universidad de guayaquil facultad de ciencias...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA INGENIERÍA AGRONÓMICA
PROPAGACIÓN DE VAINILLA (Vanilla tahitensis) EN
DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO in vitro
AUTOR: ROMEL ROMARIO MACAS SARANGO
TUTORA: ING. AGR. LAURA PARISMORENO RIVAS, MSc.
GUAYAQUIL, ABRIL 2019
DEDICATORIA
A Dios por darme salud y vida para seguir alcanzando mis objetivos.
A mis padres por darme siempre ese apoyo para seguir adelante.
A toda mi familia en general que me han ayudado para terminar mis
estudios.
iii
AGRADECIMIENTO
A Dios por darme un día más de vida para seguir cumpliendo mis
objetivos.
A mis profesores de la Facultad de Ciencias Agrarias que me
compartieron sus conocimientos.
A mi Tutora de Trabajo de Titulación Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas,
MSc. por brindarme su apoyo en mi Trabajo de Titulación.
iv
Guayaquil, 19 de febrero del 2019 Sra. Q. F. NELKA TANDAZO FALQUEZ, MSc.
VICEDECANA (E) DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
Ciudad.
De mis consideraciones:
Envío a Ud. el Informe correspondiente a la tutoría realizada al Trabajo de Titulación
Propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes medios de
cultivo in vitro del estudiante Romel Romario Macas Sarango indicando que ha
cumplido con todos los parámetros establecidos en la normativa vigente:
• El trabajo es el resultado de una investigación.
• El estudiante demuestra conocimiento profesional integral.
• El trabajo presenta una propuesta en el área de conocimiento.
• El nivel de argumentación es coherente con el campo de conocimiento.
Adicionalmente, se adjunta el certificado de porcentaje de similitud y la valoración del
trabajo de titulación con la respectiva calificación.
Dando por concluida esta tutoría de trabajo de titulación, CERTIFICO, para los fines
pertinentes, que el estudiante está apto para continuar con el proceso de revisión
final.
Atentamente,
Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc
TUTORA DE TRABAJO DE TITULACIÓN
C.I. 0906233770
CC: Unidad de Titulación
v
CERTIFICADO PORCENTAJE DE SIMILITUD
Habiendo sido nombrado Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc., tutora
del trabajo de titulación certifico que el presente trabajo de titulación ha sido
elaborado por Romel Romario Macas Sarango C.C. 1104944069, con mi
respectiva supervisión como requerimiento parcial para la obtención del título
de Ingeniero Agrónomo.
Se informa que el trabajo de titulación: “Propagación de vainilla (Vanilla
tahitensis) en diferentes medios de cultivo in vitro”, ha sido orientado durante
todo el periodo de ejecución en el programa antiplagio (URKUND) quedando
el 9% de coincidencia.
vi
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FICHA DE REGISTRO DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO: Propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes medios de cultivo in vitro.
AUTOR: Romel Romario Macas Sarango.
Director del Trabajo de titulación: Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc.
INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil
FACULTAD: de Ciencias Agrarias
CARRERA: Ingeniería Agronómica
FECHA DE PUBLICACIÓN: No de páginas: 50
TÍTULO OBTENIDO: Ingeniero Agrónomo
ÁREAS TEMÁTICAS:
PALABRAS CLAVE: in vitro, explante, rentables. RESUMEN/ABSTRACT
Esta investigación se realizó el 2018, en el Laboratorio de biotecnología AGROVITROPARIS ubicado en la ciudad de Guayaquil-parroquia Pascuales avda. Narcisa de Jesús (Metrópolis II etapa H). Se estudiaron 80 tratamientos como resultado de los diferentes medios de cultivos in vitro utilizados. Se utilizó el diseño completamente al azar con desigual número de repeticiones y arreglo grupal. Para el cálculo estadístico se realizó
el análisis de varianza, con valores transformados a √𝑥 + 0,5 , donde se presentaron
diferencias significativas, se realizó la comparación de medias mediante la prueba de Duncan al 5% de probabilidades. Se evaluaron las siguientes variables: número de entrenudos, número de hojas, longitud de raíces (cm) Color del explante (tabla de Munsell). De acuerdo con los resultados se concluye lo siguiente: 1) El tratamiento de (B5 + BAP + AIB) del grupo 2 alcanzó la mayor longitud de la raíz a los 90 días. 2) La aplicación del tratamiento (MS + BAP + G3) del grupo 1 presentó el mayor número de entrenudos y mayor número de hojas con tres entrenudos y dos hojas respectivamente. 3) Los tratamientos más económicos para la producción de explantes de vainilla, fueron (B5+BAP+ANA y B5+BAP+AIB) del grupo número 2.
No. DE REGISTRO (en base de datos):
No. DE CLASIFICACIÓN:
DIRECCIÓN URL (Trabajo de titulación en la web):
ADJUNTO PDF: x SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES Romel Romario Macas Sarango
Teléfono: 0968833562
E-mail: [email protected]
CONTACTO EN LA INSTITUCIÓN: Nombre: Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas MSc. Teléfono:(042)288040
E-mail: [email protected]
vii
CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR
Habiendo sido nombrado Ing. Arg. Eison Wilfrido Valdiviezo Freire MC,
revisor del trabajo de PROPAGACIÓN DE VAINILLA (Vanilla tahitensis)
EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO in vitro, certifico que el presente
trabajo de titulación, elaborado por Romel Romario Macas Sarango, con
mi respectiva supervisión como requerimiento parcial para la obtención del
título de INGENIERO AGRÓNOMO, en la Carrera Ingeniería Agronómica
de la Facultad de Ciencias Agrarias, ha sido REVISADO Y APROBADO en
todas sus partes, encontrándose apto para su sustentación.
Ing. Arg. Eison Wilfrido Valdiviezo Freire MC.
C.I. No. 0908084320
viii
LICENCIA GRATUITA INTRANSFERIBLE Y NO EXCLUSIVA PARA EL USO NO COMERCIAL DE LA OBRA CON FINES NO ACADÉMICOS
Yo, Romel Romario Macas Sarango con C.I. No. 1104944069, certifico que los
contenidos desarrollados en este trabajo de titulación, cuyo título es Propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes medios de cultivo in vitro, son de mi absoluta propiedad y responsabilidad Y SEGÚN EL Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN*, autorizo el uso de una licencia gratita intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la presente obra con fines no académicos, en favor de la Universidad de Guayaquil, para que haga uso del mismo, como fuera pertinente.
________________________________________ Romel Romario Macas Sarango
C.I. No. 1104944069
RESUMEN
*CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN (registro oficial No. 899-Dic./2016) Art. 114.- De los titulares de derechos de obras creadas en las instituciones de educación superior o centros educativos.- En el caso de las obras creadas en centros educativos, universidades, escuelas politécnicas, institutos superiores técnicos, tecnológicos, pedagógicos, de artes y los conservatorios superiores, e institutos públicos como resultado de actividad académica o de investigación tales como trabajos de titulación, proyectos de investigación o innovación, artículos académicos, u otros análogos, sin perjuicios de que pueda existir relación de dependencia, la titularidad de los derechos patrimoniales corresponderá a los autores. Sin embargo, el establecimiento tendrá una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra con fines académicos.
ix
Propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes medios de cultivo in
vitro
Autor: Romel Romario Macas Sarango
Tutora: Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc
Resumen
Esta investigación se realizó el 2018, en el Laboratorio de biotecnología
AGROVITROPARIS ubicado en la ciudad de Guayaquil-parroquia Pascuales
avda. Narcisa de Jesús (Metrópolis II etapa H). Se estudiaron 80
tratamientos como resultado de los diferentes medios de cultivos in vitro
utilizados. Se utilizó el diseño completamente al azar con desigual número
de repeticiones y arreglo grupal. Para el cálculo estadístico se realizó el
análisis de varianza, con valores transformados a √𝑥 + 0,5 , donde se
presentaron diferencias significativas, se realizó la comparación de medias
mediante la prueba de Duncan al 5% de probabilidades. Se evaluaron las
siguientes variables: número de entrenudos, número de hojas, longitud de
raíces (cm) Color del explante (tabla de Munsell). De acuerdo con los
resultados se concluye lo siguiente: 1) El tratamiento de (B5 + BAP + AIB)
del grupo 2 alcanzó la mayor longitud de la raíz a los 90 días. 2) La
aplicación del tratamiento (MS + BAP + G3) del grupo 1 presentó el mayor
número de entrenudos y mayor número de hojas con tres entrenudos y dos
hojas respectivamente. 3) Los tratamientos más económicos para la
producción de explantes de vainilla, fueron (B5+BAP+ANA y B5+BAP+AIB)
del grupo número 2.
