validaciÓn primaria de la tÉcnica para la detecciÓn de
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VALIDACIÓN PRIMARIA DE LA TÉCNICA PARA LA DETECCIÓN DE Salmonella sp
EN ABONOS ORGÁNICOS MEDIANTE PRUEBA ELISA (TECRA) VIA 3M BAJO
LA NORMA TÉCNICA COLOMBIANA ICONTEC (NTC 5167)
JULIETH ANDREA NAVARRETE FERNÁNDEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de
Microbióloga Agrícola y Veterinaria
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA
BOGOTÁ, D.C.
2011
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VALIDACIÓN PRIMARIA DE LA TÉCNICA PARA LA DETECCIÓN DE Salmonella sp
EN ABONOS ORGÁNICOS MEDIANTE PRUEBA ELISA (TECRA) VIA 3M BAJO
LA NORMA TÉCNICA COLOMBIANA ICONTEC (NTC 5167)
JULIETH ANDREA NAVARRETE FERNÁNDEZ
APROBADO:
____________________________ María Angélica Pichimata
Directora – Química
___________________________
Sergio Pardo Díaz Codirector - Microbiólogo
________________________________ ____________________________ Adriana Cristina Moreno Hernández Diana Beatriz Sánchez López Jurado – Química Jurado - Bacterióloga
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución N° 13 de Julio de 1946.
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Sólo velará porque no publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
4
Dedicado:
A mi mama por su cariño,
Apoyo y guía incondicional
.
5
Agradecimientos
A, Felipe Ponce de León, Gracias por tu apoyo y paciencia sin ti no lo hubiera logrado.
A la Dra. Janeth Arias por su compromiso, apoyo y colaboración Incondicional.
Sergio Pardo, Codirector, por su apoyo incondicional, colaboración, asesora y compromiso
para con el trabajo, Muchas Gracias.
A la, Dr Angélica Pichimata, Directora, por su colaboración y compromiso con el proyecto.
A la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria CORPOICA.
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TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 9
2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ............................................ 10
2.1 Formulación del problema............................................................................. 10
2.2 Justificación .................................................................................................. 11
3. MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 12
3.1 Generalidades de Validación.......................................................................... 13 3.1.1 Validación de métodos microbiológicos cualitativos. ................................................ 14
3.2 Microorganismo de Estudio ........................................................................... 15 3.2.1 Taxonomía del Genero Salmonella sp. ....................................................................... 16 3.2.2 Estructura antigénica ................................................................................................. 16 3.2.3. Salmonella sp. en el medioambiente ........................................................................ 17
3.3 Abonos Orgánicos. ........................................................................................ 17 3.3.1 Tipos de abonos orgánicos ........................................................................................ 17
3.4 Parámetros de calidad microbiológica en abonos orgánicos .......................... 18
3.5 Métodos usados ............................................................................................ 19 3.5.1 Metodología de referencia ......................................................................................... 19 3.5.2 Metodología alternativa. ........................................................................................... 20
4. OBJETIVOS ...................................................................................................... 21
4.1 Objetivo General ........................................................................................... 21
4.2 Objetivos específicos ..................................................................................... 21
5. MATERIALES Y METODOS ................................................................................ 22
5.1 Localización................................................................................................... 22
5.2 Microorganismo y matriz de evaluación......................................................... 22
5.3 Equipos ........................................................................................................ 22
5.4 Metodología ................................................................................................. 23 5.4.1 Prueba de viabilidad y pureza de la cepa. ................................................................. 23 5.4.2 Prueba de esterilidad de los medios de Cultivo. ......................................................... 23 5.4.3 Descripción de matrices y Controles. .......................................................................... 24
5.5 Validación de la Técnica ELISA (Tecra) VIA 3M para detección de Salmonella sp............................................................................................................................ 25
5.5.1 Preparación del inoculo .............................................................................................. 25
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5.5.2 Nivel de Detección Relativo del Método..................................................................... 26 5.5.3 Precisión relativa del método. .................................................................................... 26 5.5.4 Prueba para Reproducibilidad del Método ............................................................... 27
5.6 Análisis Estadístico de las Variables de Estudio .............................................. 27 5.6.1 Nivel de Detección Relativo del método. .................................................................... 27 5.6.2 Precisión relativa del Método. ................................................................................... 28 5.6.3 Reproducibilidad del Método. .................................................................................... 28
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 28
6.1 Calibración y mantenimiento de equipos. ...................................................... 28
6.2 Prueba de viabilidad y pureza de la cepa. ...................................................... 29
6.3 Prueba de esterilidad de los medios de Cultivo. ............................................. 30
6.4 Nivel de detección relativo del método. ......................................................... 30
6.5 Precisión Relativa. ........................................................................................ 31 6.5.1 Precisión Relativa (AC)................................................................................................ 33 6.5.2 Desviación Positiva del Método. ................................................................................ 34 6.5.3 Desviación Negativa del Método. .............................................................................. 34
6.6 Especificidad Relativa (SP) ............................................................................ 34
6.7 Sensibilidad Relativa (SE) .............................................................................. 35
6.8 Reproducibilidad ........................................................................................... 35
7. CONCLUSIONES ............................................................................................... 36
8. RECOMENDACIONES ....................................................................................... 37
9. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 38
ANEXOS .............................................................................................................. 41
ANEXO 1: Esquema de Método de Referencia ..................................................... 41
Anexo 2: Esquema Método Alternativo ............................................................... 42
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Medios de cultivo usados para el proceso de validación.
Tabla 2. Concentración de microorganismo/ ml para la evaluación del nivel de detección
relativo de la técnica.
Tabla 3. Programa de Calibración y Mantenimiento de los equipos usados en la validación.
Tabla 4. Resultados de las pruebas de viabilidad y pureza para Salmonella Typhimurium TB
12.
Tabla 5. Datos recopilados en los ensayos para el cálculo del nivel de detección relativo de
la técnica.
Tabla 6. Modelo de tabulación de datos norma técnica ISO 16140:2003
Tabla 7. Datos de precisión relativa de la Técnica referencia y la técnica alternativa
Tabla 8. Tabulación de Datos precisión relativa de la Técnica referencia y la técnica
alternativa
Tabla 9. Índice de concordancia Kappa.
Tabla 10. Datos recopilados en los ensayos de reproducibilidad de la técnica.
Tabla 11. Tabulación de Datos ensayos de reproducibilidad de la técnica.
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1. INTRODUCCIÓN
La sostenibilidad de los sistemas agrícolas es un problema mundial importante, el uso de
fertilizantes orgánicos extraídos de los excrementos animales u otros residuos agrícolas
contribuye a la sostenibilidad de los ecosistemas agrícolas y la protección del medio
ambiente. (Chang et al., 2010). Los estudios a largo plazo han demostrado que la aplicación
de materia orgánica mejora sustancialmente las propiedades del suelo, el rendimiento de los
cultivos e incluyendo la capacidad de retención de agua, porosidad (Chang et al., 2010). Una
de las principales formas de fertilización orgánica es la aplicación de abono orgánico, existen
varios procesos para la obtención de abonos orgánicos uno de los más utilizados es el
compostaje (Bruno et al., 2010).
