficiarse mediante el flujo genetico de sus parientes en busca de resistencia a

plagas y enfermedades (Morales et al., 2016). Razón por la cual es importante el uso y

mantenimiento de la diversidad genetica de las plantas silvestres, tradicionales,

regionales y cultivos mejorados (FAO, 2010; Hidalgo y Vallejo, 2014).




18

La caracterización y uso de la biodiversidad de los recursos fitogenéticos está

considerada entre las líneas de investigación estratégicas a nivel mundial debido a que

se establece como la base para la solución de los problemas actuales de los cultivos, la

adaptación a los cambios climáticos y el desarrollo de nuevas alternativas en la

producción (Virk et al., 1995). El valor de las colecciones de recursos fitogenéticos

reside en la utilización que de ellas se haga, al conocer el valor agronómico de los

materiales, para producir nuevos cultivares, domesticar nuevas especies y desarrollar

nuevos productos, para el beneficio de las actividades productivas (Abadie y Berreta,

2001). De tal forma que, se permita una producción más saludable y sostenible de

alimentos, haciendo que el desarrollo de iniciativas en torno a la producción orgánica y

al uso sostenible de los recursos fitogenéticos sea un reto para los países en desarrollo,

especialmente para los de mayor riqueza biológica que estén en miras de mejorar su

economía (Cestoni et al., 2001).

Aunque, se sabe que existe una considerable brecha entre el número de materiales

conservados en bancos de germoplasma y el de aquellos de los que se tienen datos de

caracterización y evaluación, estimándose a nivel mundial un 80% de muestras sin

datos de caracterización y un 95% sin datos de evaluación agronómica (Abadie y

Berreta, 2001); por ello, es importante considerar la búsqueda de variedades

resistentes que puedan ser empledas en programas de mejoramiento genético.

Así, el uso de cultivares resistentes y de herramientas como injertación in vivo e in vitro

pueden ser una forma útil y económica de controlar patógenos en los cultivos,

pudiéndose extrapolar a la agricultura de altos insumos como la producción de

hortalizas bajo condiciones controladas (Bridge, 1996; Rodríguez et al., 2005; Rivard y

Louws, 2006). De tal forma que el uso y conservación de los recursos fitogenéticos

puedan ser empleados para mejorar la productividad y la sostenibilidad de la

agricultura, contribuyendo así al desarrollo nacional, la seguridad alimentaria y el alivio

de la pobreza.




19

Injertación

El injerto es la operación mediante la cual se une íntimamente o se inserta una parte de

una planta en otra, de manera que queden soldadas y se desarrollen juntas formando

una única planta (Espiau et al., 2012). La injertación se ha empleado desde la

antigüedad, documentándose en China desde comienzos del primer milenio a. C., y en

Occidente ya se tenía conocimiento en la Grecia clásica. Para su época, Aristóteles

describe claramente las técnicas empleadas y otros autores del campo agrícola

romanos también las documentan. Sin embargo, el interés en la práctica fue

estimulado durante el Renaciomiento, cuando Henri Louis Duhamel en el siglo XVII

estudió la función de los tejidos en el proceso de injertación, estas investigaciones

sentaron las bases de los conocimientos actuales sobre el injerto. A partir de los años

1920 se describe desde el punto de vista científico el injerto en púa y a partir de los

años 50s fue ampliamente usado en cucurbitáceas y solanáceas (Espiau et al., 2012).

Esta técnica permite combinar las cualidades del injerto y las del patrón para producir

una planta con altos rendimientos. El principio del injerto consiste en poner en contacto

directo el cambium vascular del injerto con el cambium vascular del patrón para lograr

la unión entre ellos, deben mantenerse unas condiciones de temperatura y humedad

que estimulen el prendimiento en las células recién puestas en contacto y en las

circundantes (Hartmann y Kester, 1991). Después, las células del cambium del patrón y

del injerto producen células de parénquima que se entremezclan formando un callo.

Cuando esto se logra, en el cambium se inicia la formación de callo que permite el paso

de savia elaborada y bruta entre copa a patrón (Sequiera et al., 2014); de esta forma se

induce el desarrollo del injerto, proceso en el cual se evidencian tres procesos

fundamentales: 1. cohesión entre el patrón y la copa, 2. proliferación del callo en la

unión y 3. la diferenciación vascular con la formación del xilema y el floema (Ribeiro et

al., 2015; MINAGRICULTURA, 2014).

La producción de plantas injertadas comenzó en Japón y Corea a fines de 1920 con

sandía injertada usando calabaza como porta-injerto (Yamakawa, 1983). Después de

los primeros experimentos se incrementó el uso de plantas injertadas, especialmente de

frutales (Sequiera et al., 2014; Espiau et al., 2012). Sin embargo, en los últimos años,




20

ha despertado interés en cultivos hortícolas como pepino, melón, sandía, chile,

berenjena y tomate para la obtención de resistencia a diversas enfermedades que

atacan el sistema radical (Álvarez-Hernández, 2012; Santos et al., 2000; Lee, 2003).

Además, en cultivos como tomate, berenjena y sandía mediante el injerto se obtiene

mejor desarrollo en plantas y mayor rendimiento en la producción (Choi et al., 2002;

Cürük et al., 2005; Khah et al., 2006), también se sabe que el uso del injerto mejora la

calidad y las características físico-químicas de los frutos (Coutinho et al., 2006),

aumenta la tolerancia a la salinidad en el suelo (Fernández-García et al., 2004; Estañ et

al., 2005), y a temperaturas y altitudes elevadas (Venema et al., 2008). Adicionalmente,

incrementa el vigor de la planta y la vida de post-cosecha de la fruta (Lee y Oda, 2003),

reduce las infecciones causadas por virus, hongos y bacterias (Báez-Valdez et al.,

2010; Hibar et al., 2006; Rivard y Louws, 2008; Hain et al., 1993), disminuyendo el uso

de agroquímicos durante el ciclo de cultivo.

El éxito del proceso de injertación radica en: 1. la afinidad entre patrón y copa, 2. unión

estrecha entre cambium de patrón y copa, 3. realización en época adecuada (depende

del clima, la especie y disponibilidad de yemas), 4. protección frente a desecación y

ataque de patógenos que causen infecciones y pudriciones, y 5. sanidad tanto del

patrón como de la copa (Sequiera et al., 2014; Espiau et al., 2012). Además de lo

descrito anteriormente y de las características propias de las plantas a injertar, algunos

factores ambientales facilitan o dificultan el proceso. Entre los más importantes están:

temperatura (25-28 ºC), humedad (80-90 %), superficie de contacto, técnica de injerto

empleada, disponibilidad de oxígeno y condiciones de asepsia en el proceso (Arlette,

2010).

