validacin de los mtodos de filtracin por membrana y

VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA Y SUSTRATO DEFINIDO READYCULT, PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y ESCHERICHIA COLI EN AGUAS CRUDAS, TRATADAS Y POTABLES EN EL

ACUEDUCTO DE ZIPAQUIRA

AUTORES: SANDRA CAROLINA ALFARO GARZON

MARIA XIMENA ROJAS SANCHEZ

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al titulo de Microbióloga

Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA, D.C

2006

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en

sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la

moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona

alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

ii

VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA Y SUSTRATO DEFINIDO READYCULT, PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y ESCHERICHIA COLI EN AGUAS CRUDAS, TRATADAS Y POTABLES EN EL




APROBADO

DIRECTORA CODIRECTORA ________________________ ______________________ GLORIA MARITZA BERNAL JANETH ARIAS PALACIOS QUIMICA INDUSTRIAL BACTERIOLOGA M.sc

iii

VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA Y SUSTRATO

DEFINIDO READYCULT, PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y ESCHERICHIA COLI EN AGUAS CRUDAS, TRATADAS Y POTABLES EN EL




APROBADO

________________________ ______________________ Angela Umaña. M. Phil. David Gómez

Decana Académica Director de la carrera Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias

iv

Le doy gracias a Dios por permitirme cumplir mi sueño y hacer de este día una realidad.

A mi Mami por apoyarme siempre y por permitirme llegar hasta aquí porque nada seria

posible sin tu esfuerzo y dedicación, a mis abuelos que son también mis padres por ser

mi fortaleza en los días difíciles y por enseñarme a ser, valiente pero sobre todo por su

amor; a mi hermano porque siempre será el mayor de los ejemplos pero sobre todo por

ser mi amigo, a Mauro porque se robo mi amor y mi corazón y siempre creyó en mi y a

mi mejor amiga Ximena por acompañarme en mi sueño y poderlo alcanzar juntas.

Carolina

Le doy gracias a Dios por haber culminado esta importante etapa de mi vida y por

convertir este sueño en realidad. A mis padres, ya que sin su apoyo esto seria solo eso,

un sueño. A mi hermana, que con su ingenio y creatividad se ha convertido en un a

ejemplo a seguir. A Sandris, por lograr juntas llegar hasta el final de este sueño y por su

apoyo incondicional. Al Gordo porque estuvo siempre conmigo y fue mi apoyo a lo largo

de etapa. A Ernesto por transmitirme esa motivación y su continua búsqueda de

mejorar. A Lucecita por su interés de superación y su amor ilimitado. A mis amigas

Sandris, Caro, Aleja y Andreita porque aprendí con ustedes y de ustedes.

Ximena

Finalmente agradecemos Al Acueducto de Zipaquirá por permitirnos llevar a cabo este

trabajo, pero sobre todo a la Doctora Maritza Bernal quien nos apoyo siempre y creyó en

nosotras así como a la Universidad, en especial a Janeth Arias y a cada uno de los

profesores por permitirnos crecer como personas, pero sobre todo por hacer de nosotras

las mejores profesionales.

v

Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.

INDICE DE TABLAS Tabla 1. Comparación de Coliformes totales y E.coli 28 Tabla 2. Determinación del límite de detección para filtración

por membrana y limite de cuantificación para sustrato definido

Readycult utilizando E.coli. 32

Tabla 3. Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente

de variación para E. coli en filtración por membrana 33

Tabla 4. Porcentaje de Presencia y disminución según diluciones

para A/P en E.coli. 33

Tabla 5. Resultados del limite de cuantificación para las pruebas de

filtración por membrana y limite de detección Ausencia / Presencia

Readycult para Klebsiella pneumoniae 34

Tabla 6. Porcentaje de disminución en filtración por membrana

para Klebsiella pneumoniae. 35

Tabla 7. Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente de

variación para Klebsiella pneumoniae en filtración por membrana 36

Tabla 8. Resultados del limite de cuantificación para las pruebas

de filtración por membrana y limite de detección Ausencia / Presencia

Readycult para Citrobacter freundii 36

Tabla 9. Porcentaje de disminución y porcentaje de presencia en

filtración por membrana para Klebsiella pneumoniae 37

Tabla 10.Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente

de variación para Klebsiella pneumoniae en filtración por membrana 37

Tabla11. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana

y sustrato definido Readycult (A/P) para E.coli 38 Tabla12. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana

y sustrato definido Readycult (A/P) para Klebsiella pneumoniae 38

Tabla 13. Sensibilidad para los métodos de Filtración por

membrana y sustrato definido Readycult (A/P) para Citrobacter

freundii 39

Tabla 14. Replicas de repetibilidad, porcentaje de variación

intramuestra y variación con el Stock 39

Tabla 15. Repetibilidad, desviación estándar y coeficiente de variación 40

Tabla 16. Reproducibilidad en función de la temperatura y el tiempo

de incubación para el método de filtración por membrana. 41

Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 6


Tabla 17. Robustez según la temperatura y el tiempo de

incubación para el método de filtración por membrana. 43

Tabla 18. Promedio temperaturas de incubación, desviación

estándar y coeficiente de variación para filtración por membrana. 43

Tabla 19. Promedio horas de incubación, desviación estándar

y coeficiente de variación para filtración por membrana. 43

Tabla 20. Reproducibilidad Sustrato definido Readycult según

temperatura de incubación. 45

Tabla 21. Reproducibilidad Sustrato definido Readycult según

tiempo de incubación 45

Tabla 22. Pruebas de filtración por membrana y sustrato definido

Readycult (ausencia/presencia) para aguas potables 46

Tabla 23. Comparación de los métodos de filtración por membrana

y Readycult ausencia/presencia (A/P) en la Planta Galán (PGT)

y en la planta del alto del Águila (PAA) para aguas tratadas

no potables. 48

Tabla 24. Comparación de los métodos de filtración por membrana

y Readycult Ausencia/Presencia (A/P) en la planta Regional

para aguas tratadas no potables. 48

Tabla 25. Comparación de los métodos de filtración por

membrana y Readycult ausencia/presencia (A/P) en las fuentes

de agua cruda 49



INDICE DE GRAFICAS

Grafica 1. Filtración de membrana para E.coli 34

Grafica 2. Filtración por membrana Klebsiella pneumonie

concentración vs. UFC/100ml 35

Grafica 3. Concentración vs. UFC/100ml para Citrobacter freundii 37

Grafica 4. Analistas vs. Coeficiente de variación 40

Grafica 5. Reproducibilidad a las 24 horas de incubación. 41



Grafica 8. Reproducibilidad a las 24, 48 y 72 horas de incubación. 42

Grafica 9. Robustez según temperatura para analista 1, 2 y 3. 44

Grafica 10. Robustez según tiempo, analista 1. 44





LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Acción de los Sustratos Cromogénicos en Coliformes

Totales Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El agua

y los riesgos para la salud 26

Figura 2. Acción de los sustratos Cromogénicos y Fluorogénicos

en E.coli Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El

agua y los riesgos para la salud 27

Figura 3. Comparación de los métodos de filtración por membrana

y sustrato definido Readycult para E. coli 33

Figura 4. Método de Ausencia/Presencia Readycult para

klebsiella pneumoniae 35

Figura 5. Comparación de los métodos de filtración por membrana

y sustrato definido Readycult para Citrobacter freuindii 36

Figuras 6 y 7. Comparación de los métodos de filtración por

membrana y sustrato definido Readycult en diferentes tipos

de aguas potables 47

Figura 8. Comparación de los métodos de filtración por

membrana y sustrato definido Readycult en las plantas de

tratamiento (aguas tratadas no potables) 48



TABLA DE CONTENIDO

PAG

INDICE DE TABLAS 6 INDICE DE GRAFICAS 8 LISTA DE FIGURAS 9

1. INTRODUCCION 12 2. JUSTIFICACION 13 3. OBJETIVOS 14 3.1 Objetivo General 14

3.2 Objetivos Específicos 14

4. MATERIALES Y METODOS 15 4.1 Método de Filtración de Membrana para la detección de Coliformes totales

y Escherichia coli

17

4.2 Técnica Readycult Coliformes 100 sustrato definido Ausencia/presencia 19

5. VALIDACION 20 5.1 Tipos de validación 21 5.1.1 Validación Prospectiva 21

5.1.2 Validación Concurrente 21

5.1.3 Validación Retrospectiva 22

5.14 Revalidación 22

6. FILTRACION POR MEMBRANA 23 6.1 Fundamento del método MF 23

6.2 Unidades de filtración 24

6.3 Filtro de membrana 24

7. PRUEBA DE PRESENCIA AUSENCIA PARA COLIFORMES (A/P) 25

8. GRUPO COLIFORMES TOTALES 26

9. Escherichia coli 27



10. Metodología 29 10.1. Preparación de stock de Escherichia coli 29

10.2 Preparación de stock de Coliformes Totales (Klebsiella pneumoniae) 30 10.3 Preparación de stock de Coliformes Totales (Citrobacter freundii) 31 11. RESULTADOS 32 11.1 Limite de cuantificación 32

11.2 Limite de detección 32

11.3 Sensibilidad 38

11.4 Especificidad 39

11.5 Repetibilidad 39

11.6 Reproducibilidad 40

11.7 Robustez 42

12. COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS SUSTRATO DEFINIDO READYCULT Y FILTRACIÓN POR MEMBRANA

46

12.1 Comparación de los métodos Sustrato definido Readycult y filtración por

membrana en las diferentes fuentes de aguas potables

46

12.2 Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult

Ausencia/Presencia (A/P) en la planta galán (PGT) y en la planta del alto del

águila (PAA) y planta regional tratada para aguas tratadas no potables

48

12.3 Comparación de los métodos Sustrato definido Readycult y filtración por

membrana en las fuentes de agua cruda

49

13. DISCUSION DE RESULTADOS 50 CONCLUSIONES 53 RECOMENDACIONES 54

ANEXO ESPECIFICACIONES 55 BIBLIOGRAFIA 63



INTRODUCCION

El objetivo principal de la validación, es demostrar con un alto grado de confianza, por medio

de réplicas y de evidencia documentada que un proceso especifico producirá de forma

consistente y permanente productos que reunirán las características de calidad predefinidas.