Palabras Claves: in vitro, explante, rentables.
x
Author: Romel Romario Macas Sarango
Tutor: Eng. Agr. Laura Parismoreno Rivas, MSc
Abstract
This research was carried out in 2018, at the AGROVITROPARIS
biotechnology laboratory located in the city of Guayaquil-Pascuales Avda.
Narcisa de Jesús (Metropolis II stage H). 80 treatments were studied as a
result of the different in vitro culture media used. The design was completely
randomized with an unequal number of repetitions and group arrangement.
For the statistical calculation the analysis of variance was performed, with
values transformed to √𝑥 + 0,5 , where significant differences were
presented, the comparison of means was made by the Duncan test at 5% of
probabilities. The following variables were evaluated: number of internodes,
number of leaves, length of roots (cm) Color of the explant (Munsell table).
According to the results, the following is concluded: 1) The treatment of (B5 +
BAP + AIB) from group 2 reached the longest root length at 90 days. 2) The
application of the treatment (MS + BAP + G3) of group 1 presented the
highest number of internodes and greater number of leaves with three
internodes and two leaves respectively. 3) The most economical treatments
for the production of vanilla explants were (B5 + BAP + ANA and B5 + BAP +
AIB) of group number 2.
Keywords: in vitro, explant, profitable.
xi
ÍNDICE
. Página
I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………..…….1
1.1 Planteamiento del problema…………………………………….....…2
1.2 Formulación del problema………………………………………..…...2
1.3 Objetivos de la investigación……………………………………...….3
1.3.1 Objetivo general…………………………………………..……....3
1.3.2 Objetivos específicos…………………………………………..……...3
1.4 Justificación……………………………………………………………….3
1.5 Hipótesis………………………………………………………………..4
II MARCO TEÓRICO……………………………………………………………5
2.1 Cultivo de vainilla…………………………………………………………5
2.1.1 Generalidades………………………………………………………..5
2.1.2 Origen…………………………………………………………………5
2.1.3 Importancia de la vainilla……………………………………………6
2.1.4 Taxonomía de la vainilla…………………………………………….6
2.1.5 Descripción botánica………………………………………………...7
2.2 cultivos in vitro…………………………………………………………….9
2.2.1 Definición………………………………………………………….…..9
2.3 Medio de cultivo………………………………………………………......9
2.4 Micropropagación………………………………………………………..10
2.5 definiciones generales…………………………………………………..10
xii
Página
2.5.1 Hormonas…………………………………………………………....10
2.5.2 Reguladores de crecimiento……………………………………….10
2.5.3 Factores externos…………………………………………………...17
III. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………....19
3.1 Localización del ensayo………………………………………………....19
3.2 Materiales………………………………………………………………....19
3.2.1 Material tecnológico………………………………………………....19
3.2.2 Material biológico………………………………………………….....19
3.2.3 Material técnico…………………………………………………........19
3.3 Tratamientos estudiados…………………………………………….......20
3.4 Variables estudiadas…………………………………………………......21
3.5 Diseño experimental…………………………………………………..….21
3.6 Metodología………………………………………………………………..22
IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………......26
4.1 Número de entrenudos evaluados a los 90 días del grupo MS……...26
4.2 Número de entrenudos evaluados a los 90 días del grupo B5………27
4.3 Número de entrenudos evaluados a los 90 días entre el grupo MS y B5….28
4.4 Número de hojas evaluadas a los 90 días del grupo MS…………….31
4.5 Número de hojas evaluadas a los 90 días del grupo B5……………..32
4.6 Número de hojas evaluadas a los 90 días entre el grupo MS y B5…33
4.7 Longitud de raíz evaluada a los 90 días del grupo MS……………….35
xiii
Página
4.8 Longitud de raíz evaluada a los 90 días del grupo B5……………….36
4.9 Longitud de raíz evaluadas a los 90 días entre el grupo MS y B5….37
4.10 Color del explantes evaluados a los 90 días del grupo MS………..39
4.11 Color del explantes evaluados a los 90 días del grupo B5………...40
4.12 Color del explantes evaluados a los 90 días entre el grupo MS y B5……41
4.13 Análisis económico……………………………………………………..43
V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……………………………..45
5.1 Conclusiones:…………………………………………………….…...….45
5.2 Recomendación:………………………………………………………....46
VI BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………...…47
ANEXOS…………………………………………………………………………51
xiv
ÍNDICE DE CUADROS DEL TEXTO
Página
Cuadro 1 Descripción de los tratamientos estudiados. 20
Cuadro 2 Esquema de Fuente de Variación y Grados de
Libertad para el análisis de la varianza.
21
Cuadro3 Promedio de número de entrenudos evaluados a
los 90 días determinados en el cultivo de vainilla in
vitro en diferentes medios de cultivos. UG, 2019.
30
Cuadro 4 Promedio de número de hojas evaluada a los 90
días determinados en el cultivo de vainilla in vitro
en diferentes medios de cultivos. UG, 2019.
34
Cuadro 5 Promedio de longitud de raíz a los 90 días
determinados en el cultivo de vainilla in vitro en
diferentes medios de cultivos. UG, 2019.
38
Cuadro 6 Promedio de color de explante a los 90 días
determinados en el cultivo de vainilla in vitro en
diferentes medios de cultivos. UG, 2019
42
Cuadro 7 Análisis económicos de los tratamientos. 44
xv
ÍNDICE DE FIGURAS DEL TEXTO
Página
Figura 1 Número de entrenudos evaluados del grupo MS a
los 90 días mediante la aplicación de diferentes
medios de cultivos in vitro.
27
Figura 2 Número de entrenudos del grupo B5 evaluados a los
90 días mediante la aplicación de diferentes medios
de cultivos in vitro.
28
Figura 3 Número de entrenudos evaluados entre el grupo MS
y B5 a los 90 días mediante la aplicación de
diferentes medios de cultivos in vitro.
29
Figura 4 Número de hojas evaluadas del grupo MS a los 90
días mediante la aplicación de diferentes medios de
cultivos in vitro.
31
Figura 5 Número de hojas evaluadas del grupo B5 a los 90
días mediante la aplicación de diferentes medios de
cultivos in vitro.
32
Figura 6 Número de hojas evaluadas entre el grupo MS y B5
a los 90 días mediante la aplicación de diferentes
medios de cultivos in vitro.
33
Figura 7 Longitud de raíces evaluadas del grupo MS a los 90
días mediante la aplicación de diferentes medios de
cultivos in vitro.
35
Figura 8 Longitud de raíces evaluadas del grupo B5 a los 90
días mediante la aplicación de diferentes medios de
cultivos in vitro.
36
xvi
Figura 9 Longitud de raíces evaluadas entre el grupo MS y B5
a los 90 días mediante la aplicación de diferentes
medios de cultivos in vitro.
37
Figura 10 Color del explante del grupo MS evaluados a los 90
días mediante la aplicación de diferentes medios de
cultivos in vitro.
39
Figura 11 Color del explante del grupo B5 evaluados a los 90
días mediante la aplicación de diferentes medios de
cultivos in vitro.
40
Figura 12 Color de los explantes de los grupos MS y B5
evaluados a los 90 días mediante la aplicación de
diferentes medios de cultivos in vitro.
41
xvii
ÍNDICE DE CUADROS DEL ANEXOS
Página
Cuadro 1 A Análisis de la varianza de la variable número de
entrenudos con valores transformados √𝑋 + 0,5 a
los 90 días después de la siembra. Guayaquil, 2019.
52
Cuadro 2 A Análisis de la varianza de la variable número de
hojas con valores transformados √𝑋 + 0,5 a
los 90 días después de la siembra. Guayaquil, 2019.
52
Cuadro 3 A Análisis de la varianza de la variable color del explante
con valores transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días
después de la siembra. Guayaquil, 2019.
53
Cuadro 4 A Análisis de la varianza de la variable largo de raíces
con valores transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días
después de la siembra. Guayaquil, 2019.
53
xviii
ÍNDICE DE FIGURAS DEL ANEXOS
Página
Figura 1 A Cultivo de vainilla, 2018. 54
Figura 2 A Siembra de plantas madre de
vainilla, 2018.
54
Figura 3 A Obtención de explantes de vainilla,
2018
55
Figura 4 A Explantes de vainillas en los tubos
de ensayos, 2018.