También es importante considerar la selección de patrón y del injerto (copa). En el

momento de seleccionar la copa, se han considerado las siguientes características:

que provenga de una planta madre que presente altos rendimientos, presencia de frutos

de excelente calidad, producción temprana, tolerancia a plagas y enfermedades y el

porte o arquitectura de la planta (Sequiera et al., 2014).




21

Por su parte, el patrón se selecciona teniendo en cuenta un buen vigor y desarrollo de

raíces, tolerancia a plagas y enfermedades y la adaptación a condiciones del suelo

como salinidad, pH, nutrición, textura y estructura (Sequiera et al., 2014). Así mismo,

Espiau et al. (2012) plantea que el patrón debe ser: fácilmente propagable, debe tener

un buen comportamiento en vivero, debe ser compatible con una gran variedad de

especies, debe ser adaptable a las condiciones del suelo, longevo, y proporcionar un

buen anclaje para el injerto.

La perpetuación de clones que no producen semilla o no se reproducen por estacas, el

establecimiento en corto tiempo de una plantación con fines comerciales, la renovación

de cultivos viejos, la propagación de plantas con alta productividad y calidad de frutos,

la propagación de variedades que no están bien adaptadas a las condiciones del suelo

o tienen sistemas radiculares débiles, la integración de diferentes variedades o

especies aportando cada una de ellas sus propias características y la reproducción de

una planta madre con las mismas características, son algunas de las ventajas descritas

por Sequiera et al. (2014), para el uso de la injertación. Sin embargo, el mismo autor

manifiesta que la incompatibiliad presente en el punto de unión del injerto-patrón, la

poca difusión de la técnica, la falta de organización y capacitación a los productores son

desventajas a considerar, además de la influencia directa de los factores ambientales.

El uso de la técnica del injerto es una importante estrategia para disminuir

considerablemente la incidencia de enfermedades (Báez-Valdez et al., 2010; Hibar et

al., 2006; Rivard y Louws, 2008; Hain et al., 1993), ya que por ejemplo, se confronta la

susceptiblilidad de los materiales comerciales a la marchitez por Fusarium oxysporum f.

sp. lycopersici mediante el injerto sobre un patrón resistente; así por ejemplo, Hibar et

al. (2006), reportan el uso de los patrones resistentes He-Man y Beaufort en las

variedades susceptibles Durintha F y Brocha F, demostrando el efecto de su resistencia

en términos de desarrollo, rendimiento y calidad del fruto en el cultivo de tomate.

La injertación es un método tradicional para la producción de plantas, pero su éxito,

como se mencionó anteriormente, es dependiente de las condiciones ambientales




22

(Arlette, 2010); adicionalmente, las bajas tasas de prendimiento en condiciones

normales se deben a procesos de deshidratación del tejido y a la introducción de

agentes contaminantes como bacterias, hongos y virus por malas prácticas durante el

proceso de injertación (Sequiera et al., 2014; Arlette, 2010). Frente a esta dificultad, se

propone la microinjertación, la cual es realizada bajo condiciones ambientales

controladas y esterilidad, generando materiales libre de patógenos.

Microinjertación:

La aplicación del cultivo in vitro para la producción de plantas vigorosas y libres de

patógeno es una alternativa para el mejoramiento de cultivos productivos (González,

2008). Esta tecnología también permite el establecimiento de sistemas de propagación

in vitro con usos potenciales en los cultivos agrícolas como la producción a escala

comercial de genotipos homo y heterocigóticos, la regeneración somática de materiales

estériles, la propagación de material fitogenético libre de enfermedades, la inducción de

procesos de microinjertación, la conservación e intercambio de germoplasma y la

introducción de estos materiales en programas de mejoramiento genético (García-

Gonzáles et al., 2010; González, 2008; Poehlman y Allen, 2003; Calva y Pérez, 2005;

Pereira et al., 2008; Levitus et al., 2004; Sahijram y Rajasekharan, 1996; Hartmann y

Kester, 1991).

La microinjertación es una técnica de injertación in vitro que involucra la ubicación de un

meristemo o un explante en un patrón al que se le han retirado sus cotiledones y que ha

crecido en condiciones asépticas a partir de semillas o plantas micropropagadas

(Rehman y Gill, 2015; Hussain et al., 2015; Báez-Valdez et al., 2010; Onay et al., 2004).

Consiste en la ubicación de una copa en una base o patrón en condiciones in vitro, este

tipo de técnica reduce el daño ocasionado por patógenos, ya que se utilizan variedades

resistentes que han sido seleccionadas como porta-injertos, por medio de especies

silvestres tolerantes o resistentes a una enfermedad, con plantas que tiene frutos de

aceptación comercial (Rehman y Gill, 2015; Hussain et al., 2014; Yıldırım et al., 2013;

Wang et al., 2010; Aazami y Bagher, 2010; Mushtaq, 2010; de Lima Coutinho et al.,

2009; Onay et al., 2004).




23

El resultado del microinjerto es una planta constituida por una copa o injerto (parte

aérea), que según Rehman y Gill (2015) y Hussain et al. (2015), es una porción de tallo

o yema que se fija al patrón para que se desarrollen ramas, hojas, flores y frutos, y un

patrón (parte radical). La copa cuenta regularmente con cualidades agronómicas

importantes como rendimiento, forma, color, sabor, pero en algunas ocasiones es

susceptible a ciertas plagas o enfermedades. El patrón generalmente no tiene valor

agronómico, pero genéticamente contiene genes de resistencia o tolerancia a estrés

biótico o abiótico (Báez-Valdez et al., 2010; Louws et al., 2010; Gonzáles et al., 2008;

King et al., 2008; Karssen y Moens, 2006).

La microinjertación es una técnica que también es empleada en el control de

enfermedades del suelo, sus primeros reportes fueron por Doorenbos en 1953 en

hiedra y en 1956 por Holmes en crisantemo; luego, la técnica fue modificada y

mejorada incrementado la tasa de éxito por Murashige et al. (1972) y por Navarro et al.

