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I

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUILUNIDAD DE POSGRADO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO

MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

TESIS PRESENTADA PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICODE MAGÍSTER EN BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUSRESISTENTE A Β-LACTÁMICOS EN QUIRÓFANOS YSALAS DE CUIDADOS INTENSIVOS DEL HOSPITAL

UNIVERSITARIO CATÓLICO DE CUENCA, MEDIANTEPCR

AUTOR: Q.F. CARLOS FERNANDO ANDRADE TACURI

TUTORA: DRA. PAOLA PATRICIA ORELLANA BRAVO MSc.

GUAYAQUIL – ECUADOROCTUBRE-2016

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REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍAFICHA DE REGISTRO DE TESIS

TÍTULO Y SUBTÍTULO:IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A Β-LACTÁMICOS EN QUIRÓFANOS

Y SALAS DE CUIDADOS INTENSIVOS DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO CATÓLICO DE CUENCA,MEDIANTE PCR

AUTOR:Q.F. Carlos Fernando Andrade Tacuri

TUTOR:Dra. Paola Patricia Orellana Bravo Ms. C.

REVISORES:Ing. Sisiana Chávez Chica, Mg.

INSTITUCIÓN:UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD:Unidad de Posgrado, Investigación y Desarrollo

CARRERA:MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

FECHA DE PUBLICACIÓN: No. DE PÁGS:

TÍTULO OBTENIDO:QUÍMICO FARMACEUTA

ÁREAS TEMÁTICAS:Ciencias de la vida, Microbiología, Genética y ciencias afines

PALABRAS CLAVE: Staphylococcus aureus, nuc, blaZ, mecA, SARM, PCR.RESUMEN: Introducción: El rápido avance de la resistencia a los antibióticos y su diseminación,hacen de Staphylococcus aureus un microorganismo sumamente peligroso para el ser humano.Objetivo: Identificar S. aureus portadores de los genes blaZ y mecA, en los quirófanos y salasde cuidados intensivos del Hospital Universitario Católico de Cuenca mediante PCR paraprevenir las infecciones intrahospitalarias. Materiales y métodos: Se replica los procedimientosya publicados para identificación de los genes blaZ, mecA y nuc, con las cepas ATCC de S.aureus 11632 y 43300, y se prueban varios protocolos de PCR hasta encontrar uno queamplifique todos los genes para validar los procedimientos. Se toman 50 muestras enquirófanos y sala de cuidados intensivos del Hospital Docente Universitario Católico a las quese realizan PCR y pruebas bioquímicas. Resultados: Del total de cincuenta muestras, tresresultaron positivas para S. aureus, dos de las cuales fueron resistentes a los β-Lactámicos,según se pudo verificar mediante amplificación de los genes nuc, blaZ y mecA, además delantibiograma. Conclusiones: la PCR es un método sensible y efectivo para identificaciónpreventiva de S. aureus en superficies.No. DE REGISTRO (en base de datos): No. DE CLASIFICACIÓN:

DIRECCIÓN URL (tesis en la web):ADJUNTO PDF: SI NO

CONTACTO CON AUTOR/ES Teléfono:0992910299

E-mail:[email protected]

CONTACTO EN LA INSTITUCIÓN: Nombre:Unidad de Posgrado Investigación y Desarrollo

Teléfono: 2325530-38 Ext. 114E-mail: [email protected]

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VI

DEDICATORIA

La presente tesis dedico a mis hijos Jan Carlos y Carlos Eduardo, que son

mi razón de vivir, el impulso y la fuerza para salir adelante en los desafíos

y dificultades diarias.

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AGRADECIMIENTO

Quiero agradecer en primer lugar a Dios por todas las bendiciones

recibidas, a mis padres por su enorme apoyo, a mi esposa por su

confianza; y a la directora de tesis Dra. Paola Orellana Bravo por su

colaboración invaluable.

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ÌNDICE

REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA.................................................... IICERTIFICADO DEL TUTOR............................................................................................... IIICERTIFICADO DE REDACCIÓN Y ESTILO.......................................................................... IVDECLARACIÓN JURADA DEL AUTOR................................................................................ VDEDICATORIA ................................................................................................................. VIAGRADECIMIENTO ........................................................................................................ VIIÍNDICE .......................................................................................................................... VIII

CAPITULO I

1. Agente Etiológico...................................................................................................... 1

CAPÍTULO II

2. Factores de Virulencia .............................................................................................. 42.1 Proteina A ........................................................................................................ 42.2 Péptidoglucano ................................................................................................ 52.3 Ácido Teicoico .................................................................................................. 52.4 Cápsula............................................................................................................. 62.5 Proteinas de Adherencia.................................................................................. 62.6 Toxinas ............................................................................................................ 7

2.6.1 Toxinas citolíticas.................................................................................... 72.6.2 Toxinas exfoliativas................................................................................ 82.6.3 Enterotoxinas.......................................................................................... 82.6.4 TSST-1 ....................................................................................................... 8

2.7 Enzimas ............................................................................................................ 92.7.1 Coagulasa.................................................................................................. 92.7.2 Catalasa .................................................................................................. 102.7.3 Otras enzimas ......................................................................................... 10

2.8 Quorum-sensing............................................................................................. 10

CAPÍTULO III

3. Resistencia a los antibióticos.................................................................................. 123.1 Mecanismos de resistencia antimicrobiana ................................................... 123.2 Genes involucrados en la resistencia de S. aureus a los β-Lactámicos........... 143.2.1 gen blaZ ....................................................................................................... 153.2.2 Gen mecA .................................................................................................... 16

IX

CAPÍTULO IV

4. Patogénesis............................................................................................................. 214.1 Inicio del proceso infeccioso y desarrollo de signos y síntomas .................... 214.2 Principales patologías causadas por S. aureus ................................................ 22

4.2.1 Infecciones mediadas por las toxinas ..................................................... 224.2.2 Infecciones supurativas (presencia de bacterias) .................................... 24

4.3. Infecciones Intrahospitalarias ........................................................................ 294.4. Factores predisponentes del huésped ........................................................... 31

CAPÍTULO V

5. Diagnóstico de Laboratorio .................................................................................... 325.1 Frotis y tinción .................................................................................................. 325.2 Cultivo............................................................................................................... 34

5.2.1 Agar Baird-Parker...................................................................................... 355.2.2 Agar Manitol Salado.................................................................................. 385.2.3 Agar Estafilococos N° 110 ........................................................................ 405.2.4 Agar Azul de O-Toluidina-DNA o Agar DNAsa........................................... 42

5.3 Pruebas químicas ............................................................................................. 445.3.1 Prueba de la Catalasa................................................................................ 445.3.2 Prueba de la coagulasa ............................................................................. 45

5.4 Sensibilidad a los antimicrobianos ................................................................... 475.5 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) .................................................... 49

CAPÍTULO VI

6. Tratamiento: recomendaciones generales ............................................................ 526.1 Infecciones de Piel y partes blandas .................................................................. 536.2 Osteomielitis aguda, Artritis e infecciones de protésis osteoarticular .............. 556.3 Bacteriemia primaria o asociada a infección del catéter vascular..................... 566.4 Endocarditis ....................................................................................................... 576.5 Neumonía........................................................................................................... 586.6 Infección del sistema nervioso central .............................................................. 59

CAPÍTULO VII

7. Diseño Metodológico ............................................................................................. 607.1 Tipo de Investigación........................................................................................ 607.2 Criterios de inclusión ........................................................................................ 607.3 Criterios de exclusión ....................................................................................... 617.4 Equipos ............................................................................................................. 617.5 Materiales y Reactivos...................................................................................... 61

X

7.6 Criterios de validez y confiabilidad del procedimiento .................................... 627.6.1 Trabajo con cepa ATCC 11632 .................................................................. 637.6.2 Trabajo con cepa ATCC 43300 .................................................................. 657.6.3 Trabajo simultaneo con las dos cepas ATCC............................................. 677.6.4 Otras pruebas............................................................................................ 67

7.7 Análisis del manipulador .................................................................................. 707.8 Procedimiento técnico de campo..................................................................... 71

7.8.1 Toma de muestras .................................................................................... 727.8.2 Extracción de ADN .................................................................................... 757.8.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ............................................. 767.8.4 Electroforesis horizontal ........................................................................... 767.8.5 Flujograma de toma de muestras y extracción de ADN ........................... 777.8.6 Flujograma de PCR .................................................................................... 78

CAPÍTULO VIII

8. RESULTADOS Y CONCLUSIONES ............................................................................. 798.1 Resultados del Diseño Metodológico............................................................... 798.2 Resultados de la centrifugación ....................................................................... 818.3 Resultados de siembra en agar Manitol Salado ............................................... 828.4 Resultados de antibiograma y pruebas bioquímicas........................................ 838.5 Resultados de la electroforesis horizontal ....................................................... 848.6 Conclusiones..................................................................................................... 88

BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................................... 90ANEXOS ............................................................................................................................. 94

ÍNDICE FIGURAS.............................................................................................................. XFig. 1: Factores de virulencia de Staphylococcus aureus. ...................................... 4Fig. 2: síntesis de β-lactamasa estafilocócica....................................................... 16Fig. 3: Esquema de Cassette SCCmec tipo III ....................................................... 18Fig. 4: Diagrama esquemático de resistencia a la meticilina de S. aureus........... 18Fig. 5: Síndrome de Piel Escaldada....................................................................... 23Fig. 6: Síndrome de Shock Tóxico......................................................................... 24Fig. 7: Impetigo bulloso y no bulloso ................................................................... 25Fig. 8: Foliculitis y Forunculosis ........................................................................... 26Fig. 9: Conjuntivitis............................................................................................... 27Fig. 10: Celulitis infecciosa ................................................................................... 28Fig. 11: Diferencias estructurales entre bacterias Gram positivas y negativas ... 32Fig. 12: Cocos gram positivos y Gram negativos.................................................. 33Fig. 13: S. aureus en agar manitol salado............................................................. 40Fig. 14: S. aureus en Agar DNAsa ......................................................................... 44Fig. 15: Protocolo de PCR para amplificar el gen blaZ ......................................... 65

XI

Fig. 16: Protocolo de PCR para amplificar el gen mecA....................................... 66Fig. 17: DNAsa con cepas ATCC ........................................................................... 68Fig. 18: Antibiograma cepa ATTC 11632 .............................................................. 68Fig. 19: Antibiograma cepa ATTC 43300 .............................................................. 68Fig. 20: Siembra en manitol cepas ATCC 11632 y 43300 ..................................... 69Fig. 21: Prueba de la catalasa cepas ATCC 11632 y 43300 .................................. 69Fig. 22: Prueba de la coagulasa cepas ATCC 11632 y 43300................................ 69Fig. 23: Manipulador: siembra en manitol .......................................................... 70Fig. 24: Antibiograma del manipulador ............................................................... 70Fig. 25: Pruebas de la coagulasa y catalasa del manipulador .............................. 71Fig. 26: Staphylococcus aureus cepa ATCC 11632 en agar sangre....................... 79Fig. 27: Resultado de electroforesis con el amplicón del gen blaZ ...................... 79Fig. 28: Staphylococcus aureus cepa ATCC 43300 en agar sangre....................... 80Fig. 29: Resultado de electroforesis con el amplicón del gen mecA.................... 80Fig. 30: Electroforesis con el amplicones de los genes blaZ y mecA.................... 80Fig. 31: Electroforesis de controles positivos y negativos con cepas ATCC ......... 81Fig. 32: Tubos Eppendorf con pellet resultado de centrifugación de muestras .. 81Fig. 33: Resultados de siembra en agar Manitol Salado (24H00) ........................ 82Fig. 34: Resultados de siembra en agar Manitol Salado (48H00) ........................ 83Fig. 35: Antibiograma de muestras 2, 31 y 39 (positivas para S. aureus) ............ 83Fig. 36: Superficies que dieron positivo para S. aureus. ...................................... 84Fig. 37: Electroforesis de identificacion del gen nuc en muestras....................... 85Fig. 38 Electroforesis de amplicones de gen blaZ y mecA en muestras .............. 85

ÍNDICE CUADROS........................................................................................................... XICuadro 1: Factores de virulencia de Staphylococcus aureus ............................... 11Cuadro 2: Principales antibióticos a los que S. aureus es resistente ................... 13Cuadro 3: Mecanismos de resistencia identificados en S. aureus ....................... 20Cuadro 4: Infecciones nosocomiales en tres hospitales ...................................... 30Cuadro 5: Distribución de las infecciones intrahospitalarias por S. aureus......... 31Cuadro 6: Volúmenes de trabajo para la amplificación inicial del gen blaZ ........ 64Cuadro 7: Volúmenes utilizados para la amplificación inicial del gen mecA....... 66Cuadro 8: Comparación de resultados entre PCR y microbiología...................... 87

ÍNDICE GRÁFICOS .......................................................................................................... XIGráfico 1: Muestras positivas y negativas para S. aureus ................................... 86Gráfico 2: Identificación de genes blaZ y mecA................................................... 88

RESUMEN..................................................................................................................... XIIIABSTRACT..................................................................................................................... XIVINTRODUCCIÓN............................................................................................................. XVHIPÓTESIS..................................................................................................................... XVIOBJETIVOS................................................................................................................... XVII

XII

Objetivo general.................................................................................................. XVIObjetivos específicos .......................................................................................... XVI

METODOLOGÍA ........................................................................................................... XVII

XIII

RESUMEN

Introducción: El rápido avance de la resistencia a los antibióticos y sudiseminación, hacen de Staphylococcus aureus un microorganismosumamente peligroso para el ser humano. Objetivo: Identificar S. aureusportadores de los genes blaZ y mecA, en los quirófanos y salas decuidados intensivos del Hospital Universitario Católico de Cuencamediante PCR para prevenir las infecciones intrahospitalarias. Materialesy métodos: Se replica los procedimientos ya publicados paraidentificación de los genes blaZ, mecA y nuc, con las cepas ATCC de S.aureus 11632 y 43300, y se prueban varios protocolos de PCR hastaencontrar uno que amplifique todos los genes para validar losprocedimientos. Se toman 50 muestras en quirófanos y sala de cuidadosintensivos del Hospital Docente Universitario Católico a las que serealizan PCR y pruebas bioquímicas. Resultados: Del total de cincuentamuestras, tres resultaron positivas para S. aureus, dos de las cualesfueron resistentes a los β-Lactámicos, según se pudo verificar medianteamplificación de los genes nuc, blaZ y mecA, además del antibiograma.Conclusiones: la PCR es un método sensible y efectivo paraidentificación preventiva de S. aureus en superficies.

PALABRAS CLAVE: Staphylococcus aureus, nuc, blaZ, mecA, SARM,PCR.

XIV

ABSTRACT

Introduction: The quick advance of antibiotic resistance anddissemination, make of Staphylococcus aureus an extremely dangerousmicroorganism for humans. Objective: Identify S. aureus for blaZ andmecA carrier, in operating rooms and intensive care wards of the CatholicUniversity Hospital from Cuenca by PCR to prevent nosocomial infections.Materials and methods: already published procedures was replicated foridentify Blaz, mecA and nuc genes, with S. aureus ATCC strains 11632and 43300 was replicated, and several PCR protocols are tested to findone that amplify all genes to validate the procedures. 50 samples fromoperating rooms and intensive care unit of the Catholic UniversityTeaching Hospital were taken, to which biochemical tests and PCR areperformed. Results: Of the total of fifty samples, three were positive for S.aureus, two of which were resistant to β-lactams, as was verified byamplification of nuc, blaZ and mecA genes, furthermore antimicrobialsusceptibility. Conclusions: PCR is a sensitive and effective method forpreventive identification of S. aureus on surfaces.