En el presente trabajo se demostró, por medio de análisis estadístico tipo descriptivo, que las

técnicas de Filtración por membrana y Sustrato definido Readycult 100 de Merck, empleadas

para la detección de Coliformes totales y Escherichia coli en aguas crudas, tratadas y potables

en el acueducto de Zipaquirá, son realmente eficaces y arrojan resultados confiables.

Asimismo, se concluyó que el método de filtración por membrana, empleando tres tipos de

microorganismos, E.coli, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumonie, es mas sensible que

sustrato definido Readycult, ya que se estableció que el límite de cuantificación de la técnica de

filtración por membrana es de 1 UFC/100 ml, mientras que el límite de detección del método

sustrato definido Readycult es a partir de 22 UFC/100 ml. Por esta razón, se determinó que

para aguas potables y tratadas es necesario emplear el método de filtración por membrana, y

para aguas crudas, el método de sustrato definido Readycult es 100% efectivo si únicamente

se necesita determinar la ausencia o presencia de Coliformes totales o de E. coli, debido a que

la carga microbiana es lo suficientemente alta. Sin embargo, se puede hacer uso del método de

filtración por membrana mediante el empleo de diluciones.



2. JUSTIFICACION

El agua puede ser considerada un alimento de alto consumo a nivel mundial. Por consiguiente,

es de vital importancia determinar la calidad de la misma, para así evitar posibles riesgos de

enfermedad que perjudiquen la salud Humana. Debido a esto, y a los requerimientos

necesarios para mejorar e implementar sistemas de gestión de calidad en la Empresa de

acueducto, Alcantarillado y aseo de Zipaquirá, y de acuerdo a sus políticas de calidad que

buscan mejorar sus procesos de manera continua con tecnología, personal adecuado y

cumplimiento a cabalidad de la normatividad, se hace conveniente entregar a la comunidad

agua potable que garantice la ausencia de Coliformes Totales y Escherichia coli, causantes de

enfermedades gastrointestinales.

El progresivo interés por la calidad de las aguas y la obligatoriedad de su control hacen

necesario establecer y poner en marcha programas de garantía de calidad que confirmen la

validez de los datos analíticos. Este trabajo busca validar las técnicas de filtración por

membrana y sustrato definido Readycult, ampliamente utilizadas para la detección de

Coliformes Totales y Escherichia coli, ya que estos microorganismos son la base para evaluar

la calidad microbiológica del agua. Además, dichas técnicas son aceptadas y utilizadas a nivel

nacional e internacional por los entes reguladores, debido a su fácil manejo y empleo. Por lo

tanto, esta investigación se hace con el fin de comprobar la eficiencia, sensibilidad,

reproducibilidad, y las características propias de cada uno de los métodos determinando así,

por medio de una comparación, cual de las dos técnicas tiene una mayor confiabilidad.



3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Iniciar un proceso de validación de los métodos de Filtración por membrana y sustrato definido

para la detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en aguas crudas, tratadas y

potables procedentes del Acueducto de Zipaquirá

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Determinar los diferentes parámetros para realizar una primera fase de validación como

lo son la reproducibilidad, la repetibilidad, el límite de detección y el límite de cuantificación,

robustez y la variación intramuestra, para la identificación de Coliformes Totales y Escherichia

coli, mediante los métodos de sustrato definido y filtración por membrana.

• Comparar los resultados obtenidos al tratar una misma muestra por ambos métodos,

para así determinar la eficacia de estos, empleando controles a concentraciones conocidas.

• Comprobar la efectividad de los métodos utilizados.

• Verificar los parámetros y los requerimientos necesarios para la realización de la

validación.



4. MATERIALES Y MÉTODOS

El número de muestras a analizar son:

114 muestras de las cuales: 78 corresponden a agua potable, 12 a aguas tratadas y 24 a

aguas crudas.

• 78 muestras de agua potable: Cada punto de muestreo por triplicado

A. Prados del mirador

B. San Rafael.

C. Cambujos

D. Liberia

E. La esperanza

F. Potosí 1

G. El prado

H. Algarra I

I. Algarra II

J. Algarra III

K. San Pablo

L. San Carlos

M. Las Villas

N. Parcelación Santa Isabel

O. La Paz

P. La Mariela

Q. San Miguel

R. Pasoancho

S. Portachuelo

T. El Rudal

U. Casablanca

V. La Concepción

W. San Juanito

X. Coclies

Y. América 500 años

Z. Bosques de Silesia

• 12 muestras de agua Tratada: Cada punto de muestreo por cuatro



A. Planta Galán Tratada: PGT

B. Planta Regional Tratada: PRT

C. Planta Alto del Águila Tratada: PAA.

• 24 muestras de agua cruda: Bocatomas. Cada punto de muestreo por cuatro.

A. Rio frio

B. Arteza.

C. Clavel

H. La Hoya

G. Neusa

I. Borrachero

1. Material de vidrio: Frascos Schott por 250ml, pipetas volumétricas de 1, 2,5 y 10ml; Cajas

de Petri; Fiolas de 500ml; Tubos de 16 x 150, campanas de DURHAM

2. Material de plástico: 200 cajas de petri

3. Filtros de 0.45 µm

4. Reactivos: (Ver anexo especificaciones)

• Tiosulfato de sodio 0.1N

• Colorantes de Gram

• Reactivo de Kovacs

• Aceite de Inmersión

5. Medios de Cultivo: (Ver anexo especificaciones)

• Chromocult

• Plate Count

• Readycult

• Caldo Lactosado

• Caldo Brilla

6. Equipos: (Ver anexo especificaciones)

• Microscopio

• Incubadora

• Balanza analítica

• Lámpara U.V

• Turbidímetro

7. Cepas: (Ver anexo especificaciones) Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Citrobacter freundii



4.1. METODO DE FILTRACION DE MENBRANA PARA LA DETECCION DE COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli

El método de recuento de Coliformes totales y Escherichia coli esta descrito por la APHA-

AWWA-WPCF “Standard Methods” 1992

Lavado del equipo

Añadir 5 ml de alcohol y luego entre 20-30 ml de agua esterilizada

Filtro Tipo AC 0.45µm (SARTORIUS)

Equipo de filtrado SM 168-28 de, SM 16201/19/20 SARTORIUS

Abrir la llave y dejar pasar por el sistema

Colocar con pinzas estériles un filtro de membrana sobre la placa porosa del receptáculo

Situar con precaución el embudo sobre el correspondiente

receptáculo y se fija


Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Reads, tratadas y pota

ycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas cruda bles en el acueducto de Zipaquirá.


Se añade 100 ml de la muestra de agua

Para aguas crudas hacer previa

dilución

Añadir agente declorador en aguas

tratadas:1 ml de Tiosulfato 0.1N

para 200 ml de t

Dejar filtrar completamente

Se cierra el sistema

Se retira el filtro con pinzas estériles

Se lleva al medio de cultivo seleccionado

Chromocult (Merck, 1994)

Incubar: 24 horas entre 35-37°C

Leer e interpretar los resultados

Nota: Descontamínese el equipo entre filtraciones sucesivas adicionando 5 ml de alcohol y

luego entre 20-30 ml de agua esterilizada para de esta manera lavar el sistema y evitar

contaminaciones


4.2. TECNICA READYCULT COLIFORMES 100 SUSTRATO DEFINIDO AUSENCIA/PRESENCIA

Método descrito según MERCK

Test de presencia/ausencia para la detección simultanea de Coliformes totales y E.coli en el

análisis de aguas de acuerdo a la norma para Coliformes USEPA (Sec.141.21)

100 ml de la muestra de agua

Nota: Los frascos empleados para el procedimiento no deben ser fluorescentes y deben

tener una capacidad mínima de 120 ml, además para una muestra de 100ml de agua tratada o

potable se le debe adicionar 0.5 ml de Tiosulfato de sodio al 0.1N

Añadir una cápsula de Readycult Coliformes 100

Para evitar el riesgo de contaminación, no tocar la

abertura de la cápsula cuando se abra

Cerrar el recipiente y agitar hasta la completa disolución de los gránulos

Incubar: 24h 35-37◦C O

48h 20-25◦C

Leer e interpretar los resultados



5. VALIDACIÓN Validación es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada

que un proceso especifico producirá de forma consistente y permanente productos que

reunirán las características de calidad predefinidas. (CORTES, 2002)

La validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo. Esto

puede conseguirse utilizando productos contaminados naturalmente o productos inoculados

con un nivel conocido de microorganismos contaminantes. El analista debe ser consciente que

la inoculación de una matriz con microorganismos contaminantes imita tan sólo de una manera

superficial la presencia de contaminantes naturales. No obstante, a menudo es la mejor y la

única solución disponible. La extensión de la validación necesaria dependerá del método y su

aplicación. (ENAC, 2002)

Los métodos de ensayo microbiológicos cualitativos, tales como los que el resultado se

expresa en términos de detectado/no detectado, y los procedimientos de confirmación e

identificación, deben ser validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad,

exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto matricial,

repetibilidad y reproducibilidad. (ENAC, 2002)

En el caso de ensayos microbiológicos cuantitativos, debe considerarse la especificidad,

sensibilidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, repetibilidad,

reproducibilidad y el límite de cuantificación dentro de una variabilidad establecida y, en caso

necesario, determinar cuantitativamente estos parámetros. Las diferencias debidas a las

matrices deben tenerse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados

deben evaluarse utilizando métodos estadísticos apropiados. (ENAC, 2002)

