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Universidad Nacional Autónoma de MéxicoFacultad de Odontología

Laboratorio de Genética Molecular

CURSO DEMICROBIOLOGÍA BÁSICA

Dra. Laurie Ann Ximénez-FyvieMtra. Adriana Patricia Rodríguez Hernández

Diapositivas 3

Pruebas de susceptibilidad•Antibiogramas (Kirby-Bauer)•Conc. mínimas inhibitorias (MIC)•Conc. mínimas bactericidas (MBC)

Métodos para el estudio de microorganismos

Identificación fenotípica•Tinción de Gram•Morfología celular•Motilidad•Tolerancia al oxígeno•Morfología de colonia•Tipificación bioquímica•Perfiles de proteínas celulares

Identificación genética•Hibridaciones DNA-DNA•PCR (polymerase chain reaction)•Secuenciación 16S rRNA

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Identificación fenotípica•Tinción de Gram•Morfología celular•Motilidad•Tolerancia al oxígeno•Morfología de colonia•Tipificación bioquímica•Perfiles de proteínas celulares

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Identificación fenotípica

Definición

Secuencia consecutiva de métodos de “microbiología tradicional” que en conjunto llevan a la identificación de especies bacterianas en cultivo; mediante la determinación y posterior seguimiento de sus características fenotípicas y metabólicas a través de diagramas de flujo de identificación aceptados.

Aplicación• Identificación y cuantificación de especie cultivable previamente caracterizadas o

de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros.

Ventajas• Permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o

en paralelo a la identificación.• Es posible realizar la cuantificación de las especies evaluadas.

Desventajas

En comparación a la identificación genética:• Más laborioso.• Mayor tiempo y costo.• Difícil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de

especies fastidiosas.• Subestimación de especies fastidiosas.• No permite la identificación de especies no-cultivables.

Identificación fenotípica- Diagrama de flujo

Tinción de Gram

Morfología celular

Motilidad

Tolerancia al O2

Morfología de colonia

Tipificación bioquímica

Perfiles de proteínas celulares

Gram positivo Gram negativo

Identificación fenotípica- Tinción de Gram

Identificación fenotípica- Morfología celular

Coco

Bacilo

PleomórficoEspirilo

•Sin motilidad•De nado (Swimming)•De deslizamiento (Glidding)•En espasmos (Twitching)

En Agar

Tubo de Punción

Identificación fenotípica- Motilidad

Contraste de Fases Campo Obscuro

•Anaerobio estricto(en ausencia de O2)

•Microaerofílico(en conc. bajas de O2)

•Capnofílico(en presencia de CO2)

•Anaerobio facultativo(en presencia/ausencia de O2)

•Aerobio estricto(en presencia de O2)

Identificación fenotípica- Tolerancia al oxígeno

•Color•Tamaño•Forma•Textura•Consistencia

•Periferia•Adherencia al agar•Formación de fosas•Propiedades hemolíticas•Fluorescencia con luz UV

Identificación fenotípica- Morfología de colonia

Identificación fenotípica- Tipificación bioquímica

•Fermentación de carbohidratos•Productos terminales•Catalasa•Oxidasa•Coagulasa•Reacciones de aglutinación

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)

Identificación fenotípica- Perfiles de proteínas celulares

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Identificación genética•Hibridaciones DNA-DNA•PCR (polymerase chain reaction)•Secuenciación 16S rRNA

Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA

DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace a moléculas de DNA complementarias en una muestra (templete).

Aplicación • Identificación y cuantificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros.

Ventajas

En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras.

En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo.• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de

especies fastidiosas.• Permite la identificación de especies no-cultivables.

En comparación a otras pruebas genéticas:• Es posible cuantificación las especies evaluadas.

Desventajas

En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo

a la identificación.En comparación a otras pruebas genéticas:

• Menor sensibilidad y especificidad.

•Sonda: fragmento de DNA marcado con una molécula reportadoraque permite su detección después de la hibridación

•Molécula ReportadoraRadioactiva: Isótopos con emisiones β (generalmente P32)No-Radioactiva: Digoxigenina, Fluorescina, Biotina, etc.