KEYWORDS: Staphylococcus aureus, nuc, blaz, mecA, SARM, PCR.

XV

INTRODUCCIÓN

Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo, anaerobio facultativo,productor de coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulado. Las cepasmás comunes de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilinapues tienen la capacidad de generar una penicilinasa que rompe en anillobetalactámico y las inactiva.

S. aureus es uno de los patógenos más prevalentes y clínicamentesignificativo en todo el mundo, causando una variedad de enfermedadesque van desde erupciones cutáneas superficiales benignas a lasinfecciones que amenazan la vida como bacteriemia, endocarditis,neumonía y síndrome de shock tóxico. (Jimei Du, 2011).

Desde que S. aureus resistente a la Meticilina (MRSA) fue identificado porprimera vez en 1961, se ha convertido en la causa más común deinfecciones intrahospitalarias y comunitarias en todo el mundo(Deresinski, 2005).

Según el estudio realizado en España (Francisco Álvarez Lerma, 2006)Staphylococcus aureus es uno de los principales microorganismoscausantes de infecciones adquiridas en los servicios o unidades decuidados intensivos (UCI), ya que forma parte de la flora endógenaprimaria de los pacientes hospitalizados y es causante de infeccionesintrahospitalarias precoces. Su protagonismo se ha visto incrementado enlas últimas décadas con el desarrollo de cepas resistentes a la Meticilina(SARM), que forman parte del ecosistema de muchos hospitales, dondepermanece en pacientes crónicos formando parte de su flora endógenasecundaria. Recientemente se ha podido comprobar un incremento de lacolonización o infecciones por SARM en pacientes procedentes deinstituciones cerradas, como asilos, geriátricos o centros de cuidadospaliativos.

Según la OMS (Salud, 2003) las bacterias Gram positivas: comoStaphylococcus aureus causan una gran variedad de infeccionespulmonares, óseas, cardíacas y sanguíneas y a menudo son resistentes alos antibióticos, principalmente las penicilinas.

El desarrollo de un método económico y específico para la detección deéste patógeno en sus diferentes áreas de atención, es de gran ayuda parael Hospital Universitario Católico en su lucha contra las infeccionesintrahospitalarias, especialmente por Staphylococcus aureus productor deβ-Lactamasas.

XVI

HIPÓTESIS

Mediante PCR podemos detectar en Staphylococcus aureus el gen blaZ ymecA que codifican para betalactamasas y PBP2a (Penicillin BindingProtein 2a) respectivamente, y crear un sistema molecular de controlpredictivo que podría ser usado en quirófanos y salas de cuidadosintensivos del Hospital Universitario Católico de Cuenca.

XVII

OBJETIVOS

Objetivo General

Identificar Staphylococcus aureus portadores de los genes blaZ y mecA,en los quirófanos y salas de cuidados intensivos del Hospital UniversitarioCatólico de Cuenca mediante PCR para evitar las infeccionesintrahospitalarias.

Objetivos Específicos

1.- Implementar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa para ladetección de los genes blaZ y mecA en S. aureus productores de βLactamasas y PBP2a.

2.- Identificar Staphylococcus aureus productores de β-Lactamasas yPBP2a en los quirófanos y salas de cuidados intensivos del HospitalUniversitario Católico de Cuenca mediante PCR.

3.- Establecer el área más afectada por la presencia de Staphylococcusaureus productores de β-Lactamasas y PBP2a en quirófanos y sala decuidados intensivos del Hospital Universitario Católico de Cuenca.

XVIII

METODOLOGÍA

La investigación que se desarrolló fue de tipo analítico descriptivo yexperimental de laboratorio.

XIX

MARCO TEÓRICO

Staphylococcus aureus resistentes a β-lactámicos.

- 1 -

CAPÍTULO I

AGENTE ETIOLÓGICO

Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, anaerobios

facultativos, su diámetro oscila entre 0.5 a 1.5 µm. Son bacterias

inmóviles, no esporulados, sin cápsula (aunque algunas cepas pueden

desarrollar una delicada cápsula de limo), se los encuentra dispuestos

como: células únicas, en pares, tétradas o formando racimos irregulares y

a diferencia de los otros integrantes del género son Coagulasa positivos.

(Geo. F. Brooks, 2011) (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).

S. aureus es un patógeno oportunista, que se lo puede encontrar

frecuentemente colonizando la piel y mucosas del ser humano en forma

asintomática, formando parte de su microflora normal. Cuando se torna

patógeno suele producir infecciones importantes mediante su capacidad

para generar hemólisis, coagular el plasma, y producir diversas toxinas y

enzimas que son parte de su arsenal toxigénico. Actualmente esta

bacteria es una de las principales causas de infecciones en la comunidad

y adquiridas a nivel hospitalario en donde es un residente habitual. En

pacientes hospitalizados puede ocasionar muchas afecciones como

meningitis, bacteriemias y neumonías entre otras, pues el sistema

inmunológico de éstos generalmente está deprimido. Los factores

considerados más importantes para la diseminación de S. aureus en los

centros hospitalarios tienen que ver con la adaptabilidad bacteriana a

diferentes ambientes, la aglomeración de pacientes en espacios físicos

reducidos, el hecho de no cumplir con las normas básicas de asepsia,

- 2 -

pero principalmente con el hecho de no identificar tempranamente a los

portadores del patógeno y proceder a su aislamiento y tratamiento

inmediato. S. aureus posee una gran facilidad para generar resistencia

bacteriana como un efecto directo de su adaptabilidad y del

incumplimiento de tratamiento, ya sea en relación a las dosis o los

tiempos establecidos para cada antibiótico. (Estrella Cervantes-García R.

G.-G.-S., 2014) (Sandra Rincon, 2012) (IOWA STATE UNIVERSITY,

2011) (Castañón-Sánchez, 2012) (Geo. F. Brooks, 2011) (Francisco

Álvarez Lerma, 2006).

La resistencia generada por S. aureus a las penicilinas como penicilina G,

ampicilina, carboxipenicilinas y otras afines; está mediada por la

presencia del gen blaZ que codifica para una enzima llamada β-

lactamasa, la cual destruye el anillo β-lactámico de estos antibióticos

mediante hidrólisis, dejándolos sin actividad antibacteriana. Se conocen

cuatro variantes de estas β-lactamasas, para las variantes de A, C y D el

gen blaZ se localiza típicamente en los plásmidos mientras que para el

tipo B usualmente se encuentra incorporado en el cromosoma bacteriano

como parte de una sección transponible (transposón 552 o Tn552). Un

segundo gen que codifica resistencia para β-Lactámicos es el gen mecA

que se localiza en una zona móvil llamada cassett cromosómico mec o

SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec), este gen codifica

para la proteína PBP2a que tiene una afinidad disminuida por los

antibióticos como: meticilina, nafcilina, y oxacilina, por lo que a las cepas

que presentan esta característica se les conoce como MRSA (Methicillin-

resistant Staphylococcus aureus) (DEBORAH J. ZYGMUNT, 1992) (John

Elmerdahl Olsen, 2006) (Patrick R. Murray, 2014).

Se conocen siete variantes de SCCmec (I a VII) de los cuales I, IV, V y VII

generan resistencia solo para los β-lactámicos, mientras que las otras

variedades, traen incluidos además otros elementos genéticos que

- 3 -

codifican proteínas de resistencia para antibióticos como aminoglucósidos

y tetraciclinas. (Estrella Cervantes-García, 2014).

En condiciones ambientales regulares esta bacteria puede sobrevivir por

mucho tiempo. “En el medio ambiente puede encontrarse S. aureus

durante un máximo de 42 días en carcasas y órganos; y de 60 días en

productos cárnicos. Permanece viable durante 46 horas en vidrio, 17

horas bajo luz solar y menos de 7 días en pisos. Las enterotoxinas de S.

aureus son estables a temperatura de ebullición.” (IOWA STATE

UNIVERSITY, 2011).

S. aureus y MRSA pueden ser eliminados de las superficies e

instrumentales mediante desinfectantes como: hipoclorito de sodio,

alcoholes, compuestos de amoníaco cuaternario, fenoles, formaldehído y

una combinación de yodo y alcohol; o mediante autoclave (121 °C durante

un mínimo de 15 minutos) o en estufa (160-170 °C durante al menos 1

hora). (IOWA STATE UNIVERSITY, 2011).

Staphylococcus aureus produce una nucleasa termoestable de 17.000 Kd

que es una endonucleasa que degrada ADN y ARN, y está codificada por

el gen nuc, el cual es utilizado para la identificación de este patógeno.

(ODD G. BRAKSTAD, 1992).

- 4 -

CAPÍTULO II

FACTORES DE VIRULENCIA

Fig.1. Factores de virulencia de Staphylococcus aureus. (EstrellaCervantes-García R. G.-G.-S., 2014).

2.1 Proteína A (Staphylococcus aureus protein A: Spa).

La Proteína A de S. aureus es una proteína componente de la pared

celular que se ha clasificado en el grupo de adhesinas denominadas

componentes de superficie microbianas que reconocen las moléculas de

matriz adhesiva (MSCRAMMS, microbial surface components recognizing

adhesive matrix molecules), ésta ayuda a la bacteria a alterar la función

- 5 -

ciliar del hospedero, estimular respuesta inflamatoria, mediar en el daño

tisular con producción de radicales tóxicos de oxígeno, pero su función

principal es evadir la respuesta inmune del organismo huésped, mediante

su capacidad para fijarse al extremo Fc de las inmunoglobulinas: IgG1,

IgG2 e IgG4, evitando de esta manera la opsonización (al no entrar en

contacto con el extremo Fab) y por ende la fagocitosis. (Patrick R. Murray,

2014) (Geo. F. Brooks, 2011) (Castañón-Sánchez, 2012) (Estrella

Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014) (Antonina A Votintseva, 2014).

2.2 Péptidoglucano.

El péptidoglucano es el componente más abundante de la pared, en las

bacterias Gram positivas representa aproximadamente el 50% de su peso

y cumple algunas funciones como: brindar estabilidad estructural y

osmótica, activa el complemento y atrae químicamente a los leucocitos

polimorfonucleares. La construcción de la pared de péptidoglucano está

catalizada por unas enzimas llamadas “Proteínas Ligadoras de Penicilina”

que son las moléculas blanco de los antibióticos β-lactámicos. (Geo. F.

Brooks, 2011) (Patrick R. Murray, 2014) (Guadalupe Zendejas-Manzo,

2014) (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).

2.3 Ácido Teicoico.

Es un polímero de ribitol fosfato con sustituyentes D-alanina y N-acetil

glucosamina, es característico de los Staphylococcus, se lo puede

encontrar en la pared celular y ligados a los lípidos de la membrana

citoplasmática. Su función es mediar la unión de Estafilococos a las

superficies de las mucosas mediante uniones específicas a la

- 6 -

fibronectina, tiene poco poder inmunogénico, pero es capaz de activar los

mecanismos de la inflamación y desencadenar una respuesta humoral

específica. (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014) (Geo. F. Brooks,

2011) (Patrick R. Murray, 2014).

2.4 Cápsula.

Algunas cepas de S. aureus (se han identificado 11) poseen una cápsula

que les sirve principalmente para no ser reconocidos por el sistema

inmunológico del hospedero y evitar la fagocitosis. Además muchas cepas

poseen una delgada capa extracelular de limo constituida básicamente

por monosacáridos, proteínas y pequeños péptidos la cual colabora en la

adhesión de la bacteria a tejidos del hospedero y cuerpos extraños,

además de cubrir los antígenos bacterianos y constituirse en otro

mecanismo de inhibición de la fagocitosis. (Geo. F. Brooks, 2011) (Patrick

R. Murray, 2014) (Castañón-Sánchez, 2012).

2.5 Proteínas de adherencia.

Las MSCRAMMS (microbial surface components recognizing adhesive

matrix molecules) son un grupo de proteínas de superficie, que facilitan la

adherencia de S. aureus a los tejidos del hospedero cuando se ha perdido

la continuidad del tejido epitelial y se inicia la colonización.

Entre las principales adhesinas tenemos:

Las proteínas A y B de unión a fibronectina (FnbpA y FnbpB).

La proteína de adhesión al colágeno de la matriz extracelular (proteína

Cna).

- 7 -

Las proteínas de adhesión al fibrinógeno, conocidas también como factor

aglutinante A y B (ClfA y ClfB).

Además, tenemos proteínas de unión a elastina, osteopontina,

sialoproteína ósea, y una adhesina de amplia especificidad (complejo

mayor de histocompatibilidad análogo de proteína de clase II). S. aureus

tiene también gran facilidad para adherirse a superficies de catéteres y

prótesis para luego formar biofilms que protegen a la bacteria de los

antibióticos y de la acción inmunológica del huésped. (Michael C. Hudson,

1999) (Castañón-Sánchez, 2012) (Geo. F. Brooks, 2011) (Patrick R.

Murray, 2014) (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).

2.6 Toxinas

S. aureus tiene una importante producción de toxinas exógenas, entre las

cuales encontramos toxinas citolíticas, toxinas exfoliativas, enterotoxinas

y toxina-1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1).

2.6.1 Toxinas citolíticas. Las toxinas citolíticas conocidas como

hemolisinas (α, β, δ, γ, y la Leucocidina de Panton-Valentine), al

integrarse a las regiones hidrofóbicas de la membrana celular del

hospedero abren poros β-barril de alrededor de 2nm de diámetro los

cuales ocasionan perdida de la estabilidad osmótica de una gran variedad

de células del hospedero, como leucocitos, eritrocitos, macrófagos,

plaquetas, fibroblastos, y hepatocitos entre otras, las cuales se

descompensan y lisan. Las enzimas lisosomales liberadas en la

destrucción de los neutrófilos provocan el daño tisular en los tejidos

circundantes. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Geo. F. Brooks, 2011)

(Patrick R. Murray, 2014) (Castañón-Sánchez, 2012).

- 8 -

2.6.2 Toxinas exfoliativas. Las toxinas epidermolíticas o exfoliativas son

dos, Toxina Exfoliativa A (ETA) y Toxina Exfoliativa B (ETB), son unas

proteasas de serina que lisan las uniones intercelulares al romper la

desmogleína 1, que es un miembro de la familia de las estructuras de

adhesión celular (desmosomas) y disuelven la matriz de mucopolisacárido

del estrato granuloso de la epidermis, merced a lo cual generan su efecto

descamativo. A pesar de tener pesos similares, mientras ETA está

codificada por un gen cromosómico y es termoestable (20 minutos a

100oC), ETB tiene su origen en un plásmido y es termolábil. (Guadalupe

Zendejas-Manzo, 2014) (Geo. F. Brooks, 2011) (Patrick R. Murray, 2014).