Es importante tener en cuenta la calidad de estos abonos, pues en su proceso de obtención
se pueden ver afectados por contaminantes que son perjudiciales los cultivos y la salud
humana, uno de los parámetros que se debe tener en cuenta para la evaluación de calidad
de estos abonos es la detección de bacterias con potencial patógeno como Salmonella sp,
pues todos los serotipos de esta bacteria son potencialmente patógenos para animales y
humanos, causando intoxicación alimentaria que es la infección más común causada por
Salmonella sp., (Sahlstrom, 2003).
Con el fin de asegurar los parámetros de calidad exigidos por las normativas se hace
necesario llevar a cabo la estandarización y la validación de las técnicas microbiológicas,
permitiendo a los laboratorios emitir resultados confiables para dar cumplimiento a la
normatividad gubernamental. (Padilla, 2007), estos procesos de validación están orientados
al reconocimiento de la competencia técnica para evaluar que un determinado bien,
proceso, sistema de gestión, persona o instalación cumple que con las especificaciones o
requisitos técnicos establecidos en un documento normativo (CONPES 3446), para los
laboratorios de ensayo y calibración dicho documento es la Norma NTC ISO/IEC 17025: 2005.
Actualmente existen 32 laboratorios registrados ante el ICA en el control de insumos
agrícolas, diez realizan pruebas para el control de abonos orgánicos de estos, tres efectúan
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determinaciones de metales pesados y solo uno tiene registradas las técnicas para el control
de inocuidad en abonos orgánicos que da cumplimiento a la norma técnica NTC 5167: 2006:
PRODUCTOS PARA LA INDUSTRIA AGRÍCOLA. PRODUCTOS ORGÁNICOS USADOS COMO
ABONOS O FERTILIZANTES Y ENMIENDAS DE SUELO. Por lo tanto es necesario ampliar la
oferta de laboratorios que efectúen este tipo de análisis de manera confiable, que optimicen
costos y tiempos de procesamiento.
Este trabajo tiene como fin estandarizar y validar el método para detección de Salmonella
sp, en abonos orgánicos por medio de la técnica ELISA VIA 3M para la detección de
Salmonella sp, pues esta técnica a demostrado un alto grado de confiabilidad detección de
este microorganismo en matrices de alimentos y aguas, reduciendo los costos de
procesamiento, tiempo de entrega de resultados Vs la metodología de referencia usada
actualmente en el país.
2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
2.1 Formulación del problema
Actualmente existen nuevos enfoques tecnológicos en los cuales se ha soportado la
producción alimentaria, se solicita dicha producción esté libre de sustancias químicas,
introduciéndose el concepto de agricultura orgánica (FAO, 2006). Colombia no es ajena al
mercado de alimentos cultivados de manera orgánica, el Ministerio de Agricultura y
Desarrollo en la resolución 00074/02 indica el establecimiento del marco reglamentario
armonizado con las normas internacionales, donde la comercialización de productos
agropecuarios ecológicos este regulada por sistemas de inspección y certificación que
garanticen la calidad de los productos. Los abonos orgánicos toman un papel protagónico en
los procesos de agricultura ecológica remplazando de manera parcial los fertilizantes de
síntesis química, sin embargo estos pueden introducir patógenos a la cadena alimentaria
(Solomon et al., 2002; Natving et al., 2002).
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Por tanto es necesario garantizar la inocuidad de abonos orgánicos con métodos
estandarizados y validados bajo la norma NTC ISO/IEC 17025: 2005 e NTC 5167:2006
cumpliendo con la resolución del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Social 00074/02;
examinando el contexto nacional existen 32 laboratorios registrados ante el ICA en el control
de insumos agrícolas y solo uno tiene registradas técnicas para el control de inocuidad bajo
la norma NTC 5167:2006, luego se hace necesario un laboratorio certificado ante el ICA con
técnicas estandarizadas y validadas, provea estos servicios al mercado agrícola
enriqueciéndolo y ofreciendo resultados confiables, en corto tiempo y a menor costo.
Con este trabajo se pretende iniciar con este proceso, evaluando parámetros como: nivel de
detección relativo, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, sensibilidad
relativa, especificidad relativa y reproducibilidad del método a validar con el fin de cumplir
los requisitos de la normatividad vigente.
2.2 Justificación
Teniendo en cuenta la apertura de los mercados verdes y el potencial riesgo de introducción
de patógenos a la cadena productiva de alimentos orgánicos con el subsecuente impacto en
la salud pública se hace necesario un laboratorio con la capacidad técnica y de
infraestructura, acreditado en NTC ISO/IEC 17025: 2005, que cuente con pruebas
estandarizadas y validadas, para garantizar la calidad composicional y de inocuidad de
abonos orgánicos, generándose así una facilidad para la ICA al inspeccionar parámetros de
calidad de los productos aplicados y tranquilidad del consumidor final (AGRICULTOR).
Teniendo en cuenta hoy en día en el país solo existe un laboratorio registrado ante el ICA con
pruebas estandarizadas y validadas para la detección microorganismo patógenos como
Salmonella sp. en abonos orgánicos, se busca aumentar la oferta de laboratorios con
competencia para llevar a cabo este tipo de análisis, al estandarizar y validar una técnica
para la detección de Salmonella sp., en abonos orgánicos bajo la norma técnica colombiana
NTC ISO/IEC 17025: 2005 y de esta manera dar inicio al proceso de registro de la técnica ante
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el ICA para alcanzar estándares de calidad reconocida por ICONTEC bajo la norma técnica
NTC 5167:2006, también se pretende brindar apoyo a las empresas productoras de abonos
orgánicos, generando corto tiempo de respuesta y confiabilidad en el análisis , así como
costos menores favoreciendo la economía del sector agrícola.
3. MARCO TEÓRICO
Los abonos orgánicos en la última década se han destacado por su gran uso en la agricultura
para abonar los suelos mejorando las condiciones y elevando la productividad de los
mismos, colaborando con un medio ambienté más amigable y remplazando de manera
parcial los fertilizantes de síntesis química, sin embargo dichos abonos orgánicos usados en
la producción ecológica juegan un rol muy importante en la posible introducción de
microorganismo patógenos a la cadena alimentaria (Solomon et al., 2002; Natving et al.,
2002; Islam et al., 2004; Franz et al., 2005; Lemunier et al., 2005), pues en aquellos procesos
de compostaje, donde el proceso térmico es deficiente pueden persistir dichos patógenos,
reactivándose al final del proceso cuando la temperatura desciende (Gale, 2002; Lemunier et
al, 2005). Uno de los microorganismo patógenos indicadores de contaminación para tener
en cuenta en la calidad de estos abonos es Salmonella sp, pues todos los serotipos de esta
bacteria son potencialmente patógenos para animales y humanos causando comúnmente
enfermedades diarreicas.
