validar una técnica para la cuantificación de tilosina

VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA PARA LA CUANTIFICACIÓN DE

TILOSINA EN UN PRODUCTO SÓLIDO

AUTOR LUZ STELLA MEJIA RANGEL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA D.C.

2008

ii

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por

sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique

nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no

contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea

en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

iii




APROBADO

________________________ ________________________

Viviana Peña Páez Janeth Arias Microbióloga Industrial Bacterióloga MSc Director Codirector

________________________ ________________________ Cindy Fernandez Jazmín Castellanos Microbióloga Industrial Química Jurado Jurado

iv




APROBADO

________________________ ________________________ Ingrid Schuler Ph.D Janeth Arias MSc Decana Académica Director de Carrera de

Microbiología

v

A mis padres por su ayuda, confianza y apoyo incondicional y a Dios por acompañarme en cada uno de mis pasos

vi

AGRADECIMIENTOS

A mi familia por estar conmigo, darme ánimos y darme todo lo necesario para lograr mis metas.

La empresa Vicar Farmaceutica S.A. por permitirme realizar mi tesis en

sus instalaciones y la financiación de esta.

Viviana Peña por su amistad y colaboración para realizar con éxito este trabajo de grado.

Janeth Arias Docente y Directora de la Carrera de Microbiología por su

apoyo y colaboración

A todo el personal de Control de Calidad por su calor humano.

Reinaldo Orejarena por darme ánimos constantemente

vii

TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCION ......................................................................................... 0 MARCO TEORICO ...................................................................................... 2

2.1 ANTIBIÓTICOS .............................................................................. 2 2.1.1 MODO Y MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS ANTIBIOTICOS 2 2.1.2 MACROLIDOS ............................................................................ 3 2.1.2.1 ORIGEN Y COMPOSICIÓN QUÍMICA .................................... 3 2.1.2.2 FORMULACIONES DEL FARMACO ....................................... 4 2.1.2.3 MECANISMO DE ACCIÓN ...................................................... 4 2.2 TILOSINA ....................................................................................... 5 2.2.1.1 ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA TILOSINA .................... 5 2.2.1.2 DESCUBRIMIENTO ................................................................. 6 2.2.1.3 FORMULA EMPIRICA ............................................................. 6 2.2.1.4 CARACTERISTICAS FISICO – QUIMICAS ............................ 6 2.2.2 USOS DE LA TILOSINA ............................................................. 7 2.2.3.1 MECANISMO DE ACCIÓN ...................................................... 8 2.2.3.2 ABSORCIÓN, METABOLISMO Y EXCRECIÓN ..................... 8 2.2.3.3 CONTRAINDICACIONES DE LA TILOSINA ........................... 9 2.2.4 POTENCIA ................................................................................ 10 2.2.4.1 METODOS DE EVALUACIÓN DE POTENCIA MICROBIOLOGICA ............................................................................ 10 2.2.4.2 DIFUSIÓN EN PLACA ........................................................... 10 2.5. MICROORGANISMO .................................................................. 11 2.5.1 Micrococcus luteus .................................................................... 11 2.6 VALIDACIÓN ................................................................................ 14 2.6.1 PARAMETROS DE CALIFICACION Y VALIDACION .............. 15 2.6.1.1 CALIFICACIÓN DE INSTALACIÓN (IQ) ................................ 15 2.6.1.2 CALIFICACIÓN OPERACIONAL (OQ) .................................. 15 2.6.1.3 CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO (PQ) .............................. 15 2.6.2 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ............... 15 2.6.2.1 ESPECIFICIDAD .................................................................... 15 2.6.2.2 SELECTIVIDAD ..................................................................... 16 2.6.2.3 LINEALIDAD Y ALCANCE ..................................................... 16 2.6.2.4 PRECISIÓN ............................................................................ 17 2.6.2.4.1 REPETIBILIDAD ................................................................. 17 2.6.2.4.2 REPRODUCIBILIDAD ......................................................... 17 2.6.2.5 EXACTITUD ........................................................................... 18 2.6.2.6 LÍMITE DE DETECCIÓN ........................................................ 18 2.6.2.7 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN .............................................. 18 2.6.2.8 ROBUSTEZ ............................................................................ 19 2.6.2.9 SENSIBILIDAD ....................................................................... 19 2.6.3 TIPOS DE VALIDACION DEL PROCESO ............................... 19 2.6.3.1 VALIDACIÓN PROSPECTIVA ............................................... 19 2.6.3.2 VALIDACIÓN CONCURRENTE ............................................ 20

viii

2.6.3.3 VALIDACIÓN RETROSPECTIVA .......................................... 20 2.6.3.4 REVALIDACIÓN ..................................................................... 20

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ....................... 21 4. OBJETIVOS ........................................................................................... 22

4.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................. 22 4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ....................................................... 23

5. MATERIALES Y METODOS ................................................................ 23 5.1 MATERIALES ............................................................................... 23 5.2 REACTIVOS ................................................................................. 24 5.3 MEDIO DE CULTIVO ................................................................... 24 5.5 MICROORGANISMO ................................................................... 24

6. METODOLOGÍA .................................................................................... 25 6.1 PROCEDIMIENTO DE LA VALIDACION ..................................... 27 6.1.1 PREPARACIÓN DEL MICROORGANISMO ............................ 27 6.1.2 PREPARACIÓN DEL BUFFER ................................................. 27 6.1.3 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO ............................ 27 6.1.4 INOCULO .................................................................................. 28 6.1.5 PERFORACIÓN Y LECTURA ................................................... 28 6.1.6 CONTROLES ............................................................................ 28 6.2 MUESTRA DE TRABAJO Y ESTANDAR .................................... 29 6.3 VALIDACIÓN ................................................................................ 29

7. PARÁMETROS ...................................................................................... 30 7.2 ESPECIFICIDAD .......................................................................... 30 7.3 SELECTIVIDAD ....................................................................... 31 7.4 LINEALIDAD DEL SISTEMA ........................................................ 32 7.5 LINEALIDAD DEL METODO ........................................................ 34 7.6 PRECISION DEL MÉTODO ......................................................... 36 7.7 PRECISIÓN DEL SISTEMA ......................................................... 36 7.8 EXACTITUD ................................................................................. 37 7.9 LÍMITE DE DETECCIÓN .............................................................. 38 7.10LIMITE DE CUANTIFICACIÓN ................................................... 38

8. RESULTADOS Y DISCUSION .............................................................. 40 8.1 ESPECIFICIDAD ......................................................................... 40 8.2 SELECTIVIDAD ............................................................................ 40 8.2.1 SELECTIVIDAD CONDICIÓN ÁCIDA ....................................... 40 8.2.2 SELECTIVIDAD CONDICIÒN BÀSICA .................................... 41 8.2.3 SELECTIVIDAD CONDICIÓN ULTRAVIOLETA ...................... 41 8.2.4 SELECTIVIDAD CONDICIÓN TÉRMICA ................................. 41 8.3 LINEALIDAD ................................................................................. 42 8.3.1 LINEALIDAD DEL SISTEMA..................................................... 42 8.3.2 LINEALIDAD DEL MÈTODO..................................................... 43 8.4 PRECISIÓN .................................................................................. 44 8.4.1 PRECISIÓN DEL MÉTODO ...................................................... 44 8.4.1.1 PRECISIÓN DÍA 1 ANALISTA 1 ........................................... 44 8.4.1.2 PRECISIÓN DIA 1 ANALISTA 2 ............................................ 44 8.4.2.1 PRECISIÓN DIA 2 ANALISTA 1 ............................................ 45 8.4.2.2 PRECISIÓN DIA 2 ANALISTA 2 ............................................ 45 8.5 EXACTITUD ................................................................................. 46

ix

8.5.1 EXACTITUD CONCENTRACION 80% .................................... 46 8.5.2 EXACTITUD CONCENTRACION AL 100% ............................ 47 8.5.3 EXACTITUD CONCENTRACION AL 120% ............................ 47 8.6 LIMITES ........................................................................................ 48 8.6.1 LIMITE DE DETECCIÓN ........................................................... 48 8.6.2 LIMITE DE CUANTIFICACIÓN ................................................. 49

CONCLUSIONES ...................................................................................... 50 BIBLIOFRAFIA .......................................................................................... 51 ANEXOS .................................................................................................... 55

1. RESULTADOS EN EXCEL ............................................................ 55 2 RESULTADOS CON EL PROGRAMA DE VALIDACIÓN .............. 74

x

INDICE DE TABLAS Tabla 1: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la

Especificidad 31

Tabla 2. Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la

selectividad 32

Tabla 3: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la

linealidad del sistema 33


Linealidad del método 35


Precisión del método 36


Exactitud 37

Tabla 7: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en el Limite

de detección. 38

Tabla 8: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en el Limite

de cuantificación 39

Tabla 9: Resultado del parámetro de especificidad 40

Tabla 10: Resultado del porcentaje de degradación en el parámetro

Selectividad en condición ácida 40


Selectividad en condición básica 41


Selectividad en condición ultravioleta 41


Selectividad en condición térmica 41

Tabla 14: Resultados del parámetro precisión día 1, analista 1 44




Tabla 18: Resultados del parámetro Exactitud al 80% 46

xi



Tabla 21: Resultados del parámetro Limite de Detección 48

Tabla 22: Resultados del parámetro Limite de cuantificación 49

xii

TABLAS DE ANEXOS

1.1 ESPECIFICIDAD 55

1.2SELECTIVIDAD 56

1.2.1 SELECTIVIDAD CONDICIÓN ÁCIDA 56

1.2.2 SELECTIVIDAD CONDICIÓN BÁSICA 57

1.2.3 SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA 58

1.2.4 SELECTIVIDAD CONDICIÓN TÉRMICA 59

1.3 LINEALIDAD DEL SISTEMA 60

1.4 LINEALIDAD DEL MÉTODO 62

1.5 PRECISION DEL METODO 64

1.5.1 PRECISION DIA 1 ANALISTA 1 64




1.6 EXACTITUD 68

1.6.1 EXACTITUD AL 80% 68



1.7 LIMITE DE DETECCIÓN 71

1.8 LIMITE DE CUANTIFICACION 72

2.1 LINEALIDAD SISTEMA 74

2.2LINEALIDAD DEL MÉTODO 79

2. 3 PRECISIÓN DEL MÉTODO 83

2.4 PRECISIÓN DEL SISTEMA 89

2.5 EXACTITUD 92

2.6 LIMITE DE CUANTIFICACIÓN 95

xiii

RESUMEN

El presente trabajo se llevó a cabo para validar la técnica de

cuantificación de Tilosina en presentación en polvo. Previamente se

estandarizó la técnica recomendada por la United States Pharmacopeia

versión 30 año 2007 con el fin de ajustarse y dar cumplimiento a la

normatividad internacional. La Muestra tiene una composición del 10% de

Tilosina Fosfato y 90% de Carrier 40-60.

El microorganismo sometido a prueba fue Micrococcus luteus ATCC 9341

y el método empleado fue difusión en agar; los resultados de las pruebas

fueron sometidos a un programa de validación microbiológica “Validation

Manager” .

El método en difusión en agar dio valores acuerdo a lo esperado,

validando así esta técnica.

xiv

ABSTRACT The following work was performed to validate a tylosin (in powder

form) quantification technique. Previously, the technique was standardized

according to the United States Pharmacopeia, 30th version, 2007 in order

to keep with international regulations. Our working sample is composed of

10% tylosin phosphate and 90% Carrier 40-60.

Agar diffusion was used to test the micro-organism Micrococcus luteus

ATCC 9341 and all results were validated via the program "Validation

Manager".

Expected results were obtained using agar diffusion, therefore validating

this technique

INTRODUCCION

El control de calidad es la parte de las prácticas adecuadas de

fabricación que se refiere al muestreo, especificaciones y ensayo, como

también a los procedimientos de organización, documentación y

autorización que aseguren que los ensayos necesarios y pertinentes

realmente se efectúen y que no se permita la circulación de los

materiales, ni se autorice la venta o suministro de los productos, hasta

que su calidad haya sido aprobada como satisfactoria. El control de

calidad no se limita a las operaciones de laboratorio, sino que debe estar

presente en todas las decisiones concernientes a la calidad del producto.

Los conceptos de garantía de la calidad, prácticas adecuadas de

fabricación y control de calidad constituyen aspectos de la administración

de la calidad que se relacionan entre sí.

Dentro del concepto de garantía de la calidad, las prácticas adecuadas de

fabricación constituyen el factor que asegura que los productos se

fabriquen en forma uniforme y controlada, de acuerdo con las normas de

calidad adecuadas al uso que se pretende dar a los productos y conforme

a las condiciones exigidas para su comercialización. Las

reglamentaciones que rigen las prácticas adecuadas de fabricación tienen

por objeto principal disminuir los riesgos inherentes a toda producción

farmacéutica que no pueden prevenirse completamente mediante el

control definitivo de los productos. Esencialmente, tales riesgos son de

dos tipos: contaminación cruzada (en particular, por contaminantes

imprevistos) y confusión (causada por la colocación de etiquetas

equivocadas en los envases)

Se debe contar con instalaciones adecuadas, personal capacitado y

procedimientos aprobados, a fin llevar a cabo el muestreo, la inspección y

el ensayo de materias primas, materiales de envasado y productos

intermedios, a granel y acabados y en caso que sea apropiado, para

1

efectuar el control de las condiciones ambientales en relación con las

prácticas adecuadas de fabricación.