55
Figura 5 A Explantes de vainillas
contaminados, 2019.
56
Figura 6 A Explante de vainilla en desarrollo,
2019.
56
I. INTRODUCCIÓN
En la actualidad, la vainilla es una de las especias más demandadas a
nivel mundial. Pertenece a la familia de las Orquídeas. Existen
aproximadamente 150 variedades de vainilla en todo el mundo, de las cuales
sólo dos variedades son cultivadas comercialmente, la Vainilla Borbón
(Vanilla planifolia) y la Vainilla de Tahití (Vanilla tahitensis) (Molina, 2017).
Este cultivo pertenece a una especie de orquídea nativa de México, que
se caracteriza por ser una planta hermafrodita y ser la única de la cual se
obtiene un fruto en forma de vaina, que se lo conoce con el nombre “vainilla”
(Torregroza, 2018).
Este dicho nombre fue otorgado por los españoles, quienes decidieron
llamarla así por la forma de su fruto. Sin embargo, esta planta ya era
conocida por los antiguos habitantes (tonacas) con el nombre de Xahanat o
flor negra, y por los aztecas con el nombre de Tlixotlil. En estos tiempos, las
personas utilizaban a la vainilla como aromatizante, y como medicina, dado
que la vainilla cuenta con propiedades antisépticas que sirve para tratar
ciertas infecciones bacterianas (Torregroza, 2018).
La especie de vainilla era cultivada solo en México y cuando los europeos
intentaron cultivarla notaron que solo producía flor pero no daban frutos esto
se debía a que la polinización era muy baja por parte de los insectos de la
zona de manera que le surgió la necesidad de realizar una polinización
artificial y de este modo fue como la vainilla paso de cultivarse solo en
2
México a ser producida en otras regiones del mundo ya que no era
necesario del insecto (Torregroza, 2018).
Cabe recalcar que mediante la polinización artificial obtenemos las vainas
en cualquier parte del mundo pero el proceso de producción no termina ahí
dado que el proceso de recolección es manual y se requiere un tiempo de 13
a 15 meses para que las vainas estén listas para la cosecha. Por este motivo
la vainilla es una de las especies más costosas y apreciadas junto con otras
de gran valor como el azafrán (Torregroza, 2018).
1.1 Planteamiento del problema
La vainilla es una orquídea de gran importancia comercial, pues de ella
se obtiene el extracto natural de este saborizante. Bajo condiciones
naturales, las semillas de dicha especie requieren el contacto con un hongo
específico que permite el proceso de germinación lo cual hace que el
proceso de germinación natural sea más tardado y muy complicado.
1.2 Formulación del problema
¿En qué medio de cultivo in vitro es más recomendable realizar la
propagación de la vainilla (Vanilla tahitensis)?
3
1.3 Objetivos de la investigación
1.3.1 Objetivo general
Realizar la propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) en diferentes
medios de cultivo in vitro.
1.3.2 Objetivos específicos
1. Encontrar un protocolo para la propagación in vitro de vainilla.
2. Determinar el medio de cultivo con la adición de fitohormonas que
permita mejorar el desarrollo caulinarmente y radicularmente de la planta.
3. Realizar análisis económico del ensayo.
1.4 Justificación
En este trabajo de titulación se justifica realizar diferentes medios de
cultivo in vitro para la propagación de vainilla (Vanilla tahitensis) ya que su
proceso de germinación de la semilla es muy lento. Esta investigación nos
permitirá saber cuál es el medio in vitro más óptimo para su propagación y
así ayudar a los productores de vainilla a reducir el tiempo de espera.
4
1.5 Hipótesis
El uso de diferentes tipos de medios de cultivos in vitro ayuda a
potencializar el nacimiento y posterior crecimiento de esta planta, basándose
en las metodologías de cultivo de semilla, ápices y el uso de fitohormonas
que ayuden a aumentar el número de ejemplares. Lo cual el resultado de la
investigación ayudaría a los agricultores de vainilla saber en qué medio de
cultivo in vitro se desarrolla mejor este tipo de planta y así evitar pérdidas.
5
II MARCO TEÓRICO
2.1 Cultivo de vainilla
2.1.1 Generalidades
El cultivo de vainilla tahitensis se tratará como una “especie” aparte, a
pesar de ello se ha demostrado que es un hibrido entre V. planifolia y V.
odorata. Debido a que su floración es simultánea con V. planifolia y V.
odorata y conserva el tono herbal y aroma de canela de ambas especies
mencionadas, esta especie tiene un rápido desarrollo del sabor inicial y es
un poco dulce, aunque se presenta un poco mantecosa (Alicia, 2012).
2.1.2 Origen
Este cultivo pertenece a una especie de orquídea nativa de México, que
se caracteriza por ser una planta hermafrodita y ser la única de la cual se
obtiene un fruto en forma de vaina, que se lo conoce con el nombre “vainilla”
(Torregroza, 2018).
En el siglo XVI los europeos llevaron la vainilla a su país (España)
quiénes eran los que comercializaban este producto. Ahí fue donde se
dispersó el cultivo a todo el mundo, principalmente a jardines botánicos
donde se realizaron estudios sobre su horticultura. Posteriormente el cultivo
de vainilla fue introducido a las colonias inglesas, francesas y holandesas
luego a finales del siglo XVIII y principios del siglo XIX fue introducida a sitios
como Java, India, Tahití y las islas Seichelles, entre otros. Aunque en
principio el cultivo fracaso en estos lugares debido a la falta de polinizadores
naturales (Ordoñes, 2012).
6
2.1.3 Importancia de la vainilla
La vainilla es un cultivo de exportación, pues de ella se obtiene de sus
frutos los cuales son el saborizante natural de mayor importancia a nivel
mundial. Se usa generalmente en la industria alimenticia, refresquera,
licorera, farmacéutica, de perfumería y cosméticos, y en una menor cantidad
en la industria tabacalera y de artesanías (Luna, 2003).
Las industrias que elaboran productos tales como: lácteos, helados,
bombones, dulces, pasteles y perfumes, son los mayores consumidores de
vainilla en su forma natural como extracto o esencia (Luna, 2003).
2.1.4 Taxonomía de la vainilla
De acuerdo con Miller (1786) la clasificación taxonómica del cultivo de
vainilla queda de la siguiente manera:
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Liliopsida
Subclase: Liliidae
Orden: Orchidales
Familia: Orchidaceae
Subfamilia: Vanilloideae
Tribu: Vanilleae
Subtribu: Vanillinae
Género: Vanilla
7
2.1.5 Descripción botánica
Raíz:
Sus raíces son adventicias carnosas y largas, que le sirven a la planta
para adherirse al tutor, y en su exterior tienen una estructura llamada
velamen que les permite absorber y retener agua. Mientras que sus raíces
subterráneas se llaman trazadoras ya que se crecen a un radio de hasta 8
cm, y través de ellas adquieren los nutrientes del suelo (Luna, 2003).
Tallo:
Los tallos se pueden desarrollar de dos maneras: simples o ramificados,
a partir de estos es donde se desarrollan las hojas y las raíces, son de gran
tamaño, verdes, y carnosos (Luna, 2003).
Hojas:
Las hojas se caracterizan por ser enteras, planas, ovales, oblongas y
terminadas en punta, se alternan sobre todo el tallo, son gruesas y cerosas
con un diámetro de 15 a 18 cm y de cinco a siete cm de ancho, nacen de
cada uno de los nudos del tallo, están provistas de un peciolo corto que
forma una especie de canaladura, tiene nervaduras paralelas y oscuras,
cuando las hojas se secan se vuelven prominentes (Luna, 2003).
Flores:
El tipo de inflorescencia de la vainilla es en forma de racimos axilares,
cada planta puede producir de 10 a 20 racimos dependiendo de la adultez
8
de la planta, cada racimo tiene de 10 a 20 flores respectivamente. La flor
tiene un tamaño de cinco cm aproximadamente y es hermafrodita, posee un
color blanco, ligeramente amarillo verdoso y un poco abiertas.
La flor está compuesta por tres pétalos y tres sépalos, un pétalo
modificado alargado en forma de labio, el labelo que es el más corto de
todas las partes y posee lóbulos crenulados. El ovario permanece recto y se
vuelve pendiente luego de la floración (Luna, 2003).
Fruto:
El fruto se desarrolla por completo a partir de cuatro u ocho semanas
luego de la fertilización del ovario. Es una capsula carnosa, larga,
ligeramente triangular y alcanza un tamaño de 15 a 25 cm de largo y con
diámetro de ocho a 14 mm, posee un color verde oscuro brillante en su
estado inicial y al madurar cambia a un color verde amarillento. Puede tardar
de tres a 10 meses en madurar (Luna, 2003).