(1975); mostrando hasta la fecha un gran potencial para mejorar la producción o

multiplicación a escala de muchos cultivos (Hussain et al., 2015; Dumanoğlu et al.,

2014; Hassanen, 2013; Acosta-Rangel et al., 2011; Farahani et al., 2011; Nava et al.,

2011; de Lima Coutinho et al., 2009; Naz et al., 2007; Lane et al., 2003; Raharjo y Litz,

2003).

Tanto la injertación in vivo como in vitro (microinjerto) son alternativas para disminuir las

aplicaciones de agroquímicos, y disminuir los costos de producción del cultivo (Báez-

Valdez et al.,2010; de Lima Coutinho et al., 2009; Rivard and Louwis, 2006; Hibar et al.,

2006; Acosta, 2005). La injertación con patrones resistentes a patógenos son

comúnmente utilizados para su venta comercial en cultivos como: citrus, sandía, melón,

pepino, tomate entre otros, (Yıldırım et al., 2013; Aazami y Bagher, 2010; Mushtaq y

Banday, 2010; Onay et al., 2004; Rajarjo y Litz, 2003). Adicionalmente, la

microinjertación es considerada como una técnica efectiva para obtener plantas libres

de virus y enfermedades asociadas a patógenos como bacterias, hongos y nematodos




24

(Zamora-Rodríguez et al., 2015; Hussain et al., 2015; de Lima Coutinho et al., 2009; do

Rego et al., 2008; Rodrigo y Ascarrunz, 2006; Amiri, 2006a).

También es un método que puede ser empleado para el diagnóstico temprano de

enfermedades virales debido a su establecimiento en condiciones in vitro, además de

incompatibilidades entre patrones y copas (Tangolar et al., 2003). Adicionalmente, la

microinjertación ha sido usada para estudios histológicos, para la eliminación de virus,

producción de plantas libres de enfermedades particularmente resistentes a

enfermedades cuyos agentes causantes habitan en el suelo, intercambio de

germoplasma entre países y multiplicaciones de plantas con dificultades en

enraizamiento (Zamora-Rodríguez et al., 2015; Hussain et al., 2015; Yildirim et al.,

2010; Hsina y El Mtili, 2009; Mathius et al., 2008; Materan et al., 2008; Estrada-Luna,

2002).

La microinjertación es particularmente empleada en la producción de frutales, para los

cuales se han desarrollado varios protocolos, entre ellos: almendra (Yıldırım et al.,

2013; Isıkalan et al., 2011), manzano (Huang y Millikan, 1980), albaricoque (Piagnani et

al., 2006), aguacate (Raharjo y Litz, 2003), marañón (Mneney y Mantell, 2001), cereza

(Amiri, 2006a), ciruela (Amiri, 2006b) uva (Tangolar et al., 2003; Aazami y Bagher,

2010), pera (Faggioli et al., 1997), pistacho (Abousalim y Mantell, 1992), nuez (Wang et

al., 2010), maracuyá (Ribeiro et al., 2015), papaya (Nava et al., 2011), entre otras. Otras

especies como tomate (do Rego et al., 2008), chachafruto (Bonilla, 2014), pino

(Materan et al., 2008; Cortizo et al., 2004), tabaco (Fragoso et al., 2011), arabidopsis

(Turnbull et al., 2002), entre otras, usan la microinjertación como una herramienta para

el control de patógenos, eliminación de virus, reactivación de clones élite y estudios de

señalización celular. Adicionalmente, para la comercialización de plantas

microinjertadas, se han generado protocolos exitosos que han proporcionado un alto

porcentaje de plantas microinjertadas con altos rendimientos (Tabla 1).




25

Tabla 1. Especies microinjertadas a gran escala (Tomado y modificado de Hussain et al., 2014).

Nº Cultivo Porcentaje de éxito en microinjertación (%) Fuente

1 Pistacho 79,2 Onay et al. (2004)

2 Pistacho 94-100 Abousalim y Mantell (1992)

3 Mora >90 Ma et al. (1996)

4 Olivo 45-83 Farahani et al. (2011)

5 Vid 50,1-60,6 Aazami y Bagher (2010)

6 Vid 71,4 – 80,0 Tangolar et al. (2003)

7 Manzano 42,25 Mushtaq (2009)

8 Avellana 72 Nas y Read (2003)

9 Castaña 80 Nas y Read (2003)

10 Nuez 56,7-73,3 Wang et al. (2010)

11 Almendras 90-100 Yildirim et al. (2010)

12 Almendras 90 Isıkalan et al. (2011)

13 Cítricos 36-33,3 Naz et al. (2007)

14 Pera 83 Hassanen (2013)

De acuerdo con lo descrito por Hussain et al. (2015), el éxito en la microinjertación

puede ser afectado por factores como la edad de los materiales, la técnica de

injertación, las condiciones de esterilidad, la concentración y la aplicación de hormonas

o las condiciones del medio. En este mismo sentido, Rehman y Gill (2015) y Rodrigo y

Ascarrunz (2006), plantean que factores como: la compatibilidad o afinidad entre patrón

y copa; condiciones favorables de humedad, temperatura y aireación; contacto o

estrecha proximidad de las capas del cambium entre patrón y copa; la rigidez mecánica




26

para mantener la posición de ambos hasta que se forme la unión; la edad del injerto y

del patrón, deben ser considerados. También, el origen y la longitud de la copa, la edad

del patrón, el medio empleado, el método de injertación, la vitrificación y pre-

tratamientos con reguladores de crecimiento se consideran importantes, ya que regulan

y determinan el éxito del microinjerto.

Para el establecimiento de un microinjerto, Hussain et al. (2015) y Rodrigo y Ascarrunz

(2006), reportan tres fases: 1. el establecimiento y multiplicación de la copa, 2. el

establecimiento y multiplicación del patrón y 3. preparación de patrones y copas para la

microinjertación. Como resultado del proceso de injertación in vitro, se espera

encontrar: la adhesión patrón-copa, formación de callo, diferenciación de las células del

callo hacia nuevo cambium y la formación de nuevos tejidos vasculares (xilema y

floema) por el nuevo cambium (Ribeiro et al., 2015; Hussain et al., 2015; Rodrigo y

Ascarrunz, 2006).

1. Establecimiento y multiplicación de la copa

Como copas pueden ser empleadas brotes o meristemos que pueden ser tomados de

plantas creciendo en invernaderos, cámaras de crecimiento, campo o in vitro.

Generalmente los brotes apicales o los cortes nodales son los más usados como

explantes para el establecimiento in vitro. Posterior al establecimiento, los microbrotes

se transfieren a medio de proliferación para incrementar el desarrollo de nuevos brotes

axilares; estos nuevos microbrotes son usados como copas para los microinjertos.