2.6.3 Enterotoxinas. Se han identificado 18 enterotoxinas (A-E, G-R y

U, V), las cuales causan diarrea, son termoestables (hasta 30 minutos a

100°C) y resisten la hidrólisis de las enzimas digestivas, por lo que su

efectividad no se ve afectada durante su tránsito por el aparato digestivo.

Un 30 a 50% de cepas de S. aureus son productoras de una o más de

estas potentes toxinas y a pesar de no conocerse claramente su

mecanismo de acción, se sabe que estas toxinas son superantígenos

cuya función principal es debilitar el sistema inmune del hospedero para la

progresión de la enfermedad. La ingestión de apenas 25 μg de

enterotoxina B es suficiente para producir vómitos y diarrea. Las toxinas

exfoliativas, TSST-1 y los genes de las enterotoxinas se encuentran en un

elemento cromosómico denominado Isla de Patogenicidad. (Castañón-

Sánchez, 2012) (Geo. F. Brooks, 2011) (Patrick R. Murray, 2014)

(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).

2.6.4 TSST-1. La TSST-1 (toxic shock syndrome toxin-1) o enterotoxina

F, es una exotoxina termoestable y resistente a la proteólisis, codificada

por el gen tstH que se localiza en un elemento genético móvil y se la

puede encontrar en casi el 20 % de las cepas de S. aureus. Es un

superantígeno, se une a moléculas MHC clase II, suprime la quimiotaxis

de neutrófilos, bloquea el sistema reticuloendotelial, estimula la función

- 9 -

supresora de los linfocitos T y la liberación de citocinas, produciendo la

extravasación o destrucción de las células endoteliales.

La sintomatología típica del síndrome del shock tóxico incluye: malestar

general, fiebre alta, dolor de cabeza, vómito, diarrea, presión sanguínea

baja, mialgias y rash eritematoso. Los pacientes pueden presentar

también dificultad respiratoria, coagulación intravascular, meningitis,

faringitis, conjuntivitis, vaginitis, edema, artralgia, irritabilidad. Si la

condición no se ha revertido, al final suelen presentarse convulsiones,

falla de varios órganos a causa de un shock hipovolémico y la muerte del

paciente. (Jaime A. Bustos-Martínez, 2006) (Ana C. Blanco, 2005) (Geo.

F. Brooks, 2011) (Patrick R. Murray, 2014) (Guadalupe Zendejas-Manzo,

2014).

2.7 Enzimas

Entre las enzimas más importantes con las que cuenta S. aureus

podemos enumerar:

2.7.1 Coagulasa. Produce coagulación del plasma y forma una capa de

fibrina que rodea el absceso estafilocócico, con lo que evita la fagocitosis

de la bacteria y facilita el desarrollo de sepsis. Es un importante factor de

virulencia que a menudo es usado como marcador para diferenciar a las

cepas positivas de las negativas. Se conoce dos tipos de coagulasa, la

coagulasa libre y la coagulasa ligada o cumpling factor. La coagulasa

ligada no requiere de los factores plasmáticos para convertir el fibrinógeno

en fibrina, mientras que la coagulasa libre requiere de una globulina

conocida como factor de reacción con la coagulasa. (Geo. F. Brooks,

2011) (Patrick R. Murray, 2014) (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S.,

2014).

- 10 -

2.7.2 Catalasa. Cuando los macrófagos fagocitan a Staphylococcus

aureus lo destruyen con el peróxido de hidrogeno, pero la bacteria se

defiende mediante la producción de la enzima catalasa que convierte el

peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno protegiéndola de la fagocitosis.

La prueba de catalasa diferencia a los Estafilococos en positivos y

negativos. (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014) (Geo. F. Brooks,

2011).

2.7.3 Otras enzimas. Los miembros del género Staphylococcus en

general producen varias enzimas que hidrolizan la matriz extracelular de

los hospedadores para facilitar la diseminación del agente infeccioso. La

hialuronidasa por ejemplo hidroliza el ácido hialurónico del tejido

conjuntivo, la fibrinolisina disuelve coágulos de fibrina, las lipasas

hidrolizan los lípidos y la nucleasa termoestable es la encargada de

hidrolizar el ADN. Estas enzimas tienen como objetivo principal facilitar la

diseminación de la bacteria en el nuevo huésped. Actualmente además

casi todas las cepas de Staphylococcus aureus son productores de la

penicilinasa, una β-Lactamasas con actividad hidrolítica capaz de

hidrolizar los anillos β-Lactámicos de las penicilinas. (Geo. F. Brooks,

2011) (Patrick R. Murray, 2014) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014)

(Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).

2.8 Quorum-sensing (QS).

S. aureus tiene la capacidad de comportarse de diferentes maneras de

acuerdo a las condiciones de su entorno y su densidad poblacional, de

esta manera reconoce el momento adecuado para activar algunos

procesos como la liberación de los factores de virulencia, formación de

biopelículas, etc, a este sistema en S. aureus se le conoce como Quorum-

sensing (QS) o agr (gene accesorio regulador). Este gen agr “utiliza una

- 11 -

péptido feromona (péptido autoinductor AIP) cuando la concentración de

inicio es alcanzada a cierta densidad celular uniéndose a la membrana

donde se localiza una cinasa de histidina (AgrC), la cual activa una

proteína reguladora AgrA involucrada en la transcripción del operón Agr”

(Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).

Todos estos factores de virulencia están codificados por sus respectivos

genes como se muestra en el cuadro a continuación:

Cuadro 1. Factores de virulencia de Staphylococcus aureus. (Estrella

Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).

- 12 -

CAPÍTULO III

RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS

Hasta hace poco tiempo, todas las bacterias, incluido S. aureus eran

susceptibles a gran cantidad de antibióticos diferentes; sin embargo,

aparentemente la incorrecta utilización de estos fármacos ha llevado a

que la resistencia a ellos esté en aumento, y aparezcan cepas poco

sensibles o resistentes a la mayoría de estos fármacos, como se muestra

en el cuadro 2.

3.1 Mecanismos de resistencia antimicrobiana.

Los principales mecanismos de resistencia a antibióticos utilizados por las

bacterias se pueden resumir en:

a. La inactivación enzimática del antibiótico como en el caso de la

resistencia a los β-lactámicos mediante las β-lactamasas y a los

aminoglucócidos mediada por las acetiltransferasas, adeniltransferasas o

la alteración ribosomal de las fosfotransferasas.

b. La alteración de la molécula diana, esto permite que la afinidad por el

antibiótico disminuya como es en el caso de la resistencia a la meticilina

mediante la producción de la proteína PBP2a.

c. El atrapamiento del antibiótico como en el caso de la vancomicina en la

cual la resistencia está mediada por un engrosamiento de la pared, lo que

afecta la llegada del antibiótico al blanco en la membrana plasmática.

- 13 -

d. Las bombas de excreción o sistemas efflux que eliminan los fármacos

antes que lleguen a su blanco intracelular.

Cuadro 2: Principales antibióticos a los que se ha encontrado resistenciaen cepas de S. aureus (Jaime A. Bustos-Martínez, 2006).

- 14 -

Todos estos mecanismos que no son únicamente de S. aureus se

adquieren mediante diferentes vías como: transferencia horizontal de

genes, integración cromosómica de elementos transponibles, a través de

mutaciones espontáneas y/o selección positiva entre otras, que están

regulados por varios grupos de genes como el operón bla, SCCmec, etc.

(Velázquez-Meza, 2005) (Gerardo Becerra, 2009) (Carlos Andrés

Rodríguez, 2005 ).

La resistencia bacteriana a los antibióticos se inicia con la inclusión de un

gen en el ADN bacteriano, el que produce una proteína con actividad

específica contra cierto grupo de antibióticos, la mayoría de ellas son

enzimas especializadas en modificar el núcleo funcional del antibiótico

para inactivarlo, mientras que otras modifican el blanco de los antibióticos

dentro de la bacteria. (Velázquez-Meza, 2005) (Gerardo Becerra, 2009)

(Carlos Andrés Rodríguez, 2005 ).

3.2 Genes involucrados en la resistencia de S. aureus a los β-Lactámicos.

En S. aureus se han descrito dos genes centrales en la resistencia a este

tipo de antibioticos, el gen blaZ que codifica para unas enzimas llamadas

β-lactamasas que hidrolizan el anillo β-Lactámicos de la penicilina, y; el

gen mecA que codifica para PBP2a, una variante de las PBPs originales,

pero que es proteína de muy baja afinidad por la Meticilina y todos los β-

Lactámicos. Cada uno de estos genes tiene genes reguladores que están

muy cercanos, formando arreglos como el SCCmec (Staphylococcal

Cassette Chromosome mec) para el gen mecA y el operon bla para el

caso del gen blaZ. (GIL, 2000) (John Elmerdahl Olsen, 2006).

- 15 -

3.2.1 Gen blaZ. En S. aureus resistente a las penicilinas, se generan las

enzimas β-Lactamasas que destruyen el anillo β-Lactámicos de dichos

antibióticos. Se conocen 4 tipos de estas enzimas (A, B, C y D) que están

codificadas por el gen blaZ que puede ubicarse tanto en un plásmido, y en

el cromosoma como parte del elemento transponible. “Para los tipos A, C

y D usualmente se ubican en plásmidos, mientras que el tipo B

normalmente reside en el cromosoma”. (John Elmerdahl Olsen, 2006).

En el Operón β-lactamasa de Staphylococcus aureus, el gen blaZ como

puede observarse en la figura 2, forma un arreglo con los genes

reguladores: blaR1 que produce la proteína BlaR1 (un sensor-transductor)

que va a localizarse en la membrana de la bacteria y el gen blaI que

produce la proteína BlaI (un represor de la transcripción) se ubica en la

zona promotora de estos genes. (Simon R. Clarke, 2001).

La producción de β-Lactamasa en ausencia de penicilina se mantiene en

niveles bajos por la presencia de la proteína BlaI unida al ADN en la

región promotora, pero cuando la proteína BlaR1 detecta la presencia de

este antibiótico, sufre autoclivaje y por si sola o mediante la proteína

BlaR2 cliva a BlaI, desencadenando la transcripción a gran escala del

ARNm que se traducirá en β-lactamasa que inactivará a la penicilina.

Cuando se ha producido β-Lactamasas en exceso, S. aureus puede

volverse resistente incluso a la Oxacilina aún en ausencia del gen mecA,

y a estos microorganismos se los conoce como cepas con resistencia

borderline (Bordeline resistant Staphylococcus aureus-BORSA). “Las

cepas hiperproductoras de β–Lactamasas poseen un plásmido común de

β-lactamasa de 17,2 kb que codifica a la β-lactamasa estafilocócica del

tipo A”. (Castellano González Maribel, 2010).

El transposón Tn552, transporta la codificación para la β-lactamasa

estafilocócica además de los genes reguladores de la transcripción y

genes necesarios para su transposición a los diferentes elementos

- 16 -

genéticos como el plásmido estafilocócico p19789, que contiene un

derivado del sistema de resolución de Tn552 ('resR-binR') que actúa

como un "hotspot" para la transposición de Tn552. La inserción del

transposón crea segmentos de ADN flanqueado por sitios de resolución

repetidas inversamente, una (resR) en pI9789 y el otro (resL) en Tn552

que se delimitan por los dinucleótidos terminales 5'TG......CA 3’. La

translocación parecería ser replicativa ya que los genes b-lactamasa no

se pierdan en el cromosoma. La región β-lactamasa del plásmido p1524,

que comprende el gen estructural de la β-lactamasa (blaZ), genes para el

control de, la producción lactamasa (blaI, blaRI) y un segmento de forma

reversiblemente invertible de ADN, es idéntico al 'Tn552'. (S.J.Rowland,

1989).

Fig.2. Introducción a la síntesis de β-lactamasa estafilocócica en

presencia de penicilina (Castellano González Maribel, 2010).

3.2.2 Gen mecA. Este gen codifica para una variante de PBP, la proteína

PBP2a (Penicillin Binding Protein 2a), de 78KDa, de muy baja afinidad a

la penicilina y a todos los β-lactámicos, incluidas las penicilinas sintéticas,

- 17 -

por lo que la presencia de este gen brinda resistencia a todo este grupo

de antibióticos, a estos microorganismos se los conoce como resistentes

a la Meticilina. La proteína PBP2a no se encuentra en las cepas sensibles

a la Meticilina. (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014) (IOWA

STATE UNIVERSITY, 2011) (Foster, 2004) (Velázquez-Meza, 2005).

“El gen mecA se caracteriza por tener una longitud de 2.1 kb, localizado

en un elemento genético móvil, llamado cassette cromosomal

estafilococal (SCCmec). Hasta el momento se conocen siete tipos de

SCCmec (tipo I a VII), reconocidos por su tamaño que va de 20.9 a

66.9kb.” (Estrella Cervantes-García, 2014).

Se conocen varios tipos de SCCme (I-XI) muy móviles, pero algo lentos,

pues la aparición de PBP2a se demora varias horas, mientras que las β-

lactamasas aparecen en apenas minutos luego del contacto de la

penicilina con la bacteria. (José Mensa, 2013).

“El SCCmec tipo I de 34.3 kb, tipo IV de 20.9-24.3kb, el tipo V de 28 kb, y

el tipo VII de 35.9 kb propician resistencia sólo a los antibióticos β-

lactámicos, mientras que el SCCmec tipo II de 53 de kb y el tipo III de

66.9 kb causan resistencia a múltiples antibióticos debido a la integración

adicional de genes en SCCmec; ejemplo de esto son los plásmidos

pUB110 que lleva el gen ant4’ que codifica la resistencia a varios

aminoglucósidos como kanamicina, tobramicina y bleomicina”. (Estrella

Cervantes-García, 2014).

“El elemento SCCmec contiene varias secuencias de inserción como

IS431 e ISI272, así como genes responsables de la regulación y

transcripción del gen mecA. Los genes que codifican el cassette

cromosomal son recombinasas ccr tipo invertasas localizadas en el

elemento SCCmec. Estos genes son designados como ccrA1 y ccrB1 en

el tipo I de SCCmec, ccrA2 y ccrB2 en el SCCmec tipo II y tipo IV, ccrA3 y

- 18 -

ccrB3 en el SCCmec tipo III, ccrA4 y ccrB4 en SCCmec tipo IV de MRSA

cepa HDE288, y ccrC en SCCmec tipo V. La región del borde de mec y el

complejo ccr son denominados como regiones J (junkyard)” (Estrella

Cervantes-García, 2014).

Fig. 3 Esquema de Cassette SCCmec tipo III presente en hospitales.(Estrella Cervantes-García, 2014)

Fig.4. Diagrama esquemático que ilustra cómo S. aureus adquiereresistencia a la meticilina y su capacidad para expresar diferentes factoresde virulencia. (Foster, 2004).

- 19 -

“Todos los elementos SCCmec están divididos en tres regiones. La región

J1 del cromosoma derecho de la unión a los genes ccr, la región J2 que

va desde los genes ccr al complejo mec, la región J3 está localizada entre

el complejo mec y la extrema izquierda del elemento SCCmec. Se

descubrió que S. aureus presenta variantes SCCmec tipo I y tipo IV los

cuales difieren en las regiones J” (Estrella Cervantes-García, 2014).