Semillas:
Las semillas de la vainilla son redondas y pequeñas; alcanzan una
medida de 0.24 a 0.33 mm en cada vaina de vainilla puede tener hasta 100
000 semillas y estas pueden ser fértiles dependiendo si fueron polinizadas,
además estas semillas carecen de endosperma (Luna, 2003)
9
2.2 cultivos in vitro
2.2.1 Definición
La denomina cultivo in vitro a cultivar plantas dentro de frascos de vidrio
en un ambiente artificial y se debe tener en cuenta dos características
fundamentales que son: La asepsia (ausencia de gérmenes, etc.), y el
control de factores que afectan al crecimiento del cultivo (Castillo, 2004).
Los avances de las ciencias biológicas nos han permitido durante estos
años el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular
y en condiciones laboratorio adecuado se puede realizar todos los factores
que influyen en el crecimiento y desarrollo de las plantas (Castillo, 2004).
2.3 Medio de cultivo
El medio de cultivo es una solución de nutrientes o sustrato que permite
el desarrollo de la planta, en medios de cultivo de laboratorio se debe elegir
el medio nutritivo adecuado de acuerdo a la necesidad del cultivo para que
pueda desarrollarse (López Tévez, Leonor; Torres, Carola , 2006).
Los medios de cultivo más utilizados para la propagación de plantas son:
• Murashige & Skoog (1962)
• White (1963)
• Gamborg (1968)
Estos medios pueden ser semi-solidos o líquidos (Luna, 2003).
10
2.4 Micropropagación
La micropropagación está entre las diversas técnicas de cultivo in vitro y
consiste en la producción clonal de vegetales a partir de ápices o explantos
nodales extraídos de la planta madre. Las nuevas plantas se ven favorecidas
gracias al rápido crecimiento en este tipo de medio (Alvarado, 2013).
2.5 definiciones generales
2.5.1 Hormonas
Las hormonas vegetales (fitohormonas) son moléculas orgánicas que en
pequeñas cantidades pueden acelerar, retardar o inhibir determinados
procesos fisiológicos de la planta (Parra, 2017).
2.5.2 Reguladores de crecimiento
Son compuestos que administrados en pequeñas cantidades al medio
estimulan, inhiben o modifican el desarrollo del cultivo. Existen varios tipos
de reguladores de crecimiento entre los cuales tenemos: Auxinas,
citocininas, giberelinas, ácido absícico, etileno, etc (Luna, 2003).
Auxinas:
Las auxinas son las reguladoras del crecimiento en las plantas, y son las
causantes de la elongación de las células, se sintetizan en las regiones
meristematicas del ápice del tallo desplazándose luego hacia el resto de la
11
planta primordialmente hacia las raíces (Parra, 2017).
Citocininas:
Este tipo de hormonas vegetales promueven la división y diferenciación
celular y son primordiales para el proceso de organogénesis (formación de
órganos) y la regulación de procesos fisiológicos (fotosíntesis, regulación de
crecimiento, senescencia, resistencia a patógenos) en la planta. Se
sintetizan en el ápice de la raíz y el xilema, floema y hojas. Cuando la
citocinina es mayor que la auxina en concentración, se forman yemas
mientras que si ocurre lo contrario, el tejido indiferenciado organiza raíces
(Parra, 2017).
Giberelinas:
Estas hormonas estimulan el alargamiento celular de entrenudos del tallo
y los pedúnculos florales, se los obtiene de un hogo llamado Giberrella
fujikuroi (Fusarium heterosporium) además ayuda a romper la dormancia de
semillas y brotes. Este tipo de hormona es empleado en forma de ácido
giberèlico (AG3) en los diferentes medios de cultivo (Luna, 2003).
Ácido absícico:
El ácido absícico (ABA) participa en el desarrollo y crecimiento vegetal,
esta fitohormona es capaz de inducir el etileno por lo cual se la ha
relacionado con la madures y senescencia de la planta. También se dice que
da una resistencia a enfermedades pero no está muy esclarecida debido que
12
varía de acuerdo a cada tejido, desarrollo de la planta o el tipo de interacción
por lo general esta fitohormona ayuda a la resistencia a enfermedades en las
etapas tempranas de la infección y en las etapas posteriores tienen un papel
negativo (Parra, 2017).
Etileno:
El etileno inducido en altas concentraciones ayuda a inducir el
crecimiento, la formación de raíces, tallos, hojas, pedúnculos florales, y
maduración de los frutos. Esta hormona además puede ser inducida en
plantas que presenten heridas mecánicas o estrés (Parra, 2017).
Explante:
Un explante es cualquier parte vegetal que ha sido sacada de la planta,
pueden ser tallos, fragmentos de hojas, raíces, etc. Todos estos tejidos
están constituidos por células somáticos y para tener un buen explante se
debe tomar de plantas que estén en perfectas condiciones (Mojica, 2012).
Totipotencia:
La totipotencia es la capacidad de las células para regenerar la planta ya
que tienen la capacidad de dar cualquier órgano que nosotros deseemos
(Contreras, 2013).
13
Cuando se obtiene una célula totipotente a partir de una célula que no lo
es denominamos a esto embriogénesis somática (Contreras, 2013).
Organogénesis:
La organogénesis son un conjunto de procesos morfológicos en los
cuales las estructuras forman órganos no-autónomos en el explante
(protoplastos, células, callos, fragmentos de tejido, fragmentos de planta)
(Luna, 2003).
Una de las características más importantes de la organogénesis, es el
potencial organogenético de los explantes, y se puede presentar bajo cuatro
vías morfogenéticas que conducen a la rizogénesis o formación de raíces,
caulogénesis o formación de yemas, callogénesis o formación de callo y la
embriogénesis somática (Luna, 2003).
Embriogénesis somática:
Se le llama embriogénesis somática a la formación de un embrión a partir
de una célula, sin la tener la necesidad de fusión de gametos (Seijo, 2003).
Este fenómeno no se trata de algo artificial y se lo puede encontrar en la
naturaleza como una forma de apomixis (Seijo, 2003).
14
Rizogénesis:
La rizogénesis puede ser promovida por las auxinas, hidratos de carbono,
y por la luz. Estas condiciones cambian de acuerdo al tipo de cultivo y en
algunas ocasiones según las variedades de esta misma especie, por lo cual
las variaciones en las concentraciones de auxinas pueden variar (Luna,
2003).
Asepsia:
Es el procedimiento que se utiliza para evitar infecciones en tejidos
cuando hacemos las intervenciones y así mantener la esterilidad del medio
en el que vamos a trabajar (Fuentes, 2011).
Aminoácidos:
Son moléculas orgánicas que están compuestas de carbono, hidrógeno,
oxígeno y nitrógeno. El nombre de aminoácidos se debe a que los grupos
funcionales que contiene: un grupo amino básico (NH2) y un grupo carboxilo
ácido (COOH) que están unidos a una cadena carbonada (R) (AEFA, 1998).
Agentes Gelificantes:
Se trata de una gelatina vegetal de origen marino que se la obtiene en
diferentes algas rojas marinas, y se adiciona un porcentaje de 0,6 a 1%
considerando la pureza del agar (Guillén & Castro, 2015).
15
Murashige & skoog 1962 (MS):
Este medio de cultivo es el más utilizado comúnmente en cultivos de
tejidos vegetales y está comprobado que es efectivo en el crecimiento y
propagación de monocotiledóneas y dicotiledóneas (Guillén & Castro, 2015).
MS está caracterizado por una gran concentración de nitrato (NO-3) y
amonio (NH+4), el incremento de crecimiento es de cinco a siete veces más
comprado con los medios tradicionales usados comúnmente (Guillén &
Castro, 2015).
16
Componentes Murashige & Skoog 1962 y B5 **(Gamborg, 1976):
Según Mroginski y Roca estas son las cantidades de acuerdo a la
sustancia.
