validación preliminar de la técnica de rotaevaporación

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Validación preliminar de la técnica de rotaevaporación como método para concentrar aluminio, selenio y hierro en agua potable y posterior determinación por espectrofotometría

de absorción atómica de llama

GINETH XIMENA MONCADA PIÑEROS MÓNICA ALEJANDRA SANCHEZ ARDILA

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito para optar al título de MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá D.C. Colombia

Junio de 2013

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Validación preliminar de la técnica de rotaevaporación como método para concentrar aluminio, selenio y hierro en agua potable y posterior determinación por espectrofotometría

de absorción atómica de llama


___________________________ INGRID SCHULER Ph.D.

Decana Académica Facultad de Ciencias

______________________________ JANETH ARIAS

Directora Carrera de Microbiología Facultad de Ciencias

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Validación preliminar de la técnica de rotaevaporación como método para concentrar

aluminio, selenio y hierro en agua potable y posterior determinación por espectrofotometría de absorción atómica de llama


_______________________ _______________________ Luis Gonzalo Sequeda. PhD Cand Crispin Astolfo Célis . PhD. Director Par Académico

Microbiología Industrial

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NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1994

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral

católica y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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AGRADECIMIENTOS En primera medida queremos agradecerle a Dios por permitirnos llegar a donde estamos, por la salud y la sabiduría que nos ha concedido para poder finalizar esta meta trazada. Agradecemos al laboratorio de calidad de aguas y lodos de la Pontificia Universidad Javeriana y en

especial a Claudia Campos por permitirnos llevar a cabo este proyecto. De igual manera queremos

agradecer a Luis Gonzalo Sequeda por la dirección y el conocimiento que nos ha proporcionado

durante todo este tiempo, y los laboratorios que nos acogieron para llevar a cabo nuestro trabajo de

grado (Laboratorio de Absorción Atómica, Laboratorio de Bioquímica Básica y Laboratorio de

Aguas y Lodos).

Queremos extender nuestros agradecimientos a nuestros asesores Marcela Duarte, Andrés Ortiz y

Paola Correa, por sus grandes aportes en las diferentes temáticas y constante acompañamiento en el

transcurso del proyecto.

A nuestros padres por darnos el apoyo económico y moral para llegar a este punto de nuestras

carreras, por guiarnos y por darnos la fuerza para seguir adelante cada día.

A todos nuestros amigos y amigas que nos han brindado un constante acompañamiento en este

proceso y por los grandes momentos compartidos.

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TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN…………………………………………………………………………………..…....11

1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………….……………..………..12

2. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA………………..…………14

3. MARCO TEÓRICO……………………………………………………………….…………15

3.1 Metales traza ………..……....………………………………………………………………. 15 3.1.1Aluminio…..………………………………………………………………...…………… 15 3.1.2 Hierro……………………………………..……………………………………………. 16 3.1.1 Selenio ...…………………………………………….………………………………… 16

3.2 Agua potable y legislación…...……………………………….………………………………. 17 3.3 Métodos de concentración de muestras………………..……………………………………... 18

3.3.1 Resinas macroporosas XAD……………………..……………………………………… 18 3.3.2 Discos de filtración – Siloxano…………………..…………………………………….... 19 3.3.3 Rotaevaporación……………………………..…………………………………………. 20 3.3.4 Liofilización……………………………….…………………………………………… 20 3.4 Validación de un método………………...…………………..…………………….……… 20 3.4.1 Selectividad ..…………………….…………………………………………………… 21 3.4.2 Linealidad ….…………………….……………………………………………………. . 21 3.4.3 Precisión…………………………..…………………………………………………….. 21 3.4.4 Exactitud……………………………….………………………………………..…….. 22 3.4.5 Límite de detección y cuantificación………………………………….…………….…. 22

3.5 Pruebas de genotoxicidad y mutagenicidad ……………………………………...………… 22 3.5.1 Test de Ames……………………………………………………………………..……. 23 3.5.2 Ensayo de Allium cepa…………………………………...……………………..….…… 23

4. OBJETIVOS……………………………………………………………………..………..….. 24 4.1 Objetivo General……………………………………………………………..……………. 24 4.2 Objetivos Especificos……………………………………………………….…………….. 24

5. METODOLOGÍA…………….……………………...…………………………….………... 25 5.1 Materiales y reactivos…………………………………………………………………….. 25 5.2 Equipos………………………………………………………………………………….. 25 5.3 Curvas de calibración…………………………………………………………………….. 25 5.4 Determinación de selectividad……………………………………………………………. 25 5.5 Determinación de linealidad……………………………………………………………… 25 5.6 Determinación del límite de detección y de cuantificación……………………………….. 26 5.7 Determinación de exactitud……………………………………………………………… 26 5.8 Determinación de precisión……………………………………………………………… 26 5.9 Determinación del porcentaje de recuperación…………………………………………… 26 5.10 Determinación de metales en agua potable…………………………………………..…….. 27

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6. RESULTADOS ……………..………………………………………………………….……… 28

6.1 Determinación de linealidad... ……………………………………………….…………….….28 6.2 Determinación de límite de detección y cuantificación …...…...……………..………………29 6.3 Determinación de exactitud.….……………………….................................................................... 30 6.4 Determinación de precisión …………………………………………….…………………….32 6.5 Determinación del porcentaje de recuperación por rotaevaporación y por liofilización……......34 6.6 Determinación de aluminio, hierro y selenio en agua potable…….……………………….…..35

7. DISCUSIÓN…………………………………………………………….…………………..… 37 8. CONCLUSIONES……………………………………………………….……………..…….. 41 9. RECOMENDACIONES ..…………………………………………….…………….………. 42 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………….……………..………… 43 11. ANEXOS…………………………………………………………………………………..…… 46

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Curva calibración de aluminio, relacionando concentración vs absorbancia promedio…… …….28

Figura 2. Curva calibración de selenio, relacionando concentración vs absorbancia promedio…………….28

Figura 3. Curva calibración de hierro, relacionando concentración vs absorbancia promedio……………..29

9

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Absorbancias de réplicas de blancos, con el promedio y desviación estándar, para la determinación

del límite de detección y de cuantificación de aluminio……………………………………………………...29

Tabla 2. Absorbancias de réplicas de blancos, con el promedio y desviación estándar, para la determinación

del límite de detección y de cuantificación de selenio………………………………………………………..30


del límite de detección y de cuantificación de hierro………………………………………………………....30

Tabla 4. Porcentaje de error para la determinación de la exactitud en mediciones de aluminio, hierro y selenio

…………………………………………………………………………………………………………….31

Tabla 5. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de

aluminio……………………………………………………………………………………………………32

Tabla 6. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de selenio………………………………..32

Tabla 7. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de hierro…………………………………33

Tabla 8. Porcentaje de recuperación de aluminio por rotaevaporación y liofilización como métodos de

concentración……………………………………………………………………………………………….34

Tabla 9. Porcentaje de recuperación de selenio por rotaevaporación y liofilización como métodos de

concentración……………………………………………………………………………………………….34

Tabla 10. Porcentaje de recuperación de hierro por rotaevaporación y liofilización como métodos de

concentración……………………………………………………………………………………………….35

Tabla 11. Resultados para hierro de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de

Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método………………………………………….…….35

Tabla 12. Resultados para selenio de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de

Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método………………………………………………..36

Tabla 13. Resultados para aluminio de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de

Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método………………………………………………..36

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LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para aluminio…………..………….46

Anexo 2. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para selenio……………………....47

Anexo 3. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para hierro………………………..48

Anexo 4. Listado de metales con absorbancias para el Espectrofotómetro de Absorción Atómica de

Llama…………………………………………………………………………………………….. 49

Anexo 5. Mediciones de pH....……………………………………………………………………49

RESUMEN

11

Algunos metales traza se requieren en pequeñas cantidades por los seres vivos, sin embargo, cuando

éstos se encuentran en agua potable en cantidades mayores a las normales, pueden causar problemas

en la salud, o incluso, al bioacumularse pueden llegar a generar enfermedades a largo plazo. El

objetivo de este estudio fue validar de manera preliminar la rotaevaporación y la liofilización, como

técnicas de concentración para determinar aluminio, selenio y hierro en agua potable por

Espectrofotometría de Absorción Atómica de Llama, con el fin de evaluar a futuro pruebas de

mutagenicidad y genotoxicidad. Los parámetros que se evaluaron durante el proceso de validación

fueron la selectividad, linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, exactitud (expresada

como porcentaje de error), precisión, y porcentaje de recuperación para el método. Para ello se

elaboraron curvas de calibración con seis puntos para cada metal, y se leyeron a las diferentes

longitudes de onda dependiendo del elemento a analizar. Para el porcentaje de recuperación que se

obtiene al rotaevaporar, se preparó una solución stock de 5 ppm para hierro, 20 ppm de aluminio y

50 ppm de selenio. A partir de la solución stock, se prepararon tres soluciones de diferente

concentración para cada metal, y se leyeron en el espectrofotómetro antes y después de rotaevaporar.

Luego, se procedió a concentrar muestras de agua potable de tres lugares diferentes de Bogotá.

Adicionalmente, se evaluó la liofilización como otro método de concentración, en donde se

determinó el porcentaje de recuperación y se comparó con los resultados obtenidos por

rotaevaporación. Para todos los metales se evidenció linealidad, con buena selectividad, debido a que

no hay interferencias por parte de otros elementos; se obtuvo una mayor exactitud para hierro (2.5%

de error en promedio); y límites de detección y cuantificación altos para selenio (1.44 y 2.41 ppm,

respectivamente), siendo los más bajos los de hierro con un límite de detección de 0.06 ppm y de

cuantificación de 0.1 ppm; en cuanto a la precisión en términos de repetibilidad, se encontraron

coeficientes de variación de 10.19% para aluminio, 6.71% para selenio y 13.23% para hierro. De

acuerdo con lo encontrado en las 10 muestras de agua potable recolectadas, no se detectó presencia

de selenio, se encontró hierro en todas, y se detectó aluminio en 6 muestras. En cuanto a los

porcentajes de recuperación de rotaevaporación y liofilización, se encontró un promedio del 65%

para rotaevaporación y 85% para liofilización. Finalmente, se concluye que se realizó una validación

preliminar para el método de rotaevaporación para realizar la determinación de metales por

Espectrofotometría de Absorción Atómica en llama, para la determinación de aluminio, hierro y

selenio en muestras de agua potable.

PALABRAS CLAVES: Validación preliminar, rotaevaporación, liofilización, agua potable, aluminio, selenio y hierro.

1. INTRODUCCIÓN

12

El agua recibe varios tratamientos para eliminar microorganismos y sustancias químicas dañinas, que

causan serias enfermedades en los seres humanos, por medio de un proceso de potabilización, que

busca disminuir la probabilidad de encontrar agentes contaminantes en el agua. Este recurso natural,

está expuesto a diferentes contaminantes ambientales, incluyendo los metales pesados, los cuales

pueden ser introducidos al agua, por medio de fuentes naturales (desgaste y erosión del lecho de

roca, depósitos minerales y acción volcánica) y antropogénicas (minería, industrias, irrigación de agua

residual y actividades agrícolas). (Muhammad et al. 2011)

Los metales son estables ambientalmente, no son biodegradables y tienen la capacidad de acumularse

en los tejidos de los seres vivos causando toxicidad (Farahmand et al. 2011), a este último proceso se

le conoce como bioacumulación, el cual se define como un aumento en la concentración de un

producto químico en un organismo vivo en un cierto plazo de tiempo, comparada a la concentración

de dicho producto químico en el ambiente que lo rodea (Mackay & Fraser 2000). El grupo de los

metales se constituye como un componente muy importante de la corteza terrestre, dentro del cual,

se encuentran elementos indispensables para los procesos metabólicos de los organismos vivos; éstos

están normalmente presentes a nivel de trazas (µg) en el ambiente, pero al aumentar los niveles de

estos metales debido a procesos industriales, sus roles cambian a una dimensión negativa (Gawdzik J

& Gawdzik B 2012). Zhou et al. (2007), asevera que el consumo de agua potable que contenga altas

concentraciones de metales traza, incrementa los riesgos de cáncer en animales y humanos; por lo

cual, la exposición a estos elementos debe ser minimizada.