2. Establicimiento y multiplicación de patrones

Los patrones usados para microinjertación pueden ser in vivo o in vitro a partir de

semillas, brotes germinados o brotes micropropagados enraizados o no enraizados.

Cuando son usados brotes como patrones, todas las fases de la injertación se realizan

in vitro.

3. Preparación de los patrones y las copas para la microinjertación

La microinjertación es afectada por el corte del ápice de los brotes y de los patrones.




27

Usualmente el corte se hace en la base de los cotiledones y un pequeño brote es

ubicado como copa en el sitio de corte; en este punto, es importante que las capas del

cambium o los anillos del tejido vascular coincidan en las dos porciones. Esto se

conoce como método de reemplazo de superficie. El contacto firme entre el patrón y la

copa es extremadamente importante para garantizar la unión perfecta del injerto y la

formación de callo. Para mantener la unión del injerto, han sido desarrolladas varias

técnicas como tubo de silicona, tira elástica, puente de papel filtro, tubo de vidrio,

bandas de nilon, tubo de papel aluminio, doble capa de papel aluminio, y papel

absorbente (Hussain et al., 2015). Cuando los injertos son exitosos, los patrones y las

copas crecen juntos y tienen la capacidad de generar una planta.

El presente proyecto plantea el uso de la microinjertación como una herramienta para el

control de la Marchitez vascular en el cultivo de tomate. La siguiente Tabla (Tabla 2)

compara las características más importantes de la injertación y la microinjertación con el

objeto de evidenciar la participación de la microinjertación como una herramienta que

puede favorecer la producción de tomate en nuestra región y el país.

Tabla 2. Comparación entre injertación y microinjertación.

Característica del método Injertación

in vivo

Injertación in vitro

(Microinjertación)

Usos y aplicaciones:

Perpetúa clones que no producen semilla o no se reproducen por estacas. Si Si

Permite establecer en corto tiempo una plantación con fines comerciales.

Si No*

Permite renovar árboles viejos. Si Si

Permite reproducir plantas con alta productividad y calidad de frutos. Si Si

Permite controlar enfermedades. Si Si

Empleado para rescate de embriones. No Si

Permite realizar estudios tempranos de compatibilidad. No Si

Empleado para el intercambio y conservación de germoplasmas. No Si

Empleado para la propagación de plantas con problemas de enraizamiento. Si Si

Dependiente de:

La afinidad entre patrón y copa. Si Si

El método para evitar desecación y contaminación. Si No

(Condiciones controladas in vitro)

El método de injertación empleado. Si Si

Del tipo, edad, origen y características propias del patrón y la copa. Si Si

Personal entrenado. Si Si




28

Otros

Requiere espacios y equipos especializados No Si

Incremento de costos en la producción Si

($ 800/planta)

Si (Valor no conocido

aún)**

Sanidad totalmente controlada No (Dependiente del

personal y uso de herramientas) ***

Si (in vitro)

Tasa de éxito en la injertación 90-99% 80%-90%

Costos elevados para la producción de las copas y patrones Compra de semilla

Producción por micropropagación

Mantenimiento de la identidad genética No (Producción de copas y patrones por semilla)

Si (Producción de copas y patrones vía micropropagación)

* Se reporta el establecimiento comercial para frutales especialmente, los descritos en la Talab 1, sin embargo no se tiene reporte de área cultivada bajo este método. ** Se estima que los costos de la producción puedan ser altos, pero aún no se tiene reporte del valor exacto. Se espera lograrlo al final de este proyecto para poder analizar el costo/beneficio de la técnica propuesta. *** Es importante mencionar que la no dependencia de factores ambientales y la esterilidad del material vegetal durante el proceso, puede facilitar la producción de microinjertos. 4.3 Objetivos

Objetivo general

Evaluar bajo condiciones semicontroladas tomate microinjertado contra Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici causante de la Marchitez vascular.

Objetivos específicos

1. Establecer la metodología para la microinjertación de introducciones de tomate tipo

cereza promisorios contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici con copas de tomate

comercial.

2. Realizar un estudio morfo-histológico tanto del patrón como de la copa y del

microinjerto para conocer sus estructuras vasculares, previo y posterior al proceso de

microinjertación.

3. Determinar las condiciones óptimas de crecimiento y esporulación de Fusarium




29

oxysporum f. sp. lycopersici y su caracterización morfológica.

4. Evaluar bajo condiciones semicontroladas tomate microinjertado contra Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici.

4.4 Metodología propuesta

Fuente de material vegetal:

Los patrones son provenientes del banco de germoplasma de la Universidad Nacional

de Colombia, sede Palmira identificados como las accesiones *IAC426, *IAC391 y

*IAC412 y las copas serán dos, las variedades comerciales Calima y Carguero. Como

controles se tendrán un control susceptible, la introducción *IAC1624 y un control

resistente, Multifort (DeRuiter) (Tabla 3).

Tabla 3. Material vegetal.

* IAC: Introducciones procedentes del Instituto Agronómico de Campinas, Campinas, Brasil.

Introducciones Uso Origen

*IAC 426

Patrones Banco de germoplasma de la

Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira

*IAC412

*IAC 391

Calima Copas

Uso comercial Carguero

Multifort (DeRuiter) Control resistente

*IAC1624 Control susceptible Banco de germoplasma de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira




30

Localización

El establecimiento metodológico in vitro y la microinjertación se llevará a cabo en el

laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales. El crecimiento de Fusarium oxysporum f.

sp. lycopersici, su esporulación y caracterización morfológica será realizado en el

laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad

de Caldas. La evaluación de tomate microinjertado contra Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici bajo condiciones semicontroladas se realizará en la granja Montelindo de la

Universidad de Caldas, situada en la vereda Santágueda, municipio de Palestina

(Caldas), con una temperatura media de 22.8 °C, una altura de 1.010 msnm,

precipitación promedio anual de 2.200 mm y una humedad relativa de 76 %.

1. Metodología para la microinjertación in vitro de introducciones de tomate tipo

cereza promisorias contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici con copas de

tomates comerciales.

a. Establecimiento in vitro de las introducciones de tomate seleccionadas.