Los laboratorios deben mantener los datos sobre validación de los sistemas de ensayo

comerciales (kits) que utilicen. Estos datos pueden obtenerse de ejercicios de intercomparación

o de datos sobre validación remitidos por los fabricantes y sujetos a la evaluación de una

tercera parte. Si no se dispone de datos sobre validación o si éstos no son plenamente

aplicables, el laboratorio será responsable de completar la validación del método. (ENAC,

2002)



Para demostrar que una versión modificada de un método cumple las mismas

especificaciones que el método original, deben realizarse comparaciones utilizando

replicas. El diseño experimental y el análisis de los resultados tienen que ser estadísticamente

válidos. (ENAC, 2002)

Incluso cuando se haya realizado la validación, el laboratorio tendrá que verificar

periódicamente que se cumplen los parámetros documentados, utilizando, por ejemplo,

muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices más

representativas. (ENAC, 2002)

El laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos que diseña o desarrolla,

los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, así como las ampliaciones y

modificaciones de los métodos normalizados, para confirmar que los métodos son aptos para el

fin previsto. La validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las

necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados. El laboratorio debe

registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la validación y una

declaración sobre la aptitud del método para el uso previsto. (ISO 17025)

5.1 Tipos de validación 5.1.1. Validación Prospectiva Este tipo de validación se basa en la información obtenida antes de implantar el proceso de

validación. Se realiza durante la etapa de desarrollo, mediante análisis de riesgo del proceso

de producción, que se divide en pasos individuales, estos se evalúan entonces a la luz de la

experiencia para determinar si podían conducir a situaciones criticas; se investigan posibles

causas y se determina la probabilidad de que suceda y su magnitud, se trazan los planes de

ensayo y se fijan las prioridades; a continuación se efectúan y se evalúan los ensayos y se

hace una valoración general; si los resultados son aceptables al final, el proceso es

satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una

nueva validación demuestre su carácter satisfactorio. Este tipo de validación es importante para

limitar el riesgo de errores que se producen a escala de producción. (CORTES, 2002)

5.1.2. Validación Concurrente La información requerida en este tipo de validación se obtiene durante la implementación del

mismo. Se debe tener en cuento el monitoreo en el proceso de las variables críticas que

demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso

en estado productivo. (CORTES, 2002) Este es el tipo de validación utilizado en el presente trabajo.



5.1.3. Validación retrospectiva

Este tipo de validación se lleva a cabo por medio de la revisión y análisis de la información

histórica del proceso. Se deben tomar como mínimo 20 o 30 lotes que cuenten con reportes

analíticos sólidos y confiables, documentación que muestre condiciones de los procesos y

estudios de reclamos de los productos, entre otros. Dentro de este tipo de validación es

necesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles ambientales, controles

microbiológicos, equipos, procedimientos, métodos analíticos y especificaciones; es aplicada

para productos que se encuentran en el mercado y cuyo proceso de manufactura se considera

estable, además cuando por las características del producto, económicamente no se justifica

hacer una validación prospectiva.

La validación retrospectiva también puede ser útil en el establecimiento de las prioridades en

un programa de validación. (CORTES, 2002)

5.1.4. Revalidación Es la repetición de un procedimiento de validación o una parte del mismo. Esto no significa

que el programan original debe ser repetido. Se aplica cuando se presenta cambio de

uno de los componentes críticos de la formulación, cambio o reemplazo de una pieza crítica en

un sistema o equipo, cambio en instalaciones, cambio en tamaño del lote de fabricación y por

unidades producidas fuera de especificaciones en lotes consecutivos.

La revalidación periódica se presenta cuando los procesos experimentan cambios graduales,

incluso si operarios experimentados trabajan correctamente aplicando los métodos

establecidos. De manera análoga el desgaste del equipo puede causar también cambios

graduales. Por consiguiente es aconsejable realizar revalidación a intervalos programados,

incluso sin introducir cambios deliberados. La decisión de implantar la revalidación periódica

debe basarse esencialmente en un examen de datos históricos, es decir, datos producidos

durante las pruebas del proceso de fabricación y del producto terminado efectuadas después

de la validación mas reciente, con el objetivo de verificar si el proceso esta bien controlado. Al

examinar esos datos históricos se debe evaluar cualquier tendencia observada en los datos

compilados. (CARDENAS, 2002)



6. FILTRACIÓN POR MEMBRANA (MF)

La técnica de filtración por membrana (MF) es altamente reproducible, puede utilizarse para

estudiar volúmenes relativamente grandes de muestras y proporciona resultados numéricos

más rápidos que el método de tubos múltiples. (APHA, 1992)

La técnica de filtración por membrana es extraordinariamente útil para controlar las posibles

situaciones de urgencia en relación con el agua potable y para estudiar distintas aguas

naturales. Sin embargo, esta técnica tiene limitaciones, sobre todo para estudiar aguas con

elevada turbidez o que contengan bacterias no Coliformes. (APHA 1992)

Este método es una manera rápida y simple de estimar las poblaciones bacterianas en el agua.

El método MF es especialmente útil al evaluar grandes volúmenes o al realizar diariamente

muchas pruebas de Coliformes. (HACH, 2000)

6.1. Fundamento del método MF

El método MF se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a través de un filtro de

membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos.

(MILLIPORE, 2005)

Actualmente se utilizan membranas Sartorius tipo AC con un diámetro de poro 0.45 µm.

Dichas membranas cumplen con las especificaciones referenciadas en el los Métodos Estándar

y la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos. (SARTORIUS, 2003).

Bastara incubar la membrana sobre un medio de cultivo adecuado, a la temperatura y durante

el tiempo necesario, para posteriormente contar directamente las colonias sobre la superficie

de la membrana. (MILLIPORE, 2005)



6.2. Unidades de filtración.

El equipo de soporte del filtro (Fabricado en vidrio, plástico resistente a autoclave, porcelana o

acero inoxidable) consiste en un embudo sin junturas, unido a una base por un artefacto de

cierre o mantenido en su lugar mediante una fuerza magnética. (APHA, 1992)

El diseño debe permitir que el diseño de membrana se mantenga con seguridad sobre la placa

porosa del receptáculo, sin que sufra daño mecánico, de manera que todo el líquido pase a

través de la membrana durante la filtración. (APHA, 1992)

6.3. Filtro de membrana Se debe utilizar filtros de membrana con un diámetro de poro que permita una completa

retención de las bacterias Coliformes.

Solo se emplean filtros en los que se haya comprobado, mediante una adecuada prueba de

control de calidad y por la garantía del fabricante, que permitan una retención de las bacterias

Coliformes. (APHA, 1992)

Se debe tener en cuenta que dichos filtros deben ser libres de químicos susceptibles de inhibir

el crecimiento y desarrollo bacterianos, que posean una velocidad de filtración satisfactoria (en

cinco minutos), ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no mas de ± 0.2

unidades) y que no produzcan un aumento en el numero de colonias confluentes o expansivas,

en comparación con los filtros de membrana de control. (APHA, 1992)

Las membranas marcadas con una trama se utilizaran de forma que no inhiban ni estimulen el

crecimiento bacteriano cuando se incuben con las bacterias retenidas en un medio adecuado.

(APHA, 1992)

Es preferible utilizar filtros de recientes y, si es necesario, guardarlos, debe hacerse en un

ambiente sin cambios extremos de temperatura o humedad.

Se recomienda emplear filtros de membrana preesterilizados cuyos fabricantes garanticen que

la técnica de esterilización no ha inducido toxicidad ni alterado las propiedades físicas o

químicas de la membrana.

Si estas se esterilizan en el laboratorio se deben someter al autoclave por 10 minutos a 121ºC.

(APHA, 1992)



7. PRUEBA DE PRESENCIA/ AUSENCIA PARA COLIFORMES (A/P)

La prueba de presencia ausencia de Coliformes es una sencilla modificación del procedimiento

de tubos múltiples. La simplificación que se deriva de utilizar una sola porción grande “100 ml”

en una sola botella de cultivo para obtener una información cualitativa sobre la presencia o

ausencia de Coliformes, se justifica por la teoría de la falta de estos microorganismos en una

muestra de 100 ml de agua potable. La prueba de A/P proporciona además una oportunidad

opcional para hacer una detección sistemática posterior del cultivo y aislar otros indicadores

(Coliformes fecales, Aeromonas, Staphylococos, Pseudomonas, Streptococos fecales y

Clostridium) también de manera cualitativa. Otras ventajas son la posibilidad de estudiar un

mayor numero de muestras por unidad de tiempo y hacer estudios comparativos con el

procedimiento del filtro de membrana que indica que la prueba de A/P puede aumentar al

máximo la detección de Coliformes en muestras que contienen microorganismos que podrían

sobrepasar en su crecimiento al de las colonias de Coliformes provocando problemas para su

detección. (APHA, 1992)

La prueba de A/P se recomienda para el estudio habitual de las muestras obtenidas en los

sistemas de distribución o en las plantas de tratamiento de aguas. En principio se estudian

alrededor de 100 muestras por los métodos del filtro de membrana o de los tubos múltiples,

además de la prueba de A/P.

Una vez establecido que los métodos cuantitativos suelen dar resultados negativos para

Coliformes, se pueden utilizar únicamente la prueba de A/P.

Cuando una muestra produce un resultado positivo en una prueba se estudiaran las posteriores

muestras repetidas mediante un método cuantitativo hasta que se vuelvan a obtener resultados

negativos en dos muestras consecutivas. (APHA, 1992)

Las muestras tomadas en locaciones poco habituales, como los pozos privados, se analizaran

con métodos de tubos múltiples o de filtro de membrana. (APHA, 1992



8. GRUPO COLIFORMES TOTALES

Los Coliformes son bacterias Gram negativas, no formadoras de esporas, oxidasa negativa y

con forma de bacilo, que pueden crecer en medio aerobio y anaerobio facultativo en presencia

de sales biliares y capaces de fermentar lactosa con producción de ácido y aldehído en 48

horas cuando se incuban a una temperatura de 36 +/- 2 º C. Las bacterias Coliformes poseen

la enzima ß Galactosidasa. (Millipore, 2005)

La prueba mas relevante utilizada para la identificación del grupo coliformes, es la hidrólisis de

la lactosa. El rompimiento de este disacárido es catalizado por la enzima ß-D-galactosidasa.