A nivel mundial, la agricultura ecológica ha presentado en los últimos años un incremento
en su demanda debido a que el consumidor está exigiendo productos más sanos que no
afecten su salud (MADR, 2007) normalmente la fertilización usada por la agricultura
ecológica es a base de bonos orgánicos, esto ha hecho necesario se creen normativas para
garantizar la calidad de estos fertilizantes y no generar contaminación cruzada a los
alimentos y finalmente a los consumidores. En varias oportunidades se han reportado brotes
de salmonelosis en alimentos crudos como tomate (Hedberg et al, 1999) lechuga, melones,
espinacas y ensaladas (Sivapalasingam et al, 2004;) asi como la sobrevivencia del
microorganismos en una mezcla por más de 77 días y su crecimiento en temperaturas de 6 a
47 ºC (Sahlstrom, 2003).
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Por ello se deben establecer metodologías en los laboratorios registrados ante el ICA que
garanticen el control de calidad de los abonos. Con la ejecución de este proyecto se
estandarizo y se valido prueba para la detección de Salmonella sp, por la técnica 3M Tecra
Salmonella VIA Prueba ELISA para Salmonella sp. con el fin de obtener resultados confiables,
rápidos y aminorar los costos de procesamiento brindando una alternativa nueva al mercado
del país.
3.1 Generalidades de Validación.
La validación y la acreditación de estas técnicas microbiológicas es de gran importancia, ya
que permite emitir resultados confiables que garanticen que el proceso planificado se
efectuará uniformemente en conformidad con los resultados previstos especificados, que
conllevan a la toma de decisiones adecuadas; además ayuda a la regulación y el
cumplimiento de la normatividad gubernamental, a la reducción de costos en el laboratorio.
(Padilla, 2007) La acreditación es definida en la Guía ISO/IEC 002 como un procedimiento por
el cual una entidad con autoridad otorga un reconocimiento formal que un organismo o
persona es competente para llevar a cabo tareas especificas, o se puede describir también
como proceso mediante el cual se reconoce la competencia técnica de un organismo para
evaluar que un determinado bien, proceso, sistema de gestión, persona o instalación
cumplen con las especificaciones o requisitos técnicos establecidos en un reglamento
técnico o un documento normativo (CONPES 3446, NTC ISO/IEC 17025: 2005).
En cuanto a los métodos y su validación la NTC ISO/IEC 17025: 2005 indica que el laboratorio
debe aplicar métodos y procedimientos apropiados para el ensayo, seleccionando los
métodos que satisfagan al cliente; por lo tanto es necesario garantizar la calidad e inocuidad
de insumos utilizados en la producción ecológica por medio de pruebas estandarizadas y
validadas bajo la normatividad de laboratorios de ensayo y calibración con el fin de que
estos insumos orgánicos cumplan con lo establecido en la NTC 5167:2006 para abonos
orgánicos. Donde se busca cumplir con la resolución 074 de 2002 del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Social "por la cual se establece el reglamento para la producción
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primaria, procesamiento, empacado, etiquetado, almacenamiento, certificación,
importación y comercialización de productos agropecuarios ecológicos".
Una vez que se han seleccionado los métodos que se desean aplicar en el laboratorio, el
siguiente paso es la validación. La validación es la confirmación, a través del examen y el
aporte de evidencias objetivas de que se cumplen los requisitos particulares para un uso
especifico previsto o para determinar el desempeño de un método analítico antes de
implementar su uso como rutinario en el laboratorio(Cortes, 2006).
3.1.1 Validación de métodos microbiológicos cualitativos.
Se deben llevar a cabo dos fases para la validación del método la primera fase es un estudio
de comparación de método (método alternativo Vs método de referencia), y es desarrollado
por el laboratorio organizador. (Feldsine et, al 2002) se denomina estudio precolaborativo, y
otras normas como ISO 13843, la definen como fase de validación como primaria.
La segunda fase de la validación, consiste en un estudio colaborativo, ISO se refiere esta fase
como estudio interlaboratorio, su objetivo es: determinar la variabilidad de los resultados
obtenidos en diferentes laboratorios utilizando muestras idénticas. Para efecto de este
documento los parámetros usados para la validación serán los indicados en la Norma ISO
16140:2003 “PROTOCOLO PARA LA VALIDACION DE METODOS ALTERNATIVOS” y
corresponden a los descritos a continuación:
3.1.1.1 Precisión relativa (AC): Grado de correspondencia entre las respuestas
obtenidas por los métodos de referencia y alternativo en muestras idénticas. Para la
determinación de estos parámetros, el valor de referencia aceptado es el valor obtenido por
el método de referencia. Por lo tanto, el término "relativo" implica que el método de
referencia no provee automáticamente el valor de referencia aceptado. (ISO 16140:2003)
3.1.1.2 Sensibilidad relativa (SE): Habilidad del método alternativo cualitativo para
detectar el analito cuando es detectado por el método de referencia. (ISO 16140:2003)
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3.1.1.3 Especificidad relativa (SP): Habilidad del método alternativo cualitativo de
detectar el analito cuando no es detectado por el método de referencia. (ISO 16140:2003)
3.1.1.4 Nivel de detección relativo : concentración mínima del microorganismo que
puede ser detectado por los métodos alternativos y de referencia.
3.2 Microorganismo de Estudio
El genero Salmonella se caracteriza por presentar una morfología bacilar gram-negativa,
anaerobio facultativo, móvil, no formador de esporas y con flagelo peritico, cuentan con un
metabolismo fermentativo y oxidativo fermenta Glucosa con producción de gas (Excepto S.
Typhi) (Rodríguez, et al. 2010), también fermentan L-arabinosa, maltosa, L- ramnosa, D-
sorbitol, trehabosas, D-xilosa, D-dulcitol entre otras características bioquímicas se encuentra
la reducciòn de nitratos a nitritos, no desminan la fenilalanina y son tetrationato reductasa,
produce de acido sulfhídrico (H2S), es Indol negativo, no hidroliza la Urea, (ICMSF, 1996),
tambien son catalasa positiva, oxidasa negativa, normalmente su tamaño es de 0,7- 1,5 x 2-5
μm y pueden formar largas filas (Papoff & Le Minor, 1992). Los miembros del genero
Salmonella toleran un rango amplio de temperatura entre 7 ˚C y 49,5 ˚C (Rodríguez, et al.
2010)
Es habitante del tracto intestinal de animales de sangre caliente y fría. Algunas especies son
muy abundantes y otras se adaptan a un hospedero particular, es reconocido por ser el
agente causal de la salmonelosis en humanos: fiebre entérica (fiebre tifoidea) resultado de la
invasión bacteriana del torrente sanguíneo, y la gastroenteritis aguda, consecuencia de una
infección transmitida por los alimentos / intoxicación. (Todar, 2011)
Existe documentación que indica desde 1800 se encuentra asociada a brotes alimentarios,
en 1885 se le llamo Bacillus cholerae-suis se aíslo de animales enfermos de fiebre tifoidea
por el patólogo veterinario D.E Salmon, de hecho en 1900 el género se denomino salmonella
en su honor. (Cox, 2004)
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3.2.1 Taxonomía del Genero Salmonella sp.