La transcripción de blaZ y mecA es reprimida, respectivamente por los

represores BlaI y MecI, pero además BlaI y MecI pueden reprimir

intercambiablemente la transcripción de cualquiera de los dos genes

diana. (Martin K. Safo, 2005).

Los elementos reguladores y el gen mecA constituyen el denominado

complejo mec.

El sistema de regulación de la expresión del gen mecA es muy similar al

sistema de regulación de la expresión del gen blaZ, el sistema de

señalización incluye un gen mecI represor de la transcripción que codifica

para la proteína MecI que al encontrarse unida al ADN mantiene la

transcripción del gen mecA en limites muy bajos. (José Mensa, 2013).

El gen mecR1 codifica una proteína transmembrana denominada MecR1

la cual tiene dos dominios, uno extracelular y otro citoplasmático, esta

proteína actúa como sensor que reconoce la presencia del β-lactámico en

el medio mediante su dominio extracelular y cliva su dominio

citoplasmático, para mediante éste generar proteólisis en la proteína

represora MecI y de esta manera, al desaparecer el efecto inhibidor de

MecI, se libera la transcripción de PBP2a. (José Mensa, 2013).

Se ha identificado además resistencia a varios otros antibióticos como se

puede apreciar en el siguiente cuadro.

- 20 -

AntimicrobianoBlancocelular

Genes deresistencia

Mecanismo de resistencia

Aminoglucósido RNAr 30S

aacA-aphD,

aadA, aadD,

aadD, aphA,

aphC, spc, strA

Modificación por acetiltransferasas,

adeniltransferasas o alteración ribosomal de

las fosfotransferasas.

Cloranfenicol rRNA50s cat Modificación por acetiltransferasa

Fluoroquinolonas DNA girasa

gyrA / gyrB

norA

grlA

Mutaciones en los genes de la DNA girasa,

Bombas de expulsión, Mutaciones en el gen

de la DNA topoisomerasaIV

Fosfomicina

Síntesis del

ácido N-acetíl

murámico

fosBModificación por una glutatione-S-

transferasa

Ácido fusídicoFactor de

elongación GfusA/fusB

Alteración en el factor de elongación

G/disminución de la

Permeabilidad

GlicopéptidosComplejos D-

Ala-D-AlaSecuestro por la pared celular

Macrólidos,lincosamidas

RNAr 50sermA, ermB,

ermC, msrAMutilación del RNAr, Bombas de expulsión

MupirocinaIsoleucil-RNAt-

sintetasamupA

Producción de una isoleucil-RNAt-sintetasa

modificada

Rifampicina

Subunidad β de

la RNA

polimerasa

rif Alteraciones en la RNA polimerasa

SulfunamidasSíntesis de ácido

tetrahidrofólicosulA Sobreproducción de ácido p-aminobenzoico

Tetraciclinas RNAr 30s

tetA(K)/

tetA(L)

tetA(M)

Bombas de expulsión

Protección ribosomal

Trimetoprim

Síntesis del

ácido

tetrahidrofólico

drfA Bypass por una dehidrofolato reductasa

Cuadro 3. Mecanismos de resistencia identificados en S. aureus.(Velázquez-Meza, 2005).

- 21 -

CAPÍTULO IV

PATOGÉNESIS

Los integrantes del género Staphylococcus desde el punto de vista clínico

se pueden dividir en patógenos y no patógenos. Los no patógenos

generalmente forman parte de la microflora normal de la piel, del sistema

respiratorio y del sistema digestivo, son coagulasa-negativos y tienden a

ser no hemolíticos, mientras que los patógenos como S. aureus son

invasivos, coagulasa-positivos y tienden a ser hemolíticos.

“La capacidad patógena de una determinada cepa de S. aureus es el

efecto combinado de factores extracelulares y toxinas junto con las

propiedades invasivas de la cepa. En un extremo de la gama de la

enfermedad está la intoxicación alimentaria estafilocócica, que se atribuye

únicamente a la ingestión de la enterotoxina preelaborada; en el otro

extremo están la bacteriemia estafilocócica y los abscesos diseminados

en todos los órganos” (Geo. F. Brooks, 2011).

4.1 Inicio del proceso infeccioso y desarrollo de signos y síntomas.

El desarrollo de los signos y síntomas ocasionados por Staphylococcus

está condicionado principalmente con la forma de inicio del proceso

infeccioso que puede ser de dos maneras:

- 22 -

a. Mientras que cuando el proceso infeccioso se da por la acción de sus

toxinas, generalmente en lugares distantes de la localización inicial de la

bacteria como el caso de las infecciones alimentarias, el período de

incubación se reduce a horas (30 minutos a 8 horas).

b. Mediante la acción directa de la bacteria que implica colonización,

invasión del huésped y expresión de los determinantes de patogenicidad

en cuyo caso el período de incubación puede variar mucho, generalmente

de 4 a 10 días. (Seija, 2006). (IOWA STATE UNIVERSITY, 2011).

4.2 Principales patologías causadas por S. aureus.

4.2.1 Infecciones mediadas por las toxinas. Las tres principales

enfermedades que produce Staphylococcus aureus mediante sus toxinas

tenemos: Síndrome de piel escaldada, Intoxicación alimentaria y el

Síndrome del shock tóxico.

4.2.1.1 Síndrome de piel escaldada estafilocócica. (SSSS del inglés

Staphylococcal scalded skin syndrome), se caracteriza por descamación

dolorosa de la piel por acción de las toxinas exfoliativas estafilocócicas

(Toxina Exfoliativa A o ETA y Toxina Exfoliativa B o ETB) en la capa

granulomatosa de la epidermis. Las toxinas se producen en un foco de

infección inicial, pasan al torrente sanguíneo, y se diseminan en regiones

alejadas, por lo que en las zonas descamadas y sus alrededores no

encontramos ningún germen. El síndrome abarca desde afecciones

ampollosas localizadas hasta la descamación generalizada de la piel, que

afectan principalmente, pero no exclusivamente a recién nacidos y niños

menores de 5 años. Su tasa de mortalidad se ubica alrededor del 5% en

niños, pudiendo llegar hasta el 60% en adultos, debido a complicaciones

como sepsis, superinfecciones, y los desequilibrios electrolíticos.

- 23 -

(GUERRER-FERNANDEZ J. , 2002) (Inbal Braunstein, 2014) (Seija,

2006) (Jesus Saavedra, 2011).

Fig. 5. Síndrome de Piel Escaldada. (Patrick R. Murray, 2014).

4.2.1.2 Intoxicación Alimentaria. Los alimentos suelen ser un medio de

transporte de las enterotoxinas de muchos microorganismos, que cuando

ingresan al organismo producen efectos de distinta intensidad en el

huésped. Las enterotoxinas termoestables de S. aureus (A-E,G-I) son

superantígenos que aceleran el peristaltismo y generan manifestaciones

clínicas como: náuseas, dolor abdominal, vómito, diarrea (de hasta 2

días), en general sin fiebre y en los casos más graves se pueden

presentar cefalea y choque. Estos síntomas suelen aparecer de 1 a 6

horas después de la ingesta de los alimentos contaminados, que

principalmente suelen ser aquellos alimentos de elevado contenido en

proteínas e hidratos de carbono como: cárnicos (principalmente pollo,

chorizo y jamón), pasteles, helados y salsas. La recuperación suele ser

rápida mediante rehidratación y sin necesidad de tratamiento antibiótico.

(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006).

4.2.1.3 Síndrome de shock tóxico. El síndrome de shock tóxico (SST) es

una enfermedad sistémica multiorgánica provocada por la toxina 1 del

síndrome del shock tóxico (TSST-1) de S. aureus que restringe la

- 24 -

quimiotaxis de neutrófilos, induce la función supresora de los linfocitos T y

bloquea el sistema reticuloendotelial. Predomina en mujeres en edad fértil

y se relaciona con el uso de tampones superabsorbentes, y son pocos los

casos no menstruales (10-15%). Los síntomas son: dolor de cabeza,

fiebre alta, hipotensión, mialgias, rash eritematoso en pies y manos,

vómito y diarrea. Si no se controla a tiempo puede avanzar a shock grave

en 48 horas (síndrome de dificultad respiratoria, coagulación intravascular

y falla renal) y la muerte. La tasa de mortalidad es alta. (Jaime A. Bustos-

Martínez, 2006) (Ana C. Blanco, 2005) (Seija, 2006) (Guadalupe

Zendejas-Manzo, 2014).

Fig. 6 Síndrome de Shock Tóxico. (Patrick R. Murray, 2014).

4.2.2 Infecciones supurativas (presencia de bacterias). En cuanto a las

afecciones supurativas que incluyen presencia de la bacteria como tal,

podemos mencionar que S. aureus está involucrado en una amplia gama

de enfermedades, que van desde infecciones superficiales relativamente

benignas (impétigo, foliculitis, forunculosis o conjuntivitis), hasta

enfermedades sistémicas que ponen en riesgo la vida, como abscesos

profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía.

- 25 -

4.2.2.1 Impétigo. Se define como infección de la epidermis,

caracterizada por presencia de vesículas y/o pústulas, localizadas

principalmente en cara y extremidades. Afecta principalmente a niños

entre 2 a 5 años, se disemina rápidamente y está asociada a problemas

de higiene y hacinamiento.

Se distinguen dos formas clínicas de Impétigo:

No ampolloso que es el más frecuente, necesita de perdida de

continuidad de la piel para el contagio inicial, es contagioso, se

caracteriza por lesiones indoloras, a veces pruriginosas, con moderada

sensibilidad a la palpación, sin eritema alrededor y generalmente sin

fiebre.

Ampolloso se caracteriza por presencia de ampollas muy frágiles

(causadas por acción de las toxinas exfoliativas lejos de la ubicación de la

infección) que al romperse dejan una zona eritematosa.

(Sociedad Española de Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española de

Medicina Interna (SEMI), 2006) (Jesus Saavedra, 2011) (Leonardo

Sánchez–Saldaña, 2006).

Fig. 7. Impétigo Bulloso. Recuperado de:(Leonardo Sánchez–Saldaña, 2006) .

Fig. 7A. Impétigo no Bulloso.Recuperado de: (LeonardoSánchez–Saldaña, 2006).

- 26 -

4.2.2.2 Foliculitis y Forunculosis. Son procesos inflamatorios secundarios

a la infección bacteriana que afectan al folículo pilosebáceo superficial

(foliculitis) y profundo (forunculosis) en las zonas con mayor presencia de

pelo como la cabeza, el mentón, la región superior del tronco, axilas,

nalgas, región inguinal y muslos. Se presentan en forma de pápulas y/o

pústulas a nivel del orificio folicular. Las forunculosis consisten en la

aparición repetida durante largos períodos de tiempo de forúnculos únicos

o múltiples en localizaciones variables que puede ser ocasionado por una

foliculitis previa. La coalescencia de los forúnculos con extensión de la

supuración al tejido celular subcutáneo se conoce como Ántrax. (García,

2014) (VILA MAS, 2003) (Leonardo Sánchez–Saldaña, 2006).

4.2.2.3 Conjuntivitis. Es la inflamación de la conjuntiva ocular,

generalmente a causa de bacterias o virus. S. aureus puede causar esta

enfermedad pues se encuentra en nuestra piel o en vías respiratorias. La

infección puede iniciar en los dos ojos, o primero en uno y en un día pasar

el otro. (ESTEVA, 2006).

Fig. 8. Foliculitis. Recuperado de:(VILA MAS, 2003).

Fig. 8A. Forunculosis. Recuperado de:(VILA MAS, 2003).

- 27 -

Fig. 9 Conjuntivitis. Recuperado de:http://es.slideshare.net/mediconauta/oftalmologa-ojo-rojo

4.2.2.4 Celulitis. Inflamación aguda de la piel que a diferencia de la

erisipela, se extiende hasta el tejido celular subcutáneo, caracterizada por

edema, eritema con bordes mal definidos (debido a la profundidad de la

infección) y dolor de la zona afectada, con frecuencia se observa

adenopatías regionales y los signos y síntomas generales de fiebre,

escalofríos y malestar general. La causa más común suelen ser S.

pyogenes y S. aureus (aunque pueden ser otras bacterias) con

antecedentes de lesiones cutáneas previas y afecta generalmente las

mejillas (unilateral) y extremidades. Es de mucho cuidado la ubicación en

la zona cercana al ojo debido a las serias complicaciones que podrían

presentarse con la visión y el sistema nervioso central. Las

complicaciones más serias de la celulitis son: abscesos subcutáneos,

osteomielitis, artritis séptica, tromboflebitis, bacteriemia y fascitis

necrotizante. (Jesus Saavedra, 2011) (Leonardo Sánchez–Saldaña, 2006)

(Sociedad Española de Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española de

Medicina Interna (SEMI), 2006).

- 28 -

Fig. 10 Celulitis infecciosa. Recuperado de:http://www.enciclopediasalud.com/categorias/dermatologia-piel-y-

belleza/articulos/la-celulitis-infeccion-de-la-piel.

4.2.2.5 Sepsis. La sepsis estafilocócica es una entidad clínica

caracterizada por el paso de Estafilococo desde un punto inicial de

infección hacia la sangre y su metástasis a diferentes sitios,

principalmente pulmón, corazón, articulaciones, huesos, músculos, riñón y

cerebro, comprometiendo seriamente la vida del paciente.

Lamentablemente produce síntomas muy generales (Ricardo Arteaga

Bonilla, 2005) (Lismay González Reynosa, 2001).

4.2.2.6 Piomiositis. Es un tipo de infección que necrosa el tejido

muscular, se caracteriza principalmente por la presencia de abscesos en

los músculos y es más frecuente en zonas tropicales. Generalmente es

causada por S. aureus cuando ha logrado llegar a la sangre y se ha

transportado a los músculos. (Sociedad Española de Quimioterapia

(SEQ), Sociedad Española de Medicina Interna (SEMI), 2006).

- 29 -

4.2.2.7 Neumonía. A pesar de que S. aureus es un habitante frecuente

del aparato respiratorio pues un alto porcentaje de seres humanos a nivel

mundial son portadores de este microorganismo, la incidencia de

infecciones a este nivel es relativamente baja, y ocasionalmente puede

llegar a los pulmones y desarrollar neumonía necrosante con múltiples

complicaciones como: empiema, neumatoceles, pioneumotórax y fístulas

broncopleurales.

4.3. Infecciones Intrahospitalarias.

En tres hospitales de Quito-Ecuador: "Enrique Garcés" (dependiente del

Ministerio de Salud Pública), "Carlos Andrade Marín" (Instituto

Ecuatoriano de Seguridad Social) y Quito Número 1, de la Policía

Nacional (Ministerio de Gobierno), cada uno de los cuales tenía más de

60 camas se realizó un estudio en un mismo momento temporal, en las

Unidades de Cuidados Intensivos, fueron estudiados 16 pacientes, “de los

cuales 9 presentaban una infección intrahospitalaria (prevalencia 56,25 %,

IC 95 %: 29,8-80,2) localizada en vías respiratorias bajas (neumonía 6);

sistema nervioso central 1; piel y tejidos blandos 1 y osteoarticular 1”.

(César Ignacio Ruano, 2004).