Ambos monosacáridos (la galactosa después es transformada en glucosa por reacciones

bioquímicas) posteriormente son metabolizados a través de los ciclos glicolítico y del citrato.

Los productos metabólicos de estos ciclos son ácidos y/o CO2. Para la La determinación de la

ß-galactosidasa se utilizan sustratos cromógenos tales como Chromocult y Readycult.

(MANAFI, 1998)

Figura 1: Acción de los Sustratos Cromogénicos en Coliformes Totales

Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El agua y los riesgos para la salud



9. Escherichia coli.

Las bacterias E. Coli son bacterias coliformes capaces de producir Indol a partir de triptófano,

en 21 +/- 3 horas a 44 +/- 0.5 ºC. También poseen la enzima ß Galactosidasa, reaccionan

positivamente en el ensayo del rojo de metilo y pueden decarboxilar el ácido L-glutámico, pero

no son capaces de producir acetil metil carbitol, de utilizar citrato como única fuente de carbono

o de crecer en un caldo de cultivo con cianuro de potasio (KCN). (Millipore, 2005)

E. coli es la única especie dentro de las enterobacterias que presenta la β-D- glucoronidasa.

Esta enzima degrada el sustrato 4-metilumbeliferil- β-D-glucoronido (MUG), formando 4-

metilumbeliferona, este producto tiene la propiedad de emitir fluorescencia azul/verde cuando

se ilumina con luz ultravioleta.(MANAFI,1998)

Figura 2: Acción de los sustratos Cromogénicos y Fluorogénicos en E.coli Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El agua y los riesgos para la salud



Tabla 1. Comparación de Coliformes totales y E.coli

Tomado de: Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El agua y los riesgos para la salud

Coliformes totales Bacterias Gram Negativas

No esporulados

Anaerobios facultativos

Fermentadores de la lactosa con producción de

ácido y gas a 36±1º C en 24-48h

Hábitat: Tracto gastrointestinal de animales de

sangre caliente (son bacterias entéricas,)

además son comunes en otros ambientes como

en suelos, vegetales, etc.

Ej.: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes,

Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae.

E.coli Bacterias Gram Negativas

No esporuladas

Anaerobios facultativos

Fermentadores de la lactosa

con producción de ácido y

gas a 36±1º C en 24-48h y a

44.5 ±0.2 º C en 24 h

Característica de heces de

animales homeotermos



10. METODOLOGÍA

10.1. PREPARACION DE STOCK DE Escherichia coli

Escherichia coli OXOID CULTI-LOOPS LT: 6088911

Repique y aislamiento de la CEPA en medio Chromocult y Plate count

Observar las colonias

Incubar 24 horas a 37ºC

Verificar pureza del cultivo mediante coloración de Gram y Bioquímicas

Incubar a 37ºC por 24 Horas, observar e

interpretar los resultados

A partir de una colonia axenica aislada recoger con asa estéril y

resuspenderla en 100 ml de agua destilada estéril (solución patrón).

Hacer recuento en placa por profundidad en medio Chromocult

Incubar a 37ºC por 24 Horas y determinar el número de colonias

como ufc/ml

A partir de esta solución hacer diluciones hasta 10-7. Este procedimiento se realiza 6 veces. Es

decir, que se obtienen 3 replicas por dilucion para filtración por membrana y 3 replicas para A/P. las

diluciones se realizan de la siguiente manera: Tomar 11 ml de la solución patrón y verter en 99

ml de agua destilada estéril.

Las diluciones se realizan en frascos Schott de 120 ml.

Se procede a realizar filtración por membrana a las 3 replicas desde la dilución 10-1 a 10-7,

comenzando desde la mas diluida hasta la mas concentrada para evitar contaminación. Entre muestra y muestra, el embudo de filtración se

desinfecta con alcohol al 70% y se enjuaga con agua destilada estéril.

Sde l

e comprueba la efectividad a desinfección del equipo filtración mediante el uso

de alcohol al 70% y agua destilada, pasando una

muestra de agua estéril al nal del procedimiento, que seria el control negativo, esperando observar la

ausencia de crecimiento después de la incubación

de

fi

Se realiza coloracion de Gram y pruebas

bioquímicas, las cuales se incuban a 37ºC por 24

horas.

Las membranas de filtración se llevan a

cajas de Petri con medio Chromocult y se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC. Se leen a las 24 horas y se informa el numero de colonias,

luego se leen a las 48 horas para observar si

se incrementa el numero (falsos positivos).

A las 3 replicas restantes, para ausencia/presencia, se les adiciona el medio

Readycult coliform 100, de Merck, y se homogeniza hasta que se disuelva.

Se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC, para una

posterior lectura de resultados.



10.2. PREPARACION DE STOCK DE Coliformes Totales (Klebsiella pneumoniae)

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603







A partir de una colonia axenica aislada recoger con asa estéril y resuspenderla en 100 ml de agua destilada estéril (solución patrón).

Hacer recuento en placa por

profundidad en

Incubar a 37ºC por 24 Horas y determinar el número de colonias

como ufc/ml

A partir de esta solución hacer diluciones hasta 10-7. Este procedimiento se realiza 6 veces. Es decir,que se obtienen 3 replicas por dilucion para filtración por membrana y 3 replicas para A/P. las diluciones

se realizan de la siguiente manera: Tomar 11 ml de la solución patrón y verter en 99 ml de agua destilada

estéril.


Se procede a realizar filtración por membrana a las 3 replicas desde la dilución 10-1 a 10-7, comenzando desde la mas

diluida hasta la mas concentrada para evitar contaminación. Entre muestra y muestra, el embudo de filtración se desinfecta con

alcohol al 70% y se enjuaga con agua destilada estéril.

Se comprueba la efectividad de la desinfección del equipo de filtración mediante el uso


muestra de agua estéril al final del procedimiento, que

seria el control negativo, esperando observar la

ausencia de crecimiento después de la incubación

Se realiza coloracion de Gram y pruebas

bioquímicas, las cuales se incuban a 37ºC por 24

horas.

Las membranas de filtración se llevan a cajas

de Petri con medio Chromocult y se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC. Se leen a las 24 horas y se informa el numero de colonias, luego se leen a

las 48 horas para observar si se incrementa el numero

(falsos positivos).

A las 3 replicas restantes, para ausencia/presencia, se les adiciona el medio Readycult coliform 100, de Merck, y se

homogeniza hasta que se disuelva

Se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC, para una posterior lectura de

resultados.



10.3. PRAPARACION DE STOCK DE Coliformes Totales (Citrobacter freundii)

Citrobacter freundii ATCC 8090







A partir de una colonia axenica aislada recoger con asa estéril y resuspenderla en 100 ml de agua destilada estéril (solución patrón).

Hacer recuento en placa por profundidad en medio

Chromocult

Incubar a 37ºC por 24 Horas y

determinar el ero de colonias

como ufc/mlnúm

11. RESULTADOS

A partir de esta solución hacer diluciones hasta 10-7. Este procedimiento se realiza 6 veces. Es decir,que se obtienen 3 replicas por dilución para filtración por membrana y 3 replicas para A/P. las diluciones

se realizan de la siguiente manera: Tomar 11 ml de la solución patrón y verter en 99 ml de agua destilada

estéril.


Se procede a realizar filtración por membrana a las 4 replicas desde la dilución 10-1 a 10-7,

comenzando desde la mas diluida hasta la mas concentrada para evitar contaminación. Entre muestra y muestra, el embudo de filtración se

desinfecta con alcohol al 70% y se enjuaga con agua destilada estéril.

Se comprueba la efectividad de la desinfección del equipo de filtración mediante el uso


muestra de agua estéril al final del procedimiento, que seria el control negativo, esperando

observar la ausencia de crecimiento después de la

Se realiza coloración de Gram y pruebas

bioquímicas, las cuales se incuban a 37ºC 24 h

Las membranas de filtración se llevan a cajas de Petri

con medio Chromocult y se llevan a incubar por 24 horas

a 37 ºC. Se leen a las 24 horas y se informa el

numero de colonias, luego se leen a las 48 horas para observar si se incrementa el numero (falsos positivos).

A las 3 replicas restantes, para ausencia/presencia, se les adiciona el

medio Readycult coliform 100, de Merck, y se homogeniza hasta que se

suelva. di

Se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC, para una posterior lectura de

resultados.



11. RESULTADOS

En todos los ensayos, las mismas replicas se evalúan por los dos métodos utilizados, filtración

por membrana y sustrato definido Ausencia/Presencia (A/P).

11.1. Límite de cuantificación.

Aplicado a análisis microbiológicos cuantitativos –Numero mínimo de microorganismos dentro

de una variabilidad definida que puede determinarse en las condiciones experimentales del

método evaluado.

11.2. Límite de detección. Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos –Numero mínimo de microorganismos que

pueden ser detectados pero en cantidades que no pueden estimarse con precisión.

Tabla 2. Determinación del límite de detección para filtración por membrana y limite de

cuantificación para sustrato definido Readycult utilizando E.coli.