Desinfección, germinación y micropropagación de las semillas de tomate

seleccionadas:

Para la desinfección y germinación, semillas de tres introducciones de tomate tipo

cereza (IAC426, IAC391 y IAC412), dos materiales de tomate comercial (Calima y

Carguero) y los controles (IAC1624 y Multifort (DeRuiter), serán sometidas al protocolo

propuesto por Chetty et al. (2013), con algunas modificaciones así:

1. Las semillas de tomate serán ubicadas en un tubo Falcon de 50 mL de capacidad.

2. Se adicionará a las semillas una solución de hipoclorito de sodio al 10% (preparado a

partir de Clorox comercial al 5%) con dos gotas de Tween-20.

3. Se agitará el tubo que contiene las semillas en un agitador magnético a 100 rpm

durante 20 min.

4. La solución de hipoclorito de sodio será removida de la semilla con abundante agua

destilada estéril.

5. Las semillas serán almacenadas en agua destilada estéril durante 24 h a 4 ºC.




31

6. Posteriormente, se sembrarán las semillas en frascos de vidrio que contendrán 25

mL del medio de germinación sólido (MGT) compuesto por un medio basal Murashige &

Skoog (MS) (Murashige & Skoog, 1962) con sales a la mitad de la concentración

suplementado con sacarosa al 1% y Vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968).

7. Posterior a la siembra, las semillas serán llevadas a un cuarto de crecimiento entre

23 y 25 °C durante 7 días, bajo una intensidad de luz de 70 microeinsteins m-2s-2 con un

fotoperiodo luz/oscuridad de 16/8h.

Después de la germinación de las semillas in vitro, segmentos internodales de plántulas

de tomate de un mes de edad serán extraídos y cultivados en el medio de

micropropagación (MMT), modificado de Chetty et al. (2013), el cual consiste en un

medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con sacarosa 3%, vitaminas

MS, mioinositol, 2 mg/L de bencil amino purina (BAP) y 0,05 mg/L de ácido indol acético

(AIA). Posteriormente, serán incubadas en un cuarto de crecimiento entre 23 y 25 °C,

bajo una intensidad de luz de 70 microeinsteins m-2s-2 con un fotoperiodo luz/oscuridad

de 16/8h. Las plantas serán subcultivadas cada cuatro semanas. Para el

enraizamiento, las plantas serán transferidas a medio basal MS con sales a la mitad de

la concentración, suplementado con sacarosa 3%, vitaminas MS, mioinositol y 0,05

mg/L de ácido indol butírico (AIB) y serán incubados en cuarto de crecimiento en las

condiciones descritas previamente.

Los siete materiales de tomate (tres silvestres, dos comerciales y dos controles) serán

dispuestos en un diseño experimental completamente al azar (CAA) con 10

repeticiones. Cada semilla será incubada en un frasco de cultivo con 25 mL de medio,

siendo cada frasco la unidad experimental. Como variables de respuesta se

determinará el porcentaje de contaminación (PC), porcentaje de germinación (PG),

número de brotes por explante (NBE), día a inducción de brote/explante (DBE)

porcentaje de plantas enraizadas (PPE), días a germinación (DG), días a cotiledón (DC)

y días a morfogénesis completa (DMC). Los datos de cada variable en cada fase

experimental serán analizados a través de análisis de varianza y pruebas de promedio




32

tipo Duncan por medio del programa PROC GLM de SAS (SAS Inst, Cary N.C). Versión

9.0. (2010).

b. Microinjertación:

Los materiales de tomate seleccionados y previamente germinados y micropropagados,

serán sometidos a microinjertación empleando dos métodos; púa terminal y corte en

bisel. Los explantes empleados para la microinjertación serán extraídos de plantas de

30 días de germinadas, y serán sembrados en el medio propuesto por do Rego et al.

(2008) y de Lima Coutinho et al. (2009), el cual se caracteriza por ser un medio MS

basal con sales a 1/8 de la concentración. Adicionalmente, para evitar procesos de

oxidación y favorecer la promoción y formación de callo en el sitio de unión, después

del corte, cada explante (copa y patrón) será sumergido por 10 segundos en una

solución antioxidante constituida por 100 mg/L de ácido ascórbico + 100 mg/L de ácido

cítrico (Ribeiro et al., 2015; Hsina y El Mtili, 2009). Posteriormente, los microinjertos

serán transferidos al cuarto de crecimiento bajo una temperatura de 23 - 25 °C donde

serán sometidos a oscuridad durante dos semanas con el fin de disminuir el posible

efecto de oxidación y favorecer la formación de callo en el sitio de unión.

Posteriormente serán expuestos a una intensidad de luz de 70 microeinsteins m-2s-2 con

un fotoperiodo luz/oscuridad de 16/8h por un tiempo de ocho semanas. Finalmente,

las plantas microinjertadas serán transferidas al cuarto de aclimatación de la

Universidad de Caldas para su posterior aclimatación.

Los microinjertos serán distribuidos en un diseño experimental completamente al azar

(CAA) con cinco repeticiones. Cada microinjerto será incubado en un frasco de cultivo

con 25 ml de medio, siendo cada frasco la unidad experimental. Como variables de

respuesta se determinará el porcentaje de prendimiento del brote microinjertado (PPB),

crecimiento de la yema (CY), día a morfogénesis completa (DMC), número de

internodos por explante (NIE), altura de la plántula microinjertada (copa y patrón)

(APM). Los datos de cada variable en esta fase experimental serán analizados a través

de análisis de varianza y pruebas de promedio tipo Duncan por medio del programa

PROC GLM de SAS (SAS Inst, Cary N.C). Versión 9.0 (2010).




33

c. Aclimatación:

Los microinjertos serán transferidos a bandejas previamente esterilizadas que

contendrán turba Sphagnum grado 3 estéril, las bandejas serán cubiertas con domos

transparentes (cámaras para aclimatación) para el mantenimiento de la humedad.

Gradualmente, se les incrementará el intercambio gaseoso mediante el retiro del domo.

Las plántulas serán transferidas al cuarto de aclimatación a una temperatura constante

de 25-27 oC, con un fotoperiodo luz/oscuridad de 16/8h durante cinco semanas.

Durante esta fase, los microinjertos serán distribuidos en un diseño experimental

completamente al azar (CAA) con cinco repeticiones. Las variables a evaluar serán: el

porcentaje de plantas aclimatadas (PPA), porcentaje de supervivencia (PS), la

inducción de nuevos brotes (INB) y el tiempo a trasplante (TT). Estos resultados serán

analizados a través de análisis de varianza y pruebas de promedio tipo Duncan por

medio del programa PROC GLM de SAS (SAS Inst, Cary N.C). Versión 9.0 (2010).