•Especificidad: determinada por el diseño de la sonda•Sensibilidad: determinada por el tipo y concentración de la sonda


•Southern BlotBlanco = DNASonda = DNA

•Northern BlotBlanco = RNASonda = DNA

•Western BlotBlanco = ProteínaSonda = Anticuerpo

“MiniSlot”

Canales abiertos

Membranade nylon

Filtros

Socransky et al. Biotechniques 1994


“MiniBlotter”

Canales de hibridación

Membranade nylon


Socransky et al. Biotechniques 1994


* Serotipos a: 43717 & b: 43718† Subespecies nucleatum: 25586, polymorphum: 10953 & vincentii: 49256

Métodos genéticos- PCR

DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra (templete).

Aplicación • Identificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros.

Ventajas

En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor sensibilidad.



Desventajas


a la identificación.En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:

• No permite la cuantificación de especies (excepto PCR en tiempo real).En comparación a hibridaciones DNA-DNA:

• Bajo número de especies evaluadas.

PCR

Métodos genéticos- PCR

•Ciclos repetitivos de desnaturalización, alineamiento de primers yextensión para producir múltiples copias de una secuenciadeterminada de DNA

•Especificidad: determinada por el diseño de los primers•Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula

Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA

DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la determinación de la secuencia en el DNA de la fracción 16S rRNA en una muestra (templete) y su posterior comparación con secuencias publicadas.

Aplicación • Identificación de cualquier microorganismo a partir de muestras clínicas o cultivos puros.

Ventajas

En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor especificidad.



Desventajas


a la identificación.En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:

• No permite la cuantificación de especies.En comparación a hibridaciones DNA-DNA:

• Bajo número de especies evaluadas.

Secuenciación 16S rRNA

Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA

•Comparación con bancos de secuencias conocidas

•Especificidad: hipotéticamente “absoluta”•Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula

Pruebas de susceptibilidad•Antibiogramas (Kirby-Bauer)•Conc. mínimas inhibitorias (MIC)•Conc. mínimas bactericidas (MBC)


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Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana

CONSIDERACIONES GENERALES

• Todas las pruebas que se discutirán, dependen delcultivo bacteriano in vitro.

•Requieren de un tiempo relativamente largo para laobtención de resultados (3-7 días).

•No infieren sobre la susceptibilidad bacteriana enbiopelículas.

•Sólo permiten la evaluación de especies cultivables.

•Son aplicables únicamente a cultivos puros.

Antibiogramas- Prueba de Kirby-Bauer

DefiniciónMétodo para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de bacterias, basado en el tamaño de zonas de inhibición de crecimiento alrededor de discos impregnados con diferentes fármacos en un sembrado en césped.

Aplicación

• Determinación rápida (presuntiva) de la susceptibilidad de microorganismos a diferentes antimicrobianos.

• En casos donde se requiere un resultado rápido para la selección y administración inicial del antimicrobiano.

VentajasEn comparación a MIC y MBC:

• Menos laborioso y costoso.• Requiere menos tiempo para la obtención de resultados.

Desventajas• No proporciona concentraciones útiles clínicamente.• Los resultados son un indicador pobre de la efectividad clínica del agente.

Sembrado en césped

Antibiogramas- Prueba de Kirby-Bauer

Ajustar D.O.de 104 a 106

Suspender en caldo

Colocar discos

Medir zonas de inhibiciónIncubar

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c2/Bacterial_lawn_01.jpg

Interpretación de antibiogramas

Ejemplo para E. coli y otros bacilos entéricos G(-) PUNTOS DE CORTE

Antibiótico Conc. endisco (µg) Resistente Intermedio Susceptible

Amikacina 30 ≤14 15-16 ≥17Ampicilina 10 ≤13 14-16 ≥17Cefazolina 30 ≤14 15-17 ≥18Gentamicina 10 ≤12 13-14 ≥15Tetracyclina 30 ≤14 15-18 ≥19Ticarcilina 75 ≤14 15-19 ≥20Trimetoprim 5 ≤10 11-15 ≥16Tobramicina 10 ≤12 13-14 ≥15

