Uso de antibióticos y consecuencias evolutivas para el

resistoma, mobiloma y pangenoma microbiano

Dr. Miguel Gobernado, consultor en Microbiología Clínica, Valencia.

Genes y su expresión: microbioma, pangenoma y panpr oteoma El microbioma global abarca todas las células

procariotas en la biosfera. Puede contener 4-6 × 1030

de células.

Los fenotipos del microbioma están codificados por

el pangenoma , conjunto de genes presentes en todos

los genomas de todos los procariotas en la biosfera.

La capacidad de codificación del pangenoma se expresa como el panproteoma , que

es la suma de todas las proteínas codificadas y producidos por el reino microbiano

Whitman WB, et al. Prokaryotes: the unseen majority. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1998; 95: 6578-6583. Medini D, et al. The microbial pan-genome. Curr Opin Genet Dev 2005; 15: 589–594. Lapierre P, et al. Estimating the size of the bacterial pan-genome. Trends Genet 2009; 25: 107-110. El parvoma es un microcosmo de pequeñas moléculas bio-activas , de gran

diversidad estructural, producidas por las células bacterianas (metabolitos

secundarios) (1x1011)

Entre otras múltiples funciones, estas pequeñas

moléculas intervienen en la señalización de célula a

célula (quorum sensing), adhesión y formación de bio-

películas, regulación del crecimiento y sexo bacteriano,

resistencias, muerte celular. Moléculas del parvoma, por

ejemplo, son los policétidos, aminoglucósidos, macrólidos, estreptomicina, algunas

quinolonas, terpenoides, alcaloides, péptidos no-ribosomales, fragmentos tóxicos del

peptidoglucano, sideróforos, etc.

Davies J, et al. Introducing the parvome: bioactive compounds in the microbial world. ACS Chem Biol 2011; 7: 252-259. Bassler B, et al. Bacterially speaking. Cell 2006; 125: 237-246. De los millones de compuestos de bajo peso molecular del parvoma, algunos tienen

efecto antibiótico, aunque no lleguen concentraciones inhibitorias en la naturaleza. Su

función principal no es la guerra entre especies, sino la comunicación entre células

(quorum sensing)

Lo que conocemos como "antibióticos" son un subconjunto

menor de este macro-mundo de pequeñas moléculas que,

además, pueden tener otras funciones.

Hoy día, en sentido evolutivo, la palabra antibiótico, se refiere a cualquier molécula

de bajo peso molecular, sintética o natural, que inhibe el crecimiento de bacterias.

Mobiloma y resistoma El genoma básico común a todas las bacterias contiene unos 250 genes, el

genoma adaptativo nicho específico unos 8.000 y el la diversidad pangenómica

(genes accesorios) más de 139.000.

Las bacterias han evolucionando durante unos 3.800 mill. de años por lo que los

genes que codifican las vías bio-sintéticas y catabólicas de sus parvomas tienen una

historia evolutiva antigua (vg. 600 mill. de años la eritromicina y estreptomicina, y

2.000 mill. algunas β-lactamasas)

Los grupos de genes bio-sintéticos que producen "antibióticos" tienen también genes

de "resistencia" y pueden ser objeto de Traslado Lateral Génico (TLG) (medio

ambiente-patógenos)

Baltz RH. Antibiotic discovery from actinomycetes: will a renaissance follow the decline and fall? SIM News 2005; 55: 186–196. Hall BG, Barlow M. Evolution of the serine β -lactamases: past, present and future. Drug Resist Updat 2004; 7: 111-123.

El mobiloma, que es parte del pangenoma, es capaz de moverse relativamente libre

entre las especies procariotas (TLG)

Los elementos especializados en mover ADN dentro y entre

genomas incluyen plásmidos , transposones , integrones ,

de bacteriófagos , secuencias inserción y elementos

integradores de conjugación . Estos elementos y los genes

que transportan son capaces de generar enorme diversidad génica por recombinación

y crear una serie de estructuras de mosaicos complejos. En principio, y en escalas de

tiempo evolutivas, cualquier parte del pangenoma también puede ser movilizado por

TLG.

Shapiro JA, ed. (1983), Mobile genetic elements, Academic Press, ISBN 0-12-638680-3. Leplae R, et al. ACLAME: Classification of mobile genetic elements, update Nucleic Acids Res 2010; 38: D57–D61.