Con el fin de evidenciar a nivel celular los cambios morfológicos y anatómicos en el

proceso de aclimatación, se hará un análisis histológico, en el cual se evaluará la

estructura estomatal, el engrosamiento de la cutícula y de los haces vasculares y el

incremento en las células de empalizada, de acuerdo a la metodología propuesta por

Ribeiro et al. (2015), Hurtado (2013) y Mathius (2008).

2. Estudio morfo-histológico tanto del patrón como de la copa y el microinjerto

para conocer sus estructuras vasculares, previo y posterior al proceso de

microinjertación.

Se empleará la metodología descrita por Ribeiro et al. (2015), Hurtado (2013) y Mathius

(2008), para lo cual, se tomarán muestras aleatorias que serán fijadas en formaldehido

(FAA) al 50% durante 48h al vacío. Las muestras serán porciones de la copa, del patrón

y del microinjerto después de 10, 15, 20 y 30 días de microinjertar.




34

A continuación, estas muestras serán transferidas a etanol al 70% V/V , donde

permanecerán almacenados y serán sometidas al vacío nuevamente durante 24 horas.

Las muestras serán deshidratadas en una serie de etanoles al 50%, 70%, 80%, 90%,

95% y 100% y posteriormente embebidas en metacrilato (Historesin®, Leica).

Se harán cortes longitudinales de 8-10 mm de espesor por medio de micrótomo; los

cortes serán teñidos con azul de toluidina pH 4.0 y montados en resina sintética

(Permount Fisher®). La documentación fotográfica se realizará utilizando el

microscopio Olympus AX70 conectado a un sistema de fotomicrografía Olympus del

Laboratorio de Biología, de la Universidad de Caldas.

Se observarán las estructuras vasculares tanto en el parón como en la copa. En los

microinjertos se evaluará la formación de callo en tejido parenquimatoso e inducción,

conexión y engrosamiento de los haces vasculares en el sitio de corte como prueba de

la unión de los explantes (copa-patrón) y prendimiento del microinjerto (Ribeiro et al.

2015; Mathius, 2008).

3. Crecimiento, esporulación, caracterización morfológica y patogenicidad de

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.

a. Aislamiento y purificación (primero y segundo postulado de Koch):

Se empleará el aislamiento de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici denominado en el

Grupo de Investigación GIPPA como COMBIA, el cuál fue aislado y purificado por

Gonzáles y Marín (2015) y Cardona (2015), de una finca ubicada en la vereda Alto

Bonito del municipio de Neira (Caldas) a partir de plantas de tomate con sintomatología

típica del Marchitamiento vascular.

Es importante mencionar que la selección de este aislamiento se ha realizado con base

en los resultados obtenidos por los anteriores autores, los cuales muestran el alto grado

de virulencia y actividad del patógeno en condiciones in vitro e in vivo. También es

importante resaltar que la caracterización molecular para confirmar y determinar la

especie y raza de este aislamiento (COMBIA) actualmente se lleva a cabo por otro

investigador del grupo.




35

b. Crecimiento, esporulación y reactivación:

El aislamiento será sembrado y reactivado bajo tres tratamientos: el primero, será

medio PDA (Papa Dextrosa Agar), el segundo, será agar nutritivo suplementado con

macerado vegetal (3 g/L), y el tercer tratamiento, será el medio PDA suplementado con

macerado vegetal (3 g/L). Serán incubados durante 7 días bajo dos temperaturas

diferentes, 26 1 y 28 1, hasta observar esporulación.

Durante esta fase, los tratamientos serán dispuestos en un diseño experimental

completamente al azar (CAA) con tres repeticiones. Como variables respuesta se

medirá la presencia de estructuras reproductivas (ER), el tiempo de esporulación (TE) y

patogenicidad in vitro (PT). Estos resultados serán analizados a través de análisis de

varianza y pruebas de promedio tipo Duncan por medio del programa PROC GLM de

SAS (SAS Inst, Cary N.C). Versión 9.1 (2010).

Siguiendo la metodología propuesta por Castaño-Zapata y Salazar (1998), se extraerá

micelio del hongo con una aguja de disección y será ubicado en una lámina

portaobjetos con dos gotas de lactofenol al 0,05%. La muestra será observada al

microscopio de luz y microscopio electrónico (MET) para observar las estructuras

propias de Fusarium oxysporum (macroconidios septados, microconidios, en su

mayoría unicelulares y clamidosporas), posteriormente se procederá a hacer la

identificación del microorganismo, mediante las claves taxonómicas y especializadas de

Booth (1970), para Fusarium oxysporum.

c. Prueba de patogenicidad (tercer postulado):

Después de la identificación morfológica se realizarán las pruebas de patogenicidad in

vitro de acuerdo a la metodología planteada por Cardona-Piedraita (2015) y Gonzáles y

Marín (2015), para lo cual plántulas de tomate susceptibles (IAC426, *IAC391 y

*IAC412) al patógeno con una edad de 30 días, obtenidas a partir de semilla germinada

in vitro, se inocularán con 1 mL de suspensión conidial a una concentración de 1 x 106

conidios mL-1

en agua destilada estéril mediante cámara de Neubauer, la cual se

depositará en la base del tallo. Las plántulas serán incubadas en el cuarto de




36

termoterapia a 26 - 28 ºC con fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad durante

dos semanas. Para determinar la patogenicidad de Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici, se evaluará la incidencia de la marchitez vascular (IMV) en las plántulas

mediante la aparición paulatina de los síntomas de la enfermedad: necrosamiento y

estrangulamiento del tallo (NET), amarillamiento (AM), marchitez (MT) y muerte (M). La

Incidencia será definida mediante la siguiente fórmula:

IMV = Número de individuos afectados/ total de individuos * 100

d. Re-aislamiento (cuarto postulado):

Siguiendo los postulados de Koch, a continuación se debe re-aislar el patógeno de

plantas enfermas. Para ello, a partir de las plántulas in vitro inoculadas y que

manifiesten la enfermedad con los síntomas descritos previamente se les realizará

cortes longitudinales a los tallos, tomando porciones de tejido de aproximadamente 3

mm de diámetro y serán sembrados en medio PDA, metodología descrita

anteriormente.

Con la comprobación de estos postulados, se tendrá el aislamiento virulento para las

pruebas de campo, objetivo 4.

4. Evaluación de tomate microinjertado contra Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici bajo condiciones semicontroladas.