(Diámetro en mm)

INTERPRETACIÓN ESTÁNDAR• Diámetro ≥ 18 mm o radio ≥ 6 mm = “S”• Diámetro < 18 mm o radio < 6 mm = “R”• Lo anterior considera discos de 6 mm• Los puntos de corte varían específicamente para algunos MO y/o antibióticos• La interpretación debe basarse en los estándares vigentes del CLSI• El punto de corte “intermedio” se interpreta igual que en MICs

Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC)

Definición Concentración más baja de un fármaco que inhibe el crecimiento visible de microorganismos después de su cultivo en presencia del agente.

Aplicación

• “Estándar de oro” en pruebas de susceptibilidad para diagnóstico e investigación.• Uso obligado en casos de endocarditis, meningitis, septicemia, osteomielitis,

pacientes inmunosuprimidos, infecciones de prótesis y cuando no ha habido una buena respuesta a pesar de haber tenido resultado de “S” con antibiogramas.

• En pacientes críticos para quienes se requiere una MIC exacta (≥10 diluciones).

Ventajas• Proporciona concentraciones útiles clínicamente.• Permite establecer puntos de corte de sensibilidad y resistencia.

Desventajas

En comparación a los antibiogramas:• Técnicamente más laborioso.• Requiere mayor tiempo para la obtención de resultados.• Es más costoso.


Suspender en caldo

Transferir a pozos

Incubar

*Sin antibiótico

Determinar MIC a cada antibiótico

Met

roni

dazo

l

Clin

dam

icin

a

Amox

icili

na

Ampi

cilin

a

Eritr

omic

ina

Cipr

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na

Vanc

omic

ina

Gen

tam

icin

a

Clor

anfe

nico

l

Amik

acin

a

Kana

mic

ina

Nor

floxa

cina

Control*

0.5 µg/ml

1 µg/ml

2 µg/ml

4 µg/ml

8 µg/ml

16 µg/ml

32 µg/ml

MÉTODO DE DILUCIÓN EN CALDO

Aplicación: Bajo número de cepas contra número elevado de antibióticos

Estándares: CLSI (antes NCCLS)


Conc. sugeridas

…512 µg/ml16 µg/ml8 µg/ml4 µg/ml2 µg/ml1 µg/ml0.5 µg/ml0.25 µg/ml0.12 µg/ml0.06 µg/ml…0.001 µg/ml

Caldo con diferentes conc. de 12 antibióticos


Suspender en caldo

Transferir a pozos (S/A)

Replicar en placas de agar

Control* 0.5 µg/ml

1 µg/ml 2 µg/ml

4 µg/ml 8 µg/ml

16 µg/ml 32 µg/ml

Agar con diferentes conc. de 1 antibiótico*Sin antibiótico

Determinar MIC de cada cepa

Incubar

MÉTODO DE DILUCIÓN EN AGAR

Aplicación: Elevado número de cepas contra bajo número de antibióticos

Estándares: CLSI (antes NCCLS)




Suspender en caldo

Transferir en césped Incubar

Determinar MICs

MÉTODO DE TIRAS DE GRADIENTE

Aplicación: Elevado número de cepas contra elevado número de antibióticos

Colocar tira con antibiótico

Interpretación de MICs“La relatividad de la susceptibilidad”

Resultado de la prueba MIC(µg/ml)

Valores de los puntosde corte+=Interpretación clínica de la

susceptibilidad

• No tienen utilidad per se.

• Se interpreta considerando las concentraciones que el fármaco puede alcanzar en el sitio de la infección después de administrar una dosis terapéutica.

• Estándares del CLSI.

• Basados en las concentraciones que el fármaco puede alcanzar en el sitio de la infección después de administrar una dosis terapéutica.

FARMACOCINÉTICA• Dosis, distribución y vida media del fármaco: factores que

determinan la concentración alcanzable en el sitio de infección.