SUSTANCIA *CANTIDAD g
y mg/L
**CANTIDAD
g y mg/L
NH4NO3
(NH4)S04
KNO3
KH2PO4
CaCI2.2H2O
MgSO4.7H2O
KI
H2BO3
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
FeSO4.7H20
Na2EDTA
CoCI2.6H2O
Glicina
Tiamina- HCI
Piridoxina- HCI
Acido nicotínico
Mioinositol
Sacarosa
pH
1650
1900
170
440
370
0.83
6.20
22.30
8.60
0.25
0.025
27.80
37.30
0.025
2.00
0.10
0.50
0.50
100.00
30,000
5.7
0.134
2.528
0.15
0.15
0.246
17
Elaboración del medio de cultivo MS y Hoagland:
Para hacer del medio de cultivo MS según (Alvarado, 2013) se realizan
las siguientes soluciones madre:
Soluciones stock de nutrientes:
• Stock de macronutrientes,
• Stock de Calcio,
• Stock de micronutrientes
• Stock de hierro y EDTA
Soluciones Stock de vitaminas.
Soluciones Stock de Reguladores.
2.5.3 Factores externos
Los principales factores físicos que se deben tener en cuenta son la
temperatura y la luz; el grado higrométrico del aire generalmente no tiene
mucha importancia ya que las plantas cultivadas in vitro se encuentran en
una atmósfera naturalmente saturada (Luna, 2003).
Luz:
Es el principal factor físico y se ha demostrado que tiene un gran efecto
sobre los cultivos in vitro. Por lo general los cuartos de crecimiento deben
tener un fotoperiodo de 12 a 16 horas con una intensidad lumínica de 1000
10000 lux. El cambio de intensidad lumínica causa organogénesis y cambios
18
morfogenéticos debido a la longitud de onda de la iluminación (Luna, 2003).
Temperatura:
Los cultivos in vitro se desarrollan normalmente en un rango que va de
los 20° C a los 25°C; sin embargo también se pueden desarrollar en
temperaturas de 18°C a 28°C obteniendo buenos resultados (Luna, 2003).
19
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Localización del ensayo
El Trabajo de titulación se realizó en el Laboratorio de biotecnología
AGROVITROPARIS ubicado en la ciudad de Guayaquil-parroquia Pascuales
avda. Narcisa de Jesus (Metrópolis II etapa H).
3.2 Materiales
3.2.1 Material tecnológico
• Cámara Fotográfica
• Computadora
• Cámara de flujo laminar
3.2.2 Material biológico
• Plantas madre
• Reactivo químicamente puro
• Agente gelificante
• Fitohormonas
• Vitaminas
3.2.3 Material técnico
• Agenda
• Mandil
• Guantes
• Probetas
• Pipetas
20
• Cajas Petri
• Balanza analítica
• Autoclave
• Agitador magnético
• Frascos desecadores
• Mascarilla
• Balanza
• Frascos
• Erlenmeyer
3.3 Tratamientos estudiados
Se estudiaron ocho tratamientos, los mismos que se describen en el
Cuadro 1:
Cuadro 1. Descripción de los tratamientos estudiados.
No. de
tratamientos
No. de
grupos
Tratamientos
1 MS+BAP+G3
2 Grupo 1. MS+BAP+ANA
3 MS+BAP+AIB
4 Testigo
5 B5+BAP+G3
6 Grupo 2. B5+BAP+ANA
7 B5+BAP+AIB
8 Testigo
21
3.4 Variables estudiadas
• Número de entrenudos.
• Número de hojas.
• Color del explante (Escala de Munsell).
• Longitud de raíces (cm).
3.5 Diseño experimental
Se utilizó el diseño completamente al azar con desigual número de
repeticiones y arreglo grupal. Para el cálculo estadístico se realizó el análisis
de varianza con valores transformados a √𝑥 + 0,5 , donde se presentaron
diferencias significativas, se realizó la comparación de medias mediante la
prueba de Duncan al 5% de probabilidades.
Cuadro 2. Esquema de Fuente de Variación y Grados de Libertad para el
análisis de la varianza.
Fuente de Variación Grados de Libertad
Tratamientos 7
Grupos 1 3
Grupos 2 3
Entre grupos 1
Error experimental 47
Total 63
22
3.6 Metodología
Selección de plantas madres:
Se utilizó plantas madres seleccionadas de orquídeas Vainilla thaitensis
adquiridas en viveros en Santo Domingo, se utilizó yemas axilares y apicales
como explantes.
Desinfección del material vegetal:
Una vez seleccionada la planta madre, se cortaron los fragmentos a partir
de los cuales se obtuvieron los explantes. Los tejidos iniciales fueron yemas
apicales y axilares. Antes de extraer los explantes se realizó una
desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los
contaminantes externos. Los contaminantes más comunes fueron los
hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez
desinfectado el material vegetal, se mantuvo en condiciones de asepsia. A
efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajó en cabinas de flujo
laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos
explantes se colocaron en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación
para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizó la
desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial),
diluida durante un período de cinco a 15 minutos, seguido por tres a cuatro
enjuagues en agua esterilizada.
23
Preparación de medios de cultivos:
Una vez pesados en balanza analítica los reactivos. Se inició colocando
en un Erlenmeyer de 1000 ml. 300 ml de agua destilada más la solución
madre: macronutrientes, micronutrientes, quelatos de hierro, vitaminas de
Morel, inositol, azúcar de coco; luego se añadió al agitador magnético hasta
que se disuelvan todos los reactivos precipitados, cuando ya esté bien
disueltos, las soluciones, enrazamos en el Erlenmeyer hasta un litro con
agua destilada, luego se ajustó el pH con unas gotas de NaOH.y HCl.
Posteriormente se agregó el medio en un frasco de 200 ml a razón de 30 –
35 ml por frasco se tapó con papel aluminio y se selló con papel aluminio.
Finalmente, se esterilizó el medio de cultivo en una autoclave a 121 °C por
15 minutos. La cantidad inicial por cada tratamiento fue de 28 frascos de 200
ml.
Aclimatación de explantes enraizados:
Cuando Los explantes están recién enraizados son mucho más sensibles
a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el
proceso realizado depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas
sufren cambios de diferentes tipos que les permite la adaptación a las
condiciones naturales en donde van a estar. En el momento en que se
extraen los explantes enraizados de los frascos, estos no están adaptados a
crecer en un invernáculo, ya que estos han crecido en ambientes con una
humedad relativa muy elevada (Castillo, 2004).
24
Por otra parte, cuando las plantas crecen en ambientes tan húmedos
también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada,
que les ayuda a las plantas a evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la
superficie de la planta (Castillo, 2004).
Características que presenta una planta en condiciones de laboratorio (in
vitro) a diferencia de una planta en condiciones naturales (in vivo):
In vitro:
• No realiza fotosíntesis.
• Crecimiento en condiciones controladas.
• Crecimiento en condiciones de asepsia.
• Alta humedad relativa.
• Estomas no funcionales.
• Ausencia de pelos radiculares.
• Ausencia de cera en la cutícula.
In vivo:
• Realiza fotosíntesis.
• Crecimiento en condiciones no controladas.
• Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente.
• Humedad relativa variable.
• Estomas funcionales.
• Presencia de pelos radiculares.
• Presencia de cera en la cutícula.
25
La validación externa se verificó mediante comparación con los
resultados de diversos autores. La toma de datos se realizó a los 90 días
después de la siembra aséptica utilizando Verniel, cinta métrica y tablas de
Munsell de medición y seguimiento fotográfico.
La estadística se realizó usando la prueba de DUNCAN para determinar
la diferencia de medios.
Se construyó la forma de las tablas y figuras con los supuestos
indicadores teóricos de la ANDEVA.
Las plantas madres fueron obtenidas en un vivero ubicado en la provincia
de Santo Domingo de los Tsáchilas
Los tratamientos bajo estudio fueron: Murashige & skoog 1962 y B5
(Gamboll).
26
IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Número de entrenudos evaluados a los 90 días del grupo MS.
De acuerdo con el análisis de varianza, el grupo 1 (MS), presentó
significancia estadística al 1 y 5 % (Cuadro 1A), siendo el tratamiento de
MS+BAP+G3 que obtuvo el mayor número de entrenudos con un promedio
de 3 entrenudos, difiere estadísticamente de los demás tratamientos, el
tratamiento testigo presentó el menor promedio con 0.57 entrenudos, igual
estadísticamente a los tratamientos de MS+BAP+ANA y MS+BAP+AIB con
1.29 y 1.33 entrenudos respectivamente (Figura 1). Resultado que coincide
con lo mencionado por Vidalie (2013), quien manifiesta que el uso de
giberelinas es recurrente, pero solo el ácido giberélico (G3), se utiliza en
forma frecuente, adicionándose en el medio de cultivo para estimular el
crecimiento de los meristemos, entrenudos, induce el alargamiento de los
tallos y activar el crecimiento de los embriones somáticos.