Solución patrón 1600 UFC/100ml Filtración por membrana (FM) Sustrato definido Ausencia/Presencia (A/P)

DILUCION FM1 FM2 FM3 FM4 dil. A/P1 A/P2 A/P3 A/P410-1 1600 1600 1600 1600 10-1 P P P P10-2 1600 1600 1600 1600 10-2 P P P P10-3 1296 1302 1290 1306 10-3 P P P P10-4 228 223 234 230 10-4 P P P P10-5 21 24 23 24 10-5 A P P P10-6 4 3 3 2 10-6 A A A A10-7 1 1 1 10-7 A A A A1

Limite de cuantificación para filtración por membrana

Limite de detección para Sustrato definido Readycult



Figura 3. Comparación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido

Readycult para E. coli

Tabla 3. Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente de variación para E. coli

en filtración por membrana

10-1 1600 0 0 010-2 1600 0 0 010-3 1298 36,749 0.00478 6,062110-4 229 15,75 1.73 3,968610-5 23 1,2247 6.52 1,510-6 3 1,2247 23.57 0,707110-7 1 0 0 0

Promedio UFC Coeficiente de variacion Dilución Varianza Desviación Estandar

Tabla 4. Porcentaje de Presencia y disminución según diluciones para A/P en E.coli

10-1 100 010-2 100 010-3 100 010-4 100 010-5 75 -2510-6 0 -10010-7 0 -100

Dilución % Presencia % Disminución



Grafica 1. Filtración de membrana para E.coli

Filtración por membrana E.coli

R2 = 0,8449

-5000

5001.0001.5002.000

0,100

0000

0,010

0000

0,001

0000

0,000

1000

0,000

0100

0,000

0010

0,000

0001

UFC

Tabla 5. Resultados del límite de cuantificación para las pruebas de filtración por membrana y

límite de detección Ausencia / Presencia Readycult para Klebsiella pneumoniae

Solución Patrón: 1000 ufc/ml Solución Patrón: 1000 ufc/ml Filtración por membrana (FM) Sustrato definido

Ausencia/Presencia (A/P)

10-1 1000 1000 100010-2 676 681 66410-3 110 101 11910-4 18 25 2210-5 1 3 210-6 1 1 110-7 0 0 0

Replica 1 Replica 3Dilución Replica 210-1 P P P10-2 P P P10-3 P P P10-4 A P P10-5 A A A10-6 A A A10-7 A A A

Replica 3Dilución Replica 2Replica 1

Limite de cuantificación para filtración por membrana

Limite de detección para Sustrato definido A/P Readycult



Figura 4. Método de Ausencia/Presencia Readycult para Klebsiella pneumoniae

Gráfica 2. Filtración por membrana para Klebsiella pneumoniae concentración vs

UFC/100ml

Filtración por membrana Klebsiella

pneumonie

R2 = 0,7086

-5000

5001.0001.500

0,10

0000

0

0,01

0000

0

0,00

1000

0

0,00

0100

0

0,00

0010

0

0,00

0001

0

0,00

0000

1

Concentración (Dilucion)

UFC

Tabla 6. Porcentaje de disminución en filtración por membrana para Klebsiella

pneumoniae.

10-1 1000 - 10010-2 675 -32,6 10010-3 110 -83,68 10010-4 21 -80.909 6610-5 2 -90.476 010-6 1 -5010-7 0 -100

UFC/ml % Disminución PresenciaDilución

00



Tabla 7. Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente de variación para

Klebsiella pneumonie en filtración por membrana

10-1 1.000 0 0 010-2 674 7,1336 50,8882 1.05810-3 110 7,3484 53,9989 6.6810-4 21 2,1602 4,6666 0.102810-5 2 0,8164 0,6665 40.8210-6 1 0 0 010-7 0 0 0 0

Dilución Desviación Estandar Varianza Coeficiente de variación Promedio UFC/ml

Tabla 8. Resultados del límite de cuantificación para las pruebas de filtración por

membrana y limite de detección Ausencia / Presencia Readycult para Citrobacter freundii

Solución Patrón: 1000 ufc/ml Solucion Patron: 1000 ufc/ml

Filtración por membrana(FM) Ausencia/Presencia (A/P)

10-1 1000 1000 100010-2 600 615 60210-3 73 78 7510-4 24 23 2010-5 2 2 2

10-6 1 1 1

10-7 0 0 0

Replica 1 Replica 3Dilución Replica 210-1 P P P10-2 P P P10-3 P P P10-4 P P A10-5 A A A10-6 A A A10-7 A A A

Replica 3Dilución Replica 2Replica 1

Límite de cuantificación para filtración por membrana Límite de detección para Readycult (A/P)


Readycult para Citrobacter freundii



Grafica 3. Concentración vs UFC/100ml para Citrobacter freundii

Filtracion por Membrana Citrobacter freundii

R2 = 0,6813

-5000

5001.0001.500

0,0000000 0,0200000 0,0400000 0,0600000 0,0800000 0,1000000 0,1200000

Concentracion

UFC

Tabla 9. Porcentaje de disminución y porcentaje de presencia en filtración por membrana

para Klebsiella pneumoniae

10-1 1000 - 10010-2 606 -39,4 10010-3 75 -87,6237624 10010-4 22 -70.666.666 010-5 2 -90.909.090 010-6 1 -5010-7 0 -100

Dilución Promedio UFC/ml % Disminución % Presencia

00

Tabla 10.Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente de variación para

Klebsiella pneumoniae en filtración por membrana

DesviaciónEstandar

10-1 1.000 0 0 010-2 606 6,6499 44,2211 0,150310-3 75 2,0548 4,2222 0,486610-4 22 1,6996 28.888 1,224910-5 2 0 0 010-6 1 0 0 010-7 0 0 0 0

Dilución Varianza Coeficiente de variaciónPromedio UFC/ml



11.3Sensibilidad:

Fracción del número total de cultivos o de colonias correctamente asignados en el análisis

presuntivo.

a/a+c

Con pocas excepciones, se confirman más del 90% de los resultados presuntamente positivos.

Tabla11. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana y sustrato definido

Readycult (A/P) para E.coli

Dilución10-110-210-310-410-510-610-7

4/4=1 0/4= 04/4=1 0/4= 0

4/4=1 4/4= 14/4=1 3/4= 0,75

4/4=1 4/4= 14/4=1 4/4= 1

Sensibilidad para FM Sensibilidad para A/P4/4= 1 4/4= 1

Tabla12. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana y sustrato definido

Readycult (A/P) para Klebsiella pneumoniae

Dilución Sensibilidad para FM Sensibilidad para A/P10-1 3/3= 1 3/3=110-2 3/3=1 3/3=110-3 3/3=1 3/3=110-4 3/3=1 2/3=0,6610-5 3/3=1 0/3=010-6 3/3=1 0/3=010-7 0/3=0 0/3=0



Tabla 13. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana y sustrato definido

Readycult (A/P) para Citrobacter freundii

Dilución Sensibilidad para FM Sensibilidad para A/P

10-1 3/3= 1 3/3=110-2 3/3=1 3/3=110-3 3/3=1 3/3=110-4 3/3=1 2/3=0,6610-5 3/3=1 0/3=010-6 3/3=1 0/3=010-7 0/3=0 0/3=0

11.4 Especificidad Fracción del número total de cultivos o de colonias negativos correctamente asignados en el

análisis presuntivo.

Los medios utilizados demostraron ser 100% específicos:

En filtración por membrana se utilizó Chromocult medio selectivo específico para la

diferenciación de Coliformes totales característicos por presentar colonias rojas y E.coli por

evidenciar colonias moradas.

En cuanto a Ausencia presencia se empleo Readycult 100 de Merck, donde los Coliformes

totales se denotan por presentar una coloración verde y E.coli se confirma por fluorescencia

bajo lámpara UV e Indol positivo.

11.5 Repetibilidad Grado de acuerdo entre los resultados obtenidos en medidas sucesivas del mismo mesurando

realizados en las mismas condiciones de medidas.

La repetibilidad se calcula como r =2.8 sr donde sr es la desviación estándar de repetibilidad.

Stock: 10 UFC/100ml

Tabla 14. Replicas de repetibilidad, porcentaje de variación intramuestra y variación con el

Stock

1 8 10 9 20 102 9 10 9,5 10 53 8 9 8,5 10 154 9 10 9,5 10 105 9 10 9,5 10 10

% Variacion con el stockAnalistas Repetibilidad X % Variacion

intramuestra



Tabla 15. Repetibilidad, desviación estándar y coeficiente de variación

1 9 1 1 11,11 2,82 9,5 0,25 0,5 5,26 1,43 8,5 0,25 0,5 5,26 1,44 9,5 0,25 0,5 5,26 1,45 9,5 0,25 0,5 5,26 1,4

Analista X Varianza Desviación estándar CV % Repetibilidad

Grafica 4. Analistas vs coeficiente de variación

Analista Vs Coeficiente de Variacion

0

5

10

15

0 2 4

Analistas

CV

%

6

11.6 Reproducibilidad

Grado de acuerdo entre los resultados obtenidos en medidas sucesivas del mismo

mesurando realizados en distintas condiciones de medida.

La reproducibilidad se calcula como R=2.8 sR donde sR es la desviación estándar de la

reproducibilidad, generalmente compuesta por la desviación típica de diferentes

laboratorios, diferentes analistas, diferentes días, diferentes instrumentos, sL y la

desviación típica de repetibilidad, sr, es decir :

sR=√sL²+ sr²



Stock: 10 UFC/100ml

Tabla 16. Reproducibilidad en función de la temperatura y el tiempo de incubación para el

método de filtración por membrana.

Analista1 8 ufc/ml 10ufc/ml 8 ufc/ml 10ufc/ml2 9ufc/ml 10ufc/ml 9ufc/ml 10ufc/ml3 8ufc/ml 9ufc/ml 8ufc/ml 9ufc/ml

Analista1 8 ufc/ml 10ufc/ml 8 ufc/ml 11 ufc/ml2 9ufc/ml 10ufc/ml 9ufc/ml 12 ufc/ml3 8ufc/ml 9ufc/ml 8ufc/ml 13ufc/ml9ufc/ml 11ufc/ml

10ufc/ml 12ufc/ml10ufc/ml 11ufc/ml

9ufc/ml 8ufc/ml24 horas 48 horas 72 horas *

10ufc/ml 8 ufc/ml10ufc/ml 9ufc/ml

33ºC 35ºC 38ºC

* El medio se deshidrata y se observan falsos positivos

Grafica 5. Reproducibilidad a las 24 horas de incubación.