Al tener los metales la capacidad de bioacumularse y al estar en concentraciones bajas, pueden

provocar que las enfermedades que ocasionan se manifiesten a largo plazo; metales como el hierro

(Fe), aluminio (Al), selenio (Se), entre otros, se manifiestan en el desarrollo de cáncer en piel,

pulmones, hígado, riñones (OMS), además de irritaciones en la piel y mucosas (ocular, respiratoria y

digestiva), anemia, alteraciones neurológicas, etc. (Mencías & Mayero 2000).

Actualmente en Colombia, la Resolución 2115 del 2007 establece las concentraciones permisibles de

metales traza en agua potable, estas concentraciones están dadas por la Organización Mundial de la

Salud, sin embargo, los valores presentados en estos documentos, son el resultado de los valores

límites de detección de los equipos usados en pruebas laboratorios de agua potable y en la mayoría de

los casos para estos valores de referencia no se tiene claridad sobre los efectos en la salud a largo

plazo. Dentro de las técnicas de lectura de metales, se destaca la Espectrometría de Absorción

Atómica de Llama (FAAS), la cual es una técnica sencilla, conocida desde hace mucho tiempo y que

elimina interferencias, aunque, los límites de detección con esta técnica no son lo suficientemente

bajos (Morand et al. 2002), por tal motivo, es necesario usar técnicas de concentración, para

aumentar o encontrar la detección de contaminantes en una muestra de agua potable, y lograr realizar

pruebas de toxicidad.

Estas pruebas se realizan con el fin de evaluar si una sustancia puede llegar a ser tóxica para los

organismos vivos, y dentro de éstas se encuentran los ensayos de mutagenicidad y genotoxicidad, en

donde las pruebas de mutagenicidad buscan observar si se producen alteraciones o mutaciones en la

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estructura del ADN de células procariotas, por medio de pruebas como el Test de Ames (Trossero et

al. 2006), el cual permite obtener una aproximación en cuanto si una sustancia es carcinogénica o no.

Las pruebas de genotoxicidad pretenden comprobar si una sustancia puede generar afectaciones en el

genoma, induciendo aberraciones cromosomales en células eucariotas, por medio del ensayo de

Allium cepa, evidenciando reducciones en el crecimiento radicular y anormalidades mitóticas (Radic et

al. 2010). Este tipo de pruebas se deben realizar a partir de muestras con una menor intervención,

con el fin de evitar reportar falsos positivos, por la adición de otras sustancias que no sean propias de

la muestra a analizar.

Por tal motivo, se escogieron dos técnicas de concentración como la rotaevaporación y la

liofilización, debido a que con ambas técnicas no hay un tratamiento agresivo de las muestras

analizadas, siendo el objetivo de este estudio, validar una técnica de concentración de muestras por

rotaevaporación para detectar aluminio, hierro y selenio en agua potable por espectrofotometría de

absorción atómica de llama con el fin de evaluar a futuro pruebas de mutagenicidad y genotoxicidad.

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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA – JUSTIFICACIÓN

Es de importancia saber que los metales pesados no son biodegradables y entran en un ciclo

ecológico global a través del agua natural (Farahmand el al. 2011). Estos metales pueden concentrase

fácilmente a lo largo de la cadena alimentaria, por lo cual causa toxicidad en las plantas y acumulación

en los tejidos humanos (Barati et al. 2010). Actualmente en Colombia la Resolución 2115 del 2007

establece las concentraciones permisibles de metales traza en agua potable, dichas concentraciones

han sido estipuladas por la Organización Mundial de la Salud (OMS).

La OMS como entidad guía para la calidad de agua potable, no establece valores de referencia en

concentraciones inferiores a los límites de detección que son alcanzados en condiciones de

operación rutinarias en laboratorios, por lo tanto en algunos casos han fijado valores de referencia

provisionales para contaminantes de los que se dispone de información sujeta a cierta incertidumbre

o cuando no es posible, en la práctica, reducir la concentración hasta los niveles de referencia

calculados. De ahí la importancia de implementar métodos que mejoren la determinación de

componentes ligados a la calidad de agua potable, en este caso de aluminio, hierro y selenio, con el

fin futuro de realizar estudios de mutagenicidad y genotoxicidad con los valores presentes de estos

compuestos en agua potable, para que de esta manera se pueda sugerir valores de referencia acordes

al contexto nacional.

La técnica de Espectrofotometría de Absorción Atómica de Llama (FAAS), es la de mayor demanda

en los laboratorios de aguas, aunque, los límites de detección con esta técnica no son lo

suficientemente bajos (Morand et al. 2002). Por tal motivo se desea validar la técnica de

rotaevaporación, como mecanismo para la concentración de aluminio, hierro y selenio en muestras

de agua potable, lo cual proporcionaría un aumento en el límite de detección de la técnica, de igual

manera se quiere evaluar la liofilización proponiéndolo como un método de concentración para estos

tipos de analitos.

Se proponen estos métodos de concentración puesto que ofrecen una mínima intervención en la

muestra de interés, lo que facilita para estudios futuros ensayos de genotoxicidad y mutagenicidad.

15

3. MARCO TEÓRICO

3.1 Metales traza

Los elementos de la tabla periódica, son en su mayoría metales, los cuales se caracterizan por ser

sólidos (excepto el mercurio), conducir la electricidad, ser dúctiles, maleables y formar aleaciones

(Kotz et al., 2005); además, tienen densidades mayores a la del agua, son totalmente no degradables,

con lo cual pueden acumularse en los sistemas ambientales, generando toxicidad (Baird, 2001).

Manahan (2006) define los metales o elementos traza, como:

“Aquellos que existen a niveles muy bajos, de unas partes por millón o menos, en un sistema dado

que se pueden encontrar en aguas naturales. Algunos de éstos están reconocidos como nutrientes

requeridos para la vida de plantas y animales, incluyendo algunos que son esenciales a niveles bajos

pero tóxicos a niveles más altos”.

Aproximadamente 17 elementos se requieren en cantidades de traza en la mayoría de los sistemas

biológicos, aunque no en todos; algunos de ellos son el zinc, el silicio, cobalto, flúor, yodo, selenio,

hierro, entre otros (Kotz et al., 2005).

La toxicidad de este tipo de elementos, está dada por la fuerte afinidad de los cationes por el azufre,

en donde los cationes metálicos ingeridos se logran enlazar fácilmente a los grupos sulfhidrilo,

presentes comúnmente en las enzimas catalizadoras de las reacciones metabólicas, generando que la

enzima no pueda actuar normalmente, y por lo tanto, afectando la salud humana (Baird, 2001).

También, se ha encontrado que los metales se pueden enlazar químicamente a los grupos carboxilo (-

COOH) y los grupos amino (-NH2) de las proteínas, impidiendo los procesos de transporte a través

de la pared celular (Manahan, 2006).

Por estas razones, este tipo de elementos se consideran contaminantes en un sistema de agua

potable, en donde son la mayor preocupación en la seguridad de los organismos que consumen esta

agua; pueden proceder de fuentes industriales, agrícolas y de escorrentía urbana, generando toxicidad

e impactos en la salud y en la biota acuática (Manahan, 2006).

3.1.1 Aluminio

El aluminio es el metal más abundante de la corteza terrestre, y su abundancia sólo es inferior a la de

los no metales oxígeno y silicio, encontrándose generalmente combinado en arcilla y otros minerales

comunes (Kotz et al., 2005); aun así, no se han encontrado especies que necesiten el aluminio como

un elemento esencial (Emsley, 2011).

Este elemento se usa en forma de sulfato de aluminio para la purificación del agua, en donde es

utilizado como un agente floculante (Emsley, 2011). Las dosis que habitualmente se agregan son de 2

a 5 mg/L, aun cuando no se han establecido valores de referencia, debido a las limitaciones de los

datos de estudios con animales como modelos para seres humanos (OMS, 2006).

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En los últimos años, ha habido una mayor exposición al aluminio reactivo biológicamente, con

posibles consecuencias en la salud humana (Crisponi et al., 2012); factores responsables de esta

reciente sobreexposición, es la lluvia ácida, la cual actúa liberando el aluminio de los depósitos

minerales, en forma de hidroxi-aluminosilicatos (HAS), causando su aparición en aguas

contaminadas (Exley et al., 2002), otro de los factores determinantes ha sido la actividad humana,

incluyendo la tecnología moderna para extraer el aluminio en forma de criolita y bauxita (Crisponi et

al., 2013), y eso sin contar los residuos que se generan provenientes de industrias, y se vierten al agua

sin ningún tipo de tratamiento.

Esta creciente sobreexposición es alarmante, debido a las tres enfermedades asociadas a la ingesta de

aluminio, como lo son: la demencia por diálisis, osteomalacia y anemia microcítica sin deficiencia de

hierro, las cuales se manifiestan en síntomas como inhabilidad para concentrarse, pérdida de la

memoria, cambios en la personalidad, depresión, alucinaciones visuales y/o auditivas, debilidad,

fatiga, convulsiones epilépticas, entre otros (Crisponi et al., 2013).

3.1.2 Hierro

El hierro es el cuarto elemento más abundante en la corteza terrestre (Kotz et al., 2005). Es esencial

para casi todos los organismos vivos, desde los microorganismos hasta los seres humanos,

encontrando un promedio de 4 gramos de hierro en el cuerpo humano (Emsley, 2011), en donde

juega un papel importante en la química de la hemoglobina, ya que es el componente de la sangre que

transporta el oxígeno (Kotz et al., 2005).

Las necesidades diarias mínimas de este elemento oscilan entre 10 a 50 mg/día (OMS, 2006), pero al

ser consumido en exceso se pueden generar problemas de hígado y riñón, ya que el hierro se adhiere

a la proteína transferrina, impidiendo que ésta pueda transportar otros metales esenciales en el

cuerpo (Emsley, 2011). Además, a medida que transcurren los años, el hierro tiene la capacidad de

acumularse lentamente en los tejidos del cuerpo y causar finalmente artritis, disfunciones cardíacas, o

daños hepáticos, incluyendo cirrosis (Hotz et al., 2012).

Este metal está presente en aguas dulces naturales en concentraciones de 0.5 a 50 mg/L, pudiendo

haber también presencia de hierro en el agua de consumo, debido a la utilización de coagulantes de

hierro en una concentración de 4 a 10 mg/L, o a la corrosión de tuberías de acero o hierro colado

durante la distribución del agua; aun así no se han determinado valores de referencia para las sales de

hierro utilizadas en el proceso de potabilización (OMS, 2006).

3.1.3 Selenio

El selenio clasifica entre los elementos raros del planeta, estando en el lugar 67 de la lista de los

elementos más abundantes en la tierra, con una concentración aproximada de 50 ppb (µg/kg) en la

corteza terrestre (Emsley, 2011), las fuentes de las cuales proviene son fuentes naturales y carbón, y

es clasificado como un metaloide (Manahan, 2006).

Además de considerarse un componente esencial de la dieta humana (Kotz, 2005) con un valor de

ingesta diario promedio de 4 µg/kg de peso corporal (OMS, 2006), puede llegar a ser tóxico a niveles

17

superiores (Manahan, 2006), en donde 5 mg pueden llegar a producir reacciones altamente tóxicas e

inclusive la muerte, y una exposición prolongada de bajo nivel causa pérdida de peso, anemia, y

dermatitis, así como mal olor corporal y mal aliento (Emsley, 2011), comprobándose que los

compuestos de selenio son genotóxicos en sistemas in vitro con activación metabólica (OMS, 2006).