27
Figura 1. Número de entrenudos evaluados del grupo MS a los 90 días
mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
4.2 Número de entrenudos evaluados a los 90 días del grupo B5.
En esta variable el análisis estadístico de varianza expresa que el grupo 2
(B5) alcanzó significancia estadista al 1 y 5 % (Cuadro 1A), donde
B5+BPA+G3 reportaron el mayor número de entrenudos con un promedio de
1.50 entrenudos, difiere estadísticamente de los demás tratamientos, el
tratamiento testigo obtuvo el menor número de entrenudos con un promedio
de 0.14 entrenudos (Figura 2). Vidalie (2013), expresa que el uso de
sustancia orgánica como B5 es esencial para mejor el número de
entrenudos.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
MS+BAP+G3 MS+BAP+ANA MS+BAP+AIB Testigo
3.00 a1/
1.29 b 1.33 b
0.57 b
Nú
mer
o d
e en
tren
ud
os
GRUPO MS
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).
28
Figura 2. Número de entrenudos del grupo B5 evaluados a los 90 días
mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
4.3 Número de entrenudos evaluados a los 90 días entre el grupo MS y
B5.
El análisis de varianza manifiesta que entre grupo presentó significancia
estadística al 1 y 5%, el coeficiente de variación de esta variable fue de
31.41% con un promedio general de 1.25 entrenudos (Cuadro 1A y 3).
El grupo 1 (MS) obtuvo el mayor número de entrenudos con un promedio de
1.58 entrenudos difiere estadísticamente del grupo 2 (B5), la cual alcanzó el
menor promedio de entrenudos con 0.94 entrenudos (Figura 3).
El mejor medio de cultivo de estos grupos fue el de MS+BAP+G3.
Los mejores resultados obtenidos entre los dos grupos MS y B5 con la
variable de número de entrenudos fueron los del grupo MS.
0.00
0.50
1.00
1.50
B5+BAP+G3 B5+BAP+ANA B5+BAP+AIB Testigo
1.50 a1/
1.00 b 1.00 b
0.14 c
Nú
mer
o d
e en
tren
ud
os
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).
29
Figura 3. Número de entrenudos evaluados entre el grupo MS y B5 a los 90
días mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
1.00
2.00
3.00
3.00 a1/
1.29 b 1.33 b
0.57 b
1.50 a
1.00 b 1.00 b
0.14 c
1.58 a
0.94 b
Nú
mer
o d
e en
tren
ud
os
GRUPO MS GRUPO B5 ENTRE GRUPOS
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).
30
Cuadro 3. Promedio de número de entrenudos evaluados a los 90 días determinados en el cultivo de vainilla in vitro en diferentes medios de cultivos. UG, 2019
Tratamientos Número de entrenudos
evaluados a los 90 días
Grupo 1.
MS+BAP+G3
3,00 a1/
MS+BAP+ANA 1,29 b
MS+BAP+AIB 1,33 b
Testigo 0,57 b
Grupo 2.
B5+BAP+G3
1,50 a 1/
B5+BAP+ANA 1,00 b
B5+BAP+AIB 1,00 b
Testigo 0,14 c
Entre grupos
Grupo 1 1,58 a 1/
Grupo 2 0,94 b
× 1,25
C.V.(%) 31,412/
1/ Promedios señalados con la misma letra no difieren entre sí (Duncan α 0,05). 2/ Con datos transformados a√𝑥 + 0,5.
31
4.4 Número de hojas evaluadas a los 90 días del grupo MS.
De acuerdo con el cuadro 2A, el grupo 1 (MS) obtuvo significancia
estadística al 1 y 5 %, el tratamiento de MS+BAP+G3 presentó el mayor
número de hojas con un promedio de 1.25 hojas, difiere estadísticamente de
los demás tratamientos, el tratamiento testigo generó el menor número de
hoja con un promedio de 0.14 hojas, igual estadísticamente a el tratamiento
de MS+BAP+ANA y MS+BAP+AIB con un promedio de 0.57 y 0.56 hojas
respectivamente (Figura 4). Resultado que coincide con Vargas (2012),
quien mediante la aplicación de MS (Murashige & skoog), obtuvo el mayor
número de hoja.
Figura 4. Número de hojas evaluadas del grupo MS a los 90 días mediante
la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
0.50
1.00
1.50
MS+BAP+G3 MS+BAP+ANA MS+BAP+AIB Testigo
1.25 a1/
0.57 b 0.56 b
0.14 b
Nú
mer
o d
e h
oja
s
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).
32
4.5 Número de hojas evaluadas a los 90 días del grupo B5.
De acuerdo con el Cuadro 2A, el grupo 2 (B5) no alcanzó significancia, la
aplicación de B5+BAP+ANA obtuvo el mayor número de hoja con un
promedio de 0.86 hoja, mientras que el testigo generó el menor promedio de
número de hojas con 0.43 hoja (Figura 5). Resultado que coincide con
Garay, Sánchez, García y Gutiérrez (2014), quien indican que las auxinas
(ANA) son hormonas que intervienen durante todo el ciclo de vida de las
plantas y son muy interesantes debido a que se distribuyen diferencialmente
dentro de los tejidos lo que provoca diferentes procesos morfogenéticos
(estimulación y alargamiento de las hojas).
Figura 5. Número de hojas evaluadas del grupo B5 a los 90 días mediante la
aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
B5+BAP+G3 B5+BAP+ANA B5+BAP+AIB Testigo
0.75 a0.86 a
0.44 a 0.43 a
Nú
mer
o d
e h
oja
s
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).
33
4.6 Número de hojas evaluadas a los 90 días entre el grupo MS y B5.
Entre grupo nos presentó significancia estadística de acuerdo con el
análisis de varianza, el promedio general fue de 0.63 hoja con un coeficiente
de variación de 41.84% (Cuadro 2A y 4).
El mejor medio de cultivo para esta variable es el MS+BAP+G3.
Los mejores resultados obtenidos entre los dos grupos MS y B5 con la
variable de número de hojas fueron los del grupo MS.
Figura 6. Número de hojas evaluadas entre el grupo MS y B5 a los 90 días
mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
0.50
1.00
1.50 1.25 a1/
0.57 b 0.56 b
0.14 b
0.75 a0.86 a
0.44 a 0.43 a0.65 a 0.61 a
Nú
mer
o d
e h
oja
s
GRUPO MS GRUPO B5 ENTRE GRUPOS
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).
34
Cuadro 4. Promedio de número de hojas evaluada a los 90 días determinados en el cultivo de vainilla in vitro en diferentes medios de cultivos. UG, 2019.
Tratamientos Número de hojas evaluadas a los
90 días
Grupo 1.
1,25 a1/
MS+BAP+G3
0,57 b
MS+BAP+ANA
0,56 b
MS+BAP+AIB 0,14 b
Testigo
Grupo 2. 0,75 a 1/
B5+BAP+G3
0,86 a
B5+BAP+ANA 0,44 a
B5+BAP+AIB
0,43 a
Testigo
Entre grupos
Grupo 1 0,65 a
Grupo 2
0,61 a
× 0,63
C.V.(%) 41,842/
1/ Promedios señalados con la misma letra no difieren entre sí (Duncan α 0,05). 2/ Con datos transformados a√𝑥 + 0,5.
35
4.7 Longitud de raíz evaluada a los 90 días del grupo MS.
De acuerdo con el análisis de varianza el grupo 1 (MS) alcanzó
significancia estadística al 1 y 5 % (Cuadro 3A), El tratamiento de
MS+BAP+AIB reportó la mayor longitud de la raíz con un promedio de 1.74
cm, igual estadísticamente al tratamiento de MS+BAP+G3 con un promedio
de1.39 cm, difieren estadísticamente de los demás tratamientos, el testigo
presentó la menor longitud de la raíz con un promedio de 0.36 cm, igual
estadísticamente al tratamiento de MS+BAP+G3 con un promedio de 0.39
cm (Figura 7). Resultado que concuerda con el experimento por Menchaca,
Ramos, Moreno, Luna, Mata, Vázquez, & Lozano (2011), en Xalapa (México)
mediante la aplicación de Murashige & skoog + BAP alcanzaron la mayor
longitud de la raíz.
Figura 7. Longitud de raíces evaluadas del grupo MS a los 90 días mediante
la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
MS+BAP+G3 MS+BAP+ANA MS+BAP+AIB Testigo
0.39 b1/
1.39 a
1.74 a
0.36 b
Lon
gitu
d d
e ra
íz (
cm)
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre sí (Duncan α 0.05).