Los integrantes de este genero pertenecen al Reino: Bacteria, Filo: Proteobacteria; Clase:
Gammaproteobacteria; Orden: enterobacteriales; Familia: Enterobacteriaceae y Genero:
Salmonella, y cuenta con una distribución cosmopolita, en 1997 su sistema de clasificacion
fue revisado y se incluyeron dos especies: Salmonella entérica y S. bongori. En la actualidad,
existen seis subespecies de importancia médica de S. entérica que incluyen: enterica
(subespecie I), salamae (subespecie II), arizonae (subespecie III), diarizonae (subespecies
IIIb), houtenae (subespecie IV), y los indicadores (subespecie V). Las subespecies II a V son
aisladas con frecuencia de poiquilotermos y del medio ambiente. Las subespecies arizonae y
diarizonae, se asocian a reptiles y anfibios, estas poseen entre 94 y 321 serotipos,
respectivamente; hoy en día hay 2435 serotipos de Salmonella reportados, y la mayoría, si
no todos, de los serotipos descritos se consideran patógenos. (Mitchell. M, 2001)
3.2.2 Estructura antigénica
Posee tres tipos de antígenos para su identificación y diagnostico: somático, de superficie y
flagelar:
Somático (O) o de pared celular: Son estables al calor y resistentes al alcohol. Estudios han
detectado un gran número de factores antigénicos O de los cuales 67 son usados para la
identificación serológica de la bacteria. (Todar, 2011)
De virulencia (Vi): Los antígenos de superficie, son comúnmente observados en otros
géneros pertenecientes a la familia enterobacteriaceae (Escherichia coli y Klebsiella sp).
Estos antígenos de superficie pueden enmascarar el antígeno O lo cual causaría la no
aglutinación con antisueros O (Todar, 2011).
Flagelar (H): Son proteínas termolábiles que junto a las células bacterianas y los antisueros
específicos flagelares generan un patrón característico de aglutinación. Las Salmonellas
entéricas (por ejemplo, S.enteritidis, S. typhi), producen flagelos siempre tienen la misma
especificidad antigénica (monofásica). Sin embargo la mayoría de los serotipos produce dos
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flagelos con diferentes especificidades antigénicas H (bifásica) cabe resaltar que en todas las
especies de salmonella sp .el antígeno H se encuentra conservado. (Todar, 2011)
3.2.3. Salmonella sp. en el medioambiente
La Salmonella sp se encuentra ampliamente distribuida en el medio ambiente (agua, suelo y
plantas) puede ser excretada en las heces humanas y animales. Estos microorganismos no
parecen multiplicarse en el medioambiente de manera significativa pero puedan sobrevivir
en agua varias semanas así como años en el suelo si las condiciones de temperatura,
humedad y pH son favorables (Martínez et al, 2007)
3.3 Abonos Orgánicos.
El Producto sólido obtenido a partir de la estabilización de residuos de animales, vegetales o
residuos sólidos urbanos (separados en la fuente) o mezcla de los anteriores, que contiene
porcentajes mínimos de materia orgánica expresada como carbono orgánico oxidable total
(NTC. 5167:2006).
Su obtención se basa en la degradación de materia orgánica, la cual se transforma en una
mezcla homogénea de gran valor agronómico. Su calidad está dada en el proceso de
estabilización de los componentes usados para su síntesis, mediante procesos como el
compostaje, la lombricultura o camas de secado. (Zaleski et al., 2005).
3.3.1 Tipos de abonos orgánicos
3.3.1.1 Orgánico mineral sólido : Producto sólido obtenido por mezcla o combinación de
abonos minerales y orgánicos de origen animal, vegetal, pedogenético (geológico) o
provenientes de lodos de tratamiento de aguas residuales, que contiene porcentajes
mínimos de materia orgánica expresada como carbono orgánico oxidable total (NTC 5167,
2006).
3.3.1.2 Orgánico mineral liquido: Producto líquido obtenido por adición de agua a un
abono orgánico, orgánico mineral sólido o mezcla de los anteriores, con posterior extracción
al que puede o no, añadírsele un fertilizante mineral. (NTC 5167, 2006).
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3.3.1.3 Enmienda húmica sólida: Producto sólido obtenido a partir de la estabilización
de residuos de animales, vegetales o residuos sólidos urbanos (separados en la fuente) o
mezcla de los anteriores, que contiene porcentajes mínimos de materia orgánica expresada
como carbono orgánico oxidable total. (NTC 5167, 2006).
3.3.1.3 Enmienda húmica liquida : Producto orgánico líquido obtenido mediante
solubilización en medio alcalino o por oxidación química, de un material de origen
pedogenético que aporta ácidos húmicos y fúlvicos, destinado preferentemente a la
fertirrigación. (NTC 5167, 2006).
3.3.1.3. Enmienda orgánica no húmica: Producto orgánico sólido obtenido a partir de
la deshidratación y estabilización de los residuos provenientes de las plantas industriales y
de tratamiento de a) aguas residuales industriales y urbanas y b) residuos sólidos urbanos
separados en la fuente. (NTC 5167, 2006).
3.4 Parámetros de calidad microbiológica en abonos orgánicos
La Norma técnica Colombiana NTC 5167:2006, que actualmente dicta los parámetros de
calidad para abonos orgánicos, indica que se deben efectuar análisis de enterobacterias
totales para cumplir con la norma y el producto final debe reportar menos de 1000 UFC/gr
de producto final; esta norma también indica que se debe evaluar la presencia/ausencia de
las Salmonella sp., y debe reportarse como ausente en 25 g de producto final.
Además si alguna de las materias primas es de origen vegetal, deberán estar exentos de
fitopatógenos de los géneros: Fusarium sp; Botrytis sp; Rhizoctonia sp; Phytophthora sp. Y
de nemátodos fitopatógenos. De igual manera deberá garantizar la sanidad del material, en
relación con fitopatógenos específicos que pudieren estar presentes por el origen de las
materias primas; por ejemplo: Los subproductos de rechazo de la industria bananera deben
estar libres de Pseudomonas solanacearum Cepa II y Micosphaerella fijiensis, con respecto
a abonos que contengan una carga microbiana especifica (microorganismos benéficos), debe
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declararse el recuento de Microorganismos Mesófilos aerobios, mohos y levaduras. (NTC
5167:2006).
3.5 Métodos usados
Para efectuar la validación de técnicas cuantitativas es necesario poseer una metodología de
referencia y una metodología alternativa con el fin de establecer comparaciones que
indiquen la prueba alternativa equipara o supera los resultados de la metodología de
referencia (ISO 16140:2003).
3.5.1 Metodología de referencia
Definido como método internacionalmente reconocido y ampliamente aceptado para el
análisis de un componente. (ISO 16140, 2003), en este caso se uso la NTC 4164:
Microbiología de alimentos y de alimentos para animales, Método horizontal para la
detección de Salmonella sp.