Al estar presente en la corteza terrestre (OMS, 2006), y debido a los depósitos atmosféricos, el

drenaje de suelos y subsuelos (Mehdi et al., 2013), el selenio puede llegar a fuentes de agua, siendo

este elemento, junto con el arsénico y el antimonio, contaminantes importantes del agua (Manahan,

2006), y encontrándose en la mayoría de los casos un máximo de 10 mg/L en forma de selenato y

selenito en aguas frescas, y en forma de seleniuro y selenato de sodio en agua superficial,

considerando estos últimos los más solubles y móviles en agua (Mehdi et al., 2013). Aun así, en los

procesos de potabilización, la concentración de selenio (IV) podría llegar a reducirse hasta 0.01 mg/L

con la coagulación, mientras que el selenio (VI) no se puede eliminar mediante tratamientos

convencionales; siendo su concentración máxima admisible en agua 0.01 mg/L (OMS, 2006).

3.2 Agua potable y legislación

Según el Decreto 1575 del 2007, el agua potable se define como “Aquella que por cumplir las

características físicas, químicas y microbiológicas, en las condiciones señaladas en el presente decreto

y demás normas que la reglamenten, es apta para consumo humano. Se utiliza en bebida directa, en la

preparación de alimentos o en la higiene personal.” (Ministerio de la Protección Social, de Ambiente,

Vivienda y Desarrollo Territorial, 2007a), y debe cumplir con ciertos requisitos estipulados en la

Resolución 2115 del 2007, con el fin de asegurar la calidad de agua para el consumo humano

(Ministerio de la Protección Social, de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, 2007b). Dentro

de estos requisitos, se especifican las características químicas a tener en cuenta, en donde se señalan

los valores máximos aceptables de cada una de las sustancias de interés, observando un valor de 0.2

mg/L para aluminio, de 0.3 mg/L para hierro total y de 0.01 mg/L para selenio (Ministerio de la

Protección Social, de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, 2007b).

Dentro de las organizaciones con mayor reconocimiento a nivel mundial que establecen parámetros

para la calidad del agua potable se encuentran la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Agencia

de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA), entre otras.

La OMS, ha establecido como valor de referencia para selenio, 0.01 mg/L, pero aún no se han fijado

valores de referencia basados en efectos sobre la salud para el caso del aluminio y del hierro, debido a

las limitaciones de datos de estudio con animales como modelo, y a la incertidumbre de los datos

generados en estudios con personas, por lo que se establecieron valores de 0.1 y 0.3 mg/L,

respectivamente, basados en la optimización de los procesos de coagulación en las plantas de

tratamiento de agua para consumo, y en un cambio en la coloración del agua para el caso del hierro

(OMS, 2006).

18

Al fijar valores de referencia, se busca que la aplicación de éstos sea práctica y factible, protegiendo

además, la salud pública. Aun así, estos valores de referencia no suelen establecerse en

concentraciones inferiores a los límites de detección que proporcionan las técnicas rutinarias de

laboratorio, y deben tener en cuenta la concentración alcanzable mediante los tratamientos

disponibles para controlar, reducir o eliminar el contaminante hasta su máximo nivel (OMS, 2006).

En cuanto a la EPA, ésta estableció como nivel máximo de concentración para selenio un valor de

0.01 mg/L; este elemento se encuentra clasificado dentro del Reglamento Nacional Primario de Agua

Potable, por lo cual es obligatorio cumplir con lo estipulado en la norma, para asegurar una buena

calidad del agua y para proteger a los consumidores de algún riesgo a su salud. Dentro de los

contaminantes que hacen parte del Reglamento Nacional Secundario de Agua Potable, es decir,

aquellas sustancias que no son obligatorias y que se establecen como guías para asegurar

características organolépticas adecuadas del agua, se encuentra el aluminio y el hierro, con niveles

máximos de concentración secundarios de 0.05 a 0.2 mg/L y 0.3 mg/L, respectivamente (EPA,

2013).

3.3 Métodos de concentración de muestras

La preparación de alguna muestra de interés, es un proceso en el cual se transforma dicha muestra en

una forma adecuada que facilita su análisis. En este proceso se puede incluir la extracción de un

analito de una matriz compleja o sencilla, de igual forma se pude realizar una preconcentración de

analitos que se encuentren muy diluidos, hasta obtener una concentración suficiente para ser medida

(Harris, 2007).

La potencia mutagénica se puede detectar en muestras no concentradas de aguas superficiales, sin

embargo, cada contaminante está presente normalmente en niveles tan bajos que es difícil de

detectar, y por lo tanto se requiere algún tipo de método de extracción / concentración para la

evaluación fiable de mutagenicidad o genotoxicidad de muestras de agua superficial (Ohe et al. 2004).

Estos métodos de concentración se proponen como una solución a problemas cotidianos en los

laboratorios ya que usualmente se puede encontrar equipos que presenten bajos límites de detección,

que por consiguiente no alcanzan a detectar un analito en una muestra sin tratamiento, ya que se

encuentra altamente diluido. De igual manera si lo requerido es un mínimo tratamiento en la muestra

para posteriores estudios de genotoxicidad y mutagenicidad, los métodos de concentración para

diferentes analitos son los más eficientes.

3.3.1 Resinas macroporosas XAD

La adsorción en resinas Amberlite XAD es el método más comúnmente aplicado para la

concentración de sustancias orgánicas a partir de diferentes tipos de aguas superficiales (Ohe et al.

2004).

19

Las resinas XAD son polímeros sintéticos macroporosos. Están formadas por un matriz polimérica

aromática o alifática, diferenciándose de las resinas de intercambio iónico por la ausencia de grupos

funcionales iónicos. Generalmente pueden adsorber una amplia clase de compuestos mutagénicos,

incluyendo hidrocarburos aromáticos policíclicos, arilaminas, nitro-compuestos, quinolinas,

antraquinonas (Horta 2008).

La adsorción, seguido de elución con solventes orgánicos, es eficiente en la extracción de todos los

productos químicos tóxicos y mutágenos/genotoxicos polares y no polares (Ohe et al. 2004).

Estas resinas tiene una clasificación variable en donde las de tipo XAD-2 proporcionan elevadas

capacidades de extracción de compuestos altamente hidrofobicos, en cuanto a la de tipo XAD-4 es

recomendada para solutos de bajo peso molecular, esta dos son utilizadas usualmente en procesos de

depuración de aguas (Gusler et al. 1993), para los solutos de peso molecular medio esta la resina de

tipo XAD-16, esta se usa en los procesos de separación de cefalosporina-C, antibiótico comúnmente

usado en la industria farmacéutica, y para solutos orgánicos de bajo peso molecular se recomienda las

resinas de tipo XAD-1180. La única resina Amberlita XAD moderadamente polar es la XAD-7

empleada para la recuperación de compuestos no aromáticos de disolventes polares (Horta 2008).

3.3.2 Discos de filtración – Siloxano

Los discos de siloxano proporcionan una alternativa eficiente de extracción líquido / líquido para la

preparación de una muestra. Son fabricados en fibra de vidrio con una superficie de sílice, estas

partículas tienen 30 μm de diámetro y tienen un tamaño de poro de 70 Å, con una fase ligada de

octadecilo (C18) o octilo (C8), son resistentes a pH bajos. (Rodriguez 1999).

Es un proceso patentado que se utiliza para atrapar partículas, los discos pueden ser usados con

fines para la purificación y concentración de analitos a partir de muestras acuosas.

Estos discos proporcionan una solución para preparación de grandes volúmenes de muestras

acuosas. El Formato en disco ofrece una gran área de superficie de contacto lo que ayuda a tener

tasas de flujo rápido y un alto rendimiento.

Estos discos están disponibles en una variedad de materiales químicos para complementar

aplicaciones de más analíticos. Cada material exhibe propiedades únicas de retención y selectividad

para un analito en particular. La elección del material que es mejor para un método, se verá

influenciada por la diferencia en la naturaleza química del analito en la matriz de la muestra y la

limpieza de la cromatografía resultante.

Los discos de C18 y C8 tiene aplicaciones típicas incluyen hidrocarburos policíclicos aromáticos

(PAHs), bifenilos policlorados (PCBs), ftalatos, compuestos orgánicos semivolátiles, paraquat y

diquat, pesticidas y herbicidas, según como lo dice la casa comercial Sigma - Aldrich.

20

3.3.3 Rotaevaporación

Este método para concentrar un analito de interés, usa el fundamento de la destilación sencilla que

consiste en el aumento de la temperatura de un líquido, lo cual hace que se aumente de la energía

cinética de las moléculas, y por consiguiente se comience la evaporación de las moléculas que se

hallan próximas a la superficie del líquido, hasta que la presión del vapor interna iguala a la presión

externa que soporta el sistema, cuando estas presiones se igualan, se puede observar la evaporación o

ebullición del líquido (Lamarque et al., 2008).

Sin embargo en la rotaevaporación, la rápida ebullición del líquido se ve favorecida por la aplicación

de vacío, el cual ayuda a que a temperaturas menores se evapore la sustancia de interés, puesto que se

igualan las presiones con mayor rapidez y con menor temperatura, separando de esta manera el

analito de interés de la matriz (Fieser, 2004).

3.3.4 Liofilización

Esta técnica usando frio se basa en la eliminación del agua contenida en una muestra, mediante su

congelación y sublimación posterior, es decir, el paso del hielo al estado de vapor y la eliminación de

éste (Vincent, Álvarez y Zaragozá, 2006).

La liofiliación es empleada en la industria de alimentos y farmacéutica por ofrecer ventajas de

deshidratación superiores a otras técnicas, su ventaja esta en no usar calor, lo que favorece a que no

sean alterados compuestos termosensibles para que no se presente denaturación de los mismos,

también es eficiente cuando lo que se requiere es reducir el volumen mejorando así el transporte o

envasado de algún producto (Labconco, 2012).

No se han encontrado reportes en los cuales se utilice este proceso de deshidratación por frío para

muestras de análisis químico o en su efecto para concentrar muestras de agua con un analito de

interés como es este caso los metales aluminio, hierro y selenio, sin embargo por su alto potencial de

no alterar las muestras se pretende evaluar los resultados verificando si es posible usar este método

de deshidratación para concentrar muestras con analitos de interés como los metales.

3.4 Validación de un método

La validación de un método se pude definir como el proceso que establece que un método es

aceptable para realizar su objetivo. Las características que hacen que un método sea aceptable se

expresan en función de una serie de parámetros analíticos (Morante, Sierra y Del Hierro, 2007).

La validación garantiza que el procedimiento escrito es suficientemente detallado como para que

distintos analistas o laboratorios obtengan resultados comparables cuando lo utilicen (Harvey, 2002).

El Instituto de Salud Pública de Chile (2010), menciona que la validación es un paso fundamental

para asegurar que los resultados entregados por un método son confiables. Ya que cuando se realiza

la validación de un método por parte del laboratorio, lo que se busca es poder determinar con

21

fundamento estadístico que el método es adecuado para los fines previstos. Esto se logra con cinco

parámetros que son primordiales en la validación analítica: selectividad, linealidad, precisión,

exactitud y límites de detección y cuantificación (AEFI, 2001).

3.4.1 Selectividad

En la validación de un método hace referencia a la capacidad que tiene dicho método analítico para

medir y/o identificar simultáneamente o separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca,

en presencia de otras sustancias químicas que puedan estar presentes en la muestra (Harvey, 2002).

La selectividad de un método analítico se debería determinar antes de iniciar el estudio de cualquier

otro parámetro de validación, dado que debe conocerse en qué grado de respuesta se encuentra el

método en relación al analito, sin interferencia de otras sustancias relacionadas con el (AEFI, 2001).

3.4.2 Linealidad

La linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo, de dar

una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del analito que se

habrá de determinar en la muestra de laboratorio (ISP de Chile, 2010).

