visualización de bacterias mesófilas en leche cruda
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Trabajo Práctico N° 5
Visualización de bacterias mesófilas en leche cruda
Introducción
A partir de la asignación de una consigna que proponía, la posibilidad de
visualizar alguna estructura biológica de nuestro entorno y que afecte nuestra salud,
mediante el uso del microscopio, nos surgió una inquietud, que planteaba como
diferenciar a través de la tinción el tipo de bacterias mesófilas que afectan los procesos
de elaboración de productos alimenticios y en que sector del mismo se hallara una alta
carga microbiana.
Para resolver nuestra problemática, hemos tomado como objeto de estudio la
producción láctea en nuestro pueblo, debido a que son productos consumidos a diario
y en su elaboración intervienen distintos tipos de bacterias. Hemos seleccionado
dentro de esta producción la fabricación del queso, la cual consta de los siguientes
pasos:
Enfriamiento de la leche.
Deshidratación de la misma, ambos pasos realizados en el tambo.
Recepción de la leche: pesaje, muestreo, enfriamiento.
Filtrado: se separan las impurezas macroscópicas, a través del tamizado y la
filtración.
Almacenamiento.
Higienización: se separan las impurezas microscópicas (barro, sangre, etc.) por
medio de la centrifugación.
Pasteurización.
Maduración de la leche en las tinas.
Agregados de aditivos: colorantes, cloruro de calcio, nitrato, cuajo.
Tratamiento de la cuajada: lirado, agitación, calentamiento.
Desuerado.
Pre-prensado, moldeo y prensado del queso.
Salado.
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Maduración.
Teniendo en cuenta nuestra inquietud y ahora conociendo en detalle la
elaboración pudimos deducir que la pasteurización es el paso que permite la
eliminación de la mayoría de los microorganismos que ponen en riesgo nuestra salud.
Para cumplir con la consigna asignada, el agente biológico que seleccionamos
como objeto de estudio fueron las bacterias, estas son organismos unicelulares
pertenecientes al reino Monera, formados por una sola célula procariota, y miden de 1
a 10 µm. Pueden tener formas variables: esféricas (cocos), bastones (bacilos),
espiralados (espirilos), viven aisladas o en colonias. Las bacterias están rodeadas por
una pared celular compuesta por proteínas, llamadas porinas (canales para el pasaje
de soluto) y un péptidoglicano llamado mureína, que se encuentra por fuera de la
membrana plasmática. Se identificaron varios tipos de paredes, y en base a esto de
desarrolló una tinción para diferenciarlas, usando el colorante violeta de Genciana: las
bacterias que se tiñen con dicho colorante son Gram positivas y se observan de color
violeta, las bacterias que no se tiñen con este colorante son Gram negativas y
adquieren un color rosado.
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Hipótesis:
En una muestra de leche cruda encontraremos gran cantidad de bacterias
Objetivos:
Determinar la cantidad de colonias de bacterias presentes en una muestra de
leche cruda.
Diferenciar las bacterias en Gram positivas y negativas en una muestra de leche
cruda.
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Como punto de partida para esta investigación, entrevistamos a un encargado
del control de la producción láctea dentro de la fábrica de nuestro pueblo para poder
conocer acerca de la elaboración del queso, y así relacionarlo con nuestra
problemática, los pasos para la fabricación del producto fueron detallados en la
introducción.
Para ampliar la comprensión sobre la pasteurización (indicada con
anterioridad, como el paso más importante, en el cual son eliminadas gran parte de las
bacterias), se puede decir que es un proceso aplicado a la leche u otros alimentos, que
implican un riesgo para la salud humana mediante el empleo adecuado del calor,
procurando alterar lo menos posible el estado físico y el equilibro químico de sus
componentes.
Para fijar los parámetros de pasteurización de la leche, se toma como
referencia el microorganismo peligroso y más resistente a la temperatura (bacilo de
tuberculosis), y en base al tiempo de reducción décima, se determina una relación de
tiempo y temperatura para el proceso que asegure su destrucción total, esta relación
se debe a que a mayor temperatura se reduce el tiempo de exposición, si elevamos el
grado de calor a 63ºC, el calentamiento durara 20 minutos, y en el caso de que fueran
72ºC el tiempo disminuirá a 15 segundos.
El porcentaje de gérmenes destruidos, así como los cambios físico-químicos
de la leche durante este proceso depende de factores tales como:
Temperatura y tiempo de retención a temperatura prefijada.
Tipo y número inicial de microorganismos.
Concentración de materia grasa.
pH de la leche.
Movimiento de la leche y ligado a ello, la velocidad de transmisión del calor
durante la pasteurización.