El resistoma se define como la colección de todos lo genes que pueden contribuir a

la resistencia fenotípica antibiótica. Existe una base de datos de más de 30.000 genes

que son sólo una pequeña proporción del resistoma. Estos genes son componentes

antiguos del pangenoma, se han recuperado en los hielos perpetuos (permafrost) de

30.000 años de edad, en el microbioma de una cueva de 4 millones de años y en los

abismos oceánicos.

Wright GD. The antibiotic resistome: the nexus of chemical and genetic diversity. Nature Rev Microbiol 2007; 5: 175-186. Wright,GD. The antibiotic resistome. Expert Opin Drug Discov 2010; 5: 779-788. Forsberg KJ, et al. The shared antibiotic resistome of soil bacteria and human pathogens. Science 2012; 337: 1107-1111.

La resistencia es prevalente, heredable y antigua El papel del uso antropogénico de los antibióticos en la aparición de estos genes es

controvertido, las cosas no siempre son así.

M. Toth y cols. Han descrito una eficiente clase de β-lactamasas OIH-1 de la bacteria

Oceanobacillus iheyensis, habitante en el sedimento a una

profundidad de 1.050 m en el Océano Pacifico. La OIH-1 ha

evolucionado hasta ser una β-lactamasa extremadamente

halotolerante, capaz de hidrolizar su substrato a

concentraciones saturadas de ClNa. La evolución de esta β-

lactamasa en la salinidad del océano, a diferencia de las terrestres, ha dado lugar a

una superficie molecular recubierta de residuos ácidos. Esto es una prueba de la

existencia de reservorios enzimas de resistencia que no tienen nada que ver con el

uso de antibióticos.

Una aproximación diferente es la de E. Wheeler y cols. que evaluaron la resistencia

a 10 antibióticos como marcador molecular de la intensidad de

la conectividad humana-microbios en las Islas Galápagos. Se

aislaron Escherichia coli y Salmonella enterica de las heces de

iguanas terrestres (Conolophus sp.), iguanas marinas

(Amblyrhynchus cristatus), tortugas gigantes (Geochelone nigra)

y agua de mar. Las bacterias resistentes a los antibióticos se

encuentran en las heces de reptiles de dos sitios turísticos en la Isla San Cristóbal y

del agua de mar cerca de una playa de uso público. Los reptiles que viven en una

proximidad más cercana a los humanos tenían una mayor exposición a las bacterias

de origen humano y a sus genes de resistencia.

K. Bhullar y cols. han informado de una muestra del microbioma

cultivable de Lechuguilla Cave (Nuevo México, USA), una cueva

que ha estado aislada durante más de 4 millones de años. Las

bacterias aisladas son muy resistentes a los antibióticos, algunas

cepas hasta 14 antibióticos diferentes de los que disponemos

comercialmente. Las implicaciones de este estudio son

importantes para nuestra comprensión de la prevalencia de la

resistencia, incluso en microbiomas aisladas del uso humano de los antibióticos.

Los tres estudios anteriores comentados, apoyan una creciente comprensión de que

la resistencia a los antibióticos es natural, antigua, heredable y ligada al pangenoma

microbiano.

D’Costa VM, et al. Antibiotic resistance is ancient 2011. Nature 477: 457-461. Toth M et al. An antibiotic-resistance enzyme from a deep-sea bacterium. J Am Chem Soc 2010; 132: 816-823. Wheeler E et al. Carriage of antibiotic-resistant enteric bacteria varies among sites in Galápagos reptiles. J Wildlife Dis 2012; 48: 56-67. Bhullar K, et al. Antibiotic resistance is prevalent in an isolated cave microbiome. PLoS ONE 2012; 7: e34953. Doi:10.1371/journal.pone.0034953. Resistencia bacteriana clínica y ecológica La definición clínica de la resistencia a los antibióticos se suele basar en la respuesta

bacteriana al tratamiento. Un microorganismo se estima como resistente si existe una

probabilidad alta de fracaso terapéutico con antibióticos.