Para estimar cómo los datos experimentales se ajustan a una recta, se calcula el coeficiente de

correlación (r). Donde un valor de uno corresponde a un ajuste ideal a una línea recta, mientras que

un valor de cero implica que no hay correlación lineal entre las respuestas y la concentración (Sierra

et al, 2010).

Otra alternativa que propone Sierra et al. (2010), es utilizar el coeficiente de correlación al cuadrado

(r2). Para el cual, un r2 por encima de 0.995 se considera un buen ajuste, pero si el valor de r2

disminuye lentamente o de repente con el tiempo, significa que algo no funciona correctamente.

3.4.3 Precisión

Se define como el grado de concordancia entre los resultados de test individuales cuando el

procedimiento es aplicado repetidas veces para una muestra homogénea. Generalmente, la precisión

de un método se expresa en términos de desviación estándar (SD) o de desviación estándar relativa

(RSD) en porcentaje (coeficiente de variación) (Morante, Sierra y Del Hierro, 2007).

Con este parámetro se conoce la variabilidad del método, esta variabilidad es debida a errores

aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Los factores susceptibles de influir sobre los

resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analistas, equipo instrumenta, reactivos,

tiempo, etc.) (AEFI, 2001).

Generalmente la precisión se puede estimar de tres formas como lo propone (AEFI, 2001):

Repetibilidad: Se lleva a cabo en un mismo laboratorio y en un corto periodo de tiempo, en donde

se analiza la misma muestra bajo condiciones iguales (mismos analistas, aparatos y reactivos).

22

Precisión Intermedia: Se analiza la misma muestra en un mismo laboratorio pero en condiciones

diferentes (diferentes analistas, aparatos, reactivos, días)

Reproducibilidad: Establece la variabilidad del método bajo condiciones operativas diferentes y en

diferentes laboratorios.

3.4.4 Exactitud

Es la medida de proximidad existente entre el resultado de un experimento o resultado experimental

y el resultado esperado o resultado teórico (Harvey, 2002). Cuando un método posee una elevada

exactitud, la medida de la muestra proporciona un valor que idealmente es idéntico al valor

verdadero o previamente conocido (Morante, Sierra y Del Hierro, 2007).

Usualmente se confunde la exactitud con la precisión sin embargo se debe tener en cuenta que la

precisión se relaciona con la dispersión de una serie de mediciones, pero no da ninguna información

sobre lo cerca que esta dicha medición del valor verdadero. Entonces se debe tener mediciones muy

precisas pero con una baja exactitud (AEFI, 2001).

3.4.5 Límite de detección y cuantificación

El límite de detección (LOD) se puede describir como aquella concentración que proporciona una

señal en el instrumento significativamente diferente de la señal del blanco (Harris, 2007). En donde la

mínima cantidad del analito se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar (AEFI, 2001).

En cuanto a límite de cuantificación (LC) de un método, se define como la mínima cantidad de

analito presente en la muestra que se puede cuantificar, con una adecuada precisión y exactitud

(AEFI, 2001).

3.5 Pruebas de genotoxicidad y mutagenicidad

Los bioensayos son pruebas que permiten detectar una gran variedad de sustancias químicas que

pueden producir daños genéticos, sin la necesidad de información previa acerca de la identidad y

propiedades físico-químicas de las mezclas, determinando si una sustancia o una mezcla de

compuestos genera toxicidad, y cuantificando la relación entre la concentración de un contaminante

con la respuesta que genera en un organismo vivo (Ohe et al., 2004); esto es aplicable a aguas

superficiales, ya que éstas reciben grandes cantidades de residuos provenientes de fuentes

industriales, domésticas y de agricultura, lo que indica que pueden contener muchos compuestos

desconocidos, y aun así, pueden ser usadas como fuente de agua de consumo, o para actividades

agrícolas, religiosas y recreacionales, generando problemas de salud pública y en los ecosistemas

acuáticos (White & Rasmussen, 1998; Ohe et al., 2004).

23

Dentro de los diversos ensayos que se utilizan para detectar la genotoxicidad/mutagenicidad

producto de sustancias o mezclas de compuestos, se encuentran:

3.5.1 Test de Ames

El Test de Ames es un ensayo de mutación que emplea a Salmonella typhimurium como bacteria

indicadora para detectar agentes mutagénicos en diversas sustancias; es la prueba más difundida,

siendo una de las más simples, rápidas y económicas, que permite evidenciar una mutación reversa

(Trossero et al., 2006).

Este test se basa en la detección de revertantes1 independientes de histidina (his), después de la exposición a las sustancias mutagénicas, en donde las diferentes respuestas de las cepas de Salmonella proveen información de los tipos de mutágenos presentes en el agua (Ohe et al., 2004).

3.5.2 Ensayo de Allium cepa

El ensayo de Allium cepa es usado para medir una variedad de parámetros morfológicos y

citogenéticos que pueden servir como indicadores de toxicidad, lo cual incluye las aberraciones

cromosomales y de micronúcleos (Leme & Marin-Morales, 2009), y se utiliza para monitorear los

efectos potenciales de una mezcla de contaminantes que incluyen a los metales pesados, y los

químicos hidrofílicos y lipofílicos (Caritá & Marin-Morales, 2008).

Este ensayo es un indicador de toxicidad de bajo costo que requiere corto tiempo, y provee

información acerca de la presencia de sustancias mutagénicas/genotóxicas en aguas, demostrando el

potencial que tienen estos compuestos para inducir aberraciones cromosomales en las células

radiculares de la planta de Allium cepa (Radic et al., 2010).

1. En esta prueba el indicativo de la mutación es la reversión his- a his +, los revertantes se conocen porque crecen en medio mínimo sin

histidina (Melédez, 2012)

24

4. OBJETIVOS

4.1 General

Realizar una evaluación preliminar del uso de las técnicas de rotaevaporación y liofilización como

métodos de concentración para determinar aluminio, selenio y hierro en agua potable por

Espectrofotometría de Absorción Atómica de Llama.

4.2 Específicos

Realizar un estudio de la precisión, exactitud, linealidad, límite de detección y límite de

cuantificación como indicadores operativos estadísticos para validar de forma preliminar, el uso

de la técnica de rotaevaporación para detección aluminio, selenio y hierro en agua.

Evaluar la técnica de liofilización como una alternativa de concentración de aluminio, hierro y

selenio en muestras de agua.

Establecer la diferencia de recuperación de ambos métodos.

Detectar la presencia de aluminio, selenio y hierro metales traza en muestras de agua potable de

tres puntos de muestreo en la ciudad de Bogotá.

25

5. METODOLOGÍA

5.1 Materiales y reactivos

En la elaboración de las tres curvas patrón realizadas a lo largo del estudio para cada elemento, así

como para la adición de los metales en las muestras a liofilizar, se utilizaron soluciones stock de 1000

ppm de Aluminio (JT Baker), Hierro (JT Baker) y Selenio (Merck). En la preparación de las

soluciones de concentración conocida se utilizó agua ultrapura tipo I (Milli-Q) acidulada con ácido

nítrico al 0.2% v/v; el lavado del material requerido en el estudio se realizó con agua y jabón, luego

se enjuagó con abundante agua, y finalmente se agregó agua tipo I con ácido nítrico al 0.2% v/v;

luego se colocaron en mufla a 120°C durante 12 horas, para eliminar humedad y otras impurezas.

5.2 Equipos

Durante la realización del estudio, se utilizó el espectrofotómetro de absorción atómica en llama

marca Varian AA 140, con lámparas de cátodo hueco monoelemento de aluminio, hierro y selenio,

configurando el equipo para una lectura de tres réplicas, tiempo de integración de 3 segundos y

tiempo de retraso en la lectura de 5 segundos. Un rotaevaporador LabTech EV311 con bomba de

presión de vacío marca Labtech modelo VP3; y un liofilizador marca Labconco FreeZone Plus con

capacidad de 4.5 litros en cascada.

5.3 Curvas de calibración de aluminio, hierro y selenio

Para la elaboración de las curvas patrón, se tomaron seis puntos más el blanco, en un rango de

concentraciones de 5 a 100 ppm para aluminio (5, 20, 40, 60, 80 y 100 ppm), 0.06 a 15 ppm para

hierro (0.06, 3, 6, 9, 12 y 15 ppm), y 5 a 250 ppm para selenio (5, 50, 100, 150, 200 y 250 ppm),

llevando a un volumen final de 25 ml con agua acidulada. Los blancos contenían agua tipo I

acidulada con ácido nítrico al 0.2% v/v. Luego, se leyó en el espectrofotómetro a una longitud de

onda específica para cada metal, 396.1 nm para aluminio, 248.3 nm para hierro y 196.0 nm para

selenio. Este mismo procedimiento se realizó para las nueve réplicas del estudio.

5.4 Determinación de la selectividad

Este parámetro se estableció por las diferencias de longitudes de onda (λ) a la que son medidas los

metales en el espectrofotómetro de absorción atómica en llama marca Varian AA 140 y las

propuestas por el Standard Methods, para verificar que no hay interferencia de otros metales en las

mediciones, ver en Anexos.

5.5 Determinación de la linealidad

A partir de las curvas patrón realizadas a lo largo del estudio, se evaluó el coeficiente de correlación,

el cual debía tener un valor mayor o igual a 0.995 (APHA, 1998). Además, se evaluó el

comportamiento de los datos obtenidos, con el fin de saber si éstos tenían una distribución normal o

26

no, efectuando una prueba de Shapiro-Wilk; y posteriormente, se realizó una prueba de Kruskal-

Wallis, para realizar una comparación de las réplicas evaluadas en donde se postula que Ho: No hay

diferencias significativas y Hi: Hay diferencias significativas. Ambos test se realizaron el software

SigmaPlot 10.0

Para una mayor confianza en la determinación de linealidad se realizó el test de t de Student, en

donde se dice que Ho: No existe correlación lineal y Hi: Existe correlación lineal.

Tanto en el test de t de Student como para Kruskal-Wallis, se mantuvo un alfa de 0.05 para un nivel

de confianza del 95%.

5.6 Determinación del límite de detección y de cuantificación

Con el fin de hallar el límite de detección, se leyeron más de 10 blancos medidos una vez cada uno,

se calculó la absorbancia promedio y ésta se sumó al producto de 3 veces la desviación estándar.

Posteriormente, el valor resultante se restó a la absorbancia promedio y se dividió entre la pendiente

de la curva de calibración, obteniendo el límite de detección en mg/L (UBA, 2012).

Para el cálculo del límite de cuantificación, se leyeron más de 10 blancos medidos una vez cada uno,

se calculó la absorbancia promedio y ésta se sumó al producto de 5 veces la desviación estándar. A

este valor resultante se le restó la absorbancia promedio sobre la pendiente de la curva de calibración,

obteniendo el límite de cuantificación en mg/L (UBA, 2012).

5.7 Determinación de exactitud

Para la determinación de la exactitud, se prepararon muestras de concentración conocida de cada

uno de los metales, a partir de la adición de una cantidad específica de los patrones. En el caso del

hierro, se leyeron en el espectrofotómetro concentraciones de 3, 9 y 15 ppm; para selenio se leyeron

de 50, 150 y 250 ppm, y finalmente para aluminio, las concentraciones leídas fueron de 5, 60 y 100

ppm. La exactitud se expresa en este estudio como porcentaje de error, calculada mediante la

siguiente ecuación (Arias, 2008):

5.8 Determinación de la precisión

En cuanto a la precisión, se calcularon las desviaciones estándar y desviaciones estándar relativas de

las muestras mencionadas en la determinación de exactitud, buscando obtener valores menores o

iguales al 5% en las desviaciones estándar relativas (AEFI, 2001).