3.5.1.1 Principio Salmonella sp. NTC 4164
Para el aislamiento e identificación de Salmonella sp se siguió la NTC 4164, Se usaron 25 g de
muestra y se inocularon en 225 ml de caldo lactosado, se incubó a 37 ˚C de 18 a 22 horas en
agitación a 150 rpm (pre-enriquecimiento). Posteriormente se inoculó 1 ml de cada muestra
en 10 ml de caldo Rappaport (RV10) se incubo a 41 ˚C de 22 a 24 horas (enriquecimiento
selectivo). Se tomo una porción de esta preparación y con asa bacteriológica se cultivo por
agotamiento en la superficie de agar dexosicolato de lisina y xilosa-XLD y de agar Bismuto
Sulfito, se incubaron a 37 ˚C por 24 horas. A continuación las colonias sospechosas se
reaislaron en la superficie de agar nutritivo con el fin de obtener colonias bien aisladas, una
vez obtenidas, serán sometidas a identificaron con pruebas bioquímicas convencionales (TSI,
Urea, VP, indol, SIM, LIA).
20
El tiempo en el cual se confirma la presencia de Salmonella sp., en una muestra es de 5 a 7
días teniendo en cuenta los periodos de incubación y que se pueden requerir varios
aislamientos en agares selectivos para lograr obtener colonias aisladas. (Anexo 1)
3.5.2 Metodología alternativa.
Se define como un método de análisis que demuestra o estima para varias muestras el
mismo analito de manera uniforme y que corresponde al método de referencia. Este
método debe exhibir algunas características deseadas por los usuarios: Rápido análisis o
repuesta, fácil ejecución o automatización, reducción de costos y cumplimiento de las
propiedades analíticas. (ISO 16140: 2003). En este caso se uso el método oficial AOAC MS
998- 14 como método alternativo.
3.5.2.1 Método Oficial AOAC MS 998- 14. Prueba ELISA 3M VIA (Tecra) Salmonella sp.
Este análisis consiste en un inmunoensayo enzimático (ELISA) de sándwich (Ensayo de
captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Esta técnica ofrece una gran
afinidad para capturar antígenos de Salmonella sp. La reacción anterior es completada con
la adicción de enzimas marcadas con anticuerpos conjugados específicos para Salmonella
sp., indicando la presencia del microorganismo cuando el anticuerpo conjugado es ligado
hace que el color del sustrato cambie.
Para el aislamiento e identificación de Salmonella sp., se siguió el método Oficial AOAC MS
998- 14. Se usaron 25 g de muestra y se inocularon en 225 ml de caldo lactosado, se incubó
a 37 ˚C de 18 a 22 horas en agitación a 150 rpm (pre-enriquecimiento). Posteriormente se
inoculó 1 ml de cada muestra en 10 ml de caldo Rappaport (RV10) se incubo a 41 ˚C de 22 a
24 horas (enriquecimiento selectivo).
A continuación se inoculó 1 ml de cada muestra en 10 ml de caldo (M) no inhibitorio se
incubo a 42˚C de 6-8 horas (segundo pre-enriquecimiento selectivo). Luego de este paso se
inicia la preparación para el inmunoensayo enzimático la cual consiste en tomar 1 ml de los
21
tubos de caldo (M) de incubación y tratarlos con calor a 100°C por 15 minutos y
posteriormente consiste en el Inmunoensayo enzimático como tal, y consiste en la captura
de anticuerpos de Salmonella sp., en la superficie del pozo y su captura por parte de los
anticuerpos presentes en el pozo. Primero se adiciona 200 μl de caldo M tratado con calor a
los pozos se incuba por 30 min a 35-37 °C, luego de la incubación se procede a efectuar el
primer lavado con la solución de lavado 3M este paso se repite tres veces, una vez
terminado el lavado, se procede a la adición de 200 μl de conjugado a cada pozo lavado se
incuba por 30 min a 35-37 °C. Se procede a efectuar el segundo lavado con la solución de
lavado 3M repitiendo el procedimiento 4 veces, finalmente se efectúa la adición de 200μl de
conjugado a cada pozo lavado, se incuba 15 min de 20-25 ˚C. En este punto se evidencia un
cambio del color de la solución contenida en los pozos y una vez pasado el tiempo de
incubación se lee comparando con la carta de colores proporcionada por el kit. El tiempo en
el cual se confirma la presencia de salmonella en una muestra es de 3 días. (Anexo 2)
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Estandarizar y validar de forma primaria bajo la Norma Técnica Colombiana ICONTEC (NTC
5167) la técnica 3M (Tecra) VIA Prueba ELISA para la detección de Salmonella sp. en abonos
orgánicos.
4.2 Objetivos específicos
Establecer el funcionamiento, cumplimiento de parámetros establecidos y calibración
de equipos usados en el proceso de validación.
Evaluar la calidad de los medios de cultivo a utilizar en el análisis por medio de pruebas
de esterilidad y selectividad.
Evaluar el nivel de detección relativo, exactitud relativa, sensibilidad relativa,
especificidad relativa, reproducibilidad del método y parámetros estadísticos para la
validación de la técnica 3M (Tecra) VIA Prueba ELISA para Salmonella sp. en abonos
orgánicos.
22
Evaluar la reproducibilidad del método y los parámetros estadísticos para la validación
de la técnica 3M (Tecra) VIA Prueba ELISA para Salmonella sp. en abonos orgánicos.
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Localización
El presente estudio se realizó en el Laboratorio de Control de Calidad de Inoculantes –
LISSALAB de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica) - C.I
Tibaitatá, ubicado en el Km14 vía Mosquera (Cundinamarca- Colombia), a una altura de
2543 m; localizado geográficamente a 4°41‟43‟‟ de latitud norte y 74°12‟30‟‟ de latitud
oeste.
5.2 Microorganismo y matriz de evaluación
Se utilizó la cepa TB 12 de Salmonella Typhimurium la cual se obtuvo del cepario de la
Facultad de Ciencias - Pontificia Universidad Javeriana - Sede Bogotá. Se empleó como matriz
un abono orgánico mineral comercial que cumple con las exigencias de la norma técnica
colombiana NTC 5167:2006.
5.3 Equipos
Se verificó que los equipos empleados en la prueba, se encontraran calibrados y dentro de
los parámetros establecidos de funcionamiento, los equipos utilizados y su marca se
relacionan en la (Tabla 1).
Tabla 1. Equipos usados, maraca y modelo.
Equipo Marca / Modelo
Cabina de Flujo laminar horizontal. LabConco Tipo II / 36213-04
Balanza. Shimadzu / UX620H
Autoclave horizontal. American Sterilizer/ L-S-2036
Autoclave Sterilof / 5000 Plus
23
Incubadora 30 - 42˚C. Binder / BD115-UL
Microscopio. Olimpicus/ C5000
Refrigerador Vertical Indufrial/ N8-J625100
Micropipeta de 1000 a 100 ul Biopette / Labnet 1 ml
Incubadora digital con Agitador Orbital Barnstead Lab-Line / MaxQ4000
Agitador Vórtex Barnstead Thermolyne / M37615
Horno de calentamiento 100 ˚C. Estufa Memmert / U30
5.4 Metodología
5.4.1 Prueba de viabilidad y pureza de la cepa.
La cepa de Salmonella Typhimurium TB12 fue conservada en agar nutritivo, se confirmó la
pureza de la cepa sembrando por agotamiento en agar XLD y Bismuto Sulfito e incubando a
37 ± 2°C durante 24 horas. Pasado el periodo de incubación, se realizó coloración de Gram y
se efectuaron pruebas las bioquímicas típicas (TSI, SIM, VP, UREA) con el fin de confirmar la
identidad de la cepa.