36
4.8 Longitud de raíz evaluada a los 90 días del grupo B5.
El grupo 2 (B5) presentó significancia estadística al 1 y 5 % de acuerdo
con el análisis de varianza (Cuadro 3A), la aplicación de B5 +BAP+AIB
reporto la mayor longitud de la raíz con un promedio de 2.31 cm, igual
estadísticamente al tratamiento de B5+BAP+ANA con un promedio de
2.17cm, difieren estadísticamente de los demás tratamientos, el tratamiento
testigo alcanzó la menor longitud de la raíz con un promedio de 0 cm (Figura
8). Resultado que coincide con lo mencionado por Parra (2017), quien indica
que la BAP es un tipo de hormona que promueven la división y
diferenciación celular y son primordiales para el proceso de organogénesis
(formación de órganos) y la regulación de procesos fisiológicos (fotosíntesis,
crecimiento de raíz, senescencia, resistencia a patógenos) en la planta.
Figura 8. Longitud de raíces evaluadas del grupo B5 a los 90 días
mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
B5+BAP+G3 B5+BAP+ANA B5+BAP+AIB Testigo
0.65 b
2.17 a2.31 a
0.00 c
Lon
gitu
d d
e ra
íz (
cm)
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre sí (Duncan α 0.05).
37
4.9 Longitud de raíz evaluadas a los 90 días entre el grupo MS y B5.
Entre grupo reportó significancia estadística al 1 y 5 % según el análisis
estadístico de varianza, con un coeficiente de variación de 22.59 y un
promedio general de 1.16centimetros (Cuadro 3A y 5). El grupo 2 (B5)
reportó la mayor longitud de la raíz con un promedio de 1.33 cm, difiere
estadísticamente del grupo 1 (MS) que alcanzó la menor longitud de la raíz
con un promedio de 1.00 cm.
El mejor medio de cultivo de esta variable es el B5+BAP+AIB.
Los mejores resultados obtenidos entre los dos grupos MS y B5 con la
variable de longitud de raíz fueron los del grupo B5.
Figura 9. Longitud de raíces evaluadas entre el grupo MS y B5 a los 90 días
mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
0.39b1/
1.39 a
1.74 a
0.36 b
0.65 b
2.17 a2.31 a
0.00 c
1.00 b
1.33 a
Lon
gitu
d d
e ra
íz (
cm)
GRUPO MS GRUPO B5 ENTRE GRUPOS
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre sí (Duncan α 0.05).
38
Cuadro 5. Promedio de longitud de raíz a los 90 días determinados en el cultivo de vainilla in vitro en diferentes medios de cultivos.
UG,2019
Tratamientos Longitud de raíz evaluadas a los 90
días
Grupo 1.
MS+BAP+G3
0,39 c1/
MS+BAP+ANA 1,39 c
MS+BAP+AIB
1,74 b
Testigo 0,36 a
Grupo 2.
B5+BAP+G3
0,65 b 1/
B5+BAP+ANA
2,17 a
B5+BAP+AIB 2,31 a
Testigo
0,00 c
Entre grupos
Grupo 1
1,00 b
Grupo 2 1,33 a
× 1,16
C.V.(%)
22,592/
1/ Promedios señalados con la misma letra no difieren entre sí (Duncan α 0,05).
2/ Con datos transformados a√𝑥 + 0,5.
39
4.10 Color del explantes evaluados a los 90 días del grupo MS.
En este grupo (MS), el análisis de varianza obtuvo significancia
estadística al 1 y 5 % (Cuadro 4A), el tratamiento testigo ocasionó el mayor
valor en la escala de munsell con un promedio de 5.37 difiere
estadísticamente de los demás tratamientos, MS+BAP+ANA presentó el
menor valor en la escala de munsell con un promedio de 2.77 igual
estadísticamente al tratamiento de MS+BAP+G3 con un promedio de 2.85
(Figura 10).
Figura 10. Color del explante del grupo MS evaluados a los 90 días
mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
MS+BAP+G3 MS+BAP+ANA MS+BAP+AIB Testigo
2.85 c1/ 2.77 c
3.50 b
5.37 a
Co
lor
del
exp
lan
te
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).
40
4.11 Color del explantes evaluados a los 90 días del grupo B5.
El análisis de varianza Andeva indica que el grupo 2 (B5) alcanzó
significancia estadística al 1 y 5 % (Cuadro 4A), el tratamiento testigo
presentó el mayor valor en la escala de munsell con un promedio de 2.32
difiere estadísticamente de los demás tratamientos, los tratamientos
B5+BAP+G3 y B5+ BAP+ ANA reportaron los menores valores en la escala
de munsell con un promedio de 1.68 y 1.66 respectivamente, iguales
estadísticamente entre sí (Figura 11).
Figura 11. Color del explante del grupo B5 evaluados a los 90 días mediante
la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
B5+BAP+G3 B5+BAP+ANA B5+BAP+AIB Testigo
1.68 c 1.66 c1.86 b
2.32 a
Co
lor
del
exp
lan
te
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).
41
4.12 Color del explantes evaluados a los 90 días entre el grupo MS y B5.
De acuerdo con el análisis de varianza entre grupo presentó significancia
estadística al 1 y 5 %, con un coeficiente de variación de 13.06% y un
promedio general de 2.73 (Cuadro 4A y 6).
El grupo 1 (MS) alcanzó el mayor valor de la escala de munsell con un
promedio de 3.59 difiere estadísticamente al grupo 2 (B5) con un promedio
de 1.87 (Figura 12).
El mejor medio de cultivo de esta variable es el testigo.
Los mejores resultados obtenidos entre los dos grupos MS y B5 con la
variable de color del explante fueron los del grupo MS.
Figura 12. Color de los explantes de los grupos MS y B5 evaluados a los 90
días mediante la aplicación de diferentes medios de cultivos in vitro.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
2,85c1/2.77 c
3.50 b
5.37 a
1.68 c 1.66 c 1.86 b2.32 a
3.59 a
1.87 b
Co
lor
del
exp
lan
te
GRUPO MS GRUPO B5 ENTRE GRUPOS
1/. Valores señalados con la misma letra no difieren estadísticamente entre si (Duncan α 0,05).
42
Cuadro 6. Promedio de color de explante a los 90 días determinados en el . cultivo de vainilla in vitro en diferentes medios de cultivos. UG, 2019
Tratamientos Color de explante en escala de
Munsell evaluadas a los 90 días
Grupo 1.
MS+BAP+G3
2,85 c3/
MS+BAP+ANA 2,77 c
MS+BAP+AIB 3,50 b
Testigo 5,37 a
Grupo 2.
B5+BAP+G3
1,68 c 3/
B5+BAP+ANA 1,66 c
B5+BAP+AIB 1,86 b
Testigo 2,32 a
Entre grupos
Grupo 1 3,59 a3/
Grupo 2 1,87 b
2,733/
C.V.(%) 13,062/
1/ Promedios señalados con la misma letra no difieren entre sí (Duncan α 0,05). 2/ Con datos transformados a√𝑥 + 0,5.
3/. Promedios con valores transformados a √𝑥 + 0,5.
43
4.13 Análisis económico
Se realizó el análisis económico tomando en cuenta el precio de todos los
materiales y medio de cultivo que se utilizaron en el experimento, se
calcularon los gastos para 200 plantas obtenidas in vitro.
Los tratamientos testigos fueron los más económicos con USD 14.00 de
cada uno de los grupos, mientras que los más costosos correspondieron a
MS+BAP+ANA y MS+BAP+AIB ambos con un precio de USD 75,28 (Cuadro 7).
No constan los valores de mano de obra, ni precio de los explantes por
tratarse de un experimento determinativo.
44
Cuadro 7. Análisis económicos de los tratamientos.
Materiales MS+BAP+G3 MS+BAP+ANA MS+BAP+AIB Testigo B5+BAP+G3 B5+BAP+ANA B5+BAP+AIB Testigo
Obtención de
explantes(USD)
10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
Tubos de
ensayos (USD)
4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
Medios de
cultivos (USD)
50.00 61.28 61.28 0.00 37.50 47.28 47.28 0.00
Total (USD) 64.00 75.28 75.28 14.00 51.50 61.28 61.28 14.00
No consta la mano de obra.
45
V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones:
1. El tratamiento de (B5 + BAP + AIB) del grupo 2 alcanzó la mayor
longitud de la raíz a los 90 días.