Como se puede apreciar en los resultados del estudio que se exponen en

el cuadro 4, el patógeno más frecuente a nivel intrahospitalario fue

Staphylococcus aureus, el cual estuvo presente en 4 de los nueve

pacientes que presentaban infección intrahospitalaria.

- 30 -

Cuadro 4. Infecciones nosocomiales en tres hospitales de Quito Ecuador.DH: días de hospitalización. FR: factor de riesgo (el principal identificado).VM: ventilación mecánica. NE: nutrición enteral.VRB: vías respiratoriasbajas. SNC: sistema nervioso central. Bacterias coexistentes en elpaciente: pseudomona aeuroginosa y klebsiella pneumoniae,pseudomona aeuroginosa, serratia spp y proteus vulgaris.

En España también se llevó a cabo un estudio en la Unidad de Cuidados

Intensivos de los hospitales de algunas ciudades como Barcelona,

Malaga, Vizcaya, Madrid, etc, en el que (Francisco Álvarez Lerma, 2006)

evidenció que “S. aureus está presente en el 19,8% de los pacientes con

infecciones adquiridas en las UCI, principalmente en neumonías

relacionadas con ventilación mecánica. La mortalidad de los pacientes

con infecciones por S. aureus ha sido superior a la de los pacientes con

infecciones por otros microorganismos y a la de pacientes sin infecciones.

Por el contrario, no se han identificado diferencias en la evolución de los

pacientes con infecciones por S. aureus sensible o resistente a meticilina”.

- 31 -

Cuadro 5. Distribución de las infecciones intrahospitalarias en el área decuidados intensivos en función del aislamiento de Staphylococcus aureus.(Francisco Álvarez Lerma, 2006).

4.4. Factores predisponentes del huésped.

Según (Seija, 2006) dentro de los principales factores predisponentes del

huésped para adquirir la infección y desarrollar la enfermedad tenemos:

• Defectos de quimiotaxis leucocitaria congénitos o adquiridos.

• Defectos de opsonización por anticuerpos.

• Defectos en la muerte intracelular luego de la fagocitosis (enfermedad

granulomatosa crónica).

• Heridas de piel (quemaduras, incisiones quirúrgicas, eczema).

• Presencia de cuerpos extraños (suturas, vías venosas, prótesis).

• Infecciones por otros agentes, particularmente virus (influenza).

• Enfermedades crónicas como alcoholismo, falla renal crónica,

enfermedades malignas, etc.

- 32 -

CAPÌTULO V

DIAGNÓSTICO EN EL LABORATORIO

5.1 Frotis y tinción.

La extensión de las muestras sobre una lámina portaobjetos y su posterior

tinción es un procedimiento básico y de gran ayuda en microbiología

cuando de identificar agentes patógenos se trata, por lo que tenemos a

disposición una amplia variedad de tinciones entre las que podemos

encontrar a la tinción de Gram.

Tinción de Gram. La tinción de Gram es una prueba muy utilizada en los

laboratorios, por ser económica, rápida y eficaz, además de ser una

tinción diferencial pues clasifica a las bacterias en positivas (aquellas que

fijan la tinción) y en negativas (las que no la fijan) y esto depende de la

estructura de la pared celular de las bacterias. S. aureus es una bacteria

que está en el grupo de las Gram positivas. (Geo. F. Brooks, 2011) (Luis

Esaú López-Jácome, 2014) (Patrick R. Murray, 2014).

Figura 11. Esquema de las diferencias estructurales entre bacterias Gramnegativas y Gram positivas. (Luis Esaú López-Jácome, 2014).

- 33 -

La tinción de Gram utiliza dos colorantes: el violeta de cristal y la

safranina. El violeta de cristal tiene afinidad con el péptidoglucano que se

encuentra en gran cantidad en la pared celular de las Gram positivas por

lo que se tornan azuladas, mientras que las Gram negativas lo sueltan

pero fijan la safranina y se tornan rojizas. (Geo. F. Brooks, 2011) (Luis

Esaú López-Jácome, 2014) (Patrick R. Murray, 2014).

Fig. 12. Cocos Gram positivos y Gram negativos, recuperado de:

https://microbitos.files.wordpress.com/2011/08/staphylococcus-sp-fig6.jpg

y http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/ayuda/cocosgneg.GIF.

Procedimiento. Según indica (Geo. F. Brooks, 2011), se realiza el frotis o

extensión de la muestra sobre una lámina portaobjetos, se deja secar a

temperatura ambiente y se fija usando calor o metanol para evitar

desprendimiento de la muestra durante el procedimiento de tinción y

lavado de los colorantes que se han de utilizar.

A continuación se cubre la muestra con el colorante violeta de

cristal y dejamos reposar alrededor de un minuto para que el

colorante penetre en las bacterias, luego de lo cual lavamos

cuidadosamente con agua corriente.

Sin secar, aplicamos lugol (que forma un complejo con el violeta de

cristal impidiendo que escape durante la decoloración)

cuidadosamente y dejamos actuar por un minuto, luego de lo cual

- 34 -

lavamos nuevamente con agua, teniendo mucho cuidado que no se

desprenda la muestra.

Sin secar, se aclara la tinción agregando sobre la muestra, gota a

gota, una preparación de acetona (30 ml) con alcohol (70 ml), y

agitando durante 10 a 30 segundos, teniendo cuidado de no

decolorar demasiado, luego de lo cual retiramos mediante

enjuague con agua, la solución decolorante.

Posteriormente se cubre la muestra con una solución de safranina

al 2.5% en alcohol al 95%, durante 10 a 30 segundos, lavamos con

agua y dejamos secar. (Geo. F. Brooks, 2011) (Luis Esaú López-

Jácome, 2014) (Patrick R. Murray, 2014).

5.2 Cultivo.

Análisis microbiológico. Para la identificación de S. aureus es necesario

utilizar algunas pruebas bioquímicas y medios de cultivo especiales que

permitan su fácil determinación. Esta identificación se basa en las

enzimas y las toxinas que produce el microorganismo. Aprovechando

estas características en el mercado se pueden encontrar una gran

variedad de medios de cultivo sólidos y líquidos que se han diseñado

para aislar e identificar esta bacteria, entre los cuales los más importantes

son: Agar Baird-Parker, Agar Manitol Salado, Agar azul de O-toluidina-

DNA, Agar Estafilococos N° 110. (INSTITUTO ECUATORIANO DE

NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo,

2014).

- 35 -

5.2.1 Base de agar Baird-Parker.

5.2.1.1 Fórmula (por litro):

Triptona…………………………………..…. 10, 0 g

Extracto de Carne...................................... 5, 0 g

Extracto de Levadura................................. 1,0 g

Glicina........................................................ 12,0 g

Cloruro de Litio............................................. 5,0 g

Agar.......................... .................................. 20, 0 g

Sulfametacina sódica (cuando sea necesario).

Agua destilada ……………………………….1,0 L

Piruvato de sodio al 20%

Telurito de potasio al 1%

Emulsión de yema de huevo

5.2.1.2 Fundamento: Es una base a la que se deben añadir Emulsión de

Yema de Huevo y Potasio Telurito. También se puede añadir

Sulfametazina para inhibir el crecimiento de Proteus. Por la presencia del

Cloruro de Litio y Telurito de Potasio se inhibe el crecimiento de

microorganismos no deseados convirtiendose en un medio medianamente

selectivo. Por la presencia del Sodio Piruvato y la Glicina se favorece el

crecimiento de los Estafilococos recuperando incluso a aquellos que han

sufrido daño no letal. A su vez el Potasio Telurito combinado con la acción

de la yema de huevo permite diferenciar los Estafilococos.

Staphylococcus aureus da colonias negras, por la reducción del potasio

telurito a teluro, rodeadas de un halo de transparencia debido la

destrucción de los lípidos de la yema de huevo. Existe un paralelismo

importante entre los coagulasa-positivos y la reacción descrita con la

yema de huevo y el telurito; es por lo que estas características se utilizan

como indicativo de esta actividad. (INSTITUTO ECUATORIANO DE


2014).

- 36 -

5.2.1.3 Uso. En las muestras biológicas, y diferentes productos

cosméticos, farmacéuticos, e incluso alimentos en los que se necesita

aislar selectivamente Estafilococos. El medio de cultivo completo es

opaco y no puede almacenarse por lo que debemos utilizarlo

inmediatamente sembrando homogéneamente en su superficie. Incubar a

37ºC durante 24-48 horas. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija,

2006) (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013).

5.2.1.4 Preparación. Primero se prepara el medio base disolviendo los

componentes en un litro de agua destilada, se agrega el agar y se deja en

reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente y ajustamos el pH a

6,8 ± 0,2. Manteniendo agitación continua llevar a ebullición hasta que se

disuelven completamente los componentes, se distribuye en frascos (90

cc en cada frasco) y se esteriliza en el autoclave a 121ºC durante 15

minutos. Este agar base puede conservarse en refrigeración (4 °C ±1°C)

más de un mes. (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN,

2013) (Seija, 2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).

A continuación se prepara las soluciones de telurito de potasio al 1%,

Sulfametacina sódica, piruravo sódico 20% y la emulsión de yema de

huevo como se detalla a continuación:

Telurito de potasio al 1%.

Disolver 10 g de telurito de potasio en 100 cc de agua destilada tibia y

esterilizar por filtración.

Piruvato de sodio al 20%.

Disolver 20 g de piruvato de sodio en 50cc de agua destilada, una vez

disuelto agregar 50cc más de agua y esterilizar también por filtración.

Sulfametacina sódica.

Disolver 0,2 g de sulfametacina sódica en 10 cc de hidróxido de sodio

0,1N y agregar agua destilada hasta 100cc. Si la sulfametacina fuera

- 37 -

necesaria, se agrega 27,5 cc por cada litro del medio base antes de

esterilizarlo. (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013)

(Seija, 2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).

Emulsión yema de huevo.

Lavar con jabón, un cepillo y agua tibia suficientes huevos frescos como

para obtener 50cc de yema, sumergirlos en etanol al 70% v/v y dejarlos

en reposo por unas horas. Flamearlos y con una pipeta estéril retirar la

clara de cada uno de ellos, en una probeta estéril colocamos 50cc de

yemas a las que añadimos 50cc de suero fisiológico estéril y mesclamos

en una licuadora a baja velocidad para que no se forme espuma. Esta

emulsión de yema de huevo se puede conseguir preparada. (INSTITUTO

ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006) (Guadalupe


Finalmente se prepara el medio completo mezclando 90 cc del medio

base, 1 cc de solución de telurito de potasio al 1%, 5 cc de piruvato de

sodio al 20 % y 5 cc de emulsión de yema huevo. Se distribuye en las

placas y se deja enfriar. (INSTITUTO ECUATORIANO DE


2014).

Las placas preparadas deben ser utilizadas dentro de las siguientes 24h y

los resultados positivos deben ser confirmados con frotis y tinción de

Gram. (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija,

2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).

5.2.1.5 Interpretación de resultados:

Colonias MicroorganismosNegras, lustrosas, convexas 1 a 5mm de diámetro, con bordeestrecho blanquecino, rodeado porun halo claro de 2 a 5 mm deanchura. Dentro del halo claropresencia de anillos opacos novisibles antes de las 48 horas

Staphylococcusaureus

- 38 -

Negras, lustrosas, pero en formairregular. Al cabo de 24 horas,presencia de zonas opacasalrededor de las colonias.

Staphylococcusepidermitis

(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006)


5.2.2 Agar Manitol Salado.

5.2.2.1 Fórmula (g/L):

Peptona…………………………. 10,0

Extracto de carne……………….. 1,0

Cloruro sódico………………… 75,0

D (-) manitol……………………. 10,0

Rojo de fenol…………………… 0.025

Agar-agar……………………….. 12,0

pH 7,4 ± 0,1

5.2.2.2 Fundamento:

El agar manitol salado fue formulado para lograr el aislamiento de

Estafilococos, inhibiendo el crecimiento de otras bacterias al utilizar una

alta concentración de cloruro de sodio (7.5%). En este medio, las

peptonas y el extracto de carne proporcionan la fuente de carbono,

nitrógeno, vitaminas y minerales. Con la fermentación del D-Manitol se

genera ácido que ocasiona el viraje del rojo de fenol a amarillo,

permitiendo así una mayor claridad en el momento de establecer el

diagnóstico, ya que la mayoría de Estafilococos patógenos fermentan este

azúcar. El agar es adicionado como agente solidificante. . (INSTITUTO

ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006) (Guadalupe


- 39 -

5.2.2.3 Uso:

El Agar Sal y Manitol se emplea para el aislamiento selectivo y recuento

de Staphylococcus patógenos en productos cárnicos, lácteos, marinos y

otros productos alimenticios. También se emplea con el mismo fin en

productos farmacéuticos y cosméticos. La siembra se realiza en

superficie, por estría. Debido al potente efecto inhibidor de este medio,

debe sembrarse masivamente. Incubar a 37º C 24-48 horas. .



5.2.2.4 Preparación:

Suspender 108 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con

agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto.

Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos. Dejar enfriar a una

temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles.



5.2.2.5 Interpretación de resultados:

Los Estafilococos coagulasa (+) (Staphylococcus aureus) producen

colonias de color amarillo y un medio circundante de color amarillo,

mientras que los Estafilococos negativos a la coagulasa producen

colonias de color rojo y no provocan cambios en el color del indicador rojo

fenol. (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija,

2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).

- 40 -

Fig. 13. Crecimiento de diferentes cepas de S. aureus en agar manitol

salado.

5.2.3 Agar Estafilococos N° 110.

5.2.3.1 Fórmula (g/L):

Extracto de levadura………... 2.5

Tripteína…........................... 10.0

Gelatina……………………... 30.0

Lactosa……………………...... 2.0

D-Manitol……………………. 10.0

Cloruro de Sodio................... 75.0

Fosfato dipotásico.................. .5.0

Agar....................................... 15.0

http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/estafilococomedio110.htm.

5.2.3.2 Fundamento. Este medio es selectivo para Estafilococos gracias a

la producción de color debido a la hidrolisis de la gelatina y fermentación

del manitol. Los nutrientes de este medio ideal para diferenciación de

Estafilococos, son aportados por la tripteína y el extracto de levadura

mientras que la gelatina nos sirve la verificar la producción de la enzima

gelatinasa. La alta concentración de cloruro de sodio con el objetivo de

inhibir el crecimiento de microorganismos diferentes a los Estafilococos lo

- 41 -

que lo hace un medio selectivo para esta bacteria. La fuente de carbón

fermentable está constituida por el manitol y la lactosa. (Guadalupe



5.2.3.3 Uso. Se lo utiliza con el fin de aislar selectivamente Estafilococos

en muestras clínicas y no clínicas. La siembra es en placa directamente

por estriado o por extensión y se incuba de 24 a 48 horas en la estufa a

35-37°C. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014)


5.2.3.4 Preparación. Suspender 149 g del medio en un litro de agua

destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1

o 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Verter

en placas y mezclar para dispersar el precipitado. (Guadalupe Zendejas-

Manzo, 2014).