5.4.2 Prueba de esterilidad de los medios de Cultivo.
Para verificar la esterilidad de los medios de cultivo usados (Tabla 2) se procedió a tomar de
manera aleatoria el 5% de cada uno de los medios preparados, llevándolos a incubación de
24 a 48 horas a 37ºC ± 2ºC posterior a ello, se efectúo una evaluación de los medios de
cultivo verificando la ausencia de colonias bacterianas contaminantes en cajas de Petri y
ausencia de turbidez en caldos. Este procedimiento se siguió cada vez que se preparó
medios de cultivo. (Sartorius, 2003).
Adicionalmente se hizo una verificación macroscópica de por medio de un examen visual
para descartar errores en la preparación de los medios, observándose que el color y el
aspecto de los medios correspondiese con los reportados por la ficha técnica y su
consistencia fuese la indicada (Allaert et al, 2002).
24
Tabla 2. Medios de cultivo usados para el proceso de validación.
MEDIO DE CULTIVO CASA COMERCIAL
AGUA PEPTONADA TAMPONADA 3M
CALDO LACTOSADO 3M
AGAR XLD Difco & BBL
AGAR BISMUTO SULFITO Difco & BBL
AGAR TSI Difco & BBL
AGAR SIM Difco & BBL
CALDO V P Difco & BBL
CALDO UREA Difco & BBL
CALDO RV (R10) 3M
CALDO M 3M
AGAR NUTRITIVO 3M
5.4.3 Descripción de matrices y Controles.
Para la estandarización y validación del método alternativo las muestras de abono orgánico
fueron inoculadas con una concentración conocida del microorganismo de interés, ya que
los productos naturalmente contaminados no son muy frecuentes. Se recrearon tres abonos
orgánicos con diferentes características.
5.4.3.1. Abono orgánico Contaminado. Muestra de 25 g de abono en condiciones naturales (no estéril) con adición de 5 ml de
solución 1 de Salmonella Typhimurium TB 12 (tabla 2).
5.4.3.2 Abono Orgánico control positivo. Muestra de 25 g de abono estéril con adición de 5 ml de solución 1 de Salmonella t
typhimurium TB 12 (tabla 2). Para asegurar la inocuidad del abono se llevo a autoclave
25
(Tabla 1) por tres ciclos consecutivos de (15 minutos a 121°C y 15 atmósferas de presión),
luego fue secado en horno (Tabla 1) a 50°C por 24 h (Sidhu et al, 1999).
5.4.3.3 Abono orgánico control negativo. Muestra de 25 g de abono estéril sin adición de Salmonella typhimurium TB 12. Para
asegurar la inocuidad del abono se llevo a autoclave por tres ciclos consecutivos de (15
minutos a 121°C y 15 atmósferas de presión) y luego fue secado en horno (Tabla 1) a 50°C
por 24 horas.
Al lote sometido a este proceso se le aplicó una prueba de inocuidad analizándolo por el
método de recuento en placa de microorganismos en Agar nutritivo, al final se obtuvo un
resultado de 0 ufc en 25 gr de abono. Se analizaron tres muestras por cada lote de 10
abonos.
5.5 Validación de la Técnica ELISA (Tecra) VIA 3M para detección de Salmonella sp.
Para la validación de la técnica ELISA (Tecra) VIA 3M para la detección de Salmonella sp., en
abonos orgánicos, se tomo como guía la norma técnica ISO 16140: 2003 Protocolo para la
validación de métodos alternativos y en conformidad con la norma técnica NTC 5167: 2006.
Las variables tenidas en cuenta fueron: Nivel de detección relativo del método, Precisión
relativa del método, Sensibilidad relativa, Especificidad relativa y la reproducibilidad del
método. Para ello se siguieron los procedimientos que se describen a continuación.
5.5.1 Preparación del inoculo
Para la producción del inóculo de Salmonella typhimurium TB 12, se emplearon colonias
puras de tomadas de agar XLD, y reconstituidas en 50ml de agua de peptona tamponada
(Tabla 1), esta solución de incubo a 37 ± 2°C durante 24 horas a 150 rpm en agitación en un
agitador (Tabla 1) (Rodríguez, et al.2008). Se realizó coloración de Gram para determinar la
pureza del inóculo y se evaluó la concentración celular por medio de recuento en cámara de
Neubauer (Sidhu. 1999), obteniéndose una concentración inicial de 106
microorganismos/ml.
26
5.5.2 Nivel de Detección Relativo del Método.
Con el fin de determinar el nivel de detección del método alternativo (Método oficial AOAC
MS 998- 14, TECRA 3M) en comparación con el método de referencia (ISO 6579: NTC 4174),
se dividió el abono en muestras de 25g en bolsas de papel aluminio las cuales se les realizo
tres ciclos consecutivos de autoclavado (15 minutos a 121°C y 15 atmósferas de presión),
posteriormente fue secado en horno a 50°C durante 24 h (Sidhu et al, 1999).
Con el fin de probar la respuesta de los métodos a diferentes concentraciones del
microorganismo, a partir de un inoculo con concentración inicial conocida se realizaron
diluciones seriadas obteniéndose diferentes concentraciones, se obtuvieron 5 soluciones y a
cada una de ella se le asigno un nivel (Tabla 3) (ISO 16140:2003).
Tabla 3. Concentración de microorganismo/ ml para la evaluación del nivel de detección
relativo de la técnica.
SOLUCIÓN NIVEL CONCENTRACIÓN CELULAR
1 L₁ 1- 5 microorganismo/ml
2 L₂ 6 – 15 microorganismo/ml
3 L₃ 16 – 25 microorganismo/ml
4 L₄ 26 – 35 microorganismo/ml
5 L₅ 36 – 45 microorganismo/ml
Una vez las soluciones fueron identificadas, se inoculo el abono en sus respectivas bolsas con
5ml de cada solución manteniendo las concentraciones de células en relación a 25g de
muestra se dejaron reposar dos horas en cama de flujo laminar y siguiendo el anexo D en
ISO 16140:2003 se procesaron por el método de referencia y el método alternativo.
5.5.3 Precisión relativa del método.
Se usaron dos bolsas con abono orgánico contaminado (ver 5.4.3.1) manteniendo las
concentración L₁ (Tabla 3) de células en relación a 25g de muestra, se dejaron reposar
durante dos horas en cámara de flujo laminar. Cada muestra se proceso por triplicado por
27
el método de referencia ISO 6579: NTC 4174, y por el método alternativo AOAC MS 998- 14.
Protocolo 2 de VIA TECRA 3M para Salmonella sp., se realizaron controles positivos y
negativos teniendo los numerales 5.4.3.2. y 5.4.3.3.