2. La aplicación del tratamiento (MS + BAP + G3) del grupo 1
presentó el mayor número de entrenudos y mayor número de hojas
con tres entrenudos y dos hojas respectivamente.
3. Los tratamientos más económicos para la producción de
explantes de vainilla, fueron (B5+BAP+ANA y B5+BAP+AIB) del
grupo número 2.
46
5.2 Recomendación:
1. Aplicar B5 + BAP + AIB (tratamiento 7 del grupo 2) para alcanzar
un buen desarrollo radicular en los cultivos in vitro de vainilla.
2. Utilizar MS + BAP + G3 (tratamiento 1 del grupo 1) para lograr un
buen desarrollo caulinar en plantas de vainillas in vitro.
3. Realizar ensayos similares con otras formulaciones de medios
de cultivos con fitohormonas y otras sustancias químicamente
puras.
47
VI BIBLIOGRAFÍA
AEFA. (Definición aminoácidos, asociación española de fabricantes de
agronutrientes.) 1998. Los aminoácidos y su interacción con los
vegetales. Cooperativa Agraria, Valencia.
Arditti J. 2010. Clonal Propagation of Orchids by Means of Tissue
Culture_ A. Manual. En: Arditti (editor) Orchid Biology: reviews and
Perspectives Vol. I Croneli University Press. Ithaca, New York. p
203 – 293.
ARDITTI, J. 2012. Orchid seed germination and seedling culture - A
Manual. En J. Arditti (Ed.) Orchid biology: reviews and
perspectives. Cornell University Press, Londres. 234-370 p
Alicia, M. 2012. Ecamenchaca. Universidad Veracruzana, Xalapa,
Veracruz, México Retrieved from:
https://www.uv.mx/det/files/2012/06/MenchacaGarciaRebecaAlicia.
pdf.
Alvarado, L. 2013. Medios de cultivo definidos e indifinidos. Instituto
Tecnológico De Cd. Altamirano, Cd Altamirano, Gro. México.
Castillo, A. 2004. Propagación de plantas por cultivo in vitro. Unidad de
Biotecnología, INIA Las Brujas.
Contreras, R. 2013. La guia. Retrieved from La totipotencia en cultivos de
48
tejido vegetal, biologia.laguia2000 Retrieved from
https://biologia.laguia2000.com/botanica/la-totipotencia-en-cultivos-
de-tejido-vegetales
Fuentes,M.2011. Conocimientos, actitudes y prácticas de asepsia y
antisepsia en personal de enfermería. Universidad nacional
autónoma de Nicaragua, Nicaragua.
Garay, A., Sánchez, M., García, B., Álvarez, E., & Gutiérrez, C. 2014. La
Homeostasis de las Auxinas y su importancia en el Desarrollo de
Arabidopsis Thaliana. Revista de Educación Bioquímica, México.
Guillén, S., & Castro, V. 2015. Evaluación del crecimiento in vitro de
plantulas de orquídea dacyglossumedwardi en medios de cultivo
simples con suplementos orgánicos frente a medio de cultivo
murashige y skoog modificado como testigo (Bachelor´s thesis).
Universidad de cuenca, Ecuador.
López, Leonor; Torres, Carola . 2006. Medios de cultivo, Universidad
Nacional del Nordeste, Argentina.
Luna, K. 2003. Respuesta de tres explantes de vainilla (vanillaplanifolia) a
diferentes frecuencias de inmersión. Tecnológico de Costa
Rica,Costa Rica.
49
Menchaca G., Ramos, J., Moreno, D., Luna, M., Mata M., Vázquez L.*,
Miguel A. & Lozano, R. 2011. Germinación in vitro de híbridos de
Vanilla planifolia y V. pompona. Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XIII
No. 1 Julio 2011 80-84.Colombia.
Mojica, A. 2012. Manual de Cultivo de Tejidos Vegetales para Ingenieros
Biotecnólogos. Retrieved from Biotecnología
http://annymojica.blogspot.com/2012/04/233-explante.html
Molina, C. J. (2017, Noviembre). Plan de negocios para producción de
Vainilla de Tahití (Vanilla tahitensis) en Santo Domingo de los
Colorados, Ecuador, con fines de exportación.
bdigital.zamorano.edu, Ecuador.
Moreno, R. 2006. Cultivo in vitro de embriones inmaduros de Vanilla
planifolia. Tesis de Licencitura, Universidad Veracruzana, Mexico.
Ordoñez F, María C., Ospina N. 2012. La vanilla y los hongos formadores
de micorrizas. Sociedad Colombiana de Orquideología, Colombia.
Parra, Y. 2017. Las hormonas vegetales y sus Funciones. Agronomaster
Retrieved from: https://agronomaster.com/hormonas-vegetales/
Seijo, M.2003. Aspectos básicos de la embriogénesis somática.
Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Cuba.
50
Torregroza, J. 2018. El origen de la vainilla y su historia.Vainilla Retrieved
from: https://www.vainilla.info/origen-historia/
Vidalie, H. 2013. Cultivo in vitro. Ed. Científica, S.A.de C.V. México.
51
ANEXOS
52
Cuadro 1A. Análisis de la varianza de la variable número de entrenudos con
valores transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días después de la siembra.
Guayaquil, 2019.
F. de V. G.L. S.C. C.M. FC 5% 1%
Tratamientos 7 38.95870484 5.56552926 21.45** 2.27 7.54
Grupo 1 MS 3 24.40552995 8.13517665 31.35** 2,86 4,37
Grupo 2 B5 3 1.49829585 0.49943195 1.92N.S. 2,86 4,37
Entre grupos 1 13.054487904 13.054487904 50,30** 4,11 3,17
Error Exp. 47 14.01220000 0.25948519
Total 63 52.97090484
Promedio 1,62
C.V. (%) 31,41
** Significativo al 5 y 1% de Probabilidad; N.S. No significativo.
Cuadro 2A. Análisis de la varianza de la variable número de hojas con valores
transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días después de la siembra. Guayaquil,
2019.
F. de V. G.L. S.C. C.M. FC 5% 1%
Tratamientos 7 5.33033077 0.76147582 3.75* 2.27 7.54
Grupo 1 MS 3 4.80312340 1.60104113 7.89** 2,86 4,37
Grupo 2 B5 3 0.23587673 0.07862558 0.39NS. 2,86 4,37
Entre grupos 1 0.29133064 0.29133064 1.44 NS. 4,11 3,17
Error Exp. 47 10.95565794 0.20288255
Total 63 16.28598871
Promedio 1.08
C.V. (%) 41.84
* Significativo al 5% de probabilidad; Significativo al 1% de probabilidad; N.S. No significativo.
53
Cuadro 3A. Análisis de la varianza de la variable color del explante con valores
transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días después de la siembra. Guayaquil,
2019.
F. de V. G.L. S.C. C.M. FC 5% 1%
Tratamientos 7 79.04933375 11.29276196 88.62** 2.27 7.54
Grupo 1 MS 3 31.35852535 10.45284178 82.03** 2,86 4,37
Grupo 2 B5 3 1.97310518 0.65770173 5.16** 2,86 4,37
Entre grupos 1 45.71770322 45.71770322 358.77** 4,11 3,17
Error Exp- 47 6.88110496 0.12742787
Total 63 85.93043871
Promedio 2.73
C.V. (%) 13.07
** Significativo al 5 y 1% de Probabilidad.
Cuadro 4A. Análisis de la varianza de la variable longitud de raíces (cm) con
valores transformados √𝑋 + 0,5 a los 90 días después de la siembra.
Guayaquil, 2019.
F. de V. G.L. S.C. C.M. FC 5% 1%
Tratamientos 7 17.66824642 2.52403520 25.57** 2.27 7.54
Grupo 1 MS 3 11.92331349 3.97443783 40.26** 2,86 4,37
Grupo 2 B5 3 5.00350712 1.66783571 16.89** 2,86 4,37
Entre grupos 1 0.74142581 0.74142581 7.51** 4,11 3,17
Error Exp. 47 5.33072778 0.09871718
Total 63 22.99897419
Promedio 1.39
C.V. (%) 22.59
** Significativo al 5 y 1% de Probabilidad.
54
Figura 1A. Cultivo de vainilla, 2018.
Figura 2A. Siembra de plantas madre de vainilla, 2018.
55
Figura 3A. Obtención de explantes de vainilla, 2018.
Figura 4A. Explantes de vainillas en los tubos de ensayos, 2018.
56
Figura 5A. Explantes de vainillas contaminados, 2019.
Figura 6A. Explante de vainilla en desarrollo, 2019.