Los estudios de validación constituyen una parte esencial de las prácticas

adecuadas de fabricación y deben efectuarse conforme a protocolos

definidos de antemano. Debe prepararse y archivarse un informe escrito

que resuma los resultados y las conclusiones registrados. Deben

establecerse procesos y procedimientos sobre la base de un estudio de

validación, los cuales se sometan periódicamente a una revalidación para

asegurar que con ellos se puedan seguir obteniendo los resultados

deseados. Validación es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de

evidencia documentada que un proceso específico producirá de forma

consistente y permanente productos que poseerán las características de

calidad predefinidas (WHO Technical Report Series, No. 823,1992)

Bajo las condiciones adecuadas es importante realizar la validación de la

técnica de cuantificación de productos farmacéuticos; debido a su gran

importancia en la industria pecuaria, es necesario obtener antibióticos

idóneos y confiables, para esto, se debe realizar una validación

microbiológica frente a los principios activos, así asegurando la calidad del

producto y así contribuir a la calidad de la vida animal.

2

MARCO TEORICO

2.1 ANTIBIÓTICOS Un antibiótico es una sustancia química derivada o producida por

microorganismos que tienen la capacidad a bajas concentraciones de

inhibir el crecimiento o de matar bacterias y otros microorganismos.

(Groupe, 1990)

2.1.1 MODO Y MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS ANTIBIOTICOS Al referirse al mecanismo general de los antibióticos se ha hecho constar

que algunas son predominantes bactericidas, muerte de los

microorganismos y que otras predominantemente bacteriostáticas,

detección del crecimiento de los mismos. La bacteriostasis puede ser

importante para la curación de proceso infeccioso al intervenir las

defensas del organismo para destruir los microorganismos al inhibir su

multiplicación. Al emplear antibióticos bactericidas que al destruir las

bacterias hace fácil su eliminación con la ayuda de las defensas

orgánicas, mientras si se emplea antibióticos bacteriostáticos la curación

depende sobre todo de las defensas del organismo de manera que si

dichas defensas son insuficientes o si se interrumpe la droga se

interrumpe prematuramente, la población bacteriana puede aumentar de

nuevo y producirse una recaída.(Groupe, 1990)

Estas sustancias antibacterianas para producir la acción bacteriostática y

bactericida lo hacen interfiriendo con los mecanismos fisiológicos

expuestos. Son cuatro mecanismos de acción de los antibióticos.

- Inhibición de la síntesis de la pared celular, el componente esencial de

dicha pared es mucopéptido, el peptidoglucano, cuya síntesis es

impedida por el antibiótico por inhibición de los sistemas enzimáticos

3

correspondientes, la droga se fija en la pared celular y cuando se

produce la división celular de la bacteria, aparecen defectos en dicha

pared, el microorganismo se hace osmóticamente sensible, penetra

líquido en su interior, estalla y se lisa, así actúan las penicilinas,

cefalosporinas, bacitracinas, cicloserinas y vancomicina (Groupe,1990)

- Lesión de la membrana celular, en esta forma se afectan importantes

funciones celulares, pues en la membrana existen sistemas

enzimáticos vitales, y además rige la entrada y salida de elementos

nutritivos de manera que el antibiótico provoca un escape de proteínas

y nucleótidos lo que produce daño o muerte celular, la polimixina B,

colistina, nistatina, anfotericina B actúan de este modo (Groupe,1990)

- Inhibición de la síntesis proteica, existen antibióticos que bloquean los

pasos necesarios para dicha síntesis, actuando sobre los ribosomas y

en esta forma la vida de la bacteria queda afectada. Así actúa el

cloranfenicol, tetraciclinas, aminoglucosidos, rifampicina, eritromicina,

espiramicina, lincomicina y tilosina. (Groupe, 1990)

- Inhibición de la síntesis de los ácidos nucleicos, el ácido

desoxirribonucleico o DNA es esencial para la vida celular, los

antibióticos pueden actuar inhibiendo dicha síntesis, la griseofulvina

actúa de este modo. (Groupe, 1990)

2.1.2 MACROLIDOS

2.1.2.1 ORIGEN Y COMPOSICIÓN QUÍMICA

Los antibióticos macrólidos son un grupo de compuestos similares

estructuralmente, la mayoría de los cuales se obtienen de varias especies

de bacterias del género Streptomyces procedentes del suelo.

4

Químicamente todos los antibióticos de este grupo están clasificados

como lactonas macrocíclicas, con miembros que contienen entre 12 y 20

átomos de carbono en el anillo lactona. A este anillo se le une varias

combinaciones de desoxiazúcar mediante enlaces glucosídicos.

Desde el descubrimiento de la eritromicina a partir de un microorganismo

del suelo, Streptomyces erythreus, se han aislado o sintetizado a partir de

la molécula base eritromicina numerosos macrólidos, incluyendo la

tilosina, la roxitromicina, eritromicilina, la tilmicosina, la diritromicina, la

azitromicina, la claritromicina, la espiramicina, la fluritromicina. (Adams,

2003)

2.1.2.2 FORMULACIONES DEL FARMACO Todos los macrólidos son bases débiles, con valores de pKa que oscilan

entre 6 y 9, el pKa de la tilosina es 7,1 y la eritromicina tiene un pKa de

8,7-8,8. (Adams, 2003)

2.1.2.3 MECANISMO DE ACCIÓN

Los macrólidos inhiben la traslocación del RNA de trasferencia desde el

punto aceptor del aminoácido, lo que impide la formación de un nuevo

enlace peptídico, impidiendo así la síntesis de nuevas proteínas en la

célula microbiana. En general los macrólidos no se unen a los ribosomas

de las células de mamífero, resultando ser un grupo de fármacos

relativamente seguro para uso veterinario.

Aunque la mayoría de los autores han clasificado los macrólidos como

bacteriostáticos a las concentraciones terapéuticas, pueden resultar

bactericidas lentos, especialmente frente a estreptococos. Su acción

bactericida es dependiente del tiempo. (Adams, 2003)

5

2.2 TILOSINA

2.2.1.1 ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA TILOSINA

Figura 1. Estructura de la tilosina, tomada del artículo Angela C. Kolz 2005

Figura 2: Estructura de la Tilosina A, tomada del articulo de E. Cundliffe,

2001

6

2.2.1.2 DESCUBRIMIENTO La Tilosina fue obtenida primeramente en 1959 por McGuire y

colaboradores de un filtrado de cultima de Streptomyces fradie, el cual se

aisló de una muestra de tierra de Tailandia. Pertenece al grupo de los

antibióticos de los macrólidos y se emplea únicamente en veterinaria (H.

Trolldenier, 1980)

2.2.1.3 FORMULA EMPIRICA Tilosina base : C45H77NO17

Tartrato de Tilosina: C49H83NO23

(H. Trolldenier, 1980)

2.2.1.4 CARACTERISTICAS FISICO – QUIMICAS La tilosina es de base débil; en estado seco se cristaliza en pequeñas

láminas blanco-amarillentas. La solubilidad de la base en agua tiene

efecto en la proporción de 5 mg/ml a 25°C. La Tilosina se disuelve bien en

la mayoría de disolventes orgánicos, como el propilengicol. Forma sales

hidrosolubles, como son los tartratos, los fosfatos, los gluconatos, los

lactatos y el clorhidrato. Contrariamente a la base el tartrato de tilosina es

soluble en agua hasta la proporción de 600mg/ml. Las soluciones son

estables durante 30 días a temperatura ambiente y a un pH de 4 a 9. Por

hidrólisis ácida (pH inferior 4) se descompone en dos fracciones: el azúcar

y la desmicosina, un producto microbiologicamente activo que posee

propiedades físico-químicas similares. Si prosigue el desdoblamiento, se

liberan los sacáridos neutros micarosa y micaminosa. La tilosina conserva

su estabilidad durante dos años en las condiciones habituales de

condicionamiento. El tartrato se disuelve en agua a 36-38°C para usarlos

a los 10-20 minutos con el fin de dar tiempo a su disolución completa. (H.

Trolldenier, 1980)

7

2.2.2 USOS DE LA TILOSINA

Como antibiótico se ha utilizado en el control de la neumonía zoética e

infecciones respiratorias. Recientemente la Food and Drug Administration

la aprobó como ergotrópico para ganado bovino, cerdos y pollos, Se

administra en el alimento a dosis que varían en 10-1000g/tonelada. En la

actualidad, se reconoce que es especifícamete eficaz para prevenir los

abscesos hepáticos en el ganado. (Sumano, 1997)

Este fármaco es sumamente eficaz en el control de la micoplasmosis

aviar, reduce la incidencia de saculitis aérea. En los productos

comerciales, las dosis que se indican para el pollo de engorda son de 50

a 625 g/toneladas de alimento. Para las gallinas de postura, se indica de

250 a 600g/tonelada de alimento, con efecto terapéutico contra

micoplasmas. (Sumano, 1997)

Se ha utilizado terapéuticamente la tilosina para tratar el “ojo rosa”

(Moraxella bovis) en el ganado vacuno, las infecciones del tracto

respiratorio, la disentería del cerdo, la pleuroneumonía debida a

Haemophilus parahemolyticus y otras infecciones. (Adams, 2003)

La tilosina se ha utilizado como aditivo de piensos para promover el

crecimiento en animales en abastos como el cerdo, el ternero, pollo entre

otros. (Adams, 2003)

Después de administrar tilosina al ganado vacuno existe un periodo de

espera de 21 días y de 14 días en el caso del cerdo. La tilosina se

concentra en la leche y persiste durante largo tiempo y no debería

administrarse a animales en lactación (Adams, 2003)

8

La tilosina es activa contra microorganismos Gram positivos, con especial

acción sobre Mycoplasma gallisepticum S6. También actúa sobre algunos

Gram negativos. Por lo general, los microorganismos resistentes a tilosina

también lo son a la eritromicina.

Las bacterias sensibles a la tilosina en los cerdos principalmente:

Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Staphylococcus

aureus y Erysipelothrix rhusiopatiae, entre otras. En bovinos, Klebsiella,

Pseudomonas, Streptococcus, Salmonella, Herella, Pasteurella multocida,

Fusobacterium, Corybacterium pyogenes, Streptococcus haemolyticus.

En el perro: Pasteurella, Staphylococcus, Leptospira, Mycoplasma. En

aves: Mycoplasma gallisepticum y meleagridis y Coccidia. Además actúa

sobre Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes , Corybacterium

diphteriae, los géneros de Clostridium, Neisseria, Hemophilus,

Treponema, Rickettsias, virus y Entamoeba histolytica.(Sumano,1997)

2.2.3.1 MECANISMO DE ACCIÓN La tilosina llega por difusión pasiva al interior de las bacterias y bloquea la

síntesis de proteína bacteriana al unirse a la subunidad ribosomal 30S. En

general son bacteriostáticos, pero a dosis elevadas puede ser bactericida.

La resistencia bacteriana ocurre por alteración del receptor ribosomal o

por mecanismo, que dificultan la entrada del antibiótico o la célula

bacteriana, siendo muy común la resistencia cruzada a otros antibióticos

del grupo como espiramicina y eritromicina (Thomson, 2005)

2.2.3.2 ABSORCIÓN, METABOLISMO Y EXCRECIÓN

El tartrato se absorbe con suma facilidad en el aparato digestivo de

gallinas, pavos y cerdos. En las aves, esta sal se puede aplicar por vía

subcutánea y también puede darse en el agua de bebida.

9

Es posible mezclar la sal fosfato con el alimento del cerdo, aunque su

absorción es más limitada. Cuando se administra por vía parenteral, se

recomienda la vía intramuscular, disolviéndola en propilenglicol y agua,

adicionando alcohol bencílico al 4% como bactericida. (Sumano,1997)

La tilosina, se une a las proteínas plasmáticas del bovino en 40% y tiene

alto grado de liposolubilidad, por lo tanto muestra amplio distribución en

los líquidos corporales y en los tejidos. Su excreción principal, es a través

de los riñones e hígado. Sin embargo también se elimina por la leche en

altas concentraciones.

La dosis letal media (DL50) en el cerdo es de 5g/kg por vía oral y de 1 g

por vía intramuscular; en la rata y el ratón, es de 600mg/kg por vía

intravenosa y por vía oral de más de 500mg/kg. En el perro, por vía

intramuscular, es una sola dosis. (Sumano, 1997)

2.2.3.3 CONTRAINDICACIONES DE LA TILOSINA

La tilosina no se debe administrar en gallinas de postura, porque el huevo

puede adquirir concentraciones altas del antibiótico, además de que las

gallinas no se deben inyectar por vía intramuscular tres días antes del

sacrificio, ni 24 horas si la sustancia se proporciona vía oral. En el caso de

pavos debe ser 5 días de espera para el consumo humano después de

administrar la tilosina. Las vacas lactantes se deben retirar de la línea de

ordeña durante 96 horas para evitar el consumo de leche por el ser

humano ya que en la leche hay aproximadamente 1mg/ml.

Los cerdos no se deben sacrificar en un lapso de 21 días tras la

administración de tilosina, si se utilizó la vía intramuscular, y de cuatro

días si se empleó la vía oral. (Sumano, 1997)

10

2.2.4 POTENCIA Bajo las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos

puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre microorganismos. La

reducción en la actividad antimicrobiana también revela cambios sutiles

no comprables mediante métodos químicos. En consecuencia, las

valoraciones microbiológicas o biológicas sigue siendo, por lo general, el

estándar para disipar dudas en cuanto a la posible pérdida de la actividad.

La cantidad mínima de tilosina que se puede cuantificar o la potencia de

este antibiótico es de 900UI/mg (USP 30). Para la Tilosina fosfato mínimo

800 UI/mg en base anhidro, es de color ligeramente amarillo en polvo;

para tilosina Tartrato mínimo 800 UI/mg en base anhidra, es en polvo

ligeramente blanco.