Reproducibilidad a las 24 horas

88,5

99,510

0 1 2 3

analistas

Prom

edio

de

UFC

/100

ml

4


Reproducibilidad a las 48 horas

88,5

99,510

0 1 2 3 4

Analistas

Prom

edio

de

UFC

/100

ml




Reproducibilidad a las 72 Horas

11,411,611,8

1212,2

0 1 2 3 4

Analistas

Prom

edio

de

UFC

/100

ml

Grafica 8. Reproducibilidad a las 24, 48 y 72 horas de incubación.

Reproducibilidad a las 24,48 y 72 horas

0

5

10

15

0 20 40 60 8

Horas

Prom

edio

de

UFC

/100

ml

0

11.7 Robustez Insensibilidad de un método analítico a pequeños cambios en el procedimiento.

Para examinar la robustez es aconsejable forzar las condiciones del método de un modo

controlado.



Stock: 10 UFC E. coli / 100ml

Tabla 17. Robustez según la temperatura y el tiempo de incubación para el método de

filtración por membrana.

Analista

10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml



10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 11ufc/ml 11ufc/ml10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 11ufc/ml 12ufc/ml

10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 13ufc/ml 11ufc/ml23

24 horas 48 horas 72 horas *1

123

Analista

34ºC 35ºC 36ºC

El medio se deshidrata y se observan falsos negativos

Tabla 18. Promedio temperaturas de incubación, desviación estándar y coeficiente de variación

para filtración por membrana.

Promedio Promedio Promedio33ºC 35ºC 38ºC

1 9 ufc/ml 9 ufc/ml 9 ufc/ml 0 0

2 9,5 ufc/ml 9,5 ufc/ml 9,5 ufc/ml 0 0

3 8,5 ufc/ml 8,5 ufc/ml 8,5 ufc/ml 0 0

Analista Desviación estándar CV %

Tabla 19. Promedio horas de incubación, desviación estándar y coeficiente de variación

para filtración por membrana

Promedio Promedio Promedio24 horas 48 horas 72 horas

1 9 ufc/ml 9 ufc/ml 11,5ufc/ml 1,178 11,98

2 9,5 ufc/ml 9,5 ufc/ml 11,5ufc/ml 0,942 8,88

3 8,5 ufc/ml 8,5 ufc/ml 12 ufc/ml 1,649 17,07

Analista Desviacion estandar CV %



Grafica 9. Robustez según temperatura para analista 1, 2 y 3

Robustez segun Temperatura para analista 1, 2 y 3

01020

33,5 34 34,5 35 35,5 36 36,5

temperatura

UFC

/ml

Grafica 10. Robustez según tiempo, analista 1.

Robuztez segun tiempo analista 1

9,510

10,511

11,5

0 20 40 60 8

Tiempo en Horas

UFC

/ml

0



9,510

10,511

11,512

0 20 40 60 8

Tiempo en Horas

UFC

/ml

0





05

1015

0 20 40 60 8

Tiempo en Horas

UFC

/ml

0

STOCK 100 UFC de E. coli/ 100ml

Tabla 20. Reproducibilidad Sustrato definido Readycult según temperatura de incubación.

Tabla 21. Reproducibilidad Sustrato definido según tiempo de incubación.

Analista

1 P P P2 P P P3 P P P

33ºC 35ºC 38ºC

P* Reducción de color, de fluorescencia y la reacción del Indol es casi nula.

1 P P P*2 P P P*3 P P P*

Analista 72 horas * 48 horas24 horas



12. COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS SUSTRATO DEFINIDO READYCULT Y FILTRACIÓN POR MEMBRANA

12.1 Comparación de los métodos de sustrato definido Readycult (A/P) y filtración por membrana en las diferentes fuentes de aguas potables

Tabla 22. Pruebas de filtración por membrana y sustrato definido Readycult

(Ausencia/Presencia) para aguas potables

R1 R2 R3 R1 R2 R3Pasoancho A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan Juanito A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml

La Esperanza A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlLa Paz A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlPotosi A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlCoclies A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml

Nueva Navarra A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlLas Villas A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml

La Concepción A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan Carlos A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan pablo A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml

Bosques de Silecia A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlAlgarra I A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlAlgarra II A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlAlgarra III A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml

Prados del Mirador A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan Rafael A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlCambulos A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml

Liberia A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan Miguel A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlLa Mariela A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml

Parcelacion Santa Isabel A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlEl Rudal A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml

Portachuelo A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlAmerica 500 años A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml

Filtracion por membrana sin diluciónPuntos Muestreados

Sustrato definidoAusencia/Presencia (A/P)

Sin dilución




Readycult en diferentes tipos de aguas potables


Readycult en diferentes tipos de aguas potables



12.2. Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult Ausencia/Presencia (A/P) en la planta galán (PGT), en la planta del alto del águila (PAA) y en la planta regional tratada para aguas tratadas no potables

Tabla 23. Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult

Ausencia/Presencia (A/P) en la planta Galán (PGT) y en la planta del alto del Águila (PAA) para

aguas tratadas no potables


Ausencia/Presencia (A/P) en la planta Regional para aguas

tratadas no potables


Readycult en las plantas de tratamiento (aguas tratadas no potables)

Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 41 1 0 1 3 0 0 1 0

E. coli Coliformes totales

Coliformes totales E. coli Coliformes

totalesColiformes

totalesColiformes

totalesColiformes

totalesColiformes

totales

Ausencia/Presencia (A/P) A A A A A A AA

filtración membrana

Planta Galán (PGT) Planta del alto del Águila (PAA)Replica 4

Método Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 4Filtración 5 5 7 8Readycult A A A A



12.3. Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult Ausencia/Presencia (A/P) en las fuentes de agua cruda


Ausencia/Presencia (A/P) en las fuentes de agua cruda

Nota: En este caso se entiende como (P) la presencia de Coliformes totales (C.T) y E.coli

y (A) la ausencia de los mismos

FUENTE E. coli C.T E. coli C.T E. coli C.TArteza 102 105 90 92 61 65 P P P P P

Rio Frio 2 6 6 8 5 9 A A A P PBorrachero 0 5 4 11 0 4 A A A P P

Clavel 0 12 0 7 2 9 A A A P PLa Hoya 4 6 4 10 2 8 A A A P PNeusa 2 4 2 5 0 4 A A A P P

Replica 2 Replica 3 Replica 2

Filtración por membrana (dilución 10-2)

Replica 1Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 1

Readycult Ausencia/Presencia (A/P) (dilución 10-2)

Readycult Ausencia/Presencia (A/P) sin dilución



13. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Debido a que la validación es un proceso que permite demostrar que un método es capaz de

cumplir la función a la cual esta destinado; detectar o cuantificar un microorganismo o un grupo

de microorganismos con la exactitud y precisión requeridas, y según el método secundario de

validación o verificación cuyo objetivo es recopilar los datos que permitan demostrar que el

laboratorio es capaz de cumplir con las especificaciones establecidas en la validación primaria,

se emplean una seria de datos estadísticos para determinar que realmente los métodos de

filtración por membrana y sustrato definido, empleados para la detección de Coliformes totales

y Escherichia coli en aguas crudas, tratadas y potables, son realmente eficaces y arrojan

resultados confiables.

Con los resultados obtenidos en la validación se demuestra que el método de filtración por

membrana, empleando tres tipos de microorganismos, E.coli, Citrobacter freundii y Klebsiella

pneumonie, es mas sensible que sustrato definido Readycult, ya que como se muestra en las

tablas 2, 5 y 8 y de acuerdo a su límite de cuantificación donde se utilizó un análisis estadístico

de tipo descriptivo para hallar dicho límite, el primer método mencionado es capaz de detectar

concentraciones a partir de 1ufc/100ml, que correspondió a la ultima dilución 10 -7 partiendo de

un stock de 1600 ufc/ 100 ml.

De esta manera se denota que dicha técnica es capaz de hallar microorganismos a la más

mínima concentración. Se debe resaltar que el método de filtración por membrana es una

técnica que concentra las bacterias en una membrana de 0.45 µm y de ahí su efectividad para

hallar microorganismos a bajas concentraciones, además el medio utilizado Chromocult es

bastante especifico y sensible.

Mientras que el método Readycult de Merck (A/P) demostró que su límite de detección es a

partir de 22 UFC/100ml ya que como se muestra en las tablas 2 ,5 y 8, cuando se llevó a cabo

un recuento de 20 UFC/100ml para Citrobacter freundii, 18 UFC/ 100 ml para Klebsiella

pneumoniae y 21 para E. coli, el método mostró ausencia en los tres casos, mientras como se

menciono anteriormente, al evaluar cantidades iguales o mayores a 22 UFC/ml el método

demostró presencia en todas las replicas para los tres microorganismos.

Mediante el estudio se demuestra que la sensibilidad se hace menor en Readycult (A/P) a

medida que las diluciones se hacen más grandes demostrándose así que dicho método es



incapaz de detectar microorganismos a concentraciones muy bajas, mientras que

filtración por membrana es capaz de detectar la mínima concentración posible.

Aunque el método de filtración por membrana requiere de más pasos, se demostró que es

más sensible que el método de Ausencia/Presencia Readycult. Esta razón, lo hace el método

de preferencia para el análisis microbiológico de aguas potables.