5.9 Determinación del porcentaje de recuperación por liofilización y por rotaevaporación

Para la determinación del porcentaje de recuperación por liofilización, se prepararon muestras de

concentraciones conocidas para cada uno de los tres metales, mediante adición de los patrones, y

aforando a 50 ml con agua acidulada. Las concentraciones escogidas fueron de 5, 8 y 10 ppm para

27

aluminio: 1, 5 y 10 ppm para selenio; y 0.1, 0.5 y 1.3 ppm para hierro. Cada una de estas

concentraciones fue leída en el espectrofotómetro de absorción atómica en llama (FAAS), con el fin

de saber la concentración real de cada una de las soluciones. Posteriormente, se procedió a liofilizar

cada una de las muestras, ajustando el vacío a 0.040 mbar y una temperatura de -82°C, finalmente, se

midió el volumen final obtenido y se leyó en el espectrofotómetro.

En cuanto al porcentaje de recuperación por rotaevaporación, se prepararon soluciones stock de

cada metal con valores de 5, 20 y 50 ppm, para hierro, aluminio y selenio, respectivamente, mediante

la adición de cantidades conocidas de cada metal en presentación en polvo, los cuales se solubilizaron

según lo descrito en el manual del espectrofotómetro (Varian, 1989), aforando a un volumen final de

1 litro con agua acidulada. Estas soluciones se leyeron en el espectrofotómetro, y a partir de ellas se

prepararon las tres concentraciones conocidas de cada metal, con valores de 0.1, 0.5 y 1.3 ppm para

hierro; 5, 8 y 10 ppm para aluminio; y 1, 10 y 25 ppm para selenio, con un volumen final de 500 ml

en matriz de agua acidulada. Cada una de estas soluciones fue leída en el espectrofotómetro, y luego

fueron rotaevaporadas, estableciendo una temperatura de 70°C, una velocidad promedio de 110 rpm,

y un vacío constante de 0.07 MPa. Finalmente, se concentraron aproximadamente entre 10 y 20

veces, se midieron los volúmenes finales obtenidos, y se procedió a leer en el espectrofotómetro.

Los porcentajes de recuperación de cada uno de los métodos, se determinó mediante la siguiente

ecuación (AEFI, 2001):

A las muestras concentradas por rotaevaporación y por liofilización, se les midió el pH con tiras

indicadoras, con el fin de saber el estado final de las muestras.

5.10 Determinación de aluminio, hierro y selenio en tres lugares de la ciudad de Bogotá

Para determinar la concentración de estos tres metales en agua potable, se escogieron tres lugares de

muestreo en la ciudad de Bogotá (Universidad Javeriana, calle 129 y cercanías al hospital de Usme),

de los cuales se recolectó una muestra diaria de 1 litro, durante tres días consecutivos, a diferentes

horas. La Universidad Javeriana fue el único lugar del cual se obtuvieron cuatro muestras, debido a

observaciones de cambios en las características organolépticas del agua en este lugar, después del

tercer día de muestreo.

Las muestras recolectadas fueron aciduladas con 2 ml de ácido nítrico, con el fin de evitar adherencia

de los metales al material de vidrio utilizado, y luego fueron leídas en el espectrofotómetro. A

continuación, las muestras se rotaevaporaron según lo descrito anteriormente, concentrándolas entre

10 y 20 veces, para ser leídas nuevamente en el espectrofotómetro y cuantificar la concentración de

cada uno de los metales.

Finalmente, se midió el pH de cada una de las muestras rotaevaporadas, mediante tiras indicadoras.

28

6. RESULTADOS

6.1 Determinación de linealidad

Al realizar las curvas patrón de cada uno de los metales con nueve réplicas, se obtuvieron

coeficientes de correlación de 0.85, 0.96 y 0.98, y se determinaron las diferentes ecuaciones de la

recta, según lo muestran las Figuras 1-3.

Fig. 1. Curva calibración de aluminio, relacionando concentración vs absorbancia promedio

Según el análisis estadístico para la evaluación de la linealidad (t de student) para las curvas de

calibración de los tres metales en estudio, existe correlación lineal entre las concentraciones y el

promedio de las absorbancias, ver Anexos.

Fig. 2. Curva de calibración de selenio, relacionando concentración vs absorbancia promedio

A partir de la prueba de Shapiro-Wilk, se pudo determinar que los datos de las réplicas (absorbancias)

no tenían un comportamiento normal para los tres metales, para el análisis de las varianzas por

Kruskal Wallis se determinó que no existen diferencias significativas entre las réplicas; los informes

de las pruebas se encuentran en Anexos.

29

Fig. 3. Curva de calibración de hierro, relacionando concentración vs absorbancia promedio

6.2 Determinación de límite de detección y cuantificación

Para el caso del aluminio, al determinar el límite de detección y cuantificación, se obtuvieron valores

de 0.25 ppm y 0.42 ppm, respectivamente, al reemplazar en la ecuación de la recta, las mínimas

absorbancias que se diferencian de las respuestas del blanco. La ecuación de la curva de calibración

fue: y=0.002x + 0.011. A continuación, en la Tabla 1, se muestran los datos para los límites de

detección y cuantificación de aluminio.


del límite de detección y de cuantificación de aluminio

Absorbancia Promedio Desv. Est. YL LoD YL LoQ LoD (ppm) LoQ (ppm)

0.0075 0.0077

0.00757 0.000167 0.0081 0.0084 0.25 0.42

0.0073 0.0077

0.0074 0.0078

0.0074 0.0075

0.0075 0.0077

0.0075 0.0078 YL LoD= Mínima absorbancia detectada que se puede diferenciar de la absorbancia del blanco

YL LoQ= Mínima absorbancia cuantificada que se puede diferenciar de la absorbancia del blanco

LOD= Límite de Detección; LOQ= Límite Cuantificación

Al determinar el límite de detección y de cuantificación para selenio, se obtuvieron valores de 1.44 y

2.41 ppm, respectivamente, luego de haber reemplazado las absorbancias en la curva: y= 0.002x +

0.015. En la Tabla 2, se detallan los resultados de las absorbancias obtenidas y los cálculos hallados.

30


del límite de detección y de cuantificación de selenio


0.0072 0.0095

0.0085 0.0010 0.0114 0.0134 1.44 2.41

0.0071 0.0086

0.0088 0.0078

0.0094 0.0084

0.0098 0.0 1

0.0085 0.0092




Para hierro, se determinaron igualmente ambos parámetros, obteniendo un límite de detección de

0.06 ppm, y un límite de cuantificación de 0.10 ppm, reemplazando en la curva patrón de hierro: y=

0.053x + 0.137, los cuales se especifican en la Tabla 3.


del límite de detección y de cuantificación de hierro


0.0057 0.0026

0.0026 0.0011 0.0058 0.0080 0.06 0.10

0.0037 0.0013

0.0033 0.002

0.002 0.0022

0.0027 0.0019

0.0021 0.0022




6.3 Determinación de exactitud

Para la exactitud se evaluó la proximidad entre concentraciones teóricas y concentraciones

experimentales, en el caso de aluminio se evaluó este parámetro para tres concentraciones, 20, 60 y

100 ppm, en la Tabla 4 se puede observar el porcentaje de error correspondiente a la proximidad de

dichas concentraciones, con un promedio del 14.9%.

31

Tabla 4. Porcentaje de error para la determinación de la exactitud en mediciones de aluminio, hierro y selenio

Analito Concentración teórica

(ppm) Concentración

experimental (ppm) Promedio %

de error

Aluminio

20 17 60 56 14.9

100 82

Selenio

50 57 150 170 9.7

250 245

Hierro

3 2.92 9 8.8 2.5

15 14.6 *Número de muestras para cada concentración de cada analito = 18 muestras

Para el cálculo del porcentaje de error de muestras de selenio, se realizaron mediciones de

concentraciones de 50, 150 y 250 ppm, de las cuales se evaluó la proximidad con base a las

concentraciones experimentales, tal como se muestra en la Tabla 4, obteniendo un promedio de

porcentaje de error del 9.7%

En la Tabla 4 también se presenta la evaluación de proximidad correspondiente de las

concentraciones de teóricas de 3, 9 y 15 ppm y las concentraciones experimentales, para mediciones

de hierro, con un promedio del 2.5% de error.

6.4 Determinación de precisión

Para la determinación de precisión se analizó la repetibilidad del sistema de medición de dos curvas

de aluminio, bajo las mismas condiciones de medición, hallando el coeficiente de variación como se

muestra en la Tabla 5. Cada concentración fue leída dos veces por triplicado, para un total de 6

valores de absorbancia para cada concentración de cada analito.

Tabla 5. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de aluminio

Concentración (ppm)

Absorbancias Abs. Prom ± Desv. Est. CV %

0.0205 0.0269

5 0.0204 0.0267 0.0236 ± 0.0035 14.77

0.0204 0.0268

0.0818 0.1011

20 0.0819 0.1014 0.0916 ± 0.0106 11.58

0.082 0.1013

32

0.1579 0.1913

40 0.1587 0.1982 0.1763 ± 0.0194 11.03

0.1595 0.1923

0.2311 0.2765

60 0.2293 0.2760 0.2530 ± 0.0255 10.06

0.229 0.2763

0.2993 0.3497

80 0.2976 0.3496 0.3238 ± 0.0283 8.73

0.297 0.3493

0.3656 0.4157

100 0.3649 0.4161 0.3904 ± 0.0279 7.14

0.3645 0.4158

Al igual que aluminio se realizó para selenio el análisis de dos curvas para la repetibilidad del sistema

de medición, en la Tabla 6 se puede observar los coeficientes de variación obtenidos bajos las

mismas condiciones de medición.

Tabla 6. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de selenio


Absorbancias Abs. Prom ± Desv. Est. CV %

0.0102 0.0161

5 0.0107 0.0168 0.014 ± 0.0032 23.65

0.0109 0.0163

0.1364 0.1412

50 0.1362 0.1397 0.139 ± 0.0028 1.98

0.1371 0.1428

0.2731 0.2631

100 0.2722 0.2627 0.268 ± 0.0053 1.97

0.2729 0.2635

0.3935 0.3677

150 0.3911 0.3644 0.378 ± 0.0152 4.02

0.3908 0.361

0.4932 0.4551

200 0.4938 0.4572 0.475 ± 0.0200 4.20

0.4929 0.4584

0.5919 0.5445

250 0.5901 0.5449 0.568 ± 0.0250 4.41

0.5907 0.5462

33

En la Tabla 7 se muestra los coeficientes de variación para dos curvas de calibración de hierro,

obtenidas bajo las mismas condiciones de medición, analizando de esta manera la repetibilidad del

sistema.

Tabla 7. Valores de coeficiente de variación para la repetibilidad de hierro


Absorbancias Abs. Prom ± Desv.

Est. CV %

0.018 0.0248

0.06 0.0174 0.0251 0.0214 ± 0.0043 20.23

0.0169 0.0259

0.2822 0.2661

3 0.2817 0.2631 0.2735 ± 0.0091 3.32

0.2812 0.2667

0.5025 0.4696

6 0.5008 0.4759 0.4877 ± 0.0148 3.04

0.4996 0.4776

0.6818 0.6382

9 0.6813 0.638 0.6586 ± 0.0253 3.85

0.6818 0.6307

0.7958 0.7425

12 0.7977 0.7499 0.7691 ± 0.0298 3.88

0.7942 0.7342

0.8864 0.8156

15 0.8851 0.8192 0.8515 ± 0.0365 4.29

0.8829 0.8198

6.5 Determinación del porcentaje de recuperación por rotaevaporación y por liofilización.

Se analizaron los resultados obtenidos de la concentración de aluminio por rotaevaporación como el

método de concentración principal del estudio y de liofilización como un método adicional,

determinando en cada caso el porcentaje de recuperación como se muestra en la Tabla 8. Cada

concentración de cada analito se leyó tres veces por triplicado.