5.2.3.5 Interpretación de resultados. Los Estafilococos coagulasa

positivos forman colonias amarillas y doradas, pero sin embargo es

necesario realizar dos pruebas para la identificación de estos

microorganismos:

Primero buscamos averiguar si hay o no fermentación del manitol

para lo cual es necesario colocar unas gotas de purpura de

bromocresol en la zona de crecimiento bacteriano y en la zona

donde no hay crecimiento, esto con el fin de observar si se

obtienen coloraciones diferentes entre las dos zonas. Se considera

prueba positiva cuando se encuentras colonias con un halo

amarillento alrededor en la zona donde hay crecimiento bacteriano,

mientras que en la zona donde únicamente hay medio de cultivo

sin inocular, el indicador permanece intacto.

- 42 -

A continuación se evalúa si existe o no hidrolisis de gelatina para lo

cual se agrega sobre la placa 5ml de solución saturada de sulfato

de amonio y se incuba durante 10 minutos en la estufa a 35-37ºC.

Se considera prueba positiva si se forma un halo transparente

alrededor de las colonias, esto indica digestión de la gelatina por la

enzima gelatinasa.

Nota: por la alta concentración de cloruro de sodio en este medio, no es

recomendable utilizar las colonias crecidas en el para realizar la prueba

de la coagulasa, por lo que se recomienda previamente realizar un

subcultivo de estas colonias en medios no selectivos. (Guadalupe

Zendejas-Manzo, 2014)


5.2.4 Agar Azul de O-Toluidina-DNA o Agar DNAsa.

5.2.4.1 Fórmula en g/L

Peptona de Caseína………………….. 15.00

Acido Desoxirribonucleico……………... 2.00

Peptona de Soja………………………… 5.00

Cloruro Sódico………………………….. 5.00

Agar Bacteriológico……….…………… 15.00

Final pH 7.3 ± 0.2 a25ºC

http://www.condalab.com/uploads/media/1028_PARA_PRUEBA_DNASA_

REv_0_mayo_2010.pdf.

5.2.4.2 Fundamento. Las cepas patógenas de S. aureus producen

nucleasas que descomponen el ADN del medio debido a que la ADNas

tiene la capacidad de romper sus enlaces fosfodiester, lo cual se

evidencia al formar un halo alrededor de la zona inoculada del agar. Las

Peptonas de Caseína y Soja aportan nitrógeno, vitaminas, minerales y

aminoácidos, necesarios para el crecimiento de las colonias bacterianas,

- 43 -

mientras que el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006).



5.2.4.3 Usos. Aunque ha sido diseñado para identificar Estafilococos

patógenos que producen la desoxirribonucleasa debido a que esta enzima

es un indicador de su potencial patogénico, también se lo utiliza para

identificar otros microorganismos con actividad DNAsa. Para la siembra,

con un asa con una buena cantidad del cultivo realizamos una estría recta

de alrededor de 2 centímetros de longitud en el centro de la placa y

dejamos incubar en la estufa a 35-37 ºC durante 18-24 horas antes de

realizar la prueba del ácido clorhídrico. (Guadalupe Zendejas-Manzo,

2014) (Seija, 2006) http://www.condalab.com/uploads/media/1028_

PARA_PRUEBA_DNASA_REv_0_mayo_2010.pdf.

5.2.4.4 Preparación. Pesar 42 gramos del medio y diluir en un litro de

agua destilada agitando continuamente y con calor. Una vez disuelto

llevar a ebullición durante un minuto hasta conseguir una completa

disolución. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Dejare

enfriar hasta 45-50ºC y verter en placas de Petri estériles. Las placas

preparadas deben almacenarse entre 8-15 ºC.

5.2.4.5 Interpretación. El color del medio preparado es ámbar ligeramente

opalescente pero al cubrir con ácido clorhídrico 1N se torna más opaco y

en la zona que rodea a la zona inoculada, si se forma un halo

transparente indica que la prueba ha sido positiva. En lugar del ácido

clorhídrico se puede utilizar azul de toluidina en cuyo caso el medio se

torna azul y alrededor de la zona de crecimiento se forma un halo rosado.




- 44 -

Fig. 14. S. aureus en Agar DNAsa

5.3 Pruebas bioquímicas

Las pruebas o ensayos bioquímicos son aquellas reacciones que ponen

en evidencia la existencia de una enzima o pasos metabólicos

determinados, y que muchas veces nos permiten llegar a la identificación

a nivel de especie. Para el caso de Estafilococo aureus las pruebas más

importantes son las que identifican la producción de dos enzimas

principalmente, la Catalasa y la Coagulasa.

5.3.1 Prueba de la Catalasa.

5.3.1.1 Fundamento. Algunas bacterias como Staphylococcus y

Micrococcus poseen la capacidad de producir la enzima catalasa

(catalasa positivas) que tiene la propiedad de descomponer el peróxido de

hidrógeno o agua oxigenada en agua y oxígeno, logrando de esta manera

sobrevivir a los efectos tóxicos del sistema mieloperoxidasa de los

fagocitos.

2 H2O2 2 H2O + O2Catalasa

- 45 -

Esta prueba es útil para diferenciar las bacterias catalasa positivas de los

organismos catalasa negativos como Streptococcus y Enterococcus.

(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006) (Geo. F. Brooks, 2011).

5.3.1.2 Procedimiento. Colocar una o dos gotas de H2O2 sobre un

portaobjetos y luego agregar una pequeña cantidad de colonias del

cultivo. Para esta prueba no se puede obtener las colonias desde un agar

que contenga sangre, ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y

pueden dar falsos positivos. Esta prueba también puede realizarse a partir

de un cultivo en tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2 dentro

del mismo. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006) (Geo. F.

Brooks, 2011).

5.3.1.3 Interpretación. Se considera prueba positiva cuando existe la

formación de burbujas debido a la descomposición de peróxido de

hidrógeno en agua y oxígeno. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija,

2006) (Geo. F. Brooks, 2011).

5.3.2 Prueba de la coagulasa.

5.3.2.1 Fundamento. Estafilococo aureus posee la característica de

producir una proteína llamada coagulasa, lo que le diferencia de otras

especies de Estafilococos a los que no producen dicha proteína y se les

conoce como coagulasa negativos. Estafilococo dorado presenta dos

tipos de coagulasa, una endocoagulasa y una exocoagulasa:

La endocoagulasa está en la pared bacteriana y actúa directamente

sobre el fibrinógeno del plasma con EDTA o Citrato de sodio

generando coágulos o grumos.

La exocoagulasa o coagulasa libre requiere de una activación

previa mediante la unión a un factor sérico (CRF) para formar un

- 46 -

complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno y

genera el coágulo de fibrina.

La coagulasa es un factor de agregación que representa un importante

factor de virulencia, pues esta proteína convierte el fibrinógeno en fibrina

insoluble, la cual forma cúmulos que los Estafilococos utilizan para

adherirse y agruparse. Esta prueba sirve para diferenciar cepas de S.

aureus así como comprobar su presencia en la muestra analizada.

(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Guadalupe

Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006).

5.3.2.2 Procedimiento. Existen dos formas de realizar esta prueba, en

placa portaobjetos y/o en tubo para ambos casos podemos utilizar cultivos

en Caldo Infusión Cerebro Corazón (ICC).

Para la prueba en lámina portaobjetos es necesario preparar una

disolución de las colonias sospechosas con una gota de agua

destilada hasta que adopte un tono lechoso, luego se agrega una

gota de plasma de conejo y mezclamos.

Para la prueba en tubo de ensayo utilizaremos tubos de 75 mm x 7 mm

que contengan 0,5 ml de plasma de conejo, los cuales se inoculan con

colonias de los presuntos cultivos de S. aureus y, en el tubo control,

pipetear 0,1 ml de ICC sin colonias y 0,5 ml de plasma. Inmediatamente

se procede a incubar los tubos en baño maría a 35-37ºC de 4 a 6 horas

controlando a cada hora si existe o no coagulación del plasma.



5.3.2.3 Interpretación de resultados. Para la prueba en lámina, se

considera positiva la formación de grumos dentro de los primeros 10

segundos, por lo que se le considera una prueba rápida y económica;

pero en caso de resultar negativa (aproximadamente entre el 10 y 15% de

S. aureus dan resultados negativos a la prueba en placa) es necesario

- 47 -

corroborar el resultado con la prueba en tubo cuyos resultados se

interpretan de la siguiente manera:

Si al inclinar el tubo casi horizontalmente, sobresale un coagulo

pequeño, se considera que la prueba es positiva 2 +.

La formación de un coagulo que ocupe más de los ¾ del volumen

inicial del líquido, se considerará una prueba de la coagulasa

positiva 3 +.

Si se logra una coagulación total del plasma y éste no se

desprende del tubo sino con una ligera agitación, se tiene una

prueba de la coagulasa positiva 4+.

Si el resultado a las 4 horas es negativo es necesario regresar los

tubos al baño María y dejar en incubación toda la noche y se revisa

los resultados a las 18 horas. La lectura a las 4 horas es muy

importante porque ocasionalmente puede presentarse lisis del

coagulo por las fibrinolisinas de Staphylococcus aureus.

Según la norma NTE INEN 1529-14:2013 se debe considerar S.

aureus cogulasa positivos a aquellos que han producido una

coagulación de 3 + o 4 +, además es necesario diferenciar los

coágulos verdaderos de los falsos, agitando suavemente el tubo

para que los pseudocoágulos se deshagan.

En el tubo control, el plasma debe permanecer inalterado.



5.4 Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos es una de las más

importantes dentro del combate contra las infecciones bacterianas, pues

ayuda a los médicos en la elección del antibiótico más efectivo para

contrarrestarlas.

- 48 -

Para este se utiliza el Agar Mueller-Hinton como se detalla a

continuación.

5.4.1. Formula g/L

Infusión de carne………………. 300.0

Caseína ácida hidrolizada……… 17,5

Almidón…………………………….1,5

Agar………………………………..15,0

Agua purificada……………….. 1000 ml

pH final a 25ºC……………….. 7.3 ± 0.1

http://himedialabs.com/TD/M173.pdf.

5.4.2 Fundamento. La infusión de carne y la caseína ácida hidrolizada

proporcionan nitrógeno, carbono, azufre y otros nutrientes esenciales para

el crecimiento de los organismos en estudio, mientras que el almidón

actúa como un coloide protector contra sustancias tóxicas presentes en el

medio. El agar permite el crecimiento satisfactorio de la mayoría de los

microorganismos. http://himedialabs.com/TD/M173.pdf.

5.4.3 Usos. Agar Mueller-Hinton es el medio de cultivo recomendado

universalmente para realizar el antibiograma por la reproducibilidad de los

resultados. http://himedialabs.com/TD/M173.pdf.

5.4.4 Preparación.

Suspender 38 gramos en 1000 ml de agua destilada.

Calentar hasta ebullición para disolver el medio completamente.

Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión (121 ° C) durante 15

minutos.

Mezclar bien antes de verter en las cajas Petri estériles.

Inocular las placas con el microorganismo e incubar a 37ºC por 18

a 24 horas. http://himedialabs.com/TD/M173.pdf.

- 49 -

5.4.5 Interpretación. Halos de inhibición de crecimiento de 16mm o

mayores se considera que el microorganismo es susceptible al antibiótico.

5.5 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).

Los métodos biotecnológicos de identificación de los organismos vivos

basados en el análisis de su ADN han evolucionado aceleradamente

durante la última década, por lo que se han producido una gran cantidad

de equipos, materiales y reactivos que si bien no es muy fácil obtenerlos

tampoco es tan difícil, pero brindan muchas ventajas sobre los métodos

tradicionales (el cultivo y pruebas bioquímicas) como su gran

especificidad, reproducibilidad de resultados y rapidez, lo que hace de

estos métodos los más propicios para la identificación de los

microorganismos. Entre los métodos biotecnológicos más utilizados en la

actualidad para este fin podemos mencionar la Real Time PCR (qPCR),

RT-PCR (Reverse Transcription PCR) y la PCR convencional que se

complementa con la electroforesis.

Mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa, con el correcto diseño

de “primers o cebadores” se logra limitar y amplificar correctamente un

segmento deseado de la cadena de ADN (siempre y cuando se encuentre

en la muestra de ADN previamente purificada), de esta manera se puede

identificar diferentes tipos de organismos como bacterias y virus, y

además se logra distinguir diferentes cepas de acuerdo a si poseen o no

determinados genes que produzcan proteínas de patogenicidad.

La PCR basa su función en la creación de nuevas cadenas por

complementariedad de bases con una cadena molde (extraída desde el

organismo en estudio), lo cual requiere de varios reactivos en

concentraciones exactas para lograr la polimerización de los nucleótidos.

- 50 -

Entre los elementos necesarios para la PCR tenemos:

El Termociclador es el equipo que brinda los cambios de

temperatura necesarios para las diferentes etapas de la PCR.

ADN, que sirva de plantilla sobre la cual se llevará a cabo la

construcción de las primeras copias que se formarán por

complementariedad de bases con dicha plantilla, dicha

complementariedad está dada por puentes de Hidrógeno que se

forman entre las bases complementarias: A-T y G-C.

ADN Polimerasa, conocida como Taq Polimerasa por su origen

(bacteria Thermus aquaticus) la cual posee una gran estabilidad

térmica, cualidad muy útil para soportar los cambios de

temperatura durante los diferentes ciclos de la PCR.

Primers o Cebadores oligonucleótidos que generalmente fluctúan

entre 15 a 25 nucleótidos de longitud, que reconocen una

secuencia de la cadena molde, se fijan a ella y dan el soporte para

que la polimerasa inicie su trabajo de generación de la nueva

cadena. Como mínimo se necesitan un primer Forward y uno

Reverse

dNTPs libres, que son los monómeros necesarios para la

elaboración de las nuevas cadenas.

Iones divalentes, buffer y agua, en las concentraciones adecuadas

facilitan las reacciones. (Tamay de Dios L, 2013) (John Elmerdahl

Olsen, 2006)

Cada ciclo de PCR involucra tres etapas principales: desnaturalización,

hibridación y elongación, y estos ciclos se repiten por tantas veces como

sean necesarios, generalmente 25-30.

Desnaturalización, que consiste en romper los puentes de

Hidrógeno generados entre las bases complementarias de las dos

cadenas con el objetivo de separarlas, para que sea posible el

siguiente paso que es la Hibridación. Esto se logra elevando la

- 51 -

temperatura generalmente a 94-95˚C, por un lapso de tiempo

determinado por la necesidad (20 segundos a 1 minuto). Al inicio

del proceso antes de entrar en la serie de ciclos, se realiza una

desnaturalización inicial que puede variar en el tiempo de duración

entre 5-10 minutos. (Tamay de Dios L, 2013) (John Elmerdahl

Olsen, 2006)

Hibridación, es en la unión de los primers por complementariedad

de secuencias en los extremos 3’ de la cadena de ADN que sirve

como templado o molde, para esto se requiere una temperatura

que fluctúa entre 50-60˚C. El correcto diseño de los cebadores es

la clave en el éxito o fracaso de la amplificación. (Tamay de Dios

L, 2013) (John Elmerdahl Olsen, 2006)

Elongación, consiste en el trabajo de la polimerasa, es decir en la

colocación de los nucleótidos en la cadena que se está elaborando,

se le conoce también como extensión. (Tamay de Dios L, 2013)

(John Elmerdahl Olsen, 2006)

Algunos años atrás dichos reactivos llegaban individualmente, tanto cada

uno de los nucleótidos, ADN polimerasa, iones divalentes, etc., con los

cuales había que realizar los cálculos y diluciones necesarias para

preparar las masters mix y lograr las reacciones. En la actualidad se

dispone de una variedad de kits preparados con todos los componentes

incluidos en un solo vial para facilitar el trabajo del laboratorista.