Esta evaluación se llevará a cabo en la granja Montelindo de la Universidad de Caldas,

situada en la vereda Santágueda, municipio de Palestina (Caldas), con una temperatura

media de 25,8 °C, una altura de 1.010 msnm, precipitación promedio anual de 2.200

mm y una humedad relativa de 76 %.

Se evaluarán seis combinaciones de microinjertos (tres patrones x dos copas). Se

tendrán como controles una variedad resistente a Fusarium oxysporum f. sp.




37

lycopersici (Multifort, DeRuiter), como control negativo se tendrá una variedad

susceptible (introducción IAC1624). Adicionalmente se tendrá un control de método de

injertación para descartar la influencia del método (microinjertación) sobre la producción

en el cultivo de tomate y los controles absolutos serán los siete materiales vegetales sin

inocular.

Sistema de producción

Por ser el principal y mejor sistema de producción empleado en el departamento de

Caldas para la producción de tomate, en este proyecto se empleará el sistema de

semitecho + cobertura del suelo con plástico. Este sistema consta básicamente de una

estructura en guadua con una cubierta en plástico transparente tipo Agroclear calibre 6,

a una distancia entre surcos de 1,5 m y entre guaduas para tutorado de 3 m. La

cobertura de plástico será negro-negro calibre 1,2 (Gómez, 2014).

1. Establecimiento del cultivo

a. Preparación del suelo

Una semana antes del trasplante de los microinjertos se realizará la aplicación de un

cebo toxico (1kg de clorpirifos (Lorsban®) en polvo + 50 kg de aserrín + 12 kg de

melaza + 10 L de agua), para el control de trozadores como Spodoptera spp., Agrotis

ipsilon y Gryllus assimilis. Posteriormente, se hará el arado del suelo con azadón a una

profundidad de 30 cm, ya que esta es la profundidad efectiva que necesitan las raíces

de plantas de tomate para su buen desarrollo. Adicionalmente, se hará la incorporación

al suelo de gallinaza y Cal dolomita en las cantidades de 100 g de Cal y 200 g de

gallinaza por metro lineal.

b. Instalación de bolsas y trasplante de los microinjertos

Después de la incorporación de cal y la materia orgánica se realizará la instalación de

las bolsas para cada microinjerto. El mismo suelo preparado anteriormente será

incorporado en bolsas plásticas de 25 cm de alto x 10 cm de diámetro. Esta instalación

de las bolsas se hará con el fin de hacer la inoculación de Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici sin exponer el suelo restante al patógeno.




38

Los microinjertos aclimatados serán transferidos a la granja Montelindo, en donde se

ubicarán en un vivero cinco días antes de realizar el trasplante con el objetivo de

fortalecer su aclimatación, teniendo en cuenta que las condiciones climáticas del cuarto

de aclimatación donde se realizó la aclimatación in vitro a ex vitro y la granja son

diferentes. Posterior a esto, se realizará el trasplante de los microinjertos; la distancia

de siembra será de 1,50 m entre surcos y 0,50 m entre plantas para una densidad de

población de 13.333 plantas/ha. La siembra se hará bajo un diseño de bloques

completos al azar con cuatro repeticiones cada uno con tres plantas como unidad

experimental.

Durante el ciclo del cultivo se realizarán labores culturales como podas, desyerbe,

tutorado y fertilización para proporcionarle un buen manejo técnico al cultivo (Gómez,

2014 y Jaramillo et al., 2013).

2. Inoculación de los microinjertos con Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

Los microinjertos de 14 días después del trasplante, plenamente adaptados a las

condiciones del suelo descritas anteriormente, serán inoculados con una suspensión de

1 x 106 conidios del aislamiento COMBIA de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici /mL

de agua, de acuerdo con la metodología propuesta por integrantes del grupo de

investigación, la cual se encuentra actualmente en desarrollo.

3. Evaluación de los microinjertos contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

Para determinar la respuesta de los microinjertos contra Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici (Fol), durante el ciclo de producción (8 meses) se evaluará la incidencia y

daño de la marchitez vascular y su relación con la producción de tomate de la siguiente

forma:

3.1 Incidencia de la Marchitez Vascular (IMV): se determinará a través de la fórmula:

IMV = Número de individuos afectados/ total de individuos * 100

Para ello se evaluará la presencia de los siguientes síntomas característicos de la




39

enfermedad como son el estrangulamiento y necrosamiento del tallo, marchitéz de las

plantas, amarillamiento y muerte.

3.2 Escala de daño de la enfermedad: se determinará de acuerdo a la escala

propuesta por da Silva y Bettiol (2005).

1 = Planta sana.

2 = Planta con vesículas marrón antes de la primera hoja, sin hojas amarillas.

3 = Planta con vesículas marrón hasta la primera hoja, primeras hojas amarillas.

4 = Plantas con coloración marrón hasta la mitad del tallo con coloración amarilla en

más de dos hojas.

5 = Plantas que muestran coloración oscura en el tallo hasta antes de las hojas jóvenes,

con todas las hojas amarillas excepto el último par.

6 = Plantas con todas las hojas amarillas o muertas.

3.3 Evaluación de rendimiento y calidad:

La medición de los caracteres se realizará usando la metodología sugerida por el

International Plant Genetic Resources Institute –IPGRI-, (1996). Todas las

observaciones del fruto se harán en el segundo racimo por planta, en la etapa de plena

madurez. Los caracteres a evaluar serán los siguientes: número de flores/racimo

(NFLR), número de frutos/racimo (NFR), número de racimos/planta (NRP), número de

frutos totales (NFT), peso promedio del fruto (PPF), producción/planta (g/planta) (PDN),

rendimiento (t/ha) y contenido de sólidos solubles (°Brix) (CSS).

Los datos obtenidos de cada variable en esta fase experimental seran analizados bajo

diseños completamente al azar. El análisis univariado de la información de la

evaluación agronómica, se hará mediante análisis de varianza por medio del

procedimiento GLM de SAS (SAS Institute Cary N.C. Versión 9.0. (2010)), para

determinar la ocurrencia de diferencias significativas entre introducciones para el

conjunto de variables cuantitativas evaluadas. Se hará comparación de medias a través

de prueba de partición de promedios ó prueba de Duncan (P < 0,05). Finalmente, se

realizará un análisis de componentes principales y de clasificación conjunta de




40

descriptores, a partir de la matriz de combinación de tratamientos (microinjerto x Fol)

con los promedios de las variables previamente obtenidas. Se utilizará el procedimiento

Comprin de SAS (SAS Institute Cary N.C versión 9.0. (2010)).