Se debe tener en cuenta que la variabilidad de los resultados entre una replica y otra, o entre

diferentes microorganismos, se debe básicamente a que estos no son solutos como los iones,

que para análisis químicos se puede asumir su distribución homogénea. Cuando están

introducidos en el agua, los microorganismos no forman una solución perfecta sino una

suspensión que imparte un grado significativo de heterogeneidad inherente. (David P Sartory,

2005)

Asimismo, hay una variabilidad impartida por las células microbianas en una muestra, por

encontrarse en las diferentes etapas de crecimiento, el estado de estrés en el que se

encuentren y el estado metabólico a la hora del análisis. (David P Sartory, 2005)

Todos estos factores afectan la respuesta de las bacterias en los métodos cuantitativos que

requieren crecimiento selectivo, dando lugar a una variabilidad natural significativa en la

recuperación de microorganismos del agua, que debe ser considerada al idear los protocolos

analíticos y estadísticos para comparar métodos cuantitativos, particularmente cuando la

población microbiana que se encuentra en muestras de rutina tiende a ser muy baja, como en

el caso del agua potable. (David P Sartory, 2005)

Por otro lado, al determinar la robustez de ambos métodos (Tablas16,17,18 y graficas

9,10,11,12 ) se encontró en el caso de filtración por membrana, empleando medio Chromocult,

que la técnica es robusta entre 33 y 38 ºC, lo que indica que en este rango de temperatura no

se observa ninguna variación ya que el número de colonias no se modifica, se mantiene en 10

UFC/100ml en todos los casos, mientras que cuando se varia el tiempo de incubación se

observa que el numero de colonias se mantiene entre 24 y 48 horas pero cuando se excede

este tiempo y se determina el numero de colonias a las 72 horas, en el caso de Filtración por

membrana el numero de colonias aumenta, además el medio se deshidrata y los filtros de

membrana tienden a deformarse.

Así mismo, cuando se determina la robustez de la técnica Readycult se encuentra que entre

33 y 38ºC la técnica muestra presencia de E.coli, la cual se evidencia por cambio de color,

fluorescencia e Indol positivo.

Mientras que cuando se evalúa el tiempo, la técnica es robusta entre 24 y 48 horas, ya que a

las 72 horas se disminuye notablemente el color al igual que la fluorescencia y la presencia del

Indol, debido a que el metabolismo de las bacterias disminuye a medida que el sustrato del



medio desaparece y se hace menor, haciendo que las bacterias lleguen a una fase de

decadencia y de muerte.

En cuanto a la reproducibilidad, como se observa en las tablas 16,19 y 20 y en las graficas 5, 6,

7 y 8, el medio es reproducible entre 24 y 48 horas entre 33 y 38 ºC pero no es reproducible a

las 72 horas, ya que en este tiempo el número de bacterias tiende a aumentarse y a presentar

falsos positivos.

La repetibilidad analizada como el grado de acuerdo entre los resultados obtenidos usando un

mismo stock para 5 analistas, como se observa en la tabla 14, y tras las mismas condiciones

de trabajo, temperatura y tiempo, demuestran que los resultados para la técnica por filtración

por membrana no varían notablemente, ya que la concordancia de los datos, determinada por

el coeficiente de variación, no excede el 20% lo que indica que dichos resultados mantienen

una similitud entre los diferentes analistas y las replicas analizadas.

Según la tabla 21 y figuras 6 y 7, se demuestra que el proceso de Potabilización del agua que

se lleva a cabo en el acueducto de Zipaquira es efectivo, ya que los resultados obtenidos en el

estudio muestran la ausencia total de Coliformes totales y por ende de E. coli. Por esta razón

se determina que para aguas potables es necesario emplear el método de filtración por

membrana. De igual manera, se debe utilizar filtración por membrana para aguas tratadas ya

que como se muestra en la tabla 22, el número de microorganismos presentes solo es

detectado por filtración por membrana.

Por otro lado, para aguas crudas (ver tabla 23, figura 8) se determina que Readycult es 100%

efectivo si únicamente se necesita determinar la ausencia o presencia de Coliformes totales o

de E. coli, debido a que la carga microbiana es lo suficientemente alta. Sin embargo, si se

desea determinar el número de la población microbiana presente en el agua, se puede hacer

uso del método de filtración por membrana mediante el empleo de diluciones.



CONCLUSIONES

Se demuestra a través del estudio, que el método de filtración por membrana es capaz

de detectar concentraciones a partir de 1 UFC/100 ml, mientras que el método de

Ausencia/Presencia Readycult 100 de Merck detecta a partir de 22 UFC/100ml.

Se comprobó la sensibilidad de las técnicas de filtración por membrana y Readycult

100 de Merck, determinando que la primera tiene una sensibilidad del 100% lo que la

hace más efectiva.

Las dos técnicas son 100% específicas para Coliformes totales y E. coli, ya que

permiten evidenciar sus características metabólicas.

Las dos técnicas utilizadas demostraron ser altamente repetibles, reproducibles y

robustas entre 33ºC y 38ºC y en un rango de tiempo 24 a 48 horas.

Se comprueba que para aguas potables, tratadas o crudas con dilución igual o mayor a

10-2, es indispensable utilizar la técnica de filtración por membrana, mientras que para

aguas crudas o con una alta carga microbiana, se puede utilizar el método de

Readycult 100 de Merck.



RECOMENDACIONES

Se recomienda utilizar filtración por membrana en aguas potables y tratadas, cuando se

sospeche que el agua a analizar tiene baja carga microbiana o cuando se empleen diluciones

mayores a 10-2 para aguas crudas, ya que se comprobó que estas mantienen una

concentración baja de microorganismos que no son detectables por la técnica Readycult 100

de Merck. Además, se debe tener en cuenta la morfología y el color de la colonia ya que si se

presentan microorganismos atípicos se sugiere realizar coloración de Gram y pruebas

bioquímicas para determinar la veracidad de los resultados.

Al igual, se debe tener presente que en ambos métodos es indispensable la temperatura y el

tiempo de incubación, el cual no debe exceder de 48 horas y así mismo se debe mantener

siempre un rango de temperatura entre 33 y 38ºC para garantizar de esta manera unos buenos

resultados.

Cuando se realicen diluciones se debe tener la mayor precisión posible y se sugiere en aguas

crudas practicar diluciones iguales o mayores a 10-2 para poder hacer un fácil recuento de las

colonias.

Es necesario cumplir a cabalidad todos los pasos de la técnica, ya que el proceso de validación

se realizó de acuerdo al método estandarizado propuesto por el Standar Methods para filtración

por membrana y Merck para Readycult 100. Si se lleva a cabo una variación por parte del

laboratorio en las técnicas propuestas, es necesario llevar a cabo un nuevo proceso de

validación.



ANEXO ESPECIFICACIONES

INSTALACIONES Y EQUIPOS. En general todas las instalaciones y los equipos deben mantenerse limpios y en condiciones

adecuadas de trabajo. Se deben monitorear las operaciones de mantenimiento y revisar

regularmente los instrumentos de monitoreo.

REACTIVOS 1. Solución Tiosulfato de Sodio 0.1N: c ( Na2S2O3 5 H2O) = 0.1mol/l

MERCK: 1.09147.1000.

2. Colorantes de Gram:

A. Violeta de Gram (100ml): Colorante primario tinción de gram. ALBOR QUIMICOS

Composición: C25H30C1N3 0.68%

C2H5OH 10 %

C2H2O4 (NH3)2*H2O 0.4%

Cristal violeta 2.0 g

Oxalato de amonio 0.8 g

Alcohol etílico 20 ml

Agua destilada 80 ml

B. Lugol (300 ml). LAB. SAR LTDA Composición: Yodo metálico 1g

Yoduro potásico 2g


C. Alcohol acetona (100ml) LAB. SAR LTDA

Composición: Acetona al 0.1% 1 ml

Alcohol absoluto 100 ml



D. Fucsina de Gram (100ml): LAB. SAR LTDA Composición: Fucsina básica 0.25g

Alcohol etílico 95% 10 ml


3. Aceite de inmersión: MERCK Índice de refracción (n D 20º)= 1.516

4. REACTIVO DEL INDOL seg. KOVACS: MERCK 109293 Para la demostración del Indol producido microbianamente, para la identificación de

microorganismos Indol positivos e Indol negativos, seg. KOVACS (1928)

Fundamento: Diversos microorganismos son capaces de escindir el triptófano, presente en

abundancia, especialmente en la peptona sometida a digestión tríptica, dando ácido pirúvico,

amoniaco e Indol. Este reacciona con 4-dimetilaminobenzaldehído dando una coloración rojo-

oscura. No obstante dado que también el triptófano da una reacción coloreada con el 4-

dimetilaminobenzaldehído, es necesario hacer una separación del Indol. Este último se

consigue con Butanol, el cual extrae selectivamente al Indol.

Composición: n-Butanol, ácido clorhídrico, 4-dimetilaminobenzaldehído

EQUIPOS: 1. Embudo y Portafiltros metálico:

SM 16201/19/20 de SARTORIUS.

El equipo del soporte del filtro (Fabricado en vidrio, plástico resistente al autoclave, porcelana o

acero inoxidable) consiste en un embudo sin junturas, unido a una base por un artefacto de

cierre o mantenido en su lugar mediante una fuerza magnética. El diseño debe permitir que el

filtro de membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa del receptáculo, sin que

sufra daño mecánico, de manera que todo e liquido pase a través de la membrana durante la

filtración.

2. Bomba eléctrica de vacío: SM 16612/16615 de SARTORIUS

3. Soporte de los embudos y portafiltros:



SM 16826 de SARTORIUS:

Actúa sobre la presión del agua para asegurar la filtración de la totalidad de la muestra.

4. Dosificador Jeringa: SM 16685 de SARTORIUS

Se utiliza para dosificar pequeños volúmenes de agua estéril entre filtraciones

5. Microscopio: Modelo CHT N. 3C0319 Marca OLYMPUS OPTICAL CO, LTDA.

Un microscopio óptico tiene objetivos con diferente aumento. El objetivo de alto aumento con

aceite de inmersión permite la observación de la morfología del microorganismo en suspensión

acuosa o después de coloreado. El microscopio debe estar equipado preferiblemente con un

objetivo de contraste de fase y con un condensador para mejorar el examen de los cultivos

vivos. Nota: Se pueden usar instrumentos con bajo poder de aumento (microscopio con láminas) e

idealmente estereoscopios con focalización para la realización del examen de colonias de

bacterias en un medio de cultivo de agar.

6. Incubadora: Tipo B53 N. 901686 WTC BINDER Una incubadora esta constituida por una cámara capaz de mantener una temperatura estable,

distribuida uniformemente dentro de ± 1ºC, a menos que se especifique de otro modo.