Tabla 8. Porcentaje de recuperación de aluminio por rotaevaporación y liofilización como métodos de

concentración

Conc. Inicial (ppm)

Conc. Final (ppm)

Conc. Teórica (ppm)

Vol. Inicial (ml)

Vol. Final (ml)

Factor de Concentración

% de Recuperación

Concentración por rotaevaporación

5 114 166.5 500 15 33.3 68.5

8.08 141 202.0 500 20 25 69.8

10.02 170 250.5 500 20 25 67.9

34

Concentración por liofilización

1 64.6 9.1 46.8 5.1 9.1 709.89

5.9 23.2 49.38 45.2 5.4 8.3 46.98

7.8* 34 39 20 4 5 87.18

15.3 33.59 147.8 46.4 4.8 9.6 22.73 *La evaluación de este estudio fue preliminar para observar si existía evidencia de concentración por el método de

liofilización.

Para la evaluación de la concentración de selenio por rotaevaporación como método principal y de

liofilización como método adicional, se halló el porcentaje de recuperación como se muestra en la

Tabla 9.

Tabla 9. Porcentaje de recuperación de selenio por rotaevaporación y liofilización como métodos de

concentración

Conc. Inicial (ppm)

Conc. Final (ppm)


Vol. Inicial (ml)

Vol. Final (ml)


% de Recuperación


1 44 69.4 500 7.2 69.4 63.4

9.2 218 306 500 15 3.33 71.24

24.9 296 443 500 28 17.85 66.81


0.95 11.7 14.3 45.5 3 15.1 81.56

6.21 52 63.3 46 4.5 10.2 82.09

6.5* 48 54,1 25 3 8.3 88.89

13.93 138.6 154.6 48 4.3 11.1 89.64 *La evaluación de este estudio fue preliminar para observar si existía evidencia de concentración por el método de

liofilización.

En la Tabla 10 se puede encontrar el porcentaje de recuperación resultante, después de concentrar

muestras de hierro por rotaevaporación como estudio principal y liofilización de manera adicional.

Tabla 10. Porcentaje de recuperación de hierro por rotaevaporación y liofilización como métodos de

concentración

Conc. Inicial (ppm)

Conc. Final (ppm)


Vol. Inicial (ml)

Vol. Final (ml)


% de Recuperación


0.13 3 5.15 500 12.6 39.6 58.3

0.48 12.2 18.00 500 13.3 37.5 67.8

1.32 17.3 27.84 500 23.7 21 62.1


0.33 3.5 4.36 46.2 3.5 13.2 80.35

0.56 4.7 5.38 48.2 5 9.6 87.43

1.38 13.4 16.42 45.4 3.8 11.9 81.60

35

6.6 Determinación de aluminio, hierro y selenio en tres lugares de la ciudad de Bogotá

Se determinó la concentración de estos tres metales en muestras de agua potable, de tres puntos

diferentes de la ciudad de Bogotá, esto se hizo antes y después de rotaevaporar, los resultados

obtenidos se muestran en las tablas a continuación.

Tabla 11. Resultados para hierro de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de

Bogotá, junto con el porcentaje de recuperación del método

Muestras Conc. Inicial

(ppm) Conc. Final

(ppm) Conc. Teórica

(ppm) Vol. Inicial

(ml) Vol. Final

(ml) % de

Recuperación

Usme 12-06 1.46 11.58 16.18 500 45 71.57

Usme 13-06 0.55 9.89 13.64 500 20 72.51

Usme 14-06 0.46 6.93 10.07 500 23 68.83

Casa* 11-06 1.21 10.81 15.13 500 40 71.43

Casa 12-06 0.68 10.95 15.55 500 22 70.39

Casa 13-06 0.15 1.72 2.54 500 30 67.54

PUJ** 11-06 0.04 0.41 0.61 500 30 66.29

PUJ 12-06 0.03 0.26 0.39 500 40 65.33

PUJ 13-06 0.05 0.36 0.57 500 40 63.38

PUJ 14-06 2.00 23.97 33.30 500 30 71.98 * Este lugar se encuentra en la calle 129 de Bogotá.

** Este lugar hace referencia a la Pontificia Universidad Javeriana, en la cual se tomaron las muestras de la Facultad de Ciencias.

Para la totalidad de las muestras recolectadas, no se encontró presencia de selenio, tal como se

observa en la Tabla 12, presentada a continuación.

Tabla 12. Resultados para selenio de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de



(ppm) Conc. Final


(ppm) Vol. Inicial

(ml) Vol. Final

(ml) % de

Recuperación

Usme 12-06 ND ND ND 500 45 ND



Casa 11-06 ND ND ND 500 40 ND



PUJ 11-06 ND ND ND 500 30 ND

PUJ 12-06 ND ND ND 500 40 ND

36

PUJ 13-06 ND ND ND 500 40 ND

PUJ 14-06 ND ND ND 500 30 ND ND= No Detectado.

Para las muestras de aluminio (Tabla 13), se evidenció presencia de este metal en todas las muestras

recolectadas de Usme, y en tres de las cuatro tomadas en la Universidad Javeriana.

Tabla 13. Resultados para aluminio de las diez muestras tomadas en tres lugares diferentes de la ciudad de



(ppm) Conc. Final


(ppm) Vol. Inicial

(ml) Vol. Final

(ml) % de

Recuperación

Usme 12-06 0.66 6.33 7.38 500 45 85.81

Usme 13-06 0.08 1.23 2.10 500 20 58.60

Usme 14-06 0.44 7.15 9.65 500 23 74.08




PUJ 11-06 0.06 0.43 1.07 500 30 40.38

PUJ 12-06 0.10 0.72 1.30 500 40 55.69

PUJ 13-06 ND ND ND 500 40 ND

PUJ 14-06 0.70 8.08 11.73 500 30 68.84 ND= No Detectado.

37

7. DISCUSIÓN

En el análisis de la linealidad para aluminio, selenio y hierro se obtuvo el coeficiente de correlación al

cuadrado (r2), el cual tuvo un valor de 0.8529, 0.9865 y 0.9637 respectivamente; según Sierra et al.

(2010) si un r2 es igual o mayor a 0.995 se considera que hay un buen ajuste. En este estudio, el r2

está por debajo del valor ideal, lo cual indica que no hay una proporcionalidad adecuada entre el

analito y la respuesta generada, por este motivo se decidió realizar el test de t de student, puesto que

es un método con mayor robustez para el análisis de este tipo de datos. El análisis estadístico

demostró que existe correlación lineal para cada una de las curvas de los tres metales, lo cual indica

que la linealidad se cumple.

Además, se realizó un análisis estadístico, el cual demostró que para 9 réplicas no había una

distribución normal de los datos (prueba de Shapiro-Wilk), y al hacer un análisis de varianzas se

comprobó que no existen diferencias estadísticamente significativas entre las réplicas (prueba de

Kruskal-Wallis). Este resultado fue el mismo para aluminio, selenio y hierro.

Para el caso de los límites de detección y cuantificación de cada uno de los metales estudiados, se

realizaron las determinaciones desarrolladas por Eurachem (2005) y la Universidad de Buenos Aires

(UBA), obteniendo los mayores valores para el caso de selenio, con un límite de detección de 1.44

ppm y un límite de cuantificación de 2.41 ppm, lo cual indica que el método no detecta ni cuantifica

concentraciones del metal menores a las mencionadas, por lo tanto, con el fin de reducir estos límites

se podría plantear la espectrofotometría de absorción atómica con generación de hidruros (HG-AAS)

para leer este metal a menores concentraciones (del orden de µg/L) y con ellos mejores los límites de

detección (Morand et al. 2002).

Con respecto a los límites de aluminio, se obtuvo un valor de 0.25 ppm como límite de detección, y

0.42 ppm para límite de cuantificación, en donde las lecturas de los blancos arrojaron valores

cercanos al cero, muy similares entre sí, lo cual se refleja en la desviación estándar hallada para este

metal, siendo ésta la menor de los tres metales evaluados, con un valor de 0.000167.

Los datos arrojados para hierro, revelaron un límite de detección de 0.06 ppm y un límite de

cuantificación de 0.10 ppm, siendo el método para hierro, el que tuvo ambos límites con los menores

valores. Esto se puede relacionar con el poco uso que se le ha dado a esta lámpara, en comparación a

las demás, siendo estos datos los más cercanos a los límites que plantea el manual del equipo, ya que

este último señala un límite de detección de 0.06 ppm.

Para aluminio y selenio, se obtuvieron porcentajes de error promedio de 14.7% y de 9.7,

respectivamente, tal como se muestra en la Tabla 4; al ser estos resultados mayores al 5%, se

considera que la exactitud del método analítico es baja (Harvey, 2002). Se debe tener en cuenta que

dos concentraciones experimentales en el caso de selenio fueron mayores a la concentración teórica

como se muestra en la Tabla 4, esto puede deberse a una saturación del sistema, la cual puede

suceder después de pasar por el equipo una concentración alta del metal y no dejar transcurrir un

lapso de tiempo adecuado para que el sistema limpie trazas del analito. Finalmente para hierro se

38

encuentra un porcentaje de recuperación de 2.5%, lo cual indica que el método analítico es

moderadamente exacto, puesto que se encuentra entre el 1% y el 5%, según lo planteado por Harvey

(2002).

En el análisis de la precisión sólo se calculo la repetibilidad, puesto que para evaluar la

reproducibilidad era necesario variar las condiciones de los laboratorios, reactivos, material y equipos,

lo cual no se logro realizar en este trabajo. Para la repetibilidad se realizaron dos curvas de calibración

por metal, las cuales se llevaron a cabo bajo las mismas condiciones. En general el coeficiente de

variación (CV) no debería ser mayor al 5% para el análisis de impurezas (AEFI, 2001); los resultados

de aluminio presentan en todas las concentraciones un CV mayor al 5%, en el caso de selenio y

hierro se presenta un CV mayor al 5% en las menores concentraciones de la curva de calibración (5 y

0.06 ppm, respectivamente) como se muestran en la Tabla 6 y 7; esta alta variabilidad es producida

por efecto de las bajas concentraciones, en donde se asegura que los coeficientes de variación

aumentan a medida que disminuye la concentración del analito (ISP de Chile, 2010); para las demás

concentraciones de hierro y selenio hay evidencia de una adecuada precisión. Analizando los

coeficientes de variación de selenio, se puede decir que hay una buena precisión, sin embargo, se

tiene una baja exactitud, esto es posible ya que la precisión está relacionada con la dispersión de una

serie de mediciones, pero no da ninguna información sobre lo cerca que está una medición del valor

verdadero (AEFI, 2001), en el caso de hierro, se cumple con una exactitud moderada, además se

obtiene una buena precisión de los datos, mientras que para aluminio no se evidencia exactitud ni

precisión. Los métodos de concentración por rotaevaporación y liofilización se evaluaron empleando

el porcentaje de recuperación, lo cual mostró que la rotaevaporación en promedio tiene un

porcentaje de recuperación de 65%, esto es un 17% menos de recuperación en comparación a los

resultados que se muestran en el estudio de Rodríguez (1999), aunque en general las condiciones

fueron similares entre ambos estudios, no hay evidencia si en el estudio de Rodríguez se utilizó

alguna técnica de conservación de muestras para evitar la baja solubilización y adherencia de los

metales al material de vidrio, igualmente no se específica el tipo de vidrio que fue el utilizado. Sin

embargo el 65% de recuperación alcanzado en este estudio, posiblemente se dio por la adherencia de

los metales al material de vidrio, aunque se haya usado ácido nítrico para la conservación de las

muestras y lavado del material.

Para los estudios de mutagenicidad y genotoxicidad, el método de rotaevaporación es empleado para

la eliminación de los solventes orgánicos que son usados para eluir las muestras concentradas por

medio de resinas XAD 2 y XAD 8 (Carraro, 2000); sin embargo no se usa para concentrar

directamente el analito. Lo mismo sucede en el procedimiento de Guzzela (2002), en el cual la

rotaevaporación es usada para eliminar las sustancias usadas en la elución de los cartuchos C18.