2.2.4.1 METODOS DE EVALUACIÓN DE POTENCIA MICROBIOLOGICA

Se emplean dos métodos generales: la valoración en cilindro en placa y

valoración turbidimétrica o en tubo. El primer método se basa en la

difusión del antibiótico desde un cilindro vertical a través de una capa de

agar solidificada en un plato o placa de petri hasta inhibir totalmente el

crecimiento del microorganismo añadido, en un área circular o zona de

inhibición en torno del cilindro que contiene una solución del antibiótico. El

método turbidimétrico se basa en la inhibición del crecimiento de un

cultivo microbiano en una solución uniforme del antibiótico de un medio

líquido que promueva su rápido crecimiento en ausencia del antibiótico

(USP 30)

2.2.4.2 DIFUSIÓN EN PLACA Se basa en la difusión radial de una solución de un antibiótico desde un

reservorio a través de una capa de agar que ha sido inoculada con un

microorganismo sensible al antibiótico. Se colocan cantidades medidas de

sustancias a ensayar en placas con medio de cultivo sólido inoculado con

11

un microorganismo adecuado. Las placas se incuban para permitir el

desarrollo del microorganismo. La zona obtenida es una zona clara (halo)

de inhibición del crecimiento en torno a los reservorios. La base

cuantitativa del ensayo es la relación entre el diámetro de las zonas de

inhibición y la concentración de antibiótico.

Figura 3. Ventajas y desventajas de las metodologías para determinar potencia en antibióticos

Difusión en placa Turbidimetria

Mayor facilidad de operación

Mayor complejidad de operación

Mayor tiempo de incubación Menor tiempo de incubación Las placas deben ser idénticas y de fondo plano

Los tubos deben ser de igual diámetro y espesor

Las placas deben prepararse en superficie nivelada

La medida del volumen del medio debe ser muy cuidadoso

El producto se debe difundir El corte de la incubación debe ser simultaneo

El producto no debe precipitarse ni evaporarse en el medio de cultivo

El producto debe solubilizarse

La muestra no debe dar turbidez ni color

No puede usarse microorganismos que forme aglomerados

La contaminación del tubo es criticaError subjetiva de lectura La medición de la respuesta es

objetiva

2.5. MICROORGANISMO

2.5.1 Micrococcus luteus

Los miembros del género Micrococcus son Cocos Grampositivos y se

encuentran en el ambiente y como flora transitoria en la piel del hombre y

varios mamíferos (Koneman, 2004). Aunque excepcionalmente pueden

12

causar infecciones como endocarditis o bacteriemia en huéspedes

susceptibles. (http://db.doyma.es/cgi- bin/wdbcgi.exe/doyma/mrevista.pdf?pident=13042871)

Algunas especies producen pigmentos carotenoides y las colonias de

estas especies son de color amarillo o rosa brillantes en los medios

sólidos. Ciertos especies de micrococos ha sido utilizadas en la industria

como microorganismos para ensayos biológicos destinados a la detección

de agentes antimicrobianos en comidas para animales, cosméticos y

líquidos corporales. (Koneman, 2004)

A fines de 1995 Stackebrandt. Col. Realizaron análisis de secuencias del

RNA ribosómico 16S de las nueve especies reconocidas de Micrococcus

y propusieron varios cambios en la taxonomia de estos microorganismos.

Según estos investigadores, Micrococcus luteus y Micrococcus lylae son

las únicas especies que permanecen en el género Micrococcus; M.roseus,

M.varians y M. kristinae pertenece al género Kocuria, como K. roseus, K.

varians y K. kristinae, respectivamente M. halobius, M: nishinoiyaensis y

M. sedentarius se ubican ahora en tres génros separados como

Nesterenkonia halobia, Kytococcus nishinomiyaensis y Dermacoccus

sedentarius, respectivamente M.agilis ha sido reclasificado en el género

Arthrobacter como A. agilis. (Koneman, 2004)

Figura4. Cuadro de métodos para la identificación de especies de

Micrococcus

13

Método Reacción Micrococcus

Producción de ácido a partir de glucosa en

anaerobiosis

Negativo

Lisostafina Resistente

Producción de ácido a partir de la glucosa en

anaerobiosis y en presencia de 0.4 µg/ml de

eritromicina

Negativo

Furazolidona Resistente

Prueba de Oxidasa modificada Positivo

Bacitracina (disco Taxo A de 0.0 4 U) Sensible

Cuadro tomado de: (Koneman, 2004)

Micrococcus luteus la disposición celular se encuentra en pares, tétradas,

cubos, grupos y es catalasa positivo; la pigmentación es color amarillo,

oxidasa positivo, Motilidad negativo, hidrólisis de gelatina (Koneman,

2004).

Micrococcus, como muchos otros géneros de Actinobacteria, pueden ser

catabolicamente versátiles, con la habilidad de utilizar un extenso rango

de substratos inusuales, tales como piridina, herbicidas, bifenilos

policlorados y petróleo (Doddamani HP. 2201)

Sinónimos de Micrococcus luteus 9341: Kocuria rhizophila (Jane S., 2003)

14

Figura 5. Micrococcus luteus Tomada : http://www.puc.cl/sw_educ/biologia/bio100/html/portadaMIval11.2.1.1.1.html

2.6 VALIDACIÓN

El control analítico de un producto farmacéutico o de los ingredientes

específicos del producto, es necesario para asegurar la inocuidad y

eficacia del producto durante todas las fases de su período de actividad,

incluyendo el almacenamiento, la distribución y el uso. Idealmente, dicha

vigilancia debe efectuarse de conformidad con especificaciones

establecidas y comprobadas durante la elaboración del producto. Con

esto se asegura que las especificaciones de calidad sean aplicables al

material farmacéutico usado para establecer las características biológicas

de las sustancias activas, como también a las formas farmacéuticas

comercializadas. Cuando se completa la evaluación biomédica del

producto, la aceptabilidad de todos los lotes subsiguientes será juzgada

exclusivamente sobre la base de esas especificaciones. (OMS, 1996)

El objetivo principal de la validación analítica es el de asegurar que un

procedimiento analítico seleccionado dará resultados reproducibles y

confiables que sean adecuados para el propósito previsto. De ahí que sea

necesario definir debidamente tanto las condiciones en que el

procedimiento ha de emplearse como el objetivo previsto para el mismo.

Estos principios se aplican a todos los procedimientos descritos en la

farmacopea y también a los procedimientos no incluidos en la farmacopea

pero que se utilizan en una fábrica.

Si bien estas pautas son aplicables a los procedimientos usados para

examinar atributos químicos y físico-químicos, muchas de ellas son

igualmente aplicables a los procedimientos microbiológicos y biológicos.

(OMS, 1996)

15

2.6.1 PARAMETROS DE CALIFICACION Y VALIDACION

2.6.1.1 CALIFICACIÓN DE INSTALACIÓN (IQ) Establecer por evidencia objetiva que todos los aspectos claves del

equipo de proceso y la instalación de sistemas auxiliares cumplen con las

especificaciones aprobadas del fabricante y las recomendaciones del

abastecedor del equipo son consideradas de manera apropiada (FDA,

2004)

2.6.1.2 CALIFICACIÓN OPERACIONAL (OQ) Establecer por medio de evidencia objetiva los límites de control de

proceso y los niveles de acción que resultan en un producto que cumpla

con todos los requerimientos predeterminados. (FDA, 2004)

2.6.1.3 CALIFICACIÓN DE DESEMPEÑO (PQ) Establecer por medio de evidencia objetiva que los procesos, bajo

condiciones anticipadas, producen de manera consistente un producto

que cumple con todos los requerimientos predeterminados (FDA, 2004)

2.6.2 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO

2.6.2.1 ESPECIFICIDAD La especificidad es la capacidad de evaluar de manera inequívoca el

analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta

previsible, como impurezas, productos de degradación y componentes de

matriz. La falta de especificidad de un procedimiento analítico individual

16

puede compensarse usando otros procedimientos analíticos

complementarios (USP 30)

2.6.2.2 SELECTIVIDAD La selectividad o especificidad de un procedimiento es la posibilidad de

que éste mida el analito en una forma que esté libre de interferencia de

parte de otros componentes de la muestra que se está examinando (por

ejemplo, impurezas provenientes de la fabricación o de la degradación, o

bien ingredientes que no sean el analito, sean farmacológicamente

activos o inertes). La selectividad (o la carencia de la misma) puede

expresarse en relación con el sesgo de los resultados analíticos obtenidos

cuando el procedimiento se aplica al analito en presencia de niveles

previstos de otros componentes, comparado con los resultados obtenidos

con el mismo analito sin sustancias agregadas. Cuando los demás

componentes son todos conocidos y están disponibles, la selectividad

puede determinarse mediante la comparación de los resultados analíticos

obtenidos con el analito, con o sin la adición de los materiales que pueden

interferir. Cuando dichos componentes no han sido identificados o no

están disponibles, a menudo puede medirse la selectividad determinando

la recuperación de una adición normal de analito puro a un material que

contenga un nivel constante de los otros componentes. (OMS, 1996)

2.6.2.3 LINEALIDAD Y ALCANCE La linealidad de un procedimiento analítico es la posibilidad de que éste

produzca resultados que sean directamente proporcionales a la

concentración de analito en la muestra. El alcance del procedimiento es

una expresión de los niveles más bajo y más alto de analito que, según se

haya demostrado, pueden ser determinables con precisión, exactitud, y

linealidad aceptables. Estas características son determinadas mediante la

aplicación del procedimiento a una serie de muestras que tienen

17

concentraciones de analito que cubren el alcance atribuido al

procedimiento. Cuando la relación entre la respuesta y la concentración

no es lineal, se puede lograr la normalización por medio de una curva de

calibración. (OMS, 1996)

2.6.2.4 PRECISIÓN La precisión del procedimiento es el grado de concordancia entre los

resultados de los análisis individuales. Se mide por la dispersión de los

resultados individuales de la media y usualmente se expresa como una

desviación patrón o como el coeficiente de variación (desviación patrón

relativa) cuando el procedimiento completo se aplica repetidas veces a

muestras separadas e idénticas, obtenidas del mismo lote de material

homogéneo. (OMS, 1996)

2.6.2.4.1 REPETIBILIDAD Es la precisión del procedimiento cuando es repetido por el mismo

analista bajo el mismo conjunto de condiciones (los mismos reactivos,

equipos, graduaciones, y laboratorio) y dentro de un lapso breve. La

repetibilidad de un procedimiento se evalúa efectuando determinaciones

completas y separadas, con muestras separadas e idénticas del mismo

lote de material homogéneo, y por lo tanto proporciona una medida de la

precisión del procedimiento bajo condiciones normales de operación.

(OMS, 1996)

2.6.2.4.2 REPRODUCIBILIDAD Es la precisión del procedimiento cuando se efectúa bajo condiciones

diferentes, usualmente en diferentes laboratorios, con muestras

supuestamente idénticas obtenidas del mismo lote de material

homogéneo. También se puede obtener información valiosa efectuando

comparaciones de los resultados obtenidos por distintos analistas,

mediante el uso de diferentes equipos, o llevando a cabo el análisis en

diferentes momentos. (OMS, 1996)

18

2.6.2.5 EXACTITUD La exactitud del procedimiento empleado consiste en la proximidad de los

resultados obtenidos al valor real. La exactitud puede determinarse

aplicando el procedimiento a las muestras del material a examinarse,

cuando han sido preparadas con exactitud cuantitativa. Siempre que sea

posible, esas muestras deben contener todos los componentes del

material, incluyendo el analito. Deben prepararse también muestras en las

que el analito haya sido incorporado en cantidades de aproximadamente

10% por encima y por debajo de la gama de valores prevista. También es

posible determinar la exactitud comparando los resultados con los

obtenidos empleando otro procedimiento ya comprobado. (OMS, 1996)

2.6.2.6 LÍMITE DE DETECCIÓN El límite de detección es el nivel más bajo de analito que pueda

detectarse, pero no necesariamente determinado en forma cuantitativa,

empleando un método específico bajo las condiciones experimenta les

exigidas. Dicho límite generalmente se expresa en términos de la

concentración de analito (por ejemplo, en microgramos por litro) en la

muestra. Cuando la medición final se basa en la lectura de un

instrumento, se deberá tener en cuenta la respuesta de fondo (la

proporción entre señal y ruido) (OMS, 1996)

2.6.2.7 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN El límite de cuantificación es la concentración más baja de analito en la

muestra, que puede ser determinada con precisión y exactitud aceptables

cuando se emplea el procedimiento exigido. Se mide mediante el análisis

de muestras que contengan cantidades conocidas de analito en

disminución, y la determinación del nivel más bajo al cual pueden

alcanzarse grados aceptables de exactitud y precisión. Cuando la

evaluación final se basa en la lectura instrumental, tal vez sea necesario

evaluar y tener en cuenta la magnitud de la respuesta de fondo (la

proporción entre señal y ruido). En muchos casos el límite de

19

cuantificación es aproximadamente el doble que el de detección. (OMS,

1996)

2.6.2.8 ROBUSTEZ La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad

para no resultar afectado por variaciones pequeñas pero deliberadas en

los parámetros enumerados en la documentación del procedimiento, y a la

vez, da una idea de su aptitud durante su uso normal. La robustez puede

determinarse durante la etapa de desarrollo del procedimiento analítico

(USP 30)

