técnicas: elisa y western blot · 4. muestra (antígeno o anticuerpo) 5. lavado 6. anticuerpo...
TRANSCRIPT
![Page 1: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/1.jpg)
Técnicas:
Elisa y Western Blot
Aspectos prácticos…
Prof. Diana Ortiz
Cátedra Inmunología
EJMV-UCV
![Page 2: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/2.jpg)
Técnica de Elisa Fundamento:
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: Ensayo por Inmunoadsorción
Ligado a Enzimas.
Inmunoensayo: detección Antígeno – Anticuerpo unido a una
enzima y cuantificado por espectofotometría
Ventajas:
Es una prueba de alta
sensibilidad y especificidad.
Es cuantitativa.
Es relativamente
económica.
Se pueden procesar hasta
96 muestras por placa.
Reactivos de gran
estabilidad.
Limitaciones:
Positividad Vs. Infección
activa: depende del tipo de
anticuerpo evaluado. A
menos que se evalúe
presencia de antígenos en la
muestra problema.
Dificultad de detección de
Acs en pacientes con alguna
inmunodeficiencia, en período
de ventana o infectados por
cepas desconocidas.
![Page 3: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/3.jpg)
1. Unión del antígeno o anticuerpo primario a los pocillos de la
placa (soporte sólido (polímero): poliestireno, polivinilo)
2. Lavado
3. Bloqueo
4. Muestra (antígeno o anticuerpo)
5. Lavado
6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima
(sensibilidad)
7. Lavado
8. Sustrato de la enzima
9. Cuantificación (lector de ELISA)
Técnica de Elisa: fases
![Page 4: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/4.jpg)
Técnica de Elisa: tipos
Elisa Indirecto
Ejemplos: Diagnóstico de infección por VIH-1 Diagnóstico serológico de H. pylori , hongos
![Page 5: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/5.jpg)
Técnica de Elisa: tipos
Elisa sándwich
Ejemplos: Determinación de antígenos de superficie del Virus de Hepatitis B. Diagnóstico de antígenos de H. pylori en heces.
![Page 6: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/6.jpg)
Técnica de Elisa: tipos
Elisa competitivo
Ejemplos: Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-CG)
![Page 7: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/7.jpg)
Prof. E. Escobar
![Page 8: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/8.jpg)
Prof. E. Escobar
![Page 9: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/9.jpg)
Prof. E. Escobar
![Page 10: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/10.jpg)
Prof. E. Escobar
![Page 11: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/11.jpg)
Prof. E. Escobar
![Page 12: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/12.jpg)
Prof. E. Escobar
![Page 13: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/13.jpg)
Técnica de Elisa
Aspectos a considerar:
Adecuado uso de controles positivos y negativos
(control de calidad).
Adecuado diseño de la técnica (Ag-Ac, Enzima
sustrato).
Concentración/ dilución de antígenos y anticuerpos.
Reactivos en buen estado.
Cuidado de la cadena de frío.
![Page 14: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/14.jpg)
Técnica de Elisa
Estuches comerciales:
Detección de
anticuerpos
IgM, IgG, IgE,
IgA.
Kit Pyloriset EIA-G
(Orion Diagnostic):
Títulos ≥ 20 positivos
![Page 15: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/15.jpg)
1.- IgA secretora anti H. pylori en saliva: (ELISA)
Sensibilización: 2,5µg/pozo Ag Hp toda la noche a 4°C o 2h a 37°C
Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween
Bloqueo: PBS-BSA 1% x 2h a 37°C
Muestras de saliva 1/10 x 1h a 37°C
Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween
Anticuerpo secundario conjugado: con peroxidasa 1/1000 x 1h a 37°C
Revelado: OPD (o-phenylenediamine) + Peróxido de hidrógeno
Se detiene la reacción con H2SO4
Valores: UDO > 0,300 positivos
(Ortiz y col., 2000)
2.- IgA secretora total en saliva: (ELISA)
Monoclonal IgA (Sigma) (Ortiz y col., 2000)
Técnica de Elisa
Elisa estandarizada en laboratorio
![Page 16: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/16.jpg)
Técnica de Elisa Enzimas más utilizadas:
Peroxidasa
Fosfatasa alcalina β-galactosidasa
Tetra-metil-benzidina
![Page 17: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/17.jpg)
Interpretación de resultados:
Técnica de Elisa
¿Qué es un valor cut off?
Títulos de anticuerpos
Valores reportados en
unidades de Densidad óptica
![Page 18: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/18.jpg)
Algunas Aplicaciones de la ELISA
Determinación de hormonas: progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, HGC, etc.
Proteínas
Agentes infecciosos (virales, bacterianos, parásitos, hongos)
Marcadores de drogas
Control de calidad de vacunas
Screening de recién nacido
Investigación clínica
Anticuerpos: Acs antinucleares
Antígenos tumorales: alfa-feto-proteína, Ag postático, carcinoembrionario, etc.
Autoanticuerpos
Técnica de Elisa
![Page 19: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/19.jpg)
Elispot Mide el número de células productoras de anticuerpos. El antígeno se une al fondo de un pocillo, se añaden las células productoras de anticuerpos en un medio semisólido y los anticuerpos que se han secretado y unido se detectan mediante un anticuerpo anti-Ig ligado a una enzima como en un ELISA.
Una variante de la ELISA
![Page 20: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/20.jpg)
Inmunohistoquímica
![Page 21: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/21.jpg)
Western Blot
Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica
altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas
en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos
celulares o de tejidos.
Etapas:
1. Preparación de la muestra
2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de
poliacrilamida)
3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa )
4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de
anticuerpos primarios o secundarios apropiados.
![Page 22: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/22.jpg)
Western Blot
Preparación del gel de
poliacrilamida SDS-PAGE
y corrida electroforética.
![Page 23: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/23.jpg)
Western Blot
Tinción del gel con azul de Coomassie
![Page 24: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/24.jpg)
Western Blot
Transferencia Se transfieren las bandas de
proteínas o desde el gel hacia
una membrana de
nitrocelulosa (flechas azules).
![Page 25: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/25.jpg)
Western Blot
![Page 26: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/26.jpg)
Western Blot
![Page 27: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/27.jpg)
Western Blot
![Page 28: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/28.jpg)
Revelado
Western Blot
![Page 29: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/29.jpg)
CORTES X, GARCIA Z, TORRES L, TAYLOR L. Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivos por
anticuerpos contra los virus linfotrópicos de células T tipo I/II (HTLV I/II) en donantes de sangre en Costa Rica. Rev.
costarric. cienc. méd [online]. 2007, vol.28, n.1-2 [cited 2017-02-15], pp. 11-20 .
![Page 30: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/30.jpg)
Western blot
![Page 31: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/31.jpg)
Western Blot
Aplicaciones:
Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la
biología molecular
Permite identificar antígenos inmuno-dominates para vacunas.
Estudiar perfil de citocinas.
Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra.
Factores de crecimiento
Niveles de fosforilación, modificaciones post traduccionales, etc
Diagnóstico:
Prueba confirmatoria de VIH
Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente
llamada“enfermedaddelasvacaslocas”
Enfermedad de Lyme.
![Page 32: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/32.jpg)
![Page 33: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/33.jpg)
ELISA Vs. Western Blot…
![Page 34: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/34.jpg)
![Page 35: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/35.jpg)
![Page 36: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/36.jpg)
![Page 37: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/37.jpg)
![Page 38: Técnicas: Elisa y Western Blot · 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022081800/6038f15f21d54d6ff229e31a/html5/thumbnails/38.jpg)