Esta resistencia ha sido definida basándose en los puntos de corte de las

concentraciones mínimas inhibitorias (CMI)

La definición ecológica de resistencia se basa en el valor de la CMI

que identifica el límite superior de la población natural. Se define como

el punto de corte de valor ecológico (ECOFF). Las cepas que presentan

una CMI por encima del ECOFF se consideran resistentes.

Turnidge J, et al. Statistical characterisation of bacterial wild-type distributions of MIC values and the determination of epidemiological cut-off values. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 418-425. Martínez JL et al. What is a resistance gene? Ranking risk in resistomes. Nature Rev Microbiol 2015; 13: 116–123. Tipos de resistencia bacteriana antibiótica

La mayoría de estudios sobre la resistencia a los antibióticos están basados en el

análisis de bacterias resistentes que han adquirido el fenotipo R por factores genéticos

hereditarios. Los cambios pueden ser por mutaciones (incluyendo reordenamientos

génicos) o a través de TLG de genes de resistencia; sin embargo, hay otras

situaciones, también agrupadas bajo el nombre de resistencia fenotípica , en que la

situación no es heredada. Es una situación transitoria en la que una población

bacteriana, generalmente sensible, es temporalmente resistente.

Resistoma intrínseco y determinantes clásicos

Inactivación Modificación de la diana Cambios permeabilidad

Resistencia fenotípica

Persistencia Biopelículas Dispersión

Resistencia fenotípica / Persistencia

Una subpoblación de bacterias (hasta 1% de las

bacterias en fase estacionaria) no es eliminada por

un antibiótico en condiciones en las que se inhibe la

mayor parte de la población. Al eliminar el antibiótico,

las células persistentes se comportan como sensibles, no es, por tanto, la

consecuencia de un cambio génico. El primer gen descrito (1983) en el desarrollo de

persistencia fue el HipA de E. coli K12. HipA es una toxina del sistema TA, cuya sobre-

expresión inhibe el crecimiento de bacterias lo que induce

resistencia por persistencia. Estos sistemas TA suelen estar

formados por 2 componentes, toxina que inhibe el crecimiento

celular, y antitoxina que impide su actividad. Se han descrito

tres sistemas: Los tipos I y III son pequeños RNA, en tanto

que la toxina de tipo II está inhibida por antitoxinas proteínas.

Otros sistemas de TA asociados a células persistentes: HipBA (proteína quinasa),

TisAB (alteración de membrana) TisB/istR, MqsRA (desestabilización sistema TA)

Moyed H, et al. hipA, a newly recognized gene of Escherichia coli K-12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis. J Bacteriol 1983; 155: 768-775. Schumacher MA, et al. Molecular mechanisms of HipA-mediated multidrug tolerance and its neutralization by HipB. Science 2009; 323: 396–401. Germain E, et al. Molecular mechanism of bacterial persistence by HipA. Mol Cell 2013; 52: 248-254.

Resistencia fenotípica / motilidad tipo “swarming”

El swarming es un tipo de movimiento rápido de poblaciones,

coordinado y envolvente. Lo hacen bacterias hiper-flageladas

(ambientes ricos en nutrientes).

El fenotipo más visible de un complejo proceso de adaptación,

dependiente de la señalización célula-célula [percepción de QS] y de la disponibilidad

de nutrientes. Ha sido descrito, en especies de P. mirabilis, E. coli, S. marcescens, B.

thailandensis, B. subtilis, P. aeruginosa S. enterica, Vibrio, Yersinia. Es importante en

la colonización de algunas superficies durante la infección (vg. pulmones de enfermos

con fibrosis quística)

Fraser GM, et al. Swarming motility. Curr Opin Microbiol 1999; 2: 630–635. Overhage J, et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. J Bacteriol 2008; 190: 2671-2679. Kearns DB. A fiel guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol 2010; 8: 634-644.

Resistencia y entorno humano

Se ha demostrado una relación causa efecto entre, el

aumento del uso de antimicrobianos en medicina humana y

veterinaria, el mayor movimiento de personas, los animales

domésticos y salvajes, la mayor industrialización, y el

aumento de la prevalencia de bacterias resistentes a los

antimicrobianos.

Consecuencias evolutivas de la era antibiótica

Sobre el parvoma

� Los antibióticos siempre han existido

� El hombre los ha descubierto, concentrado, usado y diseminado en el medio

ambiente.

