Introducción

La transferencia de proteínas o 'blotting' supone la inmovilización de las

proteínas sobre membranas sintéticas, seguido de la detección empleando

sistemas especialmente diseñados para la tinción de 'blots'. El método más

potente es el denominado 'Western blot' en el que las proteínas son

separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y

posteriormente se transfieren mediante la aplicación de un campo eléctrico

perpendicular al gel a una membrana.

El procedimiento es análogo al desarrollado por el Prof. E. Southern

('Southern blotting') y por ello se le denominó 'Western'. Hay sin embargo otros

métodos de transferir o aplicar proteínas sobre una membrana. El más sencillo

es aplicarlas directamente en forma de una pequeña gota de una solución

concentrada sobre la membrana.

La absorción de la gota provoca la adhesión de la proteína a la

membrana, quedando en forma de una mancha o 'dot' (es el caso del 'dot blot'.

Existen dispositivos que facilitan la aplicación de las proteínas directamente a

la membrana, aplicando una succión que facilita la penetración de la solución, y

reciben los nombres de 'dot blot' o 'slot blot' en función de que la proteína

quede aplicada en forma de una gota circular o de una línea. En la imagen

puedes ver dos de estos dispositivos.

Western BlotEl western blot es un método en biología molecular/bioquímica/inmunogenética

para la detección de proteínas en una muestra de un tejido homogeneizado o

extracto. Implementa gel electroforesis para separar proteínas desnaturalizadas

de la masa. Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la membrana

(originalmente de nitrocelulosa), donde son examinadas utilizando anticuerpos

específicos para la proteína. Como resultado, los investigadores pueden

examinar la cantidad de proteínas en una muestra y comparar los niveles de

presencia entre varios grupos. Otras técnicas, también usando anticuerpos,

permiten la detección de proteínas en tejidos (inmunohistoquímica) y células

(inmunocitoquímica).

Método originado en los laboratorios de George Stark en Stanford. El nombre

de "western blot" fue dado a la técnica por W. Neal Burnette (Bioquímico

Analítico, 112:195-203, 1981) en base a "Southern blot", técnica para la

detección de ADN desarrollada con anterioridad por Edwin Southern. La

detección de ARN es denominada Northern blotting.

Western Blot: PASOS1. Preparación de las muestras:

A) Extracto celular total

Tomar aprox. 0.5x106 cél/pto.

Lavar con PBS y resuspender en 15 µl de PBS. Medir cantidad de proteína, coger 20-100 µg y añadir Laemmli Sample Buffer 4x:

12.5 ml 4x Tris-ClH/SDS, pH 6.8(6.05 g Tris base en 40 ml H2O, ajustar pH, añadir 0.4 g de SDS, completar hasta 100 ml H2O)  

10 ml glicerol

2 g SDS  

1 ml 2-ME o 3.1 g DTT  

0.5 mg azul de bromofenol  

H2O hasta 25 ml  

Guardar a -80ºC en alícuotas de 1 ml.  

Las muestras se pueden guardar a -20ºC varias semanas.  

B) Extracto citosólico

Tomar 2.106 cél/punto  

Centrifugar según volumen:

5 min a 4500rpm, 4º en minífuga

5 min a 1500rpm,4º en centrífuga  

Quitar el sobrenadante y añadir 0.5 ml de buffer de lisis frío:  

  Para 5 ml:

50 mM Hepes pH 7.4 Este tampón se puede preparar 2x y guardar a temperatura ambiente, y añadir el resto de los componentes antes de usar. Usar 2.5 ml para 5 ml de buffer de lisis.

150 mM NaCl

10 mM NaF

10 mM Iodoacetamida

1% NP-40 50 ml NP-40  

200 mM Na3VO4 (Añadir antes de usar)

10 ml Na3VO4 100mM

1 mM PMSF 25 ml PMSF 200mM

 

Dejar 10 min en hielo

Centrifugar 10 min en minífuga a 4º

Recoger el sobrenadante y añadir 0.7 ml acetona en frío.