2.6.2.9 SENSIBILIDAD

La sensibilidad es la capacidad del procedimiento de prueba de registrar

pequeñas variaciones de la concentración. Es la inclinación de la curva de

calibración. Se debe evitar usar el término en forma más general, es decir,

abarcando límite de detección y/o límite de cuantificación. (OMS,1996)

2.6.3 TIPOS DE VALIDACION DEL PROCESO

2.6.3.1 VALIDACIÓN PROSPECTIVA Este tipo de validación se basa en información obtenida antes de

implantar el proceso de validación. Se realiza durante la etapa de

desarrollo, mediante un análisis de riesgos del proceso de producción,

que se divide en pasos individuales, estos se evalúan entonces a la luz de

la experiencia para determinar si podrían conducir a situaciones críticas;

se investigan posibles causas y se determina la probabilidad de que

suceda y su magnitud, se trazan los planes del ensayo y se fijan las

prioridades; a continuación se efectúan y se evalúan los ensayos y se

20

hace una valoración general; si los resultados son aceptables al final, el

proceso es satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se tienen que

modificar y mejorar hasta que una nueva validación demuestre su carácter

satisfactorio. Este tipo de validación es importante para limitar el riesgo de

errores que se producen a escala de producción, por ejemplo, en la

preparación de productos inyectables. (Comisión Europea, 2001)

2.6.3.2 VALIDACIÓN CONCURRENTE La información requerida en este tipo de validación se obtiene durante la

implementación del mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en

proceso de la variables críticas que demuestre que el proceso está bajo

control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en estado

productivo. (Comisión Europea, 2001)

2.6.3.3 VALIDACIÓN RETROSPECTIVA Este tipo de validación se lleva a cabo por medio de la revisión y análisis

de la información histórica del proceso. Se deben tomar como mínimo 20

a 30 lotes que cuenten con reportes analíticos sólidos y confiables,

documentación que muestre condiciones de los procesos y estudios de

reclamos de los productos, entre otros. Dentro de este tipo de validación

es necesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles

ambientales, controles microbiológicos, equipos, procedimientos, métodos

analíticos y especificaciones; es aplicada para productos que se

encuentran en el mercado y cuyo proceso de manufactura se considera

estable, además cuando por las características del producto,

económicamente no se justifica hacer una validación prospectiva. La

validación retrospectiva también puede ser útil en el establecimiento de

las prioridades en un programa de validación (Comisión Europea, 2001)

2.6.3.4 REVALIDACIÓN Es la repetición de un procedimiento de validación o una parte del mismo.

Esto no significa que el programa original deba ser repetido. Se aplica

21

cuando se presenta cambio de uno de los componentes críticos de la

formulación, cambio o reemplazo de una pieza crítica en un sistema o

equipo, cambio en instalaciones, cambio en tamaño del lote de fabricación

y por unidades producidas fuera de especificaciones en lotes

consecutivos.

La revalidación periódica se presenta cuando los procesos experimentan

cambios graduales, incluso si operarios experimentados trabajan

correctamente aplicando los métodos establecidos. De manera análoga,

el desgaste del equipo puede también causar cambios graduales. Por

consiguiente, es aconsejable realizar revalidación a intervalos

programados, incluso sin introducir cambios deliberados.

La decisión de implantar la revalidación periódica debe basarse

esencialmente en un examen de datos históricos, es decir, datos

producidos durante las pruebas del proceso de fabricación y del producto

terminado efectuadas después de la validación más reciente, con el

objetivo de verificar si el proceso está bien controlado. Al examinar esos

datos históricos se debe evaluar cualquier tendencia observada en los

datos compilados. (Comisión Europea, 2001)

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

El Control de Calidad es una estrategia para asegurar el mejoramiento

continuo de la calidad. Programa para asegurar la continua satisfacción

de los clientes externos e internos mediante el desarrollo permanente de

la calidad del producto y sus servicios.

Para el control de calidad en la elaboración de medicamentos en la

industria farmacéutica veterinaria es importante obtener medicamentos

seguros y reproducibles, para esto se debe realizar la validación de las

técnicas.

22

Al examinar los datos de validación de los métodos, se espera que los

datos para las pruebas repetitivas sean coherentes y que las diversas

concentraciones de las soluciones de prueba provean resultados lineales.

Tilosina es un principio activo que pertenece al grupo de los Macrólidos,

presentando acción bacteriostática sobre una amplia gama de patógenos

como Estafilococos, Estreptococos, Clostridios, Leptospiras, Chlamydas,

Diplococos, Bacilos, Mycoplasmas y es de gran interés solo a nivel

veterinario. (Adams, 2003)

Colombia es un país agropecuario donde la Tilosina es de gran interés en

el sector ganadería y/o pecuaria y se busca ofrecer calidad en los

productos ofrecidos, apoyando el bienestar animal.

El objetivo de este estudio es la validación microbiológica de la técnica

para la cuantificación de Tilosina, en una empresa que fabrica productos

farmacéuticos de uso veterinario.

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL Implementar y validar una técnica para la cuantificación de Tilosina,

mediante el método de Potencia recomendado según la United States

Pharmacopeia (USP)

23

4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Realizar la técnica de cuantificación de tilosina durante el proceso de

validación concurrente

• Validar la técnica de cuantificación de tilosina, producto en polvo,

alimento balanceado mediante el método de difusión en placa.

• Evaluar los parámetros y la efectividad del ensayo para el análisis

microbiológico de productos farmacéuticos, específicamente tilosina,

empleando una técnica de potencia

5. MATERIALES Y METODOS

5.1 MATERIALES

Cajas de Petri estériles desechables

Balones aforados

Pipetas graduadas y aforadas

Frascos Schott volumen 500 ml

Puntas estériles

Micropipeta 10-100 µl

Asa redonda

24

Tubo taparosca 16*100 mm

Beaker 100 mL

5.2 REACTIVOS

Metanol grado reactivo

Fosfato dibásico de potasio

Fosfato monobásico de potasio

Cloruro de sodio NaCl 0.9%

Acido fosforico 18 N

Hidroxido de potasio 10 N

5.3 MEDIO DE CULTIVO

Medio antibiótico N° 11

5.5 MICROORGANISMO

Micrococcus luteus ATCC 9341

5.6 EQUIPOS Incubadora 35°C +/- 3

Baño termostatado

Cabina Seguridad Biológica Clase II

Autoclave

Ultrasonido

Calibrador

25

6. METODOLOGÍA

26

Metodología

Repique M. luteus

ATCC 9341 (día anterior)

Bases (20 ml)

Inoculo 3 ml * 100ml Patrón Mac farland 25%

transmitancia

Medio antibiótico N° 11

Diluciones

Siembra

Incubación 16-18 horas

Lectura de halos

Preparación de la muestra -> ultrasonido

Preparación del estándar

27

6.1 PROCEDIMIENTO DE LA VALIDACION

6.1.1 PREPARACIÓN DEL MICROORGANISMO A partir de una cepa original en Loop realizar recuperación en agar

tripiticasa soya para poder realizar repique de la cepa M. luteus ATCC

9341, incubar por 24 horas y observar un crecimiento macroscópico de

color amarillo; no se debe realizar mas de tres pases de la cepa.

6.1.2 PREPARACIÓN DEL BUFFER Solución amortiguadora N 3 pH 8; Disolver 16.73 g de fosfato dibásico de

potasio y 0.523 de fosfato monobásico de potasio en 1000 mL de agua.

Ajustar el pH con ácido fosfórico 18N o Hidróxido de potasio 10N a 8.0 +/-

0.1

El diluyente a utilizar con la tilosina es una mezcla de proporción1:1 con

solución Buffer N 3 y metanol grado reactivo

6.1.3 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO El medio antibiótico N 11 contiene peptona, peptona de caseína, extracto

de levadura, extracto de carne, dextrosa y agar. El pH final de 8.0 +/- 0.2

Se agrega 30.5 g de medio a 1000mL de agua destilada en frasco schott

y someter a calor hasta ebullición y luego esterilizar en autoclave a 121°C

por 15 minutos

Para preparar las bases se hizo con Medio antibiótico N° 11 agregando a

cada caja 20 ml de medio con la ayuda de un beaker, y dejar solidificar

por 40 minutos.

28

6.1.4 INOCULO Se inoculó con 6 ml con pipeta; para realizar el inóculo se preparó con

solución salina al 0.9% la suspensión de microorganismo y se enfrento

con el patrón de Mc farland al 25% de transmitancia, luego se adicionó 3

ml de esta suspensión por cada 100 ml de Medio antibiótico N° 11,

homogenizar y se deja solidificar el inóculo mínimo por una hora. Sobre la

base previamente servida en la caja

6.1.5 PERFORACIÓN Y LECTURA Con ayuda del sacabocado se perforan las cajas, se realizan 6

perforaciones y se saca el residuo de agar con pinzas. Se marcan las

cajas y se realiza la siembra enfrentándolo con la concentración central de

trabajo, se agregó 100 µl en cada pozo. Luego se incubo por 16-18 horas

a 37°C, las cajas se incuban hacia arriba y después de este tiempo se

realizó la lectura de los halos de inhibición y se registro en el formato VI-

TC36-000F1

6.1.6 CONTROLES Los controles que se lleva durante los montajes son:

Control positivo: Caja inoculada con microorganismo

Control negativo: Caja sin inoculo

Control del montaje: se lleva con el estándar que esta en pozo intermedio

de cada concentración de trabajo.

29

6.2 MUESTRA DE TRABAJO Y ESTANDAR La forma farmacéutica de la muestra es en polvo, la concentración del

activo es 10g/100g, lote TF0H0072P y el porcentaje de aceptación es de

90-110%

El estándar fue tilosina fosfato lote E067067 fecha de expiración –Junio

08 Potencia: 901.8 UI/mg.

6.3 VALIDACIÓN Se realizó una validación de tipo concurrente debido a que la información

requerida se obtuvo durante la implementación de esta.

En la validación de la metodología de la técnica de cuantificación de

Tilosina se evaluaron los parámetros y los resultados obtenidos fueron

inicialmente analizados y almacenados en Excel y luego se analizaron

mediante un programa estadístico ”Validation Manager” versión: 2.20 L

serial : 054130077083

30

7. PARÁMETROS 7.1 GENERALIDADES Para los montajes de evaluación de los parámetros para el estándar se

pesa 25mg y se afora con metanol en un balón de 50ml, se toma una

alícuota de 2ml en un balón de 50ml y se afora con metanol y buffer pH 8

relación 1:1, luego de esta dilución se toma una alícuota de 4ml en un

balón de 50ml y se afora con metanol y buffer relación 1:1.

Para el montaje de la muestra se pesa 940mg en un balón de 50ml se

somete a ultrasonido, luego se toma 2ml en un balón de 100ml y de esta

ultima dilución se toma 1ml en un balón de 25ml, las diluciones de la

muestra se aforan con metanol y buffer pH 8 relación 1:1.

Aplica para especificidad, selectividad y precisión

7.2 ESPECIFICIDAD

Para comprobar la especificidad del método analítico se prepararon

muestras al 100% con el estándar y se realizó este análisis por triplicado.

La concentración seleccionada fue de 1.6UI/ml, siendo esta la

concentración central de trabajo.

El estándar la primera dilución se realiza con metanol grado reactivo y

luego las siguientes diluciones se realiza con metanol y Buffer pH 8 en

relación 1:1. Para la muestra las diluciones de trabajo se realizaron con

metanol y Buffer pH 8 en relación 1:1, además de esto, la muestra fue

sometida a ultrasonido por 15 minutos.

31

Tabla 1: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la Especificidad

ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI/mL

2 50 BPH8:MEOH

4 50

MUESTRA 940mg 50 1.6 UI/mL

2 100

1 25

BPH8:MEOH

7.3 SELECTIVIDAD Para verificar la selectividad del método analítico se prepararon muestras

al 100% y se realizaron los siguientes pasos

Se realizó el montaje de la muestra y además de este se realizo también

el análisis al excipiente “carrier”; con el fin de detectar posibles

interferencias, siendo este el placebo.

Se evaluó las posibles interferencias de metabolitos de degradación

sometiendo la molécula a condiciones de Temperatura, pH, fotolisis y

calor.

Para pH ácido se preparó una muestra para hidrólisis ácida empleando

HCL 1N y se sometió la muestra por una hora a temperatura de 60°C.

Para pH básico se preparó una muestra para hidrólisis básica empleando

NaOH 1N y se sometió en el horno la muestra por una hora a

temperatura de 60°C.

Para observar la degradación por acción de la luz se expuso la bajo luz

U.V por una semana a exposición solar.

Para la determinación térmica se realizó exponiendo la muestra a 60°C

por una hora

32

El estándar, la muestra y el placebo fueron sometidos en la última dilución

a cada una de las condiciones anteriormente mencionadas menos a

condición ultravioleta que fue la exposición antes de hacer las diluciones.

Tabla 2. Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la selectividad

ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL

2 50 BPH8:MEOH

4 50 BPH8:MEOH


2 100

1 25

BPH8:MEOH

7.4 LINEALIDAD DEL SISTEMA Para la linealidad del sistema se trabajaron 8 concentraciones (0.6, 1.0,

1.2, 1.4, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8 UI/ml) para manejar un rango de trabajo entre

el 80% y 120%; con esta linealidad se calculó pendiente e intercepto y así

se calcularon los demás parámetros de validación.

Se pesa 25 mg de estándar en un balón de 50ml y se afora con metanol

de esta dilución se toma una alícuota de 2ml en un balón de 50ml y se

afora con metanol y buffer pH 8 relación 1:1 de esta ultima dilución tomo

alícuotas de 3, 4, 5, 6, 7ml en Balones de 50ml y se afora con el

diluyente.