� Las concentraciones locales de este subconjunto del parvoma han

aumentado notablemente debido a la actividad humana.

� Las zonas del parvoma relacionadas con antibióticos aumentan la presión

selectiva sobre los microbiomas locales.

Sobre el resistoma

� El aumento de la concentración de los antibióticos en

el medio ambiente en los últimos 75 años tiene efectos

en la diversidad y cantidad de los genes del resistoma.

� La capacidad de TLG de los elementos del resistoma,

hace que genes idénticos de R se puedan encontrar en

diversas especies patógenas de bacterias humanas, en animales domésticos y

silvestres, y en lugares distantes de la influencia de las sociedades

desarrolladas (Ártico, Antártida, Selva Amazónica)

� La presión de selección es grave en los flujos de residuos humanos, donde se

arrojan los genes R, mezclados con altas concentraciones de antibióticos y

otros agentes selectivos.

Allen HK, et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev Microbiol 2010; 8: 251-259. Martinez JL, et al. What is a resistance gene? Ranking risk in resistomes. Nat Rev Microbiol 2015; 13: 116-123.

Sobre el mobiloma

� Los complejos elementos móviles se producen con alta frecuencia en los

sistemas dominados por el hombre, y en los ecosistemas naturales, donde puedan

moverse por TLG entre los organismos ambientales.

� La contaminación antibiótica crea puntos calientes para el

montaje de mosaicos complejos de elementos móviles de

diversas fuentes, y proporciona fuerza selectiva para su

posterior fijación en diversos linajes.

� Este fenómeno se ve en la complejidad y aumento de la plasticidad fenotípica

de las islas genómicas y elementos de conjugación de integración de patógenos

nosocomiales emergentes (vg. P. aeruginosa y A. baumannii)

Perry J, et al. The antibiotic resistance "mobilome": searching for the link between environment and clinic." Front Microbiol 2013; 4: 138.

Antibióticos y genes de resistencia como contaminan tes

� Los antibióticos y sus genes de resistencia se originaron en ambientes

naturales, pero el uso humano de los antibióticos, en animales, agricultura y

acuicultura, ha perturbado la dinámica de este sistema natural.

� El uso de antibióticos conduce a la contaminación de flujos de residuos

humanos, y a la fijación de elementos génicos cada vez más complejos en

microorganismos comensales y patógenos.

� Mientras que los antibióticos podrían ser tratados como simples

contaminantes, los elementos móviles xenogénicos son capaces de replicarse,

y por tanto son más afines a las especies invasoras y la extensión por la

biosfera.

Medicina veterinaria y sector agrícola

� Anualmente, se administran grandes cantidades de fármacos a los animales en

el sector agrícola para asegurar una cantidad suficiente de alimentos (carne,

huevos y productos lácteos) para la creciente población humana.

� Un 70% de los AB que se dan en la cría de animales no son con fines

terapéuticos.

� La administración de antimicrobianos a los

animales puede tener otros fines distintos al

tratamiento: promoción del crecimiento, profilaxis y

metafilaxis.

� The European Surveillance of Antimicrobial Consumption (ESAC), recopila,

analiza y genera informes de datos de ventas de los antimicrobianos en la UE y

desarrolla un enfoque sobre su uso.

� En EE.UU., el consumo de antibióticos en animales representa hasta el 80% de

las ventas de antibióticos.

� Se usan en las ganaderías de, al menos, 238 países.

� Se estima que el uso global de antibióticos en los animales destinados al

consumo fue de 63.151 t en el 2010 y que subirá un 67% hasta el 2030

(~110.000 t)

En Brasil, China, India, Rusia y Sudáfrica la situación podrá ser peor. Se prevé

un aumento de 99% en el consumo de antibióticos, pero sólo un crecimiento del

13% en sus poblaciones humanas.

. Van Boeckel TP, et al. Global trends in antimicrobial use in food animals. PNAS 2015; 112: 5649-5654

Bacterias resistentes a los antimicrobianos en la g anadería y animales de

compañía

Algunas cepas bacterianas resistentes se propagan entre los animales, pero pueden

infectar a las personas como agentes zoonóticos. Se ha producido un aumento de los

géneros Listeria, Salmonella, Campylobacter, Staphylococcus, Enterococcus, y

Escherichia.