Se efectuaron 6 repeticiones del ensayo anteriormente descrito. El numero total de
muestras evaluadas en el diseño experimental fue 6 cada una compuesta por dos abonos
artificialmente contaminados, una matriz control positivo y una matriz control negativo, al
final se obtuvo un total de 108 resultados. El estudio se efectuó durante 6 semanas
analizando una muestra por semana.
5.5.4 Prueba para Reproducibilidad del Método
Para evaluar la reproducibilidad del método se modifico el analista y algunos instrumentos
de laboratorio. Se llevaron a cabo 2 ensayos, cada uno contaba con tres muestras, un control
positivo y un control negativo, cada muestra fue procesada por triplicado, se obtuvieron 18
resultados en total.
Los matices sujetos a análisis se prepararon como se indica en el numeral 5.4.4, se
procesaron por la técnica de referencia ISO 6579: NTC 4174 y la técnica alternativa Método
oficial 998.09, por dos analistas diferentes. Los datos obtenidos fueron tabulados en una
tabla de contingencia y se analizaron por medio del índice de acuerdo específico de
positividades (Po+).
5.6 Análisis Estadístico de las Variables de Estudio
Las variables fueron analizadas según lo recomendado en la Norma ISO 16140:2003
“PROTOCOLO PARA LA VALIDACION DE METODOS ALTERNATIVOS”
5.6.1 Nivel de Detección Relativo del método. Para el análisis de los datos obtenidos se uso el modelo propuesto en el numeral 5.1.2.3 de
ISO 16140:2003, los datos fueron tabulados en tablas de contingencia y luego analizados.
28
5.6.2 Precisión relativa del Método. En el análisis de los datos obtenidos se uso el modelo propuesto, en el numeral 5.1.1.3.1 de
la norma ISO 16140:2003.
5.6.3 Reproducibilidad del Método. Los datos obtenidos fueron tabulados en tablas de contingencia (2x2) y se analizaron por
medio del índice de acuerdo específico de positividades (Po+). (Caballero et all. 2007)
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Calibración y mantenimiento de equipos.
Se verificó las hojas de vida de los equipos usados para corroborar estuvieran en optimas
condiciones antes del inicio del proceso de validación.
Tabla 3. Programa de Calibración y Mantenimiento de los equipos usados en la validación.
Equipo Marca / Modelo ULTIMA
VERIFICACIÓN
Cabina de Flujo laminar
horizontal.
LabConco Tipo II /
36213-04
02-02-2011
Balanza. Shimadzu / UX620H 08-02-2011
Autoclave horizontal. American Sterilizer/ L-
S-2036
11-02-2011
Autoclave Sterilof / 5000 Plus 02-02-2011
Incubadora 30 - 42˚C. Binder / BD115-UL 23-02-2011
Microscopio. Olimpicus/ C5000 26-10-2010
Refrigerador Vertical Indufrial/ N8-J625100 26-10-2010
Micropipeta de 1000/100 ul Biopette / Labnet 1 ml 04-02-2010
Incubadora digital con Barnstead Lab-Line / 22-12-2011
29
Agitador Orbital MaxQ4000 26-10-2010
Agitador Vórtex Barnstead Thermolyne
/ M37615
20-09-2010
Horno de calentamiento
100 ˚C.
Estufa Memmert / U30 12-01-2011
6.2 Prueba de viabilidad y pureza de la cepa.
Una vez concluyo el periodo de incubación se confirmaron colonias típicas de Salmonella
sp., en agares selectivos, adicionalmente se confirmaron las características morfológicas
típicas del microorganismo por medio de una coloración de Gram, se aplicaron las pruebas
bioquímicas usando los siguientes medios diferenciales Urea, SIM, TSI, y VP; los resultados
obtenidos confirmaron las características propias del Género Salmonella (Tabla 3).
Tabla 4. Resultados de las pruebas de viabilidad y pureza para Salmonella typhimurium TB
12.
PRUEBA
APLICADA
DESCRIPCIÓN CRITERIO
COLORACIÓN DE
GRAM
Bacilos cortos gran negativos de
apariencia levemente ovoide.
Morfología típica de Salmonella
typhimurium TB 12
CRECIMIENTO EN
AGAR XLD
Colonias rojas de centro negro
prominente, con buen crecimiento
Colonias típicas en agar
diferencial de Salmonella
typhimurium TB 12
CRECIMIENTO EN
AGAR BISMUTO
SULFITO
Colonias negras con un
precipitado verde alrededor y con
formación de un pequeño alo
brillante
Colonias típicas en agar
diferencial de Salmonella
typhimurium TB 12
CRECIMIENTO EN
AGAR TSI
Reacción alcalino sobre acido en
tubo con formación de H2S y gas.
Reacción típica para Salmonella
typhimurium TB 12
CRECIMIENTO EN Movilidad positiva, producción de Reacción típica para Salmonella
30
AGAR SIM H2S positivas , producción de indol
negativa
typhimurium TB 12.
CRECIMIENTO EN
CALDO V P
Reacción Rojo Metilo positiva,
Reacción Vogues Proskauer
negativa.
Reacción típica para Salmonella
typhimurium TB 12
CRECIMIENTO EN
CALDO UREA
Reacción negativa Reacción típica para Salmonella
typhimurium TB 12
Una vez determinada la pureza y viabilidad de la cepa, se reconstituyo en caldo Lactosado y
se conservo en refrigeración a 3°C, se realizaron repiques en dos agares XLD y Bismuto
Sulfito antes de cada Inoculación del Abono para verificar las características de la cepa con
resultados positivos para cada una de las replicas del diseño experimental.
6.3 Prueba de esterilidad de los medios de Cultivo.
Al finalizar la preparación de los medios de cultivo se confirmo su apariencia, consistencia y
color fueran los indicados en la ficha técnica (Anexo 3) todos los casos se cumplieron con los
parámetros macroscópicos establecidos por el fabricante. Para todas las pruebas de
esterilidad se obtuvieron resultados satisfactorios confirmándose la inocuidad del medio a
usar, no se evidencio la presencia de colonias contaminantes.
6.4 Nivel de detección relativo del método.
Una vez se efectuaron los análisis correspondientes a cada una de las concentraciones por el
método de referencia y el método alternativo se obtuvo la siguiente relación de datos
(Tabla5).
En los dos ensayo para la determinación del nivel relativo de detección del método
alternativo demostró equiparar el nivel de detección de la técnica de referencia pues ambas
evidenciaron la presencia de Salmonella thipyruim TB12 desde la mayor concentración hasta
la menor.
31
Tabla 5. Datos recopilados en los ensayos para el cálculo del nivel de detección relativo de la
técnica. EN
SAYO
1
CONCENTRACIÓN
BACTERIANA
Muestra 1
Met.
alternativo
Met.
Referencia
0 Bac/ml - -
1-5 Bac/ml + +
6-15 Bac/ml + +
16-25 Bac/ml + +
26-35 Bac/ml + +
36-45 Bac/ml + +
Control (+) + +
ENSA
YO 2
0 Bac/ml - -
1-5 Bac/ml + +
6-15 Bac/ml + +
16-25 Bac/ml + +
26-35 Bac/ml + +
36-45 Bac/ml + +
Control (+) + +
6.5 Precisión Relativa.
Los datos recopilados durante las seis repeticiones (Ver Tabla 7) fueron tabulados y
procesados como se indica en el numeral 5.1.1.3 de la norma técnica ISO 16140:2003
(Tabla 6).