De la primera dilución del estándar se toma una alícuota de 3ml en un

balón de 50ml y de esta se toma una alícuota de 1ml en un balón de

50ml y se afora con el diluente.

33

Con la inicial dilución del estándar se toma una alícuota de 1ml en un

balón de 50ml, de esta dilución se toma alícuotas de 5 y 7ml en balones

de 50ml.

Tabla 3: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la linealidad del sistema

Estándar ≡ 25mg

50

2 50

3,0 4,0 5,0 6,0 7,0

50 50 50 50 50

1,2 1,6 2,0 2,4 2,8

C E F G H

Estándar ≡

25mg 50

25 50

3 50 1,0 50

1,0 5,0 7,0

50 50 50

0,6 1,0 1,4

A B D

34

7.5 LINEALIDAD DEL METODO En la linealidad del método, se realizó con el estándar más placebo

diferentes diluciones obteniendo 8 concentraciones (0.6, 1.0, 1.2, 1.4,

1.6, 2.0, 2.4, 2.8 UI/ml) para determinar la concentración de trabajo. Se le

adicionó 1 ml de placebo a cada concentración antes de aforar la última

dilución de cada concentración.

La dilución inicial se diluyo con metanol y las siguientes diluciones se

realizaron con metanol-Buffer pH 8 relación 1:1

Se pesa 25 mg de estándar en un balón de 50ml y se afora con metanol

de esta dilución se toma una alícuota de 2ml en un balón de 50ml y se

afora con metanol y buffer pH 8 relación 1:1 de esta ultima dilución tomo

alícuotas de 3, 4, 5, 6, 7ml en Balones de 50ml y se le agrega 1ml de

placebo y se afora con el diluyente.

De la primera dilución del estándar se toma una alícuota de 3ml en un

balón de 50ml y de esta se toma una alícuota de 1ml mas 1ml de placebo

en un balón de 50ml y se afora con el diluente.

Con la inicial dilución del estándar se toma una alícuota de 1ml en un

balón de 50ml, de esta dilución se toma alícuotas de 5 y 7ml en balones

de 50ml mas 1ml de placebo.

Para el placebo se pesa 940mg en un balón de 50ml de esta se toma una

alícuota de 2ml en un balón de 100ml y se afora con diluente.

35

Tabla 4: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la Linealidad del método

Estándar ≡ 25 50

2 50

3,0 +1ml

placebo

4,0 +1ml

placebo

5,0 +1ml

placebo

6,0 +1ml

placebo

7,0 +1ml

placebo

50 50 50 50 50

1,2 1,6 2,0 2,4 2,8

C E F G H

Estándar

≡ 25

50

25 50

3 50 1,0 50

1,0 +1ml

placebo

5,0+ 1ml

placebo

7,0 +1ml

placebo

50 50 50

0,6 1,0 1,4

A B D

36

PLACEBO 940 mg 50

2 100

7.6 PRECISION DEL MÉTODO

En la precisión del método se realizó por dos analistas en dos días

diferentes con la misma muestra.

Tabla 5: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la Precisión del método

ESTANDAR 25

50 MeOH

2 50 BPH8:MEOH 4 50 BPH8:MEOH

1.6 UI / mL


2 100

1 25

BPH8:MEOH

7.7 PRECISIÓN DEL SISTEMA Para la evaluación del parámetro precisión del sistema, se tomó 10 datos

de la concentración central del parámetro linealidad del sistema y se

sometió al tratamiento estadístico “Validation Manager”.

37

7.8 EXACTITUD Para la evaluación del parámetro de exactitud se realizó a diferentes

concentraciones con el estándar al 80, 100 y 120 % adicionando placebo

a la ultima dilución 1 ml. Para verificar el porcentaje de recuperación entre

97-103%.

Tabla 6: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en la Exactitud

MUESTRA 20 mg 50 MeOH 1.3 UI / mL

Concentración Al 80%

2

50 BPH8:MEOH

4 +1ml

placebo

50 BPH8:MEOH

Placebo 752 mg 50

2 100



2

50 BPH8:MEOH

4 +1ml

placebo

50 BPH8:MEOH

Placebo 940 mg 50

2 100



2

50 BPH8:MEOH

4 +1ml

placebo

50 BPH8:MEOH

Placebo 1.128mg 50

2 100

38

7.9 LÍMITE DE DETECCIÓN Para la evaluación del parámetro del límite de detección se realizó

diluciones desde 0.2 UI/ml hasta obtener la concentración de 0.6 UI/ml y

se enfrento con el estándar a una concentración de 1.6 UI / mL. En la

primera dilución se realizó con metanol y las siguientes con metanol y

buffer pH 8 relación 1:1.

Tabla 7: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en el Limite de detección.

ESTANDAR

25

50 MeOH 1.6 UI / mL


MUESTRA 25 50 MeOH 0.6 UI / mL


7.10LIMITE DE CUANTIFICACIÓN Para la evaluación de limite de cuantificación, se realizó el montaje a la

concentración de 0.8 UI/ml para la muestra enfrentándolo con el estándar

a concentración de 1.6 UI / mL, para verificar que esta es la concentración

mas diluida donde se puede cuantificar, en forma confiable el activo de

trabajo.

39

Tabla 8: Diluciones de las concentraciones que se trabajaron en el Limite de cuantificación

ESTANDAR

25 50

MeOH 1.6 UI / mL


MUESTRA 25 50 MeOH 0,8 UI / mL


40

8. RESULTADOS Y DISCUSION

8.1 ESPECIFICIDAD Tabla 9: Resultado del parámetro de especificidad

RESULTADO

M1 MUESTRA 10.6 g / 100g

M2 PLACEBO NO PRODUCE HALO

M3 DILUENTE NO PRODUCE HALO

Ver anexo N° 1.1

A partir de los resultados obtenidos, la técnica permite encontrar

respuesta en el activo de trabajo. El placebo y el diluente no afecta la

respuesta de la tilosina ya que no produce halo de inhibición demostrando

así que el halo de inhibición que se expresa es solo de la Tilosina.

8.2 SELECTIVIDAD

8.2.1 SELECTIVIDAD CONDICIÓN ÁCIDA Tabla 10: Resultado del porcentaje de degradación en el parámetro Selectividad en condición ácida

MUESTRA DEGRADACION

M1 ESTÁNDAR 32,4

M2 MUESTRA 44,2

M3 PLACEBO ----

Ver anexo N° 1.2.1

41

8.2.2 SELECTIVIDAD CONDICIÒN BÀSICA Tabla 11: Resultado del porcentaje de degradación en el parámetro Selectividad en condición básica

MUESTRA DEGRADACION

M1 ESTÁNDAR 96,1

M2 MUESTRA 95,9

M3 PLACEBO ----

Ver anexo N° 1.2.2

8.2.3 SELECTIVIDAD CONDICIÓN ULTRAVIOLETA Tabla 12: Resultado del porcentaje de degradación en el parámetro Selectividad en condición ultravioleta

MUESTRA DEGRADACION

M1 ESTÁNDAR 7,0

M2 MUESTRA 14,5

M3 PLACEBO ----

Ver anexo N° 1.2.3

8.2.4 SELECTIVIDAD CONDICIÓN TÉRMICA Tabla 13: Resultado del porcentaje de degradación en el parámetro Selectividad en condición térmica

MUESTRA DEGRADACION

M1 ESTÁNDAR 38,9

M2 MUESTRA 52,0

M3 PLACEBO ----

Ver anexo N° 1.2.4

42

En condición ácida el porcentaje de degradación del estándar fue del

32.4% y la muestra de 44.2% donde se observa que este que el principio

activo frente a condición ácida se ve afectada.

En condición básica el porcentaje de degradación del estándar fue del

96.1% y de la muestra del 95.9%, se observa que la molécula del principio

activo fue seriamente afectada.

En condición de calor el estándar tiene un porcentaje de degradación del

38.9 y la muestra de 52%; en condición de ultravioleta el estándar tiene

un porcentaje de degradación del 7% y la muestra del 14.5%.

El placebo frente a las diferentes condiciones no se vio afectado, como

era de esperarse no hubo halo de inhibición.

Estos resultados indican que el producto debe estar bien almacenado, no

debe estar bajo el sol y que la condición básica se va afectado en mayor

porcentaje que en los otro parámetros evaluados.

Tilosina es sensible a condiciones extremas de evaluación ya que a si sea

en muestra se encuentra una disminución del activo.

Las soluciones son estables durante 30 días a temperatura ambiente y a

un pH de 4 a 9. Por hidrólisis ácida (pH inferior 4) se descompone en dos

fracciones: el azúcar y la desmicosina, un producto microbiologicamente

activo que posee propiedades físico-químicas similares. Si prosigue el

desdoblamiento, se liberan los sacáridos neutros micarosa y micaminosa.

La tilosina conserva su estabilidad durante dos años en las condiciones

habituales de condicionamiento. (H. Trolldenier, 1980)

8.3 LINEALIDAD

8.3.1 LINEALIDAD DEL SISTEMA En la linealidad del sistema del principio activo tilosina fosfato, la ecuación

de la recta es y=0.094x -1.209 con un coeficiente de correlación o r2 de

0.996.

43

Se encuentra en proporcionalidad entre la concentración de trabajo y el

diámetro del halo, es decir es directamente proporcional la concentración

al halo.

La linealidad del sistema es la curva patrón para la evaluación de los

parámetros de validación.

Ver anexo N° 1.3

8.3.2 LINEALIDAD DEL MÈTODO El coeficiente de correlación obtenido es el índice estadístico que mide la

relación lineal entre las dos variables cuantitativas (log de concentración y

diámetro). Este mide la correlación entre la variable dependiente xi

(Diámetro halo) y una variable independiente yi (Log de concentración),

El coeficiente de correlación obtenido es cercano a 1 existiendo una

correlación positiva. El índice indica que existe una dependencia total

entre las dos variables denominada relación directa: cuando el halo tiene

un mayor diámetro (mm) la concentración (UI/ml) del principio activo es

mayor, es decir cuando una de las variables aumenta, la otra también lo

hace en idéntica proporción. (Reyes Aguero C., 2007).

El parámetro de aceptación va desde 0.95 el coeficiente de correlación.

La linealidad del método de tilosina con el estándar la ecuación de la recta

es y=0.121x-1.581 donde la pendiente es 0.121 y el coeficiente de

correlación r2 = 0.957 y este esta dentro de la especificación.

Se encuentra una respuesta lineal ya que hay proporcionalidad entre la

concentración de trabajo y la respuesta del halo.

Ver anexo N° 1.4

44

8.4 PRECISIÓN

8.4.1 PRECISIÓN DEL MÉTODO

8.4.1.1 PRECISIÓN DÍA 1 ANALISTA 1

Tabla 14: Resultados del parámetro precisión día 1, analista 1

MUESTRAS

M1 M2 M3

Diámetro 15,00 15,15 14,78

Concentración (UI/ml) 1,5933 1,6432 1,5192

Log (Concentración) 0,202 0,216 0,182

Cantidad Muestra (mg) 940,8 940,7 941,4

g tilosina /100 g 10,6 10,9 10,1

Potencia Promedio 10,53

% 105,3

Ver anexo N° 1.5.1

8.4.1.2 PRECISIÓN DIA 1 ANALISTA 2 Tabla 15: Resultados del parámetro precisión día 1, analista 2

MUESTRAS

M1 M2 M3

Diámetro 14,79 14,69 14,76




g tilosina /100 g 10,1 9,9 10,0


% 100,1

Ver anexo N° 1.5.2

45


MUESTRAS

M1 M2 M3

Diámetro 14,58 14,50 14,66




g tilosina /100 g 9,7 9,5 9,8


% 96,6

Ver anexo N° 1.5.3


MUESTRAS

M1 M2 M3

Diámetro 15,08 14,56 14,62




g tilosina /100 g 10,8 9,6 9,7


% 100,4

Ver anexo N° 1.5.4

Coeficiente de variación de repetitibilidad Especificación max.: 5.00

3.98

46

La precisión del procedimiento es el grado de concordancia entre los

resultados de los análisis individuales.

Se observó en la precisión del método en el analista 1 en los dos días se

obtiene el 105,3 % y 96,6 % , para el analista 2 se obtuvo 100,1% y

100,4% , proporcionándonos un coeficiente de variación de repetibilidad

de 3.98 y un coeficiente de variación de precisión de 4.81 con una

especificación máxima de 5; indicándonos que el método cumple para

repetibilidad (es la precisión del procedimiento cuando es repetido por el

mismo analista bajo el mismo conjunto de condiciones los mismos

reactivos, equipos, graduaciones, y laboratorio y dentro de un lapso

breve) y reproducibilidad (efectuando comparaciones de los resultados

obtenidos por distintos analistas, llevando a cabo el análisis en diferentes

momentos) (OMS, 1996)

8.5 EXACTITUD

8.5.1 EXACTITUD CONCENTRACION 80% Tabla 18: Resultados del parámetro Exactitud al 80%

MUESTRAS

M1 M2 M3

Diámetro 14,30 13,63 13,96

Concentración (UI/ml) recup 1,3678 1,1838 1,2700


Cantidad Muestra mg 22,7 20,3 21,8

UI reales / mg 1,3 1,2 1,3

Porcentaje Recuperado % 104 101 101

Porcentaje % 102,1

Ver anexo N° 1.6.1

Coeficiente de variación de la precisión intermedia Especificación máx.: 5.00

4.81

47

8.5.2 EXACTITUD CONCENTRACION AL 100% Tabla 19: Resultados del parámetro Exactitud al 100%

MUESTRAS

M1 M2 M3

Diámetro 14,62 14,52 14,56

Concentración (UI/ml)

recuperada 1,4674 1,4356 1,4463



UI reales / mg 1,4 1,5 1,5


Porcentaje % 98,7

Ver anexo N° 1.6.2

8.5.3 EXACTITUD CONCENTRACION AL 120% Tabla 20: Resultados del parámetro Exactitud al 120%

MUESTRAS

M1 M2 M3

Diámetro 15,28 15,96 15,28

Concentración (UI/ml)

recuperada 1,6918 1,9594 1,6909



UI reales / mg 1,7 1,8 1,7


Porcentaje % 99,2

Ver anexo N° 1.6.3

48

La exactitud del procedimiento empleado consiste en la proximidad de los

resultados obtenidos al valor real (OMS,1996)

La especificación para la exactitud, el porcentaje de recuperación debe

estar entre los limites 97%-103% El porcentaje de recuperación al 80, 100 y 120% fue cercano al 100%,

esta dentro del rango permitido, esto indica que la técnica es exacta

dando valores reales al momento de trabajar.