Ejemplos de R asociada a los animales son:

S. pseudintermedius (SPRM),

S. aureus (SARM –clon

ST398 asociado a ganado-cerdo-)

E. coli BLEE

Enterobacteriaceae MR

Los animales de compañía, en el contexto de terapia con antibióticos para sus

enfermedades infecciosas, son tratados cada vez más como miembros de la familia,

con sus consecuencias.

Acuicultura y bacterias resistentes

� Las industrias de pescado, mariscos, y la cría de camarones se ha desarrollado

rápidamente en la última década y se ha convertido en una importante fuente

de alimentos e ingresos.

� En las granjas de peces, en donde densas poblaciones son criados

intensivamente, las bacterias patógenas a menudo producen infecciones

devastadoras.

� Aunque la acuicultura moderna se basa cada vez más en la vacunación para

evitar infecciones, todavía muchas de ellas se tratan con antibióticos

incorporados a los piensos o en baños de inmersión.

� La mayoría de las bacterias patógenas de peces de piscifactorías con

antecedentes de infecciones han desarrollado cepas MR.

� Los antibióticos más utilizados son las fluoroquinolonas, florfenicol,

amoxicillina, oxitetraciclinas y sulfonamidas.

� En algunas zonas del mundo (sudeste de Asia), es común la agricultura

integrada en la que los residuos orgánicos de aves de corral y ganado son

utilizados en las granjas de peces con la consiguiente presión selectiva de

genes de RA.

� De hecho, existe un aumento de la transmisión de genes RA entre la

ganadería y el medio ambiente acuático (Vibrio, Mycobacterium, Kluyvera -

genes qnr y bla CTM-X-, Aeromonas, Yersinia ruckeri, Sewanella algae- qnr-A)

Heuer OE. Human health consequences of use of antimicrobial agents in aquaculture. Clin Infect Dis 2009; 49: 1248-1253.

Plantas agrícolas, alimentos y bacterias resistente s

� En los suelos del mundo, en los que existen bacterias productoras de

antimicrobianos, hay gran dispersión de BRA.

� Los actinomicetos, microorganismos comunes del suelo (Streptomyces,

Micromonospora, Saccharopolyspora), sintetizan más de la mitad de

antimicrobianos conocido con importancia clínica (vg. eritromicina, tetraciclina,

gentamicina, estreptomicina, vancomicina, y amfotericina)

� Estos antimicrobianos ahora también alcanzan el medio ambiente por la

terapia humana y animal, a través del estiércol, las aguas residuales y la

agricultura.

� Patógenos oportunistas ubicuos en el suelo (P. aeruginosa, Acinetobacter spp.,

Burkholderia spp., Stenotrophomonas spp.), con notable capacidad para

adquirir nuevos genes de resistencia, pueden albergar R intrínseca a varios

antimicrobianos

� Las bacterias resistentes pueden ser transferidas de animales y plantas a los

seres humanos:

(1) a través de la cadena alimentaria

(2) por contacto directo o indirecto con la industria de ganado u otros animales

(3) entornos contaminados con estiércol (agricultura)

� La estreptomicina y la oxitetraciclina se utilizan

habitualmente para la profilaxis de la enfermedad del

fuego bacteriano en manzanos, perales, membrillos y

nísperos (Erwinia amylovora)

� La gentamicina se utiliza en México y América Central para controlar el fuego

bacteriano y varias enfermedades de los cultivos de hortalizas.

� El ácido oxolínico se ha utilizado en Israel

contra el tizón de fuego y en Japón contra el

tizón del arroz (Pyricularia grisea).

Aguas residuales y bacterias resistentes

� Este tipo de aguas contiene excreciones humanas, de animales y restos de

plantas con abundante carga de bacterias comensales y patógenas resistentes.

� Los antimicrobianos se transforman y se degrada en este medio, pero no del

todo, esto hace que se puedan encontrar en concentraciones que van de 1 ng

a 1 mg/L.

Clase Degradación (%) Tiempo (días)

Macrólidos 0-50 5-30

Sulfamidas 0-50 22-60

Fluorquinolonas 0-30 56-80

Tetraciclinas 0-50 10-180

β-lactámicos 0-50 30

Imidazoles 50 14-75

Björklund et al. Residues of oxytetracycline in fish and sediments from fish farms. Aquaculture 1991; 97: 85-96.