• Difiere de fármaco a fármaco, de sitio a sitio y de paciente a paciente.

Por lo tanto, los puntos de cortes son diferentes para cada agente:

• Una MIC baja puede representar “R” a un fármaco y una MIC elevada “S” a otro por diferencias en sus puntos de corte.

Interpretación de MICs- Puntos de corte e índices PD

ÍNDICES FARMACODINÁMICOS (PDI)

• Consideran la cinética y dinamia del fármaco junto con la MIC para determinar su efectividad

• Se compara el “coeficiente del punto de corte” (MBQ) con el valor de la MIC

• MBQ = Punto de corte(1) ÷ MIC

• <MIC y >MBQ: >eficacia del fármaco

PUNTOS DE CORTE (PC)

• MIC < PC(1) = “S”

• MIC > PC(3) = “R”

• PC(2): Puede ser efectivo si la infección se localiza en sitios que concentran al fármaco ó cuando se pueden administrar dosis altas con seguridad

PUNTOS DE CORTE EJEMPLOS

Antibiótico Susceptible (1) Intermedio (2) Resistente (3) MIC MBQ Interpretación

A. Imipenem ≤8 16 ≥32 48 0.17 RB. Ampicilina ≤2 4 ≥8 4 0.5 IC. Cefotaxima ≤2 4 ≥8 1 2 SD. Clindamicina ≤16 32 ≥64 2 8 SE. Metronidazol ≤12 24 ≥48 4 3 S

(Concentraciones en µg/ml)

R

I

S

R

I

S

R

I

SR

I

S

R

I

S

Interpretación de MICs

PUNTOS DE CORTE EJEMPLOS

Antibiótico Susceptible (1) Intermedio (2) Resistente (3) MIC MBQ Interpretación

A. Imipenem ≤8 16 ≥32 48 0.17 RB. Ampicilina ≤2 4 ≥8 4 0.5 IC. Cefotaxima ≤2 4 ≥8 1 2 SD. Clindamicina ≤16 32 ≥64 2 8 SE. Metronidazol ≤12 24 ≥48 4 3 S

(Concentraciones en µg/ml)

Fármaco EFármaco DFármaco CFármaco BFármaco A

Concentraciones mínimas bactericidas (MBC)

DefiniciónConcentración más baja de un fármaco capaz de matar microorganismos, se determina después de subcultivar en agar sin el agente, muestras de caldo sin crecimiento visible en una serie de diluciones para la determinación de MIC.

Aplicación• Se utiliza con menor frecuencia que las MICs.• Uso obligado en casos de endocarditis, meningitis y en pacientes críticos.

Ventajas• Proporciona concentraciones útiles clínicamente.• Permite identificar el efecto “bactericida” y “bacteriostático” del fármaco.

Desventajas

En comparación a MICs y antibiogramas:• Técnicamente más laborioso.• Requiere mayor tiempo para la obtención de resultados.• Es más costoso.

Concentraciones mínimas bactericidas (MBC)

MIC: método de dilución en

caldo

Incubar

Determinar MBC

Subcultivo en agar sin

antibiótico

Interpretación de MBCs

“Bactericida” vs. “Bacteriostático”

• Bactericida: MBC ≤ 4 veces MIC• Bacteriostático: MBC > 4 veces MIC

Antibiótico Ejemplos Efecto

Penicilinas - Amoxicilina- Ampicilina Bactericida

Cefalosporinas - Cefotaxima- Cefalexina Bactericida

Carbapenems - Imipenem- Meropenem Bactericida

Aminoglucósidos - Amikacina- Gentamicina Bactericida

Quinolonas - Ciprofloxacina- Levofloxacina Bactericida

Lincosaminas - Clindamicina Bacteriostático

Macrólidos - Azitromicina- Claritromicina Bacteriostático

Tetraciclinas - Doxiciclina- Minociclina Bacteriostático

Nitroimidazoles - Metronidazol Bacteriostático

Fenólicos - Chloramfenicol Bacteriostático

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