Algunos kits de amplificación, como el que se usó en este estudio (GoTaq

Green 2X de Promega) incluso traen incluido en su mezcla un tampón de

depósito, de manera que cuando termina la PCR, el amplicón se coloca

directamente en el gel de agarosa (para la electroforesis) sin necesidad

de realizar ninguna otra preparación lo que representa una ventaja en

ahorro de tiempo y trabajo.

- 52 -

CAPÍTULO VI

TRATAMIENTO: RECOMENDACIONES GENERALES

Un elevado porcentaje de cepas de S. aureus (más del 90%) tienen la

capacidad de producir β- lactamasas que inactivan a las penicilinas por lo

que para el tratamiento de las infecciones ocasionadas por este patógeno

se recurre con frecuencia a:

- Asociaciones de Penicilina con un inhibidor de Betalactamasas.

- Cefalosporinas (especialmente las de primera generación).

- Carbapenems.

- Penicilinas resistentes a la penicilinasa.

En el tratamiento de las infecciones en las que se sospecha la presencia

de S. aureus, sin duda alguna hay que tomar en cuenta, que puede no ser

el único patógeno presente en la lesión, pues a menudo en los focos

infecciosos pueden presentarse más de un microorganismo por lo que el

adecuado diagnóstico clínico cumple un rol fundamental para la elección

del tratamiento antibiótico empírico que debe iniciarse con premura,

pudiéndose modificar posteriormente con los resultados de sensibilidad

de la cepa aislada.

Debido a la falta de consenso para el tratamiento de estas infecciones se

tomará como base la “Guía de tratamiento antimicrobiano de la infección

por Staphylococcus aureus” y la “Guía de tratamiento de la infección

producida por Staphylococcus aureus resistente a meticilina” de la

Sociedad Española de Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española de

Medicina Interna (SEMI) y la GTIPO-Sociedad Española de

- 53 -

Anestesiología y Reanimación, elaboradas en el 2008 y 2013 por un

grupo de médicos representantes de las entidades antes mencionadas.

Dentro de las consideraciones más importantes al momento de la elección

del antibiótico en las diferentes infecciones, está el hecho de indagar

sobre la utilización de estos fármacos durante el último mes, pues pueden

existir residuos de los mismos que condicionan su uso, debido a que los

efectos terapéuticos no son los mejores cuando se encuentran

Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI) presentes ya en los

pacientes. Por ejemplo en el caso de SARM, si se trata con vancomicina,

solo se la utiliza si las CMI preexistente es menor de 1 mg/l, pues hay

varios estudios que indican que con CMI de 1,5 mg/l o superiores el

pronóstico de recuperación es muy bajo, incluso si se llega a una

concentración mayor de 15 mg/l, razón por la cual ha sido desplazada a

segundo plano en el tratamiento de infecciones por S. aureus. (Josep

Mensa, 2008).

6.1 Infecciones de Piel y partes blandas.

En el procedimiento diagnóstico de cualquier infección de la piel y los

tejidos blandos lo más importante es determinar la existencia o no de

necrosis y la profundidad de la afección.

Luego de realizada la valoración clínica basada en los antecedentes

personales y las manifestaciones clínicas, se puede realizar análisis

complementarios de laboratorio como: bioquímica sérica, biopsia, cultivo y

antibiograma, etc., lo cual no debería retrasar de ninguna manera el inicio

del tratamiento antibiótico, pues basado inicialmente en el diagnóstico

clínico debe iniciarse en forma precoz, por vía intravenosa con antibióticos

de amplio espectro debido a que en la mayoría de estas infecciones se

pueden encontrar varias bacterias y es difícil diferenciar unos cuadros de

- 54 -

otros. (Sociedad Española de Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española

de Medicina Interna (SEMI), 2006).

Una vez aislado el agente patógeno y comprobado que estamos en

presencia de S. aureus se puede iniciar el tratamiento específico

diferencial, si se trata de SASM o SARM, con las siguientes opciones:

6.1.1 Infección leve por SASM o SARM. Se puede atacar con

Amoxicilina/Clavulánico, Cefalexina, Clindamicina, Minociclina o

Doxiciclina, pero si el patógeno fuera SARM se prefiere Cotrimoxazol,

Clindamicina, Linezolid, Minociclina o Doxiciclina, aunque por ser una

afección leve en ocasiones el drenaje completo del forúnculo o absceso

cutáneo puede ser suficiente, pero se acompaña de antibiótico si el

paciente es de edad avanzada, si no se logra el drenaje completo, si hay

evidencia de celulitis, flebitis, fiebre, inmunodepresión o presencia de un

dispositivo o material protésico endovascular o endocardíaco. Puede

utilizarse Clindamicina 300 mg/8 h, Cotrimoxazol 800/160 mg/12 h o

Doxiciclina 100 mg/12 h, por vía oral. Para estos casos no hay un

medicamento que demuestre superioridad terapéutica sobre los otros.

(Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).

6.1.2 Infección de gravedad moderada o alta por SASM. Se opta por

utilizar como primera elección Cloxacilina + Clindamicina o Linezolid vía

endovenosa (EV) cada 4 horas o preferiblemente en infusión continua,

para mantener una mejor concentración sérica, y como segunda opción

monoterapia con Linezolid o Daptomicina. (Josep Mensa, 2008) (José

Mensa, 2013).

6.1.3 Infección de gravedad moderada o alta por SARM. Si el patógeno

fuera SARM como primera opción tenemos Linezolid o Daptomicina y

como segunda opción Vancomicina o Teicoplanina con las siguientes

dosis: Linezolid 600 mg/12 h oral o EV, Vancomicina 2 g/dia (500 mg/6h),

- 55 -

o Daptomicina 6 mg/kg 1 vez/24 h. En caso de infección grave o de

fascitis necrosante es aconsejable asociar Clindamicina 600-900 mg/6-8 h

EV con Vancomicina o Daptomicina. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa,

2013).

6.2 Osteomielitis aguda, Artritis e infecciones de material protésicoosteoarticular.

En las infecciones del material protésico articular, como primer paso es

recomendable efectuar el retiro del mismo y luego se puede iniciar el

tratamiento antibiótico aunque, “La asociación de Rifampicina con Ácido

Fusídico se ha empleado en el tratamiento de 20 casos de infección

aguda sobre material protésico producida por S. aureus (en 11 casos se

trataba de SARM). Se realizó desbridamiento quirúrgico, sin retirar la

prótesis y se obtuvo la curación en un 90% de pacientes” (Josep Mensa,

2008).

6.2.1 Osteomielitis o Artritis por SASM. El medicamento de primera

elección es la Cloxacilina vía EV en la fase aguda, dejando como

segunda elección Clindamicina, Linezolid o Clotrimoxazol, pero si se trata

de infección del material protésico osteoarticular es necesario iniciar con

Cloxacilina EV por 5 a 7 días y continuarlo con Levofloxacino +/o

Rifampicina y como segunda opción tenemos Linezolid + Rifampicina,

Cotrimoxazol o Clindamicina + Rifampicina. (José Mensa, 2013) (Josep

Mensa, 2008).

6.2.2 Osteomielitis o Artritis por SARM. Tenemos como primera elección

Linezolid o Daptomicina dejando como alternativa Clindamicina,

Vancomicina y Teicoplanina. Tras el tratamiento por vía EV de la fase

aguda, puede continuarse por vía oral, con Linezolid, Cotrimoxazol o

Clindamicina, o asociaciones de Rifampicina con Cotrimoxazol,

Clindamicina o Ácido Fusídico, pues se ha observado clínicamente el

- 56 -

fracaso de cerca del 50% de los casos en el tratamiento de osteomielitis

por SARM con Vancomicina mientras que con Linezolid se alcanzó el

80% de efectividad. (José Mensa, 2013) (Josep Mensa, 2008).

Para las infecciones moderadas o graves de material protésico articular

por SARM se aconseja iniciar con Daptomicina + Rifampicina vía EV por 5

a 7 días y continuar con la asociación de Linezolid ± Rifampicina dejando

como alternativa la utilización de Cotrimoxazol o Clindamicina +

Rifampicina. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).

6.3 Bacteriemia primaria o asociada a infección del catéter vascular.

En este caso, lo primero es retirar el catéter y a continuación iniciar con el

tratamiento antibiótico.

6.3.1 Bacteriemia producida por SASM. Luego de retirar el catéter

vascular, el antibiótico de elección es la Cloxacilina vía EV, también

puede emplearse Amoxicilina-Ácido Clavulánico, Clindamicina, o

Minociclina en monoterapia o una Fluoroquinolona (Levofloxacino o

Moxifloxacino) asociada a Rifampicina, siempre teniendo en cuenta la

función renal. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).

6.3.2 Infección es producida por SARM. Tomando en cuenta que la

Vancomicina que hasta hace pocos años fuera considerada la primera

elección y de a poco ha sido desplazada, se recomienda el uso de

Daptomicina vía EV como antibiótico de primera elección, dejándola como

segunda opción junto a Linezolid, Clotrimoxasol, Minociclina y

Teicoplanina. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).

- 57 -

Dentro de las consideraciones especiales que deben ser tomadas en

cuenta al momento de la terapia antibiótica de la bacteriemia, se puede

agregar elementos que guían la decisión de suspender o continuar el

tratamiento EV, entre las que se puede mencionar que si se obtienen

hemocultivos negativos en las primeras 24-48 horas de tratamiento por

vía EV, el paciente se encuentra sin fiebre, estable y sin evidencia clínica

de metástasis, se puede completar el tratamiento por vía oral. (Josep

Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).

6.4 Endocarditis.

En este caso hay que diferenciar también si la válvula afectada es natural

o prótesis.

6.4.1 Endocarditis de válvula nativa por SASM. La primera elección es la

terapia mixta con Cloxacilina ± Gentamicina vía EV de 3 a 5 días, pero en

este caso debido la presencia del Aminoglucósido, se hace indispensable

vigilar la función renal, y en caso de que el paciente además reciba otra

medicación potencialmente nefrotóxica o que el filtrado glomerular sea

menor de 40 mL/min, la Gentamicina debe ser sustituida por Daptomicina.


6.4.2 Endocarditis de válvula nativa por SARM. Daptomicina +

Fosfomicina y/o Gentamicina EV de 3 a 5 días es el tratamiento de

elección, dejando la Vancomicina como segunda opción bajo la condición

de que la CMI previa se menor a 1mg/L. También hay que tomar en

consideración la vigilancia de la función renal como en el caso anterior.


- 58 -

6.4.3 Endocarditis de válvula protésica por SASM. Se recomienda en este

caso Cloxacilina + Gentamicina por 15 días y continuar con Rifampicina,

tomando en cuenta siempre la función renal para ver la conveniencia de

cambiar la Gentamicina con por una Quinolona si la cepa es sensible. El

tratamiento con Rifampicina se puede iniciar a partir del tercer o quinto

día. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).

6.4.4 Endocarditis de válvula protésica por SARM. La primera elección de

antibioticoterapia es Daptomicina + Rifampicina + Fosfomicina y/o

Gentamicina, teniendo en cuenta la toxicidad renal por la Gentamicina y la

sensibilidad de la cepa a la Fosfomicina que de ser resistente, se debe

considerar la sustitución con Cloxacilina o Cotrimoxazol. Como segunda

elección tenemos Vancomicina + Gentamicina por 15 días + Rifampicina.

Otra alternativa es la Daptomicina sola o asociada a Gentamicina. (Josep

Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).

6.5 Neumonía.

6.5.1 Neumonía por SASM. Está recomendado el tratamiento con

Cloxacilina, pero si la cepa fuera productora de PVL (Leucocidina de

Panton-Valentine) se aconseja la asociación con Linezolid o Clindamicina.


6.5.2 Neumonía por SARM. Linezolid es la primera opción para el

tratamiento de neumonía por SARM, pero si el proceso cursa con

bacteriemia debe considerarse su asociación con Daptomicina. Como

tratamiento alternativo se puede aplicar Vancomicina ± Rifampicina. La

Daptomicina pierde parcialmente su efecto en contacto con el surfactante

pulmonar por lo que no se recomienda su uso en este caso.


- 59 -

“En dos estudios aleatorizados, realizados a doble ciego en pacientes

adultos con neumonía comunitaria, Daptomicina administrada a dosis de

4 mg/kg/día fue significativamente inferior a Ceftriaxona 2 g/día” (Josep

Mensa, 2008).

6.6 Infección del sistema nervioso central. (Meningitis, Abscesocerebral o epidural, Empiema subdural, Trombosis séptica de lossenos venosos).

6.6.1 Infección del sistema nervioso central por SASM. Como en los

casos anteriores la principal opción es Cloxacilina.

6.6.2 Infección del sistema nervioso central por SARM. Linezolid es la

primera opción, considerando la posibilidad de adicionar al tratamiento

Vancomicina (vía intratecal en dosis de 10 mg) o Fosfomicina. Tomar en

cuenta que los corticoides pueden reducir la difusión de Vancomicina en

las meninges.

En los pacientes con alergia a los betalactámicos se puede emplear

Aztreonam, Amikacina o una Fluoroquinolona (Ciprofloxacino o

Levofloxacino) asociada con Metronidazol y Linezolid o un Glucopéptido.

La Tigeciclina, por su amplio espectro que incluye SARM, enterobacterias

productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y

microorganismos anaerobios, puede ser una opción en monoterapia para

los pacientes alérgicos a los betalactámicos. (Sociedad Española de

Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española de Medicina Interna (SEMI),

2006).

- 60 -

CAPÍTULO VII

DISEÑO METODOLÓGICO

7.1 Tipo de Investigación.

La investigación que se desarrolló fue de tipo analítico descriptivo y

experimental de laboratorio.

7.1.1 Universo. El universo está constituido por los equipos, instrumentos

y superficies que permanecen en las dos salas de quirófano y la sala de

cuidados intensivos con dos camas, existentes en el Hospital Docente

Universitario Católico.

7.1.2 Muestra. Se tomaron aleatoriamente 50 muestras de los equipos,

instrumentos y superficies que cumplen con los criterios de inclusión.

7.2 Criterios de inclusión.

Muestras de instrumental, equipos y superficies de las áreas de

quirófano y sala de cuidados intensivos (con mayor frecuencia de

uso y/o mayor dificultad para limpieza y esterilización).

- 61 -

7.3 Criterios de exclusión.

Muestras de instrumental, equipos y superficies del área de

consulta externa.

7.4 Equipos.

Cámara de flujo laminar con luz UV.

Estufa de incubación

Congelador

Centrifuga

Termociclador Piko (Finnzymes).

Cámara de electroforesis y fuente de poder.

Transiluminador UV.