 

Precipitar a -20 ºC mínimo de media a una hora. Mejor toda la noche

Centrifugar 5 min en minífuga

Quitar el sobrenadante y resuspender el pellet en 20 ml de sample buffer (receta explicada arriba)

 

2. ELECTROFORESIS

Correr un gel de acrilamida entre el 7.5 y el 15% (140v, aprox. una hora)

Lower 7.5%    7.5% 10% 12%    Upper  

Acril/bis    2 ml    2.64 ml 3.2ml    0.64ml  

Agua bidest    4 ml    3.36 ml 2.8ml    3.05ml

Buffer Tris 4XL 2ml   2 ml 2ml   

Buffer Tris 4XU  1.25ml  

Temed 4micl  4micl 5micl  

APS 10%    40micl 40micl 25micl

Geles acrilamida:  

 

Buffer Tris Lower 4X:

Para 100ml :

1.5M Tris pH 8.8 18.17g

SDS 4ml de SDS 10%

Agua  Hasta 100ml

 

Buffer Tris Upper 4X:

Para 100ml:

 

0.5M Tris pH6.8 6.06g

SDS    4ml de SDS 10%

Agua    Hasta 100ml

 

Correr en una cubeta con aprox. 400ml de Running Buffer:

Running Buffer 5X  pH8.3(no ajustar)  

Tris base    9 g    15 g

Glicina    43.2 g    72 g

SDS    3 g    5 g

Agua    Hasta 600ml    1litro

 

3 TRANSFERENCIA

A) HUMEDA  

Dejar el gel en CAPS 1X mientras se prepara la membrana  

Lavar la membrana (PVDF) con:    a) metanol

b) Agua

c) CAPS 1X  

Transferir a 300mA (0.3 A) 3 horas, con CAPS 1X en frío y con agitación  

Teñir con Pounceau y lavar con PBS para quitárselo y ver si se ha transferido

Orden de montaje del sandwich:  

Lado blanco arriba

Esponjilla empapada en CAPS 

2 papeles 3M

Membrana

Gel (invertido de izq. a dcha)

2 papeles 3M

Esponjilla empapada en CAPS  

Lado negro abajo  

 

Cerrar bien el sandwich y ponerlo en la cubeta con el lado negro siempre unido al lateral negro de ésta

Llenar con CAPS hasta los bordes internos de la cubeta

 

B) SEMI-SECA  

Dejar el gel en tampón de transferencia semi-seca:

Para 1 L:  

Tris 48 mM 5.8 g

Glicina 39 mM 2.92 g

Metanol 20 % 200 ml

SDS 0.035% 1.75 ml del 20%

Lavar la membrana con Metanol (1 min)-Agua (2 min)-Buffer transferencia

Colocar en el blot: 3 papeles 3M; Gel; Membrana; 3 papeles 3M

Humedecer cada parte con buffer

Transferir a:    

Límite amperaje 50 mA (0.05) por membrana

Voltaje: 5 vol

Tiempo: 45 min

Seguir el protocolo de la otra transferencia

 

4) BLOQUEO  

Bloquear con PBS + 0.5-1% Tween + 5% leche 1 hora a T.A. o toda la noche a 4º  

Incubar con el anticuerpo primario preparado en buffer de bloqueo (aprox 1 hora). 

 

Lavar 3 X con PBS-Tween (o con solución de bloqueo) durante 5 min cada vez.

Incubar con el anticuerpo secundario preparado en solución de bloqueo 1 hora a temperatura ambiente.  

Lavar 3X con PBS Tween, 5 min cada vez

 

5. FLUOROGRAFíA

Incubar la membrana con ECL durante 1 min  

Exponer un chasis con la membrana envuelta en plástico y una película

6. REUTILIZACIÓN DE UNA MEMBRANA YA PROCESADA  

MÉTODO 1  

Lavar la membrana con buffer stripping 30 min a 50º con agitación:

 

Para 50 ml:

100mM b-mercaptoetanol 347 ml del stock

2% SDS  5 ml del 20%

62.5 mM Tris pH 6.7 3.125 ml de 1M

H2O bidestilada  Hasta 50 ml

 

Lavar con PBS-Tween durante 60 min en agitación, cambiando el buffer cada 15 min

Bloquear de nuevo con PBS-Tween-Leche al menos 1 hora

Incubar con los anticuerpos

 

METODO 2 (Recomendado)

Lavar 10 min con una solución ácida:

10mM Tris 150 mM NaCl pH 2.3

Lavar 3 X,10 min con PBS_ Tween

Volver a bloquear la membrana con PBS-Tween-Leche