Griffol (1992) y Dutka (1981) usan el método de rotaevaporación, para luego filtrar las muestras y

agregar DMSO. En estos estudios se logra ver la eficiencia de la concentración, pero son realizados

para un conjunto de agentes contaminantes diferentes a los metales.

Como un método de concentración alterno para metales, se propuso y se evaluó la liofilización, este

procedimiento fue propuesto por el director de este trabajo (Luis Gonzalo Sequeda), ya que no se ha

39

reportado para concentrar muestras que contengan analitos de interés que vayan a ser posteriormente

cuantificados; usualmente su uso está ligado a la industria de alimentos y farmacéutica, en donde es

utilizado para reducir volumen, envasado de algún producto, conservación de muestras o alimentos,

por este motivo se realizó un ensayo para observar la recuperación que este método tiene para

concentrar aluminio, selenio y hierro, encontrándose que este presenta un porcentaje de recuperación

promedio del 85% para selenio y hierro, en el caso del aluminio los resultados presentaron una alta

variación puesto que durante el estudio se evidencio la deficiencia de la lámpara de aluminio, por esto

los datos de este metal no se incluyen en el promedio anterior. El resultado de 85% en la liofilización

puede deberse a que el proceso favorece la eliminación de agua sin alterar los componentes de la

muestra, quedando intactos en el concentrado. Es posible que este método arroje un porcentaje de

recuperación mayor, si el material volumétrico usado fuese de teflón, para evitar adherencia de los

analitos a las paredes internas del material. Se evidencia que esta técnica supera a la rotaevaporación

en un 13%, lo cual puede ser posible ya que el proceso de rotaevaporación se realiza en material de

vidrio, lo cual hace que se presenten mayores pérdidas de metales por adherencia.

En cuanto a los resultados obtenidos para las muestras de agua potable recolectadas, no hubo

detección de selenio en las muestras antes y después de rotaevaporar, ya sea porque no se encontraba

en las muestras, o debido a que los límites de detección y cuantificación para el método de selenio

son los más altos como se muestra en la Tabla 2, y no se esperan concentraciones muy altas en agua

potable para este metal (Mehdi et al., 2013); por lo tanto, no fueron detectados en las muestras

analizadas en este estudio, sin embargo este análisis se hizo directamente sin el uso del generador de

hidruros, lo cual influye en gran medida en la determinación de este metal.

Para la determinación de aluminio, se encontró presencia de este metal en todas las muestras de

Usme, y en tres muestras de la Universidad Javeriana como se muestra en la Tabla 13, logrando un

porcentaje de recuperación promedio de 64% con este método. Esto puede explicarse debido al uso

de este elemento en forma de sal, como coagulante (OMS, 2006), o por la liberación de aluminio

debido a la lluvia ácida, que hace que éste pueda movilizarse en corrientes de agua (Exley et al., 2002;

Crisponi G, 2012).

La Resolución 2115 del 2007, señala que el valor máximo permisible de aluminio en agua potable es

de 0.2 mg/L, este valor se ve sobrepasado en tres muestras antes de ser rotaevaporadas, como se

muestra en la (Tabla 13) (Usme 12 -06, Usme 14 -06 y PUJ 14 – 06), estos valores pueden ser el

resultado de un exceso en el uso de coagulante en el proceso de potabilización. Sin embargo se debe

tener en cuenta que el límite de detección del aluminio en el sistema en este estudio es de 0.25 ppm

Tabla 1, por lo cual, para este metal no se pueden obtener datos confiables por debajo de este límite

de detección. Las implicaciones que tiene el aluminio al encontrarse en una mayor cantidad a la

permitida es la aparición de síntomas como inhabilidad para concentrarse, pérdida de la memoria,

cambios en la personalidad, depresión, alucinaciones visuales y/o auditivas, debilidad, fatiga,

convulsiones epilépticas, entre otros (Crisponi et al., 2013).

En las Tablas 11, 12 y 13 se pueden observar las concentraciones iniciales de las muestras de agua

potable para los tres metales en estudio, en las cuales se puede observar que existe un porcentaje de

40

recuperación considerable y que en muestras en donde no se detectó el metal al inicio si se detectó

después de realizar la concentración por rotaevaporación, lo cual indica que aunque no se detecte al

inicio del análisis con ayuda de la concentración se puede determinar con facilidad aluminio y hierro.

La Resolución 2115, también establece que el valor máximo aceptable de hierro en agua potable es

de 0.3 mg/L, el cual es sobrepasado al inicio del tratamiento, en 6 de las 10 muestras recolectadas

(Tabla 11), estos valores indican que el agua que se usa para el consumo no cumple con la normativa

actual, esto puede presentarse al igual que el aluminio por la mala dosificación del floculante al

momento de su adición, ésta es una de las razones planteadas por la OMS. Incluso, las

concentraciones que se encontraron por debajo de lo establecido, pueden significar un peligro

potencial para la salud, ya que el hierro tiene la capacidad de acumularse lentamente en los tejidos del

cuerpo (Hotz, 2012), llegando a causar enfermedades a largo plazo, incluido el estrés oxidativo

inducido por hierro (Barton et al. 1998).

Finalmente, se logró determinar la presencia de hierro en todas las muestras recolectadas en el

estudio, obteniendo un porcentaje de recuperación promedio del método del 69%. Su presencia en el

agua no se debe solamente a su uso como agente coagulante en el proceso de potabilización, sino

también por la corrosión de las tuberías durante la distribución del agua a los hogares (OMS, 2006).

Al lograr un aumento en la concentración de los contaminantes analizados en este estudio, mediante

la técnica de rotaevaporación, se podría llegar a utilizar este método para la evaluación de

mutagenicidad y genotoxicidad; sin embargo, aparte de la determinación de los analitos en estudio, se

midió al final del proceso el pH de las muestras tratadas, encontrándose valores inferiores a 1, según

la escala de la prueba; un pH tan bajo afecta el crecimiento adecuado de los organismos empleados

como indicadores de toxicidad, y pueden generar falsos positivos; por este motivo si se requieren las

muestras para realizar bioensayos, se deberá hacer la evaluación de proceso con otro material para no

acidificar las muestras y lograr comparar los resultados obtenidos con los arrojados por este estudio.

En general, se puede afirmar que los resultados de hierro fueron mejores en comparación a los

resultados de aluminio y selenio, esto se debe en su mayoría a que la lámpara de hierro tiene un

menor tiempo de uso. Esto se vio reflejado al momento del ajuste del equipo, ya que para las

lámparas de aluminio y selenio se tenía que colocar una mayor corriente para poder arrancar el

proceso y la ganancia promedio obtenida era de 26%, en cambio para la lámpara de hierro no hubo

problemas en el ajuste, y la ganancia promedio era del 84%.

Es importante tener en cuenta que al igual que la exactitud, la precisión se ve afectada por los

factores que influyen directamente sobre la relación entre la señal y el analito (Harvey, 2002), por este

motivo es de esperarse que la señal deficiente que emite la lámpara de aluminio por el desgaste que

presenta, afecte directamente las mediciones.

41

8. CONCLUSIONES

Se realizó una validación preliminar de la técnica de rotaevaporación como método de concentración

para aluminio, selenio y hierro, evaluando los parámetros de selectividad, linealidad, exactitud,

precisión en términos de repetibilidad, límites de detección y de cuantificación.

Analizando las dos técnicas puestas a punto para concentrar aluminio, selenio y hierro, se encontró

que el porcentaje de recuperación promedio para la rotaevaporación y liofilización es de 66% y 85%

respectivamente, se puede ver, entonces, que el método de concentración por liofilización es un 19%

mejor que la rotaevaporación.

Los resultados de las Tablas 11 y 13, muestran que se halló hierro y aluminio en muestras donde al

inicio no son detectados, e igualmente se evidenció concentración del analito en muestras que

presentaban concentraciones bajas antes de rotaevaporar o liofilizar; esto demuestra que las técnicas

cumplen con el objetivo de recuperar metales en muestras de agua potable que se encuentran por

debajo del límite de detección.

El pH menor a 1 de las muestras concentradas por ambas técnicas, hace que no sea posible la

realización de ensayos de mutagenicidad y genotoxicidad a partir de dichas muestras, debido a la

susceptibilidad de los organismos indicadores al bajo pH.

42

9. RECOMENDACIONES

La técnica de liofilización no fue un método de concentración óptimo para concentrar grandes

volúmenes muestras, esto, por las limitaciones del equipo que se encuentra en el laboratorio de

bioquímica especializada, es por esta razón que es importante hacer un escalado del proceso, si se

desea realizar más estudios.

De igual manera se debe tener en cuenta que la liofilización no se encuentra reportada por la EPA u

otra entidad, para la concentración de metales en agua potable, y que es necesario realizar más

ensayos para saber qué tan eficiente es a la hora de ser aplicada a este tipo de pruebas.

Con el fin de llegar a implementar la técnica de rotaevaporación como método de concentración, se

recomienda evitar el material de vidrio y usar teflón para rotaevaporar las muestras, con el fin de no

acidular las muestras y no reportar falsos positivos en las pruebas de mutagenicidad y genotoxicidad

Al momento de realizar la validación se debe contar con lámparas de cátodo hueco que presenten

condiciones óptimas de trabajo, y realizar un seguimiento de la vida útil de éstas.

43

10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Agencia de Protección Ambiental – EPA (2013) http://water.epa.gov/drink/contaminants/.

Consultado Junio 3 de 2013

American Public Health Association – APHA (1998) Standard Methods for the examination of water

and wastewater. Edición 20, Greenbers, USA

Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria – AEFI (2001) Validación de Métodos

Analíticos, Barcelona, España

Baird C (2001) Environmental Chemistry. W.H. Freeman and Company, second edition, New York,

USA

Barton JC, McDonell SM, Adams PC, Brissot PC, Powell LW, et al. (1998) Management of

Hemochromatosis. Annals of Internal Medicine 129:932-939

Caritá R, Marin-Morales MA (2008) Induction of chromosome aberrations in the Allium cepa test

system caused by the exposure of seeds to industrial effluents contaminated with azo dyes.

Chemosphere 72:722-725

Carraro E, Bugliosi EH, Meucci L, Baiocchi C, Gilli G (2000) Biological drinking water treatment

processes, with special reference to mutagenicity. Water Research 34(11):3042-3054

Crisponi C, Fanni D, Gerosa C, Nemolato S, Nurchi VM, et al. (2013) Review: The meaning of

aluminium exposure on human health and aluminium-related diseases. Biomolecular Concepts

4(1):77-87 doi: 10.1515/bmc-2012-0045

Crisponi G, Nurchi VM, Bertolasi V, Remelli M, Faa G (2012) Chelating agents for human diseases

related to aluminium overload. Coordination Chemistry Reviews 256:89–104

Dutka B, Jova A, Brenchin J ( 1981) Evaluation of four concentration/extraction procedures on

waters and effluents collected for use with the Salmonella thyphimurium screening procedure for

mutagens. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 27:758-764

Emsley J (2011) Nature’s Building Blocks: An A-Z Guide to the Elements. Oxford University Press,

New York, USA

Exley C, Schneider C, Doucet F (2002) The reaction of aluminium with silicic acid in acidic solution:

an important mechanism in controlling the biological availability of aluminium. Coordination

Chemistry Reviews 228:127–135

Farahmand F, Pirumyan G, FarahmandGhavi F (2011) Evaluation of heavy metals pollution in

drinking water based on ground water sources. Australian Journal of Basic and Applied Sciences

5(6):891-896

Fieser L (2004). Experimentos de química orgánica. Editorial Reverté, primera edición, pp. 269-275

Gawdzik J, Gawdzik B (2012) Mobility of heavy metals in municipal sewage sludge from different

throughput sewage treatment plants. Polish Journal of Environmental Studies 21(6):1603-1611

Grifoll M , Solanas A, Bayona J (1992) Bioassay-directed chemical characterization of genotoxic

agents in the dissolved and particulate water phases of the Besos and Llobregat rivers (Barcelona,

Spain). Enviromental Contamination and Toxicology 23:19-25

Gusler G, Browne T, Cohen Y (1993). Sorption of Organics from Aqueous solution onto Polymeric

Resins. Industrial & Engineering Chemistry Research 32:2727 – 2735

44

Guzzella L, Feretti D, Monarca S (2002) Advanced oxidation and adsorption technologies for organic

micropullutant removal from lake water used as drinking-water supply. Water Research 46:4307-

4318

Harris D (2007). Análisis químico cuantitativo. Editorial Reverté, sexta edición, España, pp. 596

Harvey D (2002) Química Analítica Moderna. McGraw-Hill. Madrid, España, pp. 46-94

Horta A (2008). Separación de aminoácidos y derivados utilizando resinas impregnadas de

extractante. Universidad de Burgos Departamento de Biotecnología y Ciencia de los Alimentos. 49-

57.