8.6 LIMITES

8.6.1 LIMITE DE DETECCIÓN Tabla 21: Resultados del parámetro Limite de Detección

MUESTRAS CONCENT RESULTADO

M1 ST 0.2 UI / mL

No se detecta halo de

inhibición

M2 ST 0.4 UI / mL

No se detecta halo de

inhibición

M3 ST 0.6 UI / mL Se detecta halo de inhibición

Ver anexo N°1.7

El límite de detección es el nivel más bajo de analito que pueda

detectarse, pero no necesariamente determinado en forma cuantitativa,

empleando un método específico bajo las condiciones experimenta les

exigidas (OMS, 1996) El limite de detección se determinó a partir de la concentración de 0.6 UI/

mL esta es la mínima concentración donde se detecta y se observa halo

de inhibición.

El límite de detección por no ser un parámetro que pueda ser sometido a

programa debe hacerse en forma experimental para poder establecer en

donde no se puede encontrar halo de inhibición

49

8.6.2 LIMITE DE CUANTIFICACIÓN Tabla 22: Resultados del parámetro Limite de cuantificación

MUESTRAS

M1 M2 M3

Diámetro 11,90 12,09 12,08


Log (Concentración) -0,089 -0,072 -0,073


UI reales / mg 0,8 0,8 0,8

Porcentaje Recuperado% 103 106 108

Porcentaje % 105,9

MUESTRAS

M1 M2 M3

Diámetro 12,03 11,97 11,81


Log (Concentración) -0,078 -0,084 -0,098


UI reales / mg 0,8 0,8 0,8

Porcentaje Recuperado% 105 104 101

Porcentaje % 103,1

El límite de cuantificación es la concentración más baja de analito en la

muestra, que puede ser determinada con precisión y exactitud aceptables

cuando se emplea el procedimiento exigido. En muchos casos el límite de

cuantificación es aproximadamente el doble que el de detección (OMS,

1996)

50

El límite de cuantificación fue de 0.8 UI/mL Se confirma que la

concentración es exacta y cuantificable porque arrojó resultados

coherentes y confiables.

Ver anexo N° 1.8

CONCLUSIONES

51

Se estandarizó la técnica para la cuantificación del principio activo

tilosina Se valido la técnica de cuantificación de tilosina en un producto en

polvo. Se evidenció que el principio activo frente a condiciones de calor,

ultravioleta y ácidos es susceptible la tilosina y en condición básica

supera el 95% de degradación. Los parámetros críticos para la validación microbiológica de la

técnica es selectividad y precisión Se demostró que la técnica difusión en agar mediante la técnica de

potencia funciona para la validación de la técnica de cuantificación

de tilosina. La linealidad por ser parámetro fundamental ya que a partir de este

se calculan los otro parámetro, debe manejarse con valores

aceptables como por ejemplo el r2 superior a 0.95. Cuando cambie su composición o fabricación del Tifomix se

recomienda hacer revalidación de la técnica de cuantificación de

tilosina.

BIBLIOFRAFIA

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Revisión: 21 Febrero de 2007.

55

ANEXOS

1. RESULTADOS EN EXCEL

1.1 ESPECIFICIDAD TIFOMIX

ACTIVO Tilosina Fosfato Concentración 10 g / 100g Lote TF0H0072P Nº Análisis P012

ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 940mg 50 1.6 UI/mL

2 50 BPH8 2 100 4 50 BPH8 1 25 BPH8

Muestras Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio correlación

S3 16,74 15,53 15,72 15,34 16,11 16,06 15,35 16,02 15,03 15,77 MUESTRA 15,59 16,14 15,61 14,90 16,45 14,95 15,19 16,10 15,59 15,61 15,00 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 16,97 18,83 15,71 15,41 16,28 15,34 14,98 13,96 14,52 15,78 PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 DILUENTE --- --- --- --- --- --- --- --- ---

MUESTRAS DATOS ESTANDAR MUESTRA PLACEBO DILUENTE Peso (mg) 27,7

Diámetro 15,00 Potencia (P) UI/mg 901,8 Concentración (UI/ml) 1,5933 Fecha de vencimiento Jun-08 Log (Concentración) 0,202 Lote E0607067 Cantidad Muestra (mg) 940,8 DATOS g tilosina /100 g 10,6 Pendiente 0,0941 Intercepto -1,2096 Factor de Dilución (D) 6250

RESULTADO M1 MUESTRA 10.6 g / 100g M2 PLACEBO ---

M3 DILUENTE ---

56

1.2SELECTIVIDAD

1.2.1 SELECTIVIDAD CONDICIÓN ÁCIDA Concentración 10 g / 100g Lote TF0H0072P Nº Análisis P012

ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 940mg 50

2 50 BPH8 2 100 4 50 BPH8 1 Muestras Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 18,10 15,50 17,35 18,24 16,58 16,00 16,70 20,81 16,83 17,11ESTANDAR 15,47 14,64 16,85 14,51 14,21 15,08 15,89 14,53 15,34 15,17 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 16,84 16,18 16,90 16,29 16,18 18,00 17,94 13,27 15,28 16,52MUESTRA 13,69 13,99 13,87 12,94 13,40 12,76 12,16 12,71 15,11 13,40 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 16,97 18,83 15,71 15,41 16,28 15,34 14,98 13,96 14,52 15,78PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- ---

MUESTRAS DATOS ESTANDAR ESTANDAR MUESTRA PLACEBO Peso (mg) 27,7

Diámetro 13,21 12,05 Potencia (P) UI/mg 901,8Concentración (UI/ml) recuperada 1,0806 0,8392

Fecha de vencimiento Jun-08

Log (Concentración) 0,034 -0,076 Lote E0607067Cantidad Muestra mg 27,7 940,0 DATOS UI reales / mg 1,6 5,6 Pendiente 0,0941Porcentaje % 68 56 Intercepto -1,2096 Factor de Dilución (D) 6250

MUESTRA DEGRADACION M1 ESTÁNDAR 32,4 M2 MUESTRA 44,2

M3 PLACEBO ----

57

1.2.2 SELECTIVIDAD CONDICIÓN BÁSICA ACTIVO Tilosina Fosfato

Concentración 10 g / 100g Lote TF0H0072P Nº Análisis P012 ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 940mg 50 1.6 UI/mL 2 50 BPH8 2 100 4 50 BPH8 1 25 BPH8

Muestras

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 18,34 16,18 15,96 16,08 17,26 15,18 16,94 17,97 16,31 16,69 ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 15,44 15,56 16,81 14,09 16,70 15,58 17,73 16,84 17,38 16,24 MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- --- Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 16,91 16,49 14,98 16,39 15,87 16,51 14,08 14,45 14,93 15,62 PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- ---


Diámetro 0,00 0,00 Potencia (P) UI/mg 901,8

Concentración (UI/ml) recuperada 0,0617 0,0617 Fecha de vencimiento Jun-08

Log (Concentración) -1,210 -1,210 Lote E0607067 Cantidad Muestra mg 27,7 940,0 DATOS UI reales / mg 1,6 0 Pendiente 0,0941 Porcentaje 3,9 4,1 Intercepto -1,2096 Factor de Dilución (D) 6250

MUESTRA DEGRADACION

M1 ESTÁNDAR 96,1

M2 MUESTRA 95,9

M3 PLACEBO ----

58

1.2.3 SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA ACTIVO Tilosina Fosfato

Concentración 10 g / 100g Lote TF0H0072P Nº Análisis P012 ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 940mg 50 2 50 BPH8 2 100 4 50 BPH8 1 Muestras Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 16,12 13,91 14,52 13,56 15,65 14,42 14,59 15,96 14,38 14,78ESTANDAR 14,57 13,70 15,33 13,83 14,93 13,38 14,25 14,66 14,07 14,30 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 14,95 13,97 14,37 13,25 15,13 14,82 15,48 14,92 13,63 14,49MUESTRA 13,99 14,43 13,62 14,09 15,59 14,05 16,13 15,04 15,39 14,70 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 14,57 13,70 15,33 13,83 14,93 13,38 14,25 14,66 14,07 14,30PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- ---


Diámetro 14,68 14,01 Potencia (P) UI/mg 901,8Concentración (UI/ml) recuperada 1,4865 1,2859 Fecha de vencimiento Jun-08Log (Concentración) 0,172 0,109 Lote E0607067Cantidad Muestra mg 27,7 940,2 940,1 DATOS UI reales / mg 1,6 8,5 Pendiente 0,0941Porcentaje % 93 85 Intercepto -1,2096 Factor de Dilución (D) 6250

MUESTRA DEGRADACION

M1 ESTÁNDAR 7,0

M2 MUESTRA 14,5 M3 PLACEBO ----

59

1.2.4 SELECTIVIDAD CONDICIÓN TÉRMICA ACTIVO Tilosina Fosfato

Concentración 10 g / 100g Lote TF0H0072P Nº Análisis P012


2 50 BPH8 2 100 4 50 BPH8 1 25 BPH8 Muestras

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio correlación

S3 16,85 16,60 16,93 15,85 17,12 16,65 17,53 16,83 17,53 16,69 ESTANDAR 14,44 12,66 14,99 14,12 13,85 14,31 13,95 14,17 14,40 14,28 12,75 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 15,86 16,93 16,91 17,02 17,10 17,97 16,15 15,86 16,29 16,91 MUESTRA 12,38 12,27 11,86 13,82 13,74 14,59 13,41 12,79 --- 13,11 11,36 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 16,88 16,91 15,14 16,65 15,91 14,59 14,98 13,96 14,52 15,50 PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- ---


Diámetro 12,75 11,36 Potencia (P) UI/mg 901,8

Concentración (UI/ml) recuperada 0,9769 0,7226 Fecha de vencimiento Jun-08

Log (Concentración) -0,010 -0,141 Lote E0607067 Cantidad Muestra mg 27,7 940,0 DATOS UI reales / mg 1,6 4,8 Pendiente 0,0941 Porcentaje % 61 48 Intercepto -1,2096 Factor de Dilución (D) 6250

MUESTRA DEGRADACION

M1 ESTÁNDAR 38,9

M2 MUESTRA 52,0 M3 PLACEBO ----

60

1.3 LINEALIDAD DEL SISTEMA TIFOMIX

LINEALIDAD SISTEMA TILOSINA ACTIVO Tilosina Fosfato

Concentración 10 g / 100g Lote TF0H0072P Nº Análisis P012 Fecha 07 11 07

Curva Estándar

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total PromedioPromedio corr.

S3- C 15,37 16,55 14,59 14,99 14,14 14,30 15,75 16,30 14,44 136,43 15,16 S1 - A 10,39 11,51 10,97 10,19 10,60 10,44 10,05 10,16 10,00 94,31 10,48 10,48S3- C 14,20 16,10 14,44 14,53 14,42 15,21 15,73 15,32 14,43 134,38 14,93 S2 - B 12,55 12,50 11,61 12,28 12,09 12,98 13,66 12,77 13,40 113,84 12,65 12,88S3- C 15,09 15,57 14,65 15,32 13,84 15,88 13,99 15,86 14,45 134,65 14,96 S4 - D 14,99 13,88 13,10 13,07 12,27 14,78 13,67 14,54 12,09 122,39 13,60 13,80S3- C 13,71 13,88 15,29 14,48 13,92 15,31 16,42 15,02 16,42 134,45 14,94 S4 - E 12,67 14,50 13,92 13,15 13,49 13,69 14,64 14,92 15,66 126,64 14,07 14,29S3- C 15,30 15,40 15,66 16,47 17,66 15,11 14,58 15,99 16,20 142,37 15,82 S5- F 16,73 16,84 15,86 17,85 16,15 14,82 16,68 16,77 15,96 147,66 16,41 15,75

S3- C 14,21 16,25 16,11 17,49 15,11 15,73 14,90 15,63

14.97 140,40 15,60 S6 - G 19,69 19,18 16,57 17,11 16,46 18,00 16,06 16,97 17,03 157,07 17,45 17,01S3- C 16,39 16,41 13,99 14,11 14,77 14,55 14,36 14,51 13,16 132,25 14,69 S7 - H 18,02 18,50 16,51 17,36 16,66 17,62 16,60 17,61 15,36 154,24 17,14 17,60

X S 15,16

CURVA ESTANDAR DATOS ESTANDAR

Puntos Diámetro ConcentraciónLog

(Conc.) Peso (mg) 27,7 (mg/ml) Potencia (P) UI/mg 901,8

S1 10,48 0,60 -0,2222 Fecha de vencimiento Jun-08

S2 12,88 1,00 -0,0004 Lote E0607067 S3 13,80 1,20 0,0788 S4 14,29 1,40 0,1458 S5 15,16 1,60 0,2038 S6 15,75 2,00 0,3007 S7 17,01 2,40 0,3799

S8 17,60 2,80 0,4468

61

CURVA CALIBRACION TILOSINALINEALIDAD SISTEMA

y = 0,0941x - 1,2096R2 = 0,996

-0,3000

-0,2000

-0,1000

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00 16,00 17,00 18,00 19,00

Halo (mm)

Log.