4.5 Cronograma de actividades:

Actividad 2015-2 2016-1 2016-2 2017-1 2017-2 2018-1 2018-2 2019-1

Preparación del proyecto.

Examen de candidatura.

Establecimiento de la

metodología para la

microinjertación de líneas de

tomate tipo cereza y de

tomates comerciales.

Crecimiento, re-activación,

esporulación y caracterización

morfológica de Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici,

aislamiento COMBIA.

Evaluación de los microinjertos

de tomate contra Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici,

bajo semitecho.

Pasantía internacional.

Preparación del documento final

y publicaciones.




41

4.6 Resultados esperados6

- Producción de plantas de tomate tolerantes al Marchitamiento vascular causado por

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, para los productores de tomate del

departamento y otras regiones del país y su introducción en futuros programas de

mejoramiento.

- Protocolos para la desinfección, germinación, micropropagación y microinjertación y

aclimatación de introducciones de tomate tipo cereza.

- Métodos estandarizados para la micropropagación y el mantenimiento in vitro de

genotipos de tomate seleccionados por su tolerancia a Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici para futuros procesos de microinjertación.

- Establecimiento de un método in vitro eficiente para estudios de incidencia de la

Marchitez vascular en diferentes genotipos de tomate.

4.7 Impactos esperados a partir del uso de los resultados

- A futuro, se espera generar un sistema de producción sostenible para los agricultores

y de bajo impacto ambiental mediante el incremento en producción, reducción en el

uso de agroquímicos y de los costos de producción.

- Generación de nuevo conocimiento y su aplicación para el desarrollo de nuevas

variedades de tomate mejoradas para Colombia y el Mundo.

- Fortalecimiento de recurso humano mediante el desarrollo de nuevas destrezas y

habilidades en la tecnología implementada para los involucrados en el proyecto de la

Universidad de Caldas.

- Consolidación del Grupo de investigación GIPPA en el uso de tecnologías de cultivo

de tejidos vegetales con miras al fortalecimiento de los procesos de mejoramiento

genético.

- Formación de un estudiante de Pregrado, uno de Maestría y uno de Doctorado.

- Establecimiento de métodos in vitro para la conservación del germoplasma, y

multiplicación masiva de plantas de tomate.

6 Serán reportados en el informe técnico final (o de avance cuando se requiere prórroga), de acuerdo al formato para

tal fin, disponible en la página web de la Universidad en el link de investigaciones




42

- Contribución significativa a la preservación de los recursos genéticos del género

Solanum.

Guía para la presentación de proyectos en el marco de la “Convocatoria general para la financiación de proyectos de Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2015”


43

Anexo 1: Presupuesto

Descripción de los gastos de personal

*Valor correspondiente a pago de matrícula y sostenimiento financiado por Colciencias mediante beca Doctorado Nacional.

Nombre del

Investigador /

Experto/

Auxiliar/estudiante

Formación

Académica

Función

dentro en del

proyecto

Institución o

Empresa

Tipo de

vinculación

DEDICACIÓN

Horas/semana

Fuentes

Total Recursos de

esta

convocatoria

Especie

Nelson Ceballos

Aguirre

PhD. Ciencias

Agrarias

Dirección en pruebas

de campo y análisis

estadístico

Universidad de

Caldas

Docente de

planta 4 horas/semana 4.680.000 37.440.000

Jairo Castaño

Zapata

Ph.D.

Fitopatología

Dirección análisis

fitopatológicos

Universidad de

Caldas

Docente de

planta 4 horas/semana 4.680.000 37.440.000

Dora Janeth

García*

M.Sc.Biología

Molecular y

Biotecnología

Estudiante Doctorado Universidad de

Caldas Estudiante 40 horas/semana 28.002.000 224.016.000

Asistente de

Laboratorio Pregrado

Mantenimiento de

material de

laboratorio,

preparación de

medios

Universidad de

Caldas Asistente 40 horas/semana 7.200.000 28.800.000

Totales

327.696.000



44

Descripción de equipos a adquirir

Equipos Justificación

Fuentes Otras fuentes

Total ($) Recursos de esta

convocatoria ($)

Destilador de agua

Requerida para la preparación de

los medios de cultivo necesarios

para el establecimiento de las

plántulas in vitro.

6.380.000 $ 6.380.000

Juego de Micropipetas

Medición de volúmenes con alta

precisión en la preparación de

medios de cultivo y reacciones

químicas.

1.653.000 $1.653.000

Totales $ 8.033.000



45

Totales de materiales e insumos

Insumo/Tópico Valor total ($)

Insumos cultivo in vitro e histología 14.400.000

Insumos de campo 16.000.000

TOTAL 30.400.00

Descripción y justificación de viajes

Lugar /No. de viajes Justificación Pasajes

($) Estadía ($) Total días Total ($)

1 Pasantía internacional 7.000.000 27.000.000 6 meses 34.000.000

2 Ponencia Nacional 1.000.000 800.000 8 1.800.000

1 Ponencia Internacional 5.000.000 3.000.000 5 8.000.000

Totales 43.800.000



46

Valoración de salidas de campo

Lugar de la Salida : Palestina - Granja Montelindo-

Justificación:

Concepto $ / día No. de salidas No. de personas Total salidas TOTAL ($)

Alimentación 7000 40 3 120 840.000

Alojamiento

Transporte 17.000 40 3 120 2.040.000

TOTAL 2.880.000



47

Presupuesto global

Rubros A financiar*

Contrapartida Universidad de Caldas Total

Ejecutora(s)

Equipos 8.033.000 218.961.017 226.994.017

Bibliografía 1.000.000 1.000.000

Personal científico 327.696.000 327.696.000

Materiales e insumos 30.400.000 30.400.000

Servicios técnicos 2.400.000 2.400.000

Salidas de campo 2.880.000 2.880.000

Eventos académicos y pasantía internacional

43.800.000 43.800.000

Publicaciones y patentes 10.000.000 10.000.000

Valor total del proyecto 98.513.000 546.657.017 645.170.017

EL 30% del proyecto se encuentra financiado por Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de Caldas, a través de

convocatorias internas.

Guía para la presentación de proyectos en el marco de la “Convocatoria general para la financiación de proyectos de

Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2014”


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1. información general - universidad de caldas · guía para la presentación de proyectos en el...

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