Hotz K, Krayenbuehl PA, Walezyk T (2012) Mobilization of storage iron is reflected in the iron

isotopic composition of blood in humans. Journal of Biological Inorganic Chemistry 17:301-309

doi: 10.1007/s00775-011-0851-2

Instituto de salud Pública de Chile (2010). Validación de métodos y determinación de la

incertidumbre de la medición: Aspectos generales sobre la validación de métodos. Chile, pp. 21-44

Kotz J, Treichel P, Weaver G (2005) Química y Reactividad Química. Editorial Thomson, sexta

edición, México D.F.

Labconco Corporation. (2012). Freeze dry systems and accerrories. [en linea], disponible en:

http://www.labconco.com/category/freezone/product_literature. Recuperado Junio 3 2013.

Lamarque A, Zygadlo J, Labuckas D, López L, Torres M, Maestri D. (2008). Fundamentos teórico-

prácticos de química orgánica. Encuentro grupo editor. Primera edición, pp 29-33

Leme DM, Marin-Morales MA (2009) Allium cepa test in environmental monitoring: a review on its

application. Mutation Research 682:71-81

Mackay D, Fraser A (2000) Bioaccumulation of persistent organic chemicals: mechanisms and

models. Environmental Pollution 110:375-391

Manahan S (2006) Introducción a la Química Ambiental. Ediciones Reverté S.A., México D.F.

Mehdi Y, Hornick JL, Istasse L, Dufrasne I (2013) Review: Selenium in the environment, metabolism

and involvement in body functions. Molecules 18:3292-3311 doi: 10.3390/molecules18033292

Meléndez I, Martínez M, Quijano A. (2012) Actividad mutagénica y genotóxica en el material

particulado fracción respirable MP2,5, en Pamplona, Norte de Santander, Colombia. IATREIA

Vol 25(4), pp 349 – 356.

Mencías E, Mayero LM (2000) Metales. En: Mencías E (ed) Manual de Toxicología Básica. Ediciones

Díaz de Santos, Madrid, España, pp 619-647

Ministerio de la Protección Social, Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial (2007a)

Decreto 1575.

www.participacionbogota.gov.co/index.php?option=com_remository&Itemid=73&func=fileinfo&

id=821. Consultado Junio 2 2013

Ministerio de la Protección Social, Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial (2007b)

Resolución 2115. http://www.minambiente.gov.co/documentos/res_2115_220707.pdf.

Consultado Junio 2 2013

Morand E, Giménez M, Benitez M, Garro O (2002) Determinación de arsénico en agua por

espectrometría de absorción atómica con generación de hidruro (HG-AAS) Reunión de

Comunicaciones Científicas y Tecnológicas UNNE

45

Morante S, Sierra I, Del Hierro I. (2007). Desarrollo de métodos analíticos para la separación quiral y

su aplicación al estudio de procesos de síntesis asimétrica. Editorial Dykinson, Madrid, España, pp

24-28

Muhammad S, Shah M, Khan S (2011) Health risk assessment of heavy metals and their source

apportionment in drinking water of Kohistan region, northern Pakistan. Microchemical Journal

98:334-343

Ohe T, Watanabe T, Wakabayashi K (2004) Mutagens in surface waters: a review. Mutation Research

567:109-149

Organización Mundial de la Salud - OMS (2006) Guías para la calidad del agua potable [recurso

electrónico]: Primer apéndice, Vol. 1. Tercera edición

Radic S, Stipanicev D, Vujcic V, Rajcic MM, Sirac S, Pevalek-Kozlina B (2010) The evaluation of

surface and wastewater genotoxicity using the Allium cepa test. Science of the Total Environment

408:1228-1233

Sierra I, Pérez D, Gómez S, Morante S (2010). Análisis Instrumental. Netbiblo, España, pp 4-17

Suárez R, Arévalo E, Linares L, Ustáriz F, Hernández G (2009) Validación de un método analítico

para la determinación de magnesio eritrocitario. Avances en Química 4(2):53-62

Trossero C, Caffarena G, Hure E, Rizzotto M (2006) Detección de mutagenicidad en compuestos N-

Nitroso con el Test de Ames. Acta farmacéutica bonaerense 25(1):139-144

Universidad de Buenos Aires – UBA (2012) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Guía de

Laboratorio para la Calibración y Límite de Detección en Técnicas Instrumentales [recurso

electrónico] En: http://www.qi.fcen.uba.ar/materias/ai/laboratorio/calibracion.pdf Consultado

Junio 22 2013

Vincent M, Álvarez S, Zaragozá J (2006). Química industrial orgánica. Editorial Universidad

Politécnica de Valencia, Valencia, España, pp 98-100

White PA, Rasmussen JB (1998) The genotoxic hazards of domestic wastes in surface waters.

Mutation Research 410:223-236

Zhou Y, Benson JM, Irvin C, Irshad H, Yung-Sung C (2007) Particle size distribution and inhalation

dose of shower water under selected operating conditions. Inhalation Toxicology 19(4):333-342

46

11. ANEXOS

Anexo 1. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para aluminio

Modelo de linealidad Aluminio

Prueba de normalidad (Shapiro-Wilk) Pasado (P = 0,923)

1.

Nombre del

grupo

N Faltante Promedio Des.

estandar

SEM

Prom 6 0 0,184 0.122 0.0498

Media poblacional hipotética 0,000

t = 3,694 con 5 grados de libertad. (P = 0,014)

Intervalo de confianza del 95 por ciento para la media poblacional: 0,0559 a 0,312

Existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de la población de la muestra y la

media poblacional hipotética (P = 0,014).

Poder de la prueba realizada con alfa = 0,050: 0,836

Análisis de varianza de Aluminio

Prueba de normalidad (Shapiro-Wilk) Fallo (P <0,050)

Kruskal-Wallis una forma de análisis de varianza de Rangos

Grupo N Faltante Mediana 25% 75%

Col 2 6 0 0,195 0,0665 0,316

Col 3 6 0 0,194 0,0665 0,314

Col 4 6 0 0,194 0,0666 0,314

Col 5 6 0 0,234 0,0825 0,366

Col 6 6 0 0,234 0,0827 0,366

Col 7 6 0 0,234 0,0827 0,366

Col 8 6 0 0,134 0,0489 0,214

Col 9 6 0 0,134 0,0489 0,213

Col 10 6 0 0,134 0,0487 0,212

H = 4832 con 8 grados de libertad. (P = 0,775)

Las diferencias en los valores medios entre los grupos de tratamiento no son lo suficientemente grande

como para excluir la posibilidad de que la diferencia se debe a la variabilidad del muestreo aleatorio, y no

hay una diferencia estadísticamente significativa (P = 0,775).

47

Anexo 2. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para selenio

Modelo de linealidad Selenio


Nombre del

grupo

N Faltante Promedio Des. estandar SEM

Prom 6 0 0,308 0.208 0.0850


t = 3.631, con 5 grados de libertad. (P = 0,015)

Intervalo de confianza del 95 por ciento para la media poblacional: 0,0901 a 0,527




Análisis de varianza Selenio




Col 1 6 0 0,333 0,105 0,518

Col 2 6 0 0,332 0,105 0,518

Col 3 6 0 0,332 0,106 0,517

Col 4 6 0 0,315 0,110 0,477

Col 5 6 0 0,314 0,109 0,479

Col 6 6 0 0,312 0,111 0,480

Col 7 6 0 0,338 0,112 0,505

Col 8 6 0 0,340 0,112 0,502

Col 9 6 0 0,339 0,110 0,478


Las diferencias en los valores de la mediana entre los grupos de tratamiento no son lo suficientemente

grande como para excluir la posibilidad de que la diferencia se debe a la variabilidad del muestreo

aleatorio, y no hay una diferencia estadísticamente significativa (P = 1,000).

48

Anexo 3. Pruebas estadísticas de t de Student y Kruskal-Wallis para hierro

Modelo de linealidad para hierro


Nombre del

grupo

N Faltante Promedio Des. estandar SEM

Prom 6 0 0,308 0.208 0.0850


t = 3.784, con 5 grados de libertad. (P = 0,013)

Intervalo de confianza del 95 por ciento para la media poblacional: 0133 a 0696




Análisis de varianza Hierro




Col 2 6 0 0,327 0,118 0,497

Col 3 6 0 0,328 0,120 0,507

Col 4 6 0 0,337 0,109 0,492

Col 5 6 0 0,554 0,200 0,761

Col 6 6 0 0,553 0,199 0,767

Col 7 6 0 0,558 0,202 0,756

Col 8 6 0 0,486 0,171 0,709

Col 9 6 0 0,483 0,170 0,706

Col 10 6 0 0,487 0,169 0,709


Las diferencias en los valores medios entre los grupos de tratamiento no son lo suficientemente grande

como para excluir la posibilidad de que la diferencia se debe a la variabilidad del muestreo aleatorio, y no

hay una diferencia estadísticamente significativa (P = 0,704).

49

Anexo 4 Listado de metales con absorbancias para el Espectrofotómetro de Absorción

Atómica de Llama

Metal Longitud de onda (λ)






Ag 328.1 Cr 425.4 Ho 559 Nb 405.9 Rh 369.2 Te 214.3

Al 396.1 Cs 852.1 Ln 451.1 Nd 660.8 Ru 372.8 Ti 399.8

As 189 Cu 327.4 Lr 380 Ni 341.5 Sb 259.8 Tl 535.1

Au 267.6 Dy 526.5 K 766 Os 426.1 Sc 402 Tm 410.6

B 249.7 Er 400.8 La 441.7 P 213.6 Se 196 u 591.5

Ba 553.6 Eu 459.4 Li 670.8 Pb 405.8 Si 251.6 V 437.9

Be 234.9 Fe 372 Lu 466.2 Pd 363.5 Sm 442.4 W 400.9

Bi 223.1 Ga 403.3 Mg 285.2 Pr 284 Sn 284 Y 407.7

Ca 422.7 Gd 461.7 Mn 403 Pt 266 Sr 460.7 Yb 398.8

Cd 326.1 Hf 368.2 Mo 390.3 Rb 780 Ta 481.3 Zn 213.9

Co 345.4 Hg 253.7 Na 589 Re 346.1 Tb 596 Zr 360.1

Anexo 5. Mediciones de pH

Fig. 1. Tabla de comparación para resultados de

las tiras de pH. Fuente: Autor

Fig. 2. Prueba control de agua Tipo I y agua

acidulada al 2%. Fuente: Autor

50

Fig. 3. pH de muestras de hierro después de

rotaevaporar. Fuente: Autor

Fig. 4. pH de muestras de hierro después de

liofilizar. Fuente: Autor

Fig. 5. pH de muestras de aluminio después de


Fig. 6. pH de muestras de aluminio después de


Fig.7. pH de muestras de selenio después de


Fig. 8. pH de muestras de selenio después de


51

Fig.9. pH de muestras de la PUJ después de


Fig.11. pH de muestras de la calle 129 después de


Fig. 10. pH de muestras de Usme después de


validación preliminar de la técnica de rotaevaporación

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