Hektoen et al. Persistence of antibacterial agents in marine sediments. Aquaculture 1995; 133: 175-184.

Thiele-Bruhn, J. Pharmaceutical antibiotic compounds in soils – a review. Plant Nutr Soil Sci 2003; 166: 145-167.

Vaz-Moreira I. ET AL. Bacterial diversity and antibiotic resistance in water habitats: searching

the links with the human microbiome. FEMS Microbiol Rev 2014; 38 761–778.

Existe un interés creciente en la exploración de la ocurrencia de genes de resistencia

(GT) a antibióticos en el medio ambiente, así como los factores que contribuyen a su

aparición. Los ecosistemas acuáticos proporcionan un entorno ideal para la

adquisición y difusión de RG debido a la contaminación continua por compuestos

antimicrobianos derivados de las actividades antropogénicas

La Dra. Sara Rodríguez-Mozaz y cols. han investigado la cantidad de contaminación

de una amplia gama de antibióticos y los GR liberados en aguas residuales urbanas,

su eliminación a través de una estación depuradora (EDAR) y su presencia en el río

receptor. Se detectaron varios compuestos antimicrobianos en todas las muestras de

agua recogidas. Entre las familias de antibióticos, se detectaron las fluoroquinolonas a

la mayor concentración, especialmente en muestras de efluentes de hospital. Aunque

se observó una buena eficiencia de eliminación de varios compuestos antimicrobianos,

la mayoría de los antibióticos todavía estaban presentes en los efluentes de EDAR.

Los resultados también revelaron que copias de ARG, como blaTEM (resistencia a β-

lactámicos), qnrS (sensibilidad reducida a las fluoroquinolonas), ermB (resistencia a

macrólidos), Suli (resistencia a las sulfonamidas) y tetW (resistencia a las tetraciclinas),

se detectaron en concentraciones más altas en el efluente de hospital y muestras de

entrada en EDAR.

La eliminación incompleta de antibióticos y RG en EDAR afectó gravemente a las

aguas receptoras, tanto río abajo como río arriba. En conjunto la investigación

demuestra presencia generalizada de antibióticos y RG en las aguas residuales

urbanas y del hospital y cómo estos efluentes, incluso después de ser tratados,

contribuyen a la difusión de estos contaminantes en el medio acuático.

Concentraciones medias (ng/L) de antibióticos en lo s diferentes puntos de muestreo Rodríguez-Mozaz S, et al. Occurrence of antibiotics and antibiotic resistance genes in hospital and urban wastewaters and their impact on the receiving river. Water Research 2015; 69: 234-242.

Depósitos de aguas rurales en Guantao (China)

Ha más de 10.000 Km. de distancia, en la ciudad de Guantao en China, han

encontrado también genes de resistencia antibiótica, en enterobacterias productoras

de BLEE (17% de las muestras) concretamente en cepas de Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae, Raoultella planticola y Enterobacter cloacae.

Tipo de gen bla Número % Fuente

TEM 2 3,0 1/1

CTX-M 17 25,8 6/11

SHV 1 1,5 0/1

TEM+CTX-M 38 57,6 18/20

SHV +CTX-M 6 9,1 2/4

TEM+SHV +CTX-M 2 3,0 1/1

Total 66 100,0 28/38

Zhang H, et al. Multidrug resistance found in extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae from rural water reservoirs in Guantao, China. Front. Microbiol 6:267. doi: 10.3389/fmicb.2015.00267

En resumen

� Los genes de resistencia (resistoma ) son de evolución ancestral y, además,

se trasladan entre géneros y especies (mobiloma ) y ocupan todo el medio

ambiente (pangenoma ), junto a pequeñas moléculas bio-activas, de

comunicación –QS- y capacidad antibiótica (parvoma )

� Los antimicrobianos han llegado a alcanzar la categoría de contaminantes

en todos los ambientes (comunidad social, medicina, veterinaria, alimentación,

agricultura, acuicultura …)

� La preocupación clínica por las resistencias y el fenómeno de persistencia y

la formación de bio-películas es importante, pero es más la ecológica.

� Las actividades antropogénicas son la principal causa del actual

“desaguisado” medio-ambiental.