Con

cent

raci

ón

62

1.4 LINEALIDAD DEL MÉTODO TIFOMIX

LINEALIDAD METODO TILOSINA ACTIVO Tilosina Fosfato

Concentración 10 g / 100g Lote TF0H0072P

Nº Análisis P012 Fecha 07 09 11

Curva Estándar Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total Promedio Promedio corr. S3- C 14,59 14,23 13,93 14,03 13,03 14,31 13,27 13,75 14,09 125,23 13,91 S1 - A 12,91 12,85 12,68 11,25 12,29 13,04 12,25 12,91 11,94 112,12 12,46 12,77S3- C 12,29 14,14 15,91 13,21 14,03 15,34 15,91 13,89 13,75 128,47 14,27 S2 - B 12,80 14,91 14,63 12,82 14,69 14,65 14,91 13,61 14,53 127,55 14,17 14,12S3- C 14,43 12,89 14,40 15,08 13,60 15,05 15,45 14,18 16,14 131,22 14,58 S4 - D 13,11 13,18 14,35 14,40 13,42 15,12 14,28 13,92 15,00 126,78 14,09 13,73S3- C 14,17 14,03 15,61 12,49 14,72 14,70 14,78 15,35 15,26 131,11 14,57 S4 - E 15,31 15,70 16,10 14,70 16,20 14,94 14,23 15,05 16,01 138,24 15,36 15,01S3- C 13,40 13,88 14,56 13,11 13,91 14,55 15,18 13,52 13,31 125,42 13,94 S5- F 14,82 16,82 15,59 15,00 16,40 14,92 16,11 14,06 16,70 140,42 15,60 15,89

S3- C 14,66 13,12 14,68 15,07 13,00 15,35 13,70 13,26

13,72 126,56 14,06 S6 - G 15,44 16,34 16,98 16,90 15,49 17,01 17,38 16,92 16,74 149,20 16,58 16,74

X S 14,22

CURVA ESTANDAR DATOS ESTANDAR Puntos Diámetro Concentración Log (Conc.) Peso (mg) 27,7

(mg/ml) Potencia (P) UI/mg 901,8 S1 12,77 1,0 -0,0004 Fecha de vencimiento Jun-08 S2 14,12 1,2 0,0788 Lote E0607067 S3 13,73 1,4 S4 15,01 1,6 0,2038 S5 14,22 2,0 S6 15,89 2,4 0,3799 S7 16,74 2,8 0,4468

63

CURVA CALIBRACION TILOSINA LINEALIDAD DEL METODO

y = 0,121x - 1,5818R2 = 0,9577

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

11 12 13 14 15 16 17 18

Halo (mm)

Log.

Con

cent

raci

ón

64

1.5 PRECISION DEL METODO

1.5.1 PRECISION DIA 1 ANALISTA 1 TIFOMIX

ACTIVO Tilosina Fosfato

Concentración 10 g / 100g Lote TF0H0072P Nº Análisis P012 Fecha


2 50 BPH8 2 100 4 50 BPH8 1 25 BPH8

Muestras

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr S3 16,74 15,53 15,72 15,34 16,11 16,06 15,35 16,02 15,03 15,77 M1 15,59 16,14 15,61 14,90 16,45 14,95 15,19 16,10 15,59 15,61 15,00 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 14,57 15,48 16,14 15,96 16,05 15,55 15,89 16,08 16,17 15,77 M2 14,98 16,33 15,66 16,11 15,56 15,16 15,73 16,16 16,10 15,75 15,15 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 15,87 16,24 15,05 15,89 15,90 15,58 15,69 15,19 16,03 15,72 M3 15,59 15,65 14,84 15,33 15,22 15,13 15,27 15,55 15,50 15,34 14,78

MUESTRAS DATOS ESTANDAR M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7

Diámetro 15,00 15,15 14,78 Potencia (P) UI/mg 901,8

Concentración (UI/ml) 1,5933 1,6432 1,5192 Fecha de vencimiento Jun-08

Log (Concentración) 0,202 0,216 0,182 Lote E0607067 Cantidad Muestra (mg) 940,8 940,7 941,4 DATOS g tilosina /100 g 10,6 10,9 10,1 Pendiente 0,0941 Potencia Promedio 10,53 Intercepto -1,2096 % 105,3 Factor de Dilución (D) 6250

65

1.5.2 PRECISION DIA 1 ANALISTA 2



ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 940mg 50 1.6 UI/mL 2 50 BPH8 2 100 4 50 BPH8 1 25 BPH8

Muestras Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr S3 16,04 16,40 15,23 15,44 16,11 15,98 16,32 15,88 15,23 15,85 M1 16,38 15,41 15,21 15,33 15,48 15,17 15,89 14,59 15,83 15,48 14,79 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 15,84 15,12 15,56 15,72 15,17 15,62 16,08 15,04 15,37 15,50 M2 15,12 15,38 15,22 14,77 15,01 15,91 14,38 14,68 14,83 15,03 14,69 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 15,75 15,56 15,15 15,66 16,32 15,56 15,21 15,86 16,12 15,69 M3 15,07 14,74 15,48 16,30 15,74 14,69 15,02 15,83 14,72 15,29 14,76


Diámetro 14,79 14,69 14,76 Potencia (P) UI/mg 901,8 Concentración (UI/ml) 1,5199 1,4880 1,5104 Fecha de vencimiento Jun-08 Log (Concentración) 0,182 0,173 0,179 Lote E0607067 Cantidad Muestra (mg) 940,4 940,0 940,1 DATOS g tilosina /100 g 10,1 9,9 10,0 Pendiente 0,0941 Potencia Promedio 10,0 Intercepto -1,2096 % 100,1 Factor de Dilución (D) 6250

66


ACTIVO Tilosina Fosfato Concentración 10 g / 100g Lote TF0H0072P Nº Análisis P012 Fecha ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 940mg 50 1.6 UI/mL 2 50 BPH8 2 100 4 50 BPH8 1 25 BPH8 Muestras

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr

S3 13,94 14,84 16,42 14,16 15,29 15,42 14,61 16,74 15,12 15,17 M1 13,46 15,57 14,15 13,85 16,57 13,51 14,94 15,44 13,86 14,59 14,58 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 14,16 14,50 14,12 15,21 15,22 13,13 15,65 15,06 13,67 14,52 M2 14,28 14,29 15,25 13,99 12,69 14,30 14,55 12,12 13,32 13,87 14,50 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 15,44 14,09 13,88 15,82 16,08 15,37 14,64 13,88 15,96 15,02 M3 14,94 12,08 14,05 15,65 16,19 14,87 13,53 15,63 13,72 14,52 14,66 MUESTRAS DATOS ESTANDAR M1 M2 M3 Peso (mg) 27,7 Diámetro 14,58 14,50 14,66 Potencia (P) UI/mg 901,8 Concentración (UI/ml) 1,4537 1,4280 1,4780 Fecha de vencimiento Jun-08 Log (Concentración) 0,162 0,155 0,170 Lote E0607067 Cantidad Muestra (mg) 940,3 940,5 940,0 DATOS g tilosina /100 g 9,7 9,5 9,8 Pendiente 0,0941 Potencia Promedio 9,66 Intercepto -1,2096 % 96,6 Factor de Dilución (D) 6250

67




ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 940mg 50 1.6 UI/mL 2 50 BPH8 2 100 4 50 BPH8 1 25 BPH8

Muestras Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr S3 14,36 14,73 15,24 15,86 14,36 15,58 14,17 15,16 14,46 14,88 M1 13,94 14,26 14,79 14,53 15,27 15,36 15,62 14,99 14,45 14,80 15,08 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 15,52 13,49 15,92 14,27 13,23 15,76 15,40 14,36 14,19 14,68 M2 14,44 13,56 14,14 13,81 13,78 14,35 14,76 13,22 14,66 14,08 14,56 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 14,51 14,58 15,61 15,35 13,91 13,76 14,07 14,92 14,71 14,60 M3 13,13 14,22 15,44 14,43 12,96 14,08 14,37 14,74 13,24 14,07 14,62


Diámetro 15,08 14,56 14,62 Potencia (P) UI/mg 901,8 Concentración (UI/ml) 1,6192 1,4456 1,4670 Fecha de vencimiento Jun-08 Log (Concentración) 0,209 0,160 0,166 Lote E0607067 Cantidad Muestra (mg) 940,4 940,5 940,8 DATOS g tilosina /100 g 10,8 9,6 9,7 Pendiente 0,0941 Potencia Promedio 10,04 Intercepto -1,2096 % 100,4 Factor de Dilución (D) 6250

68

1.6 EXACTITUD

1.6.1 EXACTITUD AL 80%



ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 20 50 MeOH 1.3 UI / mL

2 50 BPH8 2 50 BPH8 4 50 BPH8 4 50 BPH8

Muestras



Diámetro 14,30 13,63 13,96 Potencia (P) UI/mg 901,8 Concentración (UI/ml) recup 1,3678 1,1838 1,2700 Fecha de vencimiento Jun-08 Log (Concentración) 0,136 0,073 0,104 Lote E0607067 Cantidad Muestra mg 22,7 20,3 21,8 DATOS UI reales / mg 1,3 1,2 1,3 Pendiente 0,0941 Porcentaje Recuperado% 104 101 101 Intercepto -1,2096 Porcentaje % 102,1 Factor de Dilución (D) ---

69




ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 25 50 MeOH

1.6 UI / mL

2 50 BPH8 2 50 BPH8 4 50 BPH8 4 50 BPH8

Muestras



Diámetro 14,62 14,52 14,56 Potencia (P) UI/mg 901,8 Concentración (UI/ml) recuperada 1,4674 1,4356 1,4463 Fecha de vencimiento Jun-08 Log (Concentración) 0,167 0,157 0,160 Lote E0607067 Cantidad Muestra mg 25,1 25,7 25,6 DATOS UI reales / mg 1,4 1,5 1,5 Pendiente 0,0941 Porcentaje Recuperado% 101 97 98 Intercepto -1,2096 Porcentaje % 98,7 Factor de Dilución (D) ---

70





1.9 UI / mL

2 50 BPH8 2 50 BPH8 4 50 BPH8 4 50 BPH8

Muestras



Diámetro 15,28 15,96 15,28 Potencia (P) UI/mg 901,8 Concentración (UI/ml) recuperada 1,6918 1,9594 1,6909 Fecha de vencimiento Jun-08 Log (Concentración) 0,228 0,292 0,228 Lote E0607067 Cantidad Muestra mg 30,0 30,7 30,3 DATOS UI reales / mg 1,7 1,8 1,7 Pendiente 0,0941 Porcentaje Recuperado% 98 103 97 Intercepto -1,2096 Porcentaje % 99,2 Factor de Dilución (D) ---

71

1.7 LIMITE DE DETECCIÓN ACTIVO Tilosina Fosfato



0.6 UI / mL

2 50 BPH8 3 50 BPH8 4 50 BPH8 1 50 BPH8

Muestras

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr S3 13,35 13,99 13,65 16,02 15,86 14,34 14,37 13,96 14,68 14,28 0,2 UI / mL --- --- --- --- --- --- --- --- --- Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 13,07 14,48 13,60 14,11 14,24 14,37 13,79 13,44 14,18 13,92 0,4 UI / mL --- --- --- --- --- --- --- --- --- Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio S3 13,98 13,93 13,51 13,55 13,85 13,24 13,09 13,78 13,44 13,60 0,6 UI / mL 8,88 8,81 8,96 8,86 9,01 9,13 8,94 8,87 8,98 8,94 10,50

MUESTRAS DATOS ESTANDAR 0,2 0,4 0,6 Peso (mg) 27,7

Diámetro 10,50 Potencia (P) UI/mg 901,8 Concentración (UI/ml) recup 0,6002 Fecha de vencimiento Jun-08 Log (Concentración) -0,222 Lote E0607067 Cantidad Muestra mg 27,7 DATOS UI reales / mg 0,6 Pendiente 0,0941 Intercepto -1,2096 Factor de Dilución (D) ---

72

1.8 LIMITE DE CUANTIFICACION ACTIVO Tilosina Fosfato



0,8 UI / mL

2 50 BPH8 4 50 BPH8 4 50 BPH8 1 50 BPH8

Muestras



Diámetro 11,90 12,09 12,08 Potencia (P) UI/mg 901,8 Concentración (UI/ml) recup 0,8139 0,8465 0,8457 Fecha de vencimiento Jun-08 Log (Concentración) -0,089 -0,072 -0,073 Lote E0607067 Cantidad Muestra mg 27,3 27,6 27,1 DATOS UI reales / mg 0,8 0,8 0,8 Pendiente 0,0941 Porcentaje Recuperado% 103 106 108 Intercepto -1,2096 Porcentaje % 105,9 Factor de Dilución (D) ---