32
Tabla 6. Modelo de tabulación de datos norma técnica ISO 16140:2003
Método alterno Método Referencia
Positivos Negativos
Positivos PA PD
Negativos ND NA
Tabla 7. Datos de precisión relativa de la Técnica referencia y la técnica alternativa
Ensayo Muestra CONTROL + CONTROL -
Met.
Referencia
Met.
Alternativo
Met.
Referencia
Met.
Alternativo
Met.
Referencia
Met.
Alternativo
1 + + + + - `
+ + + + - -
+ + + + - -
2 + + + + - -
+ + + + - -
- + + + - -
3 + + + + - -
+ + + + - -
+ + + + - -
4 + + + + - -
+ + + + - -
+ + + + - -
5 + + + + - -
- + + + - -
+ + + + - -
6 + + + + - -
+ + + + - -
+ + + + - -
33
Siguiendo el esquema de la y conforme a las indicaciones de la norma técnica ISO
16140:2003 se pueden identificar los siguientes criterios (Tabla 8):
PA: Concordancia Positiva = 18
PD: Desviación Positiva = 0
ND: Desviación Negativa = 2
NA: Concordancia Negativa = 34
Tabla 8. Tabulación de Datos precisión relativa de la Técnica Referencia y la Técnica
Alternativa
Método alterno Método Referencia
Positivos Negativos Total
Positivos 34(PA) 2 (PD) 36
Negativos 0(ND) 18 (NA) 18
Total 34 20 54
6.5.1 Precisión Relativa (AC)
Indica la capacidad del método de referencia de dar el mismo resultado en mediciones
diferentes, efectuadas en las mismas condiciones. En este caso el método de referencia
obtuvo un 96% de precisión lo cual indica que ofrecerá resultados confiables en el 96% de
las oportunidades.
34
6.5.2 Desviación Positiva del Método.
Un alto porcentaje de desviación positiva indica un verdadero positivo cuando el resultado
real puede ser probado como positivo, es decir que hay un 94,44% de probabilidad de que
una muestra positiva sea identificada como positiva por el método alternativo.
6.5.3 Desviación Negativa del Método.
Un alto porcentaje de desviación negativa indica la no ocurrencia de falsos negativos, es
decir que una muestra positiva, sea catalogada como negativa, para el método de referencia
se obtuvo un porcentaje de 90%, lo que es indicador de que la posibilidad de que ocurra un
falso negativo por la técnica es mínima.
6.6 Especificidad Relativa (SP)
Indica la fracción de pruebas verdaderamente negativas (con ausencia de Salmonella
Typhimurium TB 12 que tengan un resultado negativo), en este caso la metodología alterna
en un 90% de los casos identificara verdaderos negativos.
35
6.7 Sensibilidad Relativa (SE)
Indica la fracción de pruebas verdaderamente positivas (con presencia de Salmonella
Typhimurium TB 12 que tengan un resultado positivo), en este caso la metodología alterna
en un 100% de los casos identificara verdaderos positivos.
N = Numero total de muestras
NNAPAPDND
N- = Numero total de resultados negativos con el método de referencia
N N A P D
N+= Numero total de resultados positivos con el método de referencia
N P A N D
6.8 Reproducibilidad
Una vez se efectúo el análisis de las muestras por parte de los dos analistas se obtuvieron los
siguientes resultados:
Tabla 10. Datos recopilados en los ensayos de reproducibilidad de la técnica.
ensayo MATRIZ 1 MATRIZ 2 MATRIZ 3 CONTROLES
A 1 A 2 A 1 A 2 A 1 A 2 + -
1
+ + + + + +
+ +
- -
+ + + + + +
+ + + + + +
2 + + + + - -
+ +
- - + + + + - -
+ + + + - -
Analista 1(A1): Andrea Navarrete; Analista 2 (A2): Sergio pardo.
36
Tabla 11. Tabulación de Datos ensayos de reproducibilidad de la técnica.
ANALISTA 2
ANALISTA 1 + - TOTAL
+ 15 (A) 0 (B) 15
- 0 (C) 3 (D) 3
TOTAL 15 3 18
Cada analista realizo 18 mediciones para un total de 36 datos (Tabla. 10,11), se puede
afirmar que 15 mediciones positivas del analista 1 coinciden con 15 mediciones positivas del
analista 2 (30 mediciones), de un total de mediciones de 15 para el analista 1 y de 15 para el
analista 2 (30 mediciones). El cociente entre ambas cifras (30 / 30 = 1) este indicador es el
índice de acuerdo específico de positividades (Po+).
Estos cálculos indican reproductibilidad de la prueba para positividades para esta prueba se
encuentran valores que oscilan entre 0 y 1; índices cercanos a 1 implican buena
reproductibilidad. (Caballero. G et al 2007). En este caso se obtuvo un acuerdo específico de
positividades de 1, lo cual implica que el método presenta un altísimo grado de
reproducibilidad. Como se noto los resultados obtenidos son iguales para cada uno de los
pares. La prueba estadística de Chi-Square arroja que los dos son iguales con un p-valor de
1.0.
7. CONCLUSIONES
Se aseguro los métodos y medios utilizados en el proceso de validación estuvieran en
condiciones óptimas y ofrecieran resultados confiables.
Se demostró el método alternativo posee el mismo nivel de detección que el método
referencia, asegurando el mismo nivel de recuperación del microorganismo.
37
Se demostró de una forma documentada la técnica de referencia es reproducible; es
decir cuenta con un alto grado de exactitud relativa demostrando indicando así un alto
grado de confiabilidad en el momento de su ejecución.
Se demostró un alto grado de concordancia entre el método de referencia y el método
alternativo lo cual hace posible que se puedan equiparar.
Se demostró el método de referencia es en un 90% especifico a la detección de
Salmonella sp. Este valor es aceptado como con alto grado de sensibilidad para un
método.
Se demostró el método de referencia es en un 100% sencible en la detección de
Salmonella sp. Este valor es aceptado como con alto grado de especificidad para un
método.
Se demostró la reproducibilidad del método de referencia, asegurando su fácil
procesamiento por otros analistas y equivalencia del resultado en diferentes
condiciones.
Todos los parámetros analizados indican la técnica referencia puede ser validada para la
detección de Salmonella sp en abonos orgánicos
Se cumplieron con todos los requerimientos de la NTC 17025 para validación de técnicas
analíticas y así como también con los parámetros descritos en la NTC 5167.
8. RECOMENDACIONES
Se recomienda el uso de esta técnica solo para las matrices descritas bajo las
condiciones documentadas.
Se aconseja validar esta técnica para el análisis microbiológico de otras matrices de
interés para el laboratorio como: Aguas utilizadas para riego y suelos.
38
9. BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
ANEXO 1: Esquema de Método de Referencia.
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Anexo 2: Esquema Método Alternativo