La incubadora debe estar ocupada por un sistema de regulación de la temperatura, el cual

debe mantenerse uniforme y estable para los volúmenes de trabajo.

Si la temperatura del ambiente se encuentra cerca o es mayor que la de la incubadora, es

conveniente adicionar un sistema de enfriamiento a la cámara.

Las paredes de la incubadora deben estar protegidas de los rayos directos del sol.

Si es posible, la incubadora no se debe llenar completamente en una sola operación, porque

los medios de cultivo requieren mucho tiempo para lograr el equilibrio de la temperatura,

cualquiera que sea el tipo de cultivo que requieren mucho tiempo para lograr el equilibrio de la

temperatura, cualquiera que sea el tipo de incubadora que se use (por convección de aire

forzado o cualquier otro).

Durante la carga de la incubadora, se debe tener en cuenta la circulación del aire; bajo ninguna

circunstancia se deben colocar las cajas de Petri; estas deben separarse por lo menos 25 mm.



7. Autoclave: Modelo 25x Marca All American.

El autoclave es un instrumento, que proporciona vapor saturado a una temperatura de por los

menos 121 ºC (245 kpa), cuyo objetivo es destruir microorganismos.

Durante el mismo ciclo de esterilización el autoclave no debe usarse para esterilizar material

limpio (y /o medio de cultivo) y/o para descontaminar material ya usado (y/o medio de cultivo ya

usado). Es preferible usar autoclaves por separado para estos dos procesos.

El autoclave debe estar equipado con:

• Al menos una válvula de seguridad;

• Un medidor de presión;

• Una llave de drenado;

• Un dispositivo de regulación que permita mantener la temperatura entre ±1 ºC del valor

establecido;

Un termómetro o un registro de termocupla.

Además, el autoclave debe estar provisto preferiblemente con un indicador de duración o un

programador de tiempo.

En el caso de esterilización con vapor, todo el aire debe expulsarse entes de que el equipo sea

presurizado. Si el autoclave no posee un dispositivo de evacuación automático, se debe

remover el aire hasta que haya emisión continua de vapor.

8. pHmetro: 320/SET WTW

El medidor de PH se usa para medir la diferencia de potencial, a una determinada temperatura,

entre el electrodo de medida y otro usado como referencia. Ambos electrodos deben

introducirse en el producto. El medidor de PH debe ser capaz de medir con una resolución de ±

0.1 unidades de PH y la mínima medida del umbral de 0.001 unidades de PH: El medidor de

PH debe equiparse con corrección por temperatura manual o automática.

Nota: El electrodo de medición y el de referencia se agrupan usualmente en un sistema de

electrodos combinados.

Se usa para medir el PH de cada lote del medio de cultivo y el de los reactivos y para verificar,

si se necesita un ajuste de PH. Además, se pude usar para medir y o ajustar el PH de la

muestra de ensayo o de la suspensión inicial. El uso del medidor de PH se debe discutir en la

norma específica del producto que se va a analizar en la cual se especifica las condiciones

para la determinación del PH, para el ajuste del PH, así como el método de limpieza y de

descontaminación de los electrodos.

9. Balanza: SP 250 Scientech



Un laboratorio de microbiología de alimentos debe estar equipado con balanzas con el

rango y la resolución adecuadas para los diferentes productos que se requieren pesar. En

general, se necesitan dos grados de resolución: ± 0.01g y ± 0.0001 g.

Estas balanzas se usan principalmente para el pesaje de la porción de ensayo de la muestra

que se va a analizar, de los componentes del medio de cultivo y de los reactivos. Además es

posible usarlas para la medición de volúmenes por peso de los fluidos de dilución.

10. Lámpara UV: MERCK 13203 Para la detección de sustancias fluorescentes.

La lámpara UV puede utilizarse para la demostración de E.coli mediante la escisión del MUG

en los medios de cultivo que contienen esta sustancia.

DATOS TÉCNICOS: Potencia: 4 Watios

Longitud de onda: 366 nm

Baterías: 5 de 1,5 V

Peso: aprox. 400g

Medidas: 16x9x2.5 cm.

MEDIOS DE CULTIVO 1. READYCULT Coliformes 100: MERCK 1.01298.001 Test de presencia ausencia para la detección simultanea de Coliformes totales y E. coli en el

análisis de agua.

FUNDAMENTO: La elevada calidad nutricional de las peptonas y el tampón fosfato

incorporado garantizan un rápido crecimiento de los Coliformes mientras que el Lauril sulfato

inhibe de forma sustancial la flora acompañante, especialmente la grampositiva. La detección

simultanea de Coliformes y E. coli es posible por el sustrato cromogénico X-GAL y el sustrato

fluorogénico MUG. Una coloración azul-verdosa del caldo indica la presencia de Coliformes

totales, y la de E.coli por una fluorescencia azul bajo luz UV (365nm).

COMPOSICION en g/cápsula: Triptosa 0.5; Sodio cloruro 0.5; sorbitol 0.1; Triptófano 0.1; Di-

potasio hidrogeno fosfato 0.27; Potasio dihidrogenado fosfato 0.2; Lauril sulfato Sodio sal 0.01;

X-GAL 0.008; MUG 0.005; IPTG 0.01.

2. CHROMOCULT Agar para Coliformes: MERCK 10426 Agar selectivo para la identificación simultánea de Coliformes totales y E.coli en muestras de

agua y de alimentos.



FUNDAMENTO: Gracias a la acción conjunta de peptonas selectas, piruvato y tampón de

fosfatos se garantiza un rápido crecimiento también de coniforme con daños subletales. El

contenido en Lauril Sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de bacterias grampositivas, sin

tener influencias negativas sobre el crecimiento de Coliformes.

La identificación simultanea de Coliformes totales y E.coli se hace posible de dos sustitos

cromógenos.

El sustrato Salmon-GAL es encendido por el enzima β-D galactosidasa característico de de

Coliformes y provoca una coloración roja de las colonias de Coliformes. La identificación de la

β-D-glucoronidasa característica para E.coli tiene lugar mediante el sustito X-glucoronido, cuyo

producto de escisión produce una coloración azul de las colonias positivas. Ya que E.coli

enciende tanto Salmon-Gal como X-glucoronido, las colonias se tiñen de violeta azul oscuro y

debido a ello son fáciles de diferenciar de las restantes Coliformes, que se presentan de color

rojo.

El contenido en triptófano mejora la reacción de Indol para la confirmación adicional de E.coli y

aumenta con ella la seguridad de identificación en combinación con la reacción Salmon-GAL y

la reacción X-glucoronido.

COMPOSICION g/litro: Peptona 3.0; cloruro sódico 5.0; dihidrogenofosfato potásico 1.7;

hidrogenofosfato dipotásico 3.0; piruvato sodico1.0; triptófano; Agar-agar 21.0; Lauril sulfato

sódico 0.1; mezcla de cromógenos 0.2

PREPARACIÓN: Disolver 27 g/l en agua desmineralizada por calentamiento en el baño de

agua hirviendo o en vapor fluente.

NO AUTOCLAVAR, enfriar de 45-50ºC y verter en las cajas.

pH: 6.8± 0.1 a 25ºC.

3. AGAR PLATE COUNT: Agar–peptona de caseína-glucosa-extracto de levadura MERCK 5463. Medio de cultivo exento de sustancias inhibitorias y de indicadores, concebido esencialmente

para la determinación del número total de gérmenes en leches, productos lácteos, aguas y

otros minerales.

Por su composición corresponde a lo prescrito en la APHA para el análisis de leche y productos

lácteos (1985) y de agua (1981), en las normas analíticas apartado 35 de la LMBG para el

análisis de alimentos y a los productos derivados del huevo (1975)

COMPOSICIÓN g/litro: Peptona de caseína 5.0; extracto de levadura 2.5; D(+)-glucosa 1.0;

Agar-agar 14.0.



PREPARACIÓN: Disolver 22.5 g/litro y esterilizar en autoclave (15 min. a 121ºC)

pH: 7.0± 0.1

Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras.

4. CALDO BRILA: Caldo-verde brillante-bilis-lactosa. MERCK 5454 Para el enriquecimiento selectivo y numeración de Escherichia coli en aguas, leche alimentos

y otros materiales mediante la determinación del titulo o según la técnica de NMP.

FUNDAMENTO: La bilis y el verde brillante inhiben notablemente el crecimiento de la flora

indeseable acompañante.

La fermentación de la lactosa con formación de gas, que es un indicativo de la presencia de

E.coli, se demuestra mediante campanas DURHAM.

Los restantes Coliformes no fecales también crecen en este medio, pero caso siempre sin

formación de gas.

COMPOSICIÓN: Peptona 10.0; lactosa10.0; bilis de buey desecada 20.0; verde brillante

0.0133

PREPARACIÓN: Disolver 40g/litro, distribuir en tubos de ensayo provistos de campana de DURHAM y esterilizar

en autoclave (15 min. a 121ºC)

pH: 7.2± 0.1

El caldo preparado es claro de color verdoso.

5. CALDO LACTOSA: MERCK 7661 Medio de cultivo exento de sustancias inhibidoras para el ensayo previo orientado a Bacterias

Coliformes especialmente de E.coli.

FUNDAMENTO: La utilización de lactosa se demuestra por la formación de gas, que se recoge

en campanas de DURHAM

COMPOSICIÓN g/litro: Peptona de gelatina 5.0; extracto de carne 3.0; lactosa 5.0

PREPARACIÓN: Disolver 13 g/litro, distribuir en tubos de ensayo provistos de campanas

DURHAM y esterilizar en autoclave (15mim a 121ºC)

pH: 6.9±0.1

El caldo preparado es claro e incoloro.



CEPAS 1. Escherichia coli: OXOID CULTI-LOOPS

C 750

QTY: 10

LT: 6088911

2006/07/31

2. Klebsiella pneumoniae

CMDM-PUJ 095

ATCC700603

3. Citrobacter freundii.

CMDM -PUJ

ATCC 8090



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