73

LIMITE DE CUANTIFICACION ACTIVO Tilosina Fosfato


ESTANDAR 25 50 MeOH 1.6 UI / mL MUESTRA 25 50 MeOH 0,8 UI / mL

2 50 BPH8 4 50 BPH8 4 50 BPH8 1 50 BPH8

Muestras



Diámetro 12,03 11,97 11,81 Potencia (P) UI/mg 901,8

Concentración (UI/ml) recup 0,8358 0,8248 0,7976 Fecha de vencimiento Jun-08

Log (Concentración) -0,078 -0,084 -0,098 Lote E0607067 Cantidad Muestra mg 27,6 27,5 27,5 DATOS UI reales / mg 0,8 0,8 0,8 Pendiente 0,0941 Porcentaje Recuperado% 105 104 101 Intercepto -1,2096 Porcentaje % 103,1 Factor de Dilución (D) ---

74

2 RESULTADOS CON EL PROGRAMA DE VALIDACIÓN

2.1 LINEALIDAD SISTEMA Data.

The model used is : bXaY +=)Log( The linearity of the method is tested with the following data :

Variables transformation Number of repetitions 3 Unit

Linearity

# HALO CONCEN 1 10.96 0.60 2 10.41 0.60 3 10.07 0.60 4 12.22 1.00 5 12.45 1.00 6 13.28 1.00 7 13.99 1.20 8 13.37 1.20 9 13.43 1.20 10 15.50 1.60 11 14.48 1.60 12 15.50 1.60 13 16.48 2.00 14 16.27 2.00 15 16.47 2.00 16 17.19 2.40 17 16.69 2.40 18 17.21 2.80 19 17.68 2.80

75

Results The model used is : bXaY +=)Log( The test of linearity of the method gives the following results :

Variables transformation Number of values 19 Number of repetitions 1 Unit

Linearity

# HALO Log CONCEN Residuals 1 10.96 -0.22 -0.06 2 10.41 -0.22 -0.01 3 10.07 -0.22 0.02 4 12.22 0.00 0.05 5 12.45 0.00 0.03 6 13.28 0.00 -0.04 7 13.99 0.08 -0.03 8 13.37 0.08 0.03 9 13.43 0.08 0.02 10 15.50 0.20 -0.04 11 14.48 0.20 0.05 12 15.50 0.20 -0.04 13 16.48 0.30 -0.03 14 16.27 0.30 -0.01 15 16.47 0.30 -0.03 16 17.19 0.38 -0.01 17 16.69 0.38 0.03 18 17.21 0.45 0.05 19 17.68 0.45 0.01

76

Calibration curve

Confidence level for calibration curve : 95.00

Plot of the residuals

77

Confidence level for the residuals : 95.00 Analysis of the variance of linearity Confidence level 95 Student t 1.74 Y intercept -1.14094e+000

- Variance 2.72761e-003 - Confidence interval 9.08742e-002

Slope 8.92383e-002 - Variance 1.28089e-005 - Confidence interval 6.22738e-003

Correlation coefficient r 0.986602 Determination coefficient r² 0.973384 Variance due to the regression SI² 8.33768e-001 Residual variance SR² 1.34108e-003 Residual sum of squares 2.27984e-002

78

Test for the existence of a significant slope (F1) Confidence level 95.00 Degrees of freedom (1,2) 1 , 17 F table 4.450 F calculated 621.713 The Fisher F test is satisfactory. Conclusion The characteristic " Linearity " of the analytical method is validated. Conclusions

Linearity

SUMMARY Analysis of the variance of linearity Y intercept : -1.14094e+000 Slope : 8.92383e-002 Determination coefficient r² : 0.973384 Not

Satisfactory

Satisfactory

Test for the existence of a significant slope (F1)

⌧

The analytical method is for this characteristic Not Validated Validated ⌧

79

2.2LINEALIDAD DEL MÉTODO Data.

The model used is : bXaY +=)Log( The linearity of the method is tested with the following data :

Variables transformation Number of repetitions 3 Unit

Linearity

# HALO CONCEN 1 12.81 1.00 2 12.19 1.00 3 12.37 1.00 4 13.55 1.40 5 14.31 1.40 6 14.40 1.40 7 15.70 2.00 8 15.28 2.00 9 15.10 2.00 10 15.74 2.40 11 15.44 2.40 12 15.62 2.40 13 16.25 2.80 14 16.47 2.80 15 17.01 2.80

Results The model used is : bXaY +=)Log( The test of linearity of the method gives the following results :

Variables transformation Number of values 15 Number of repetitions 1 Unit

Linearity

80

# HALO Log CONCEN Residuals 1 12.81 0.00 -0.04 2 12.19 0.00 0.03 3 12.37 0.00 0.01 4 13.55 0.15 0.03 5 14.31 0.15 -0.05 6 14.40 0.15 -0.06 7 15.70 0.30 -0.05 8 15.28 0.30 -0.00 9 15.10 0.30 0.02 10 15.74 0.38 0.02 11 15.44 0.38 0.06 12 15.62 0.38 0.04 13 16.25 0.45 0.04 14 16.47 0.45 0.01 15 17.01 0.45 -0.05

Calibration curve

Confidence level for calibration curve : 95.00

81

Plot of the residuals

Confidence level for the residuals : 95.00

Analysis of the variance of linearity Confidence level 95 Student t 1.771 Y intercept -1.35693e+000


Slope 1.08790e-001

82


Correlation coefficient r 0.971872 Determination coefficient r² 0.944535 Variance due to the regression SI² 3.72901e-001 Residual variance SR² 1.68442e-003 Residual sum of squares 2.18975e-002

Test for the existence of a significant slope (F1) Confidence level 95.00 Degrees of freedom (1,2) 1 , 13 F table 4.670 F calculated 221.382 The Fisher F test is satisfactory. Conclusion

The characteristic " Linearity " of the analytical method is validated. Conclusions

Linearity

SUMMARY Analysis of the variance of linearity Y intercept : -1.35693e+000 Slope : 1.08790e-001 Determination coefficient r² : 0.944535 Not

Satisfactory

Satisfactory

Test for the existence of a significant slope (F1)

⌧

The analytical method is for this characteristic

83

Not Validated Validated ⌧

2. 3 PRECISIÓN DEL MÉTODO Data The study of the characteristic "Intermediate Precision" is done on the following data: Data from group: Group 1 Author : VM administrator

Variables transformation Unit

Intermediate precision

# Concentration Area 1 10.0 10.6 2 10.0 10.9 3 10.0 10.1

Data from group: Group 3




84









Results The study of the characteristic " Intermediate Precision" gives the following results: Results for the group: Group 1

85

Intermediate precision #

Concentration

Area STAT Test # Q calc. Q (99%) Q (95%)

1 10.0 10.6 2 10.0 10.9 3 10.0 10.1 1 0.625 0.988 0.941

(*) suspicious value, (**) aberrant value Number of values 3 Number of values used for calculation 3 Variance test Confidence level 95.00 Test # Mean of values 10.5 C calc. Confidence interval 0.7 C (99%) Variance for this group 1.63333e-001 C (95%) Coefficient of variation 3.84 % STAT

For the calculation of the variances, this group will be:

Accepted Results for the group: Group 3


Concentration


1 10.0 9.7 2 10.0 9.5 1 0.667 0.988 0.941 3 10.0 9.8


86




Concentration


1 10.0 10.1 2 10.0 9.9 1 0.500 0.988 0.941 3 10.0 10.0





Concentration


87

1 10.0 10.8 1 0.917 0.988 0.941 2 10.0 9.6 3 10.0 9.7

(*) suspicious value, (**) aberrant value Number of values 3 Number of values used for calculation 3 Variance test Confidence level 95.00 Test # 1 Mean of values 10.0 C calc. 0.693 Confidence interval 1.1 C (99%) 0.864 Variance for this group 4.43333e-001 C (95%) 0.768 Coefficient of variation 6.64 % STAT


Accepted Calculation of the variance of repeatability and of intermediate precision

Total number of values used for calculation 12 Confidence level (1-α/2) 95.00 Degrees of freedom 11 t (table) 1.796 Mean value 10.1 Variation interval 0.3 Variation interval (%) 2.50 Number of groups 4 Variance of repeatability Sr² 1.60000e-001 Inter-group variance Sg² 7.43519e-002 Variance de intermediate precision SR² 2.34352e-001 Coefficient of variation of repeatability

Specification max.: 5.00 3.98

Coefficient of variation of intermediate precision Specification max.: 5.00

4.81

Results are within assay specifications.

88

Conclusion

The characteristic "Intermediate Precision " of the analytical method is validated. Conclusions

Intermediate Precision

SUMMARY Analysis of variance Variance of repeatability Sr² 1.60000e-001 Inter-group variance Sg² 7.43519e-002 Variance of intermediate

precision SR² 2.34352e-001

Coefficients of variation of: - repeatability 3.98 Specification max.: 5.00 - intermediate precision 4.81 Specification max.: 5.00

The analytical method is for this characteristic

Not Validated Validated ⌧

89

2.4 PRECISIÓN DEL SISTEMA Data The study of the characteristic "Intermediate Precision" is done on the following data: Data from group: Group 1 Author : VM administrator



# Concentration Area 1 1.6 14.20 2 1.6 14.44 3 1.6 14.53 4 1.6 14.42 5 1.6 14.43 6 1.6 14.78 7 1.6 14.54 8 1.6 14.58 9 1.6 14.97 10 1.6 14.21

Results The study of the characteristic " Intermediate Precision" gives the following results: Results for the group: Group 1

90


Concentration


1 1.6 14.20 2 1.6 14.44 3 1.6 14.53 4 1.6 14.42 5 1.6 14.43 6 1.6 14.78 7 1.6 14.54 8 1.6 14.58 9 1.6 14.97 1 0.247 0.527 0.412 10 1.6 14.21



Accepted Calculation of the variance of repeatability

Total number of values used for calculation 10 Mean value 14.51 Variation interval 0.14 Variation interval (%) 0.94 Variance of repeatability Sr² 5.51333e-002

91

Coefficient of variation of repeatability Specification max.: 3.00

1.62

Results are within assay specifications. Conclusion

The characteristic "Intermediate Precision " of the analytical method is validated. Conclusions

Intermediate Precision

SUMMARY Analysis of variance Variance of repeatability Sr² 5.51333e-002 Coefficient of variation of

repeatability 1.62

Specification max.: 3.00


92

2.5 EXACTITUD Data

The accuracy of the method is tested with the following data: Number of values 9 Unit

At the target level

# Concentration Area 1 100.0 104.0 2 100.0 101.0 3 100.0 101.0 4 100.0 101.0 5 100.0 97.0 6 100.0 98.0 7 100.0 98.0 8 100.0 103.0 9 100.0 97.0

Results Study of accuracy gives the following results:

Number of values 9 Number of values used for calculation 9 Mean of concentrations 100.0 Concentration unit

93

At the target level # Concentration Area STAT Recovery1 100.0 104.0 104.00 2 100.0 101.0 101.00 3 100.0 101.0 101.00 4 100.0 101.0 101.00 5 100.0 97.0 97.00 6 100.0 98.0 98.00 7 100.0 98.0 98.00 8 100.0 103.0 103.00 9 100.0 97.0 97.00

(*) suspicious value, (**) aberrant value

Area Confidence level (1-�/2) 95.00 Variance 6.75000e+000 Mean 100.0 Confidence interval 1.6 Coefficient of variation of repeatability 2.60 %

Recovery Variance 6.75000e+000 Coefficient of variation of repeatability 2.60 Confidence level (1-�/2) 95.00 Degrees of freedom 8 t table 1.860 Mean recovery 100.00 Interval (+-) 1.61 Specification min.: 95.00 Specification max.: 105.00

Mean recovery is centered on 100%. Results are within assay specifications. Conclusion

94

The characteristic "Accuracy - At the target level " of the analytical method is validated.

Conclusions

Accuracy At the target level

SUMMARY Mean recovery Variance 6.75000e+000 Mean recovery(%) 100.00 Interval (+-) 1.61 Specification min.: 95.00 Specification max.: 105.00


95

2.6 LIMITE DE CUANTIFICACIÓN Accuracy Accuracy - At the target level . Calculations

Data The accuracy of the method is tested with the following data: Number of values 6 Unit

At the target level

# Concentration Area 1 100.0 99.0 2 100.0 103.0 3 100.0 105.0 4 100.0 102.0 5 100.0 101.0 6 100.0 99.0

Results Study of accuracy gives the following results:

Number of values 6 Number of values used for calculation 6 Mean of concentrations 100.0 Concentration unit

At the target level

# Concentratio

n

Area STAT

Recovery

Test #

Q calc. Q (99%)

Q (95%)

1 100.0 99.0 99.00 2 100.0 103.0 103.00 3 100.0 105.0 105.00 1 0.333 0.698 0.560 4 100.0 102.0 102.00 5 100.0 101.0 101.00 6 100.0 99.0 99.00

96

(*) suspicious value, (**) aberrant value

Area Confidence level (1-�/2) 95.00 Variance 5.50000e+000 Mean 101.5 Confidence interval 1.9 Coefficient of variation of repeatability 2.31 %

Recovery Variance 5.50000e+000 Coefficient of variation of repeatability 2.31 Confidence level (1-�/2) 95.00 Degrees of freedom 5 t table 2.015 Mean recovery 101.50 Interval (+-) 1.93 Specification min.: 95.00 Specification max.: 105.00

Mean recovery is centered on 100%. Results are within assay specifications. Conclusion

The characteristic "Accuracy - At the target level " of the analytical method is validated.

Conclusions

Accuracy At the target level

SUMMARY Mean recovery Variance 5.50000e+000 Mean recovery(%) 101.50 Interval (+-) 1.93 Specification min.: 95.00 Specification max.: 105.00


validar una técnica para la cuantificación de tilosina

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