Para obtener más información sobre la problemática, averiguamos como
dentro de la fábrica se controla la calidad de la leche a través de la toma de muestras,
las cuales se hacen en base estéril al igual que los utensilios que se utilizan, una vez
tomada se las mantiene a 4ºC para impedir la reproducción microbiana (aerobios
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totales, hongos, Escherichia Coli, Staphylococcus aureus coagulasa positiva). El medio
de cultivo utilizado para las muestras no es el convencional, sino que emplean placas
de Petrifilm, que tienen un sistema incorporado de nutrientes (rojo Bilis Violeta,
indicador tetrasolium, etc.) que propicia el ambiente para el sembrado de bacterias.
Poniendo en práctica este sistema, no es necesario el uso del microscopio, ya que cada
bacteria adquiere un color característico que permite diferenciarlas unas de otras.
Debido a que nuestra nueva observación es a través del microscopio, lo que hicimos
fue tomar una muestra de leche cruda (sin pasteurizar).
Una vez en el laboratorio del instituto, le realizamos una dilución seriada a la
muestra: tomamos 1ml de la misma con una pipeta previamente esterilizada y lo
añadimos a uno de los tubos de ensayo con 9ml de solución salina fisiológica, ya que
cuenta con la misma presión osmótica que la célula, teniendo precaución en la
exactitud de los volúmenes, lo agitamos para homogeneizar totalmente la superficie, y
así conseguimos diluir la muestra inicial diez veces (1/10); luego extrajimos 1ml de la
muestra realizada anteriormente y lo agregamos al segundo tubo, el cual contenía 9ml
de solución fisiológica, obteniendo una dilución de 1/100. Repetimos el procedimiento
hasta lograr diluir la muestra diez mil veces (1/10000).
Al concluir con este procedimiento, preparamos el medio de cultivo cubriendo
la base de una capsula de Petri con agar nutritivo, luego pipeteamos sobre esta
superficie 0,1ml de la muestra sin diluir, y utilizando un ansa esterilizada (se la expone
al fuego hasta que alcance un color rojizo, se retira y se deja enfriar), extendimos la
muestra en estrías. Estos mismos pasos los aplicamos al resto de las muestras. Seguido
de esto rotulamos las capsulas de Petri, y las incubamos a 37ºC.
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Al cabo de 9 horas chequeamos el desarrollo de las colonias y logramos
determinar la existencia de 5 colonias en la muestra sin dilución.
A causa del escaso desarrollo microbiano, prolongamos el tiempo de
incubación a 78 horas, culminando este lapso, contábamos con la presencia de 90
colonias aproximadamente en el cultivo de la muestra 1/10000.
Para llegar a nuestro objetivo, realizamos la tinción de Gram:
Esterilizamos nuevamente un ansa, con la cual retiramos del medio de cultivo,
parte de una colonia.
Sobre un portaobjeto, realizamos un frotis bacteriano:
Fijamos la muestra, balanceando tres veces el portaobjeto sobre la llama.
Ya fijada la muestra, colocamos sobre la muestra el colorante violeta de
Genciana.
Al cabo de 1 minuto, lo lavamos con abundante agua para eliminar el exceso de
colorante.
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Cubrimos el portaobjeto con lugol, y después de 1 minuto quitamos el exceso
del mismo con agua.
Decoloramos con alcohol-acetona, hasta que la preparación deje de perder
color, y enjuagamos la muestra.
Le aplicamos safranina durante 1 minuto, y luego lavamos con agua para
eliminar el colorante de contraste.
Secamos la preparación.
Llevamos al microscopio para observar la morfología y el color adquirido por los
distintos tipos bacterianos en estudio.
Una vez observada la muestra, pudimos deducir debido al color que
adquirieron los microorganismos que se encontraban en la misma, hacían referencia a
las características de una bacteria Gram positiva: la pared de estas bacterias está
formada por una capa homogénea y espesa de péptidoglicano (mureína) y
polisacáridos.
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Dentro de las bacterias que se clasifican como Gram pos itivas podemos
encontrar lactobacillus, que son grupos de bacilos no patógenos que producen acido
láctico a partir de los carbohidratos.
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Conclusión:
A través de esta investigación logramos establecer un número aproximado de
unidades formadoras de colonias, luego de un determinado tiempo de incubación en
una muestra de leche cruda. A su vez, también pudimos detectar que las bacterias
presentes en la misma eran Gram positivas, mediante el uso de métodos comunes de
investigación.
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Bibliografía:
Díaz, R., C. Gamazo y Otros. 1995. Manual práctico de microbiología. Masson.
Barcelona, España.
Madigan, Michael, Jack Parker y otros. 2004. Biología de los microorganismos.
Pearson. Madrid.
Curtis, Helena, N. Sue Barnes y otros. 2001. Biología. Panamericana. España.
Ingraham Jonh y Catherine. 1997. Introducción a la microbiología. Reverte S.A.
Barcelona.
Entrevistas: Arighini, Matías y Yanina Moretti.
Integrantes:
Arrebillaga Micaela
De Pauli Sofia
Borgatello Lorenzo
Manavella Laura
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