7.5 Materiales y Reactivos.

Cepa ATCC 11632 S. aureus productora de betalactamasa

Cepa ATCC 43300 S. aureus resistente a la meticilina

Cepa ATCC 12344 Streptococcus pyogenes (control negativo)

Primer blaZ 1: 5’-GTTGCGAACTCTTGAATAGG-3’

Primer blaZ 2: 5’-GGAGAATAAGCAACTATATCATC-3’

Primer mecA F: 5’-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATGA-3’

Primer mecA R: 5’-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA-3’

Primer Tn1: 5’-GACTATTATTGGTTGATCCACCTG-3’ (gen nuc)

Primer Tn2: 5’-GCCTTGACGAACTAAAGCTTCG-3' (gen nuc)

SDS 1% en NaOH 2,5N (solución de lisis)

Mastermix GoTaq Green 2X de Promega

- 62 -

Ladder

Blue Juice 10X

Agar sangre

Agar manitol salado

Agar DNAsa

HCl 1% Agar Mueller Hinton

Agarosa

Caldo Tripticasa Soya

TAE 40X

Agua ultrapura libre de DNAsa

Bromuro de etidio

Discos de sensibilidad (9 antibióticos)

Cajas Petri

Tubos Eppendorf

Tubos de PCR (0,2 ml)

Lámpara de alcohol

Asa bacteriológica

7.6 Criterios de validez y confiabilidad del procedimiento.

El obtener un sistema de identificación preventiva de una de las bacterias

más frecuentes como lo es Estafilococo dorado resistente a la Penicilina y

la Meticilina (antibióticos del grupo de los β-Lactámicos), el cual brinde

algunas ventajas como rapidez, bajo costo y alta sensibilidad, es sin duda

de gran ayuda para el personal de salud que labora en los hospitales y

para los pacientes que necesitan utilizar los quirófanos y salas de

cuidados intensivos.

Por este motivo, nuestro propósito ha sido desarrollar un método basado

en las bondades de la biología molecular como la PCR y la electroforesis,

con el cual se pueda identificar cepas de Estafilococos dorados

- 63 -

productora de β-Lactamasas (resistentes a Penicilina) y simultaneamente

cepas productoras de PBP2a (resistentes a Meticilina).

Para garantizar la efectividad del procedimiento se trabajó con cepas

ATCC de Staphylococcus aureus: la cepa 11632 productora de β-

lactamasa para detectar la presencia del gen blaZ y la cepa 43300

resistente a la Meticilina, para la detección del gen mecA.

Como primer paso se trabajó por separado con estas dos cepas,

siguiendo los pasos establecidos en investigaciones anteriores como las

descritas por John Elmerdahl Olsen, 2006 quien trabajó con el gen blaZ, y

Mogahid M. Elhassan, 2015 y Ewan M. Harrison, 2014 quienes trabajaron

con el gen mecA.

7.6.1 Trabajo con cepa ATCC 11632. Se realizaron varias tareas que se

detallan a continuación:

7.6.1.1 Siembra en Agar Sangre. Esta cepa ATCC de S. aureus, fue la

primera con la cual se trabajó sembrándola en agar sangre, e incubándola

a 37ºC por 24 horas.

7.6.1.2 Extracción de ADN. Para este procedimiento se utilizó la solución

de lisis formada por SDS (dodecilsulfato sódico) al 1% en NaOH 0,25N y

ebullición como se detalla a continuación:

a. Se tomó con un asa bacteriológica en anillo colonias de la

siembra en agar sangre y se suspendió en tubos eppendorf con1

ml de agua destilada estéril.

b. A continuación se centrifugó 10 minutos a 3000rpm y se

descartó el sobrenadante.

c. Agregamos 50 µl de solución de lisis, dimos vortex y llevamos

los tubos al calor, introduciéndolos en agua en ebullición por 15

minutos.

- 64 -

d. Agregamos 450 µl de agua libre de nucleasas y centrifugamos

por 20 seg.

7.6.1.3 PCR. Posteriormente se desarrolló la PCR en un termociclador

PIKO con capacidad para volumen final de 20µL, para lo cual se empleó

la mastermix GoTaq Green 2X de Promega la que suministra la

polimerasa en un tampón de reacción con pH 8,5, 400μM dATP, 400μM

dGTP, 400μM dCTP, 400μM dTTP y 3 mM MgCl2, un tampón verde que

aumenta la densidad de la muestra y los tintes amarillo y azul que

funcionan como colorantes de carga cuando los productos de la reacción

se analizar por electroforesis. Se aplicó el siguiente protocolo:

a. Desnaturalización inicial 5 min X 94 ºC,

b. 34 ciclos de:

i. 1 min X 94ºC para desnaturalización,

ii. 1 min X 54ºC para alineamiento,

iii. 1 min X 72ºC para elongación,

c. Elongación final de 72ºC X 10 minutos.

Los “primers” o cebadores utilizados fueron 5’-

GTTGCGAACTCTTGAATAGG-3’ y 5’-GGAGAATAAGCAACTATATCATC-3’

que generan un amplicón de 674 pb, tanto los primers (par 486-488)

como el protocolo de amplificación fueron descritos por (John Elmerdahl

Olsen, 2006). Se probó diferentes mezclas para identificar la cantidad

óptima de ADN con la que se trabajará las siguientes PCR con el objeto

de amplificar el gen blaZ, las cuales se detallan en el cuadro a

continuación:

Master mix µl 10 10 10 10 10 10 10 10Primer 1 µl 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5Primer 2 µl 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

ADN µl 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5Agua µl 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5

Volumen final µl 20 20 20 20 20 20 20 20Cuadro 6. Volúmenes con los que se trabajó para la amplificacióninicial del gen blaZ.

- 65 -

Fig. 15 Protocolo de PCR para amplificar el gen blaZdescrita por John Elmerdahl Olsen, 2006.

7.6.1.4 Electroforesis horizontal. Finalmente se realizó la electroforesis en

gel de Agarosa al 1,5% con los amplicones obtenidos en la PCR antes

mencionada y se pudo apreciar que el mejor resultado de amplificación se

obtuvo con 1,5 µl de ADN.

7.6.2 Trabajo con cepa ATCC 43300. Se trabajó con la cepa ATCC S.

aureus 43300 portadora del gen mecA, repitiendo los protocolos de

extracción de ADN y de Electroforesis llevados a cabo con la cepa ATCC

11632 y variando únicamente en la PCR.

7.6.2.1 PCR. El protocolo de PCR aplicado fue:


b. 30 ciclos de:


ii. 30 seg X 62ºC para alineamiento,

iii. 35 seg X 72ºC para elongación,


Los cebadores específicos utilizados son F: 5’-

GTAGAAATGACTGAACGTCCGATGA-3’ y R: 5’-

- 66 -

CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA-3’ que generan un amplicón de 310

pb. Los primers y protocolos de PCR fueron descritos por (Mogahid M.

Elhassan, 2015) y (Ewan M. Harrison, 2014).

Fig. 16 Protocolo de PCR para amplificar el gen mecA.

Los volúmenes de reactivos utilizados para la amplificación del gen

mecA, en la cual se buscaba la cantidad óptima de ADN se indican en

el cuadro 7.

Master mix µl 10 10 10 10 10 10 10

Primer 1 µl 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

Primer 2 µl 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

ADN µl 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Agua µl 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3

Volumen final µl 20 20 20 20 20 20 20Cuadro 7. Volúmenes utilizados para la amplificación inicial del

gen mecA.

- 67 -

7.6.2.2 Electroforesis horizontal. Se procedió con la electroforesis con

diferentes concentraciones de ADN para evaluar cuál es el volumen

óptimo de ADN para el trabajo.

7.6.3 Trabajo simultaneo con las dos cepas ATCC. Probados los

reactivos, primers y la cantidad optima de ADN de las dos cepas

individualmente al obtener los respectivos amplicones, se procedió a

buscar un protocolo con el que se logre amplificar tanto el gen blaZ como

el mecA, para lo cual tuvimos que probar inicialmente con el protocolo con

el que se amplificó el gen blaZ, una variedad de éste con 30 ciclos en

lugar de los 34 llevados a cabo en la PCR inicial, y finalmente un

protocolo con temperatura de hibridación intermedia que se describe a

continuación:


b. 34 ciclos de:


ii. 1 min X 58ºC para alineamiento,

iii. 1 min X 72ºC para elongación,


Se pudo apreciar que el mejor resultado se obtuvo con el protocolo 2 que

consiste en: 5 minutos a 94°C para la desnaturalización inicial, seguido de

30 ciclos de 1 minuto a 94 °C para desnaturalización, 1 minuto a 54 °C

para alineamiento y 1 minuto a 72 °C para elongación. La elongación final

fue de 10 minutos a 72 °C.

7.6.4 Otras pruebas. Además a las cepas ATCC se realizó las pruebas

de:

ADNasa

- 68 -

Fig. 17: prueba de ADNasa positiva para las dos cepas ATCC.

Antibiograma en agar Mueller Hinton con discos de sensibilidad

de: Penicilina (P 10U), Amoxicilina (AX 25mcg), Netilmicina (NET

30 mcg), Cefuroxima (CXM 30 mcg), Ceftriaxone (CRO 30 mcg),

Meticilina (ME 5mcg), Vancomicina (VA 30mcg), Oxacilina (OX

1mcg), y Cloxacilina (CX 1mcg).

Fig. 18: Antibiograma cepa sensible a Cefuroxime, Meticilina y

Ceftriaxone.

Fig. 19: Antibiograma, cepa sensible únicamente a Cefuroxime.

- 69 -

Siembra en manitol.

Fig. 20: Las dos cepas ATCC viran el agar manitol salado.

Prueba de la catalasa.

Prueba de la Coagulasa.

Fig. 22 Cepa ATCC 11632 y cepa ATCC 43300 son Coagulasa positivas.

Fig. 21: Cepa ATCC 11632 y la cepa ATCC 43300positivas a prueba de la catalasa.

- 70 -

7.7 Análisis del Manipulador.

Para un trabajo completo también se realizó análisis del manipulador

como se muestra a continuación:

7.7.1. Toma de muestra de las fosas nasales. Se realiza con hisopo estéril

y se siembra en agar manitol salado. A las 24 horas se obtiene

crecimiento de colonias y viraje del medio del que se toman algunas

colonias para realizar extracción de ADN, PCR (con los 3 pares de

primers) y electroforesis horizontal.

Fig. 23. Prueba de Manitol del manipulador.

7.7.2. Antibiograma. Se realizó el antibiograma (se observa sensibilidad

únicamente para Cefuroxima), y se siembra en agar sangre del que se

realiza las pruebas de la coagulasa y catalasa que dan resultado positivo.

Fig. 24. Antibiograma de muestra del Manipulador.

- 71 -

7.7.3. Prueba de la coagulasa. Las colonias del manipulador dan

resultado positivo para la prueba de la coagulasa.

Fig. 25 Coagulasa y catalasa positivas del manipulador.

7.7.3. Extracción de ADN, PCR y electroforesis horizontal. Luego de la

extracción de ADN con el protocolo enunciado en el punto 7.6.1.2, se

realiza la reacción en cadena de la polimerasa y electroforesis horizontal,

donde se encuentra el gen nuc (este gen está presente en todas las

cepas de Staphylococcus aureus) en las dos cepas control, y; en el

manipulador se identifican los genes nuc, blaZ (codifica para

Betalactamasa) y mecA (codifica para PBP2a). Además en la cepa ATCC

12344 de Streptococcus pyogenes que se utilizó como control negativo no

se encontró amplicón de ninguno de los tres genes.

Para la amplificación del gen nuc en las cepas control y del manipulador

de S. aureus se trabaja con 1,5 µl de ADN y se utilizaron los cebadores

Tn1 5’-GACTATTATTGGTTGATCCACCTG-3’ y Tn2 5’-

GCCTTGACGAACTAAAGCTTCG-3’ que generan un amplicón de 218pb.

(Florence Depardieu, 2004 ).

7.8 Procedimiento técnico de campo.

Debido a que el manipulador es portador asintomático, se enfatiza en las

medidas de seguridad para evitar contaminación de las muestras.

- 72 -

7.8.1 Toma de muestras. La correcta toma de muestras es crucial para el

éxito de todo el procedimiento, pues podría obtenerse falsos negativos. La

toma de muestras en el Hospital Docente Universitario Católico se realizó

en instrumental, equipos y superficies de las áreas de quirófano y sala de

cuidados intensivos (con mayor frecuencia de uso y/o mayor dificultad

para limpieza y esterilización) y se trasladó las mismas hasta el

laboratorio en tubos eppendorf con 1 ml de caldo Tripticasa Soya o TSB

(Tryptic Soy Broth), en el cual se obtiene un buen crecimiento de S.

aureus y contiene por cada 1000 ml:

Triptona 17,0 g

Fitona(peptona de soya) 3,0 g

Cloruro de sodio 5,0 g

D(+) glucosa 2,5 g

Fosfato dipotásico 2,5 g

Agua destilada 1,0 L.

(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013).

Se preparó 100 ml de Caldo Tripticasa Soya, para lo cual se pesó 3

gramos de medio deshidratado y se diluyó en 100 ml de agua destilada,

calentando suavemente se agitó hasta disolución total y se colocó en

autoclave a 121ºC por 15 minutos. Se dispensó 1 ml del preparado en

tubos eppendorf previamente enumerados (del 1 al 50 por duplicado) y

esterilizados por 15 minutos en luz UV de la cámara de flujo laminar,

ayudándonos con una pipeta micrométrica de 1000µl y puntas con filtro.

Ayudándonos de hisopos estériles humedecidos en Caldo Tripticasa Soya

al momento de la toma de muestras y luego de la toma se retira los

excedentes del medio de cultivo líquido con swabs comerciales con

alcohol isopropílico al 70%. Se tomó un total de 50 muestras en los

quirófanos y sala de cuidados intensivos del Hospital Docente

Universitario Católico como se detalla a continuación:

- 73 -

- EN EL QUIRÓFANO 1

1. Mascarilla de anestesia general (verde)

2. Mascarilla de anestesia general (azul)

3. Mascarilla de anestesia general infantil (blanca)

4. Filtro bacteriano

5. Tubo para anestesia

6. Conector 1 de mascarilla

7. Conector 2 de mascarilla

8. Cánula grande

9. Cánula mediana

10.Cánula pequeña

11.Piso (esquina)

12.Lámpara

13.Mesa para instrumental

14.Mesa de materiales

15.Semiluna para instrumental

- EN EL QUIRÓFANO 2

16.Mascarilla para anestesia general (azul)

17.Ambo (insuflador) para oxigeno (grande)

18.Conector de mascarillas

19.Conector de salida de oxígeno

20.Filtro bacteriano

21.Salida de aire de la máquina de anestesia

22.Cánula grande

23.Cánula pequeña

24.Ambo (insuflador) para oxígeno (pequeño)

25.Mesa para materiales

26.Mesa para instrumental

27.Semiluna para instrumental

- 74 -

28.Piso (esquina)

29.Lámpara

30. Interruptores para la luz

- EN LA SALA DE CUIDADOS INTENSIVOS, CAMA 1

31.Equipo de intubación

32.Soporte para sueros

33.Superficie de la ventana

34.Superficie metálica de la cama

35.Coche de paro

36.Mesa del coche de paro

37.Manija de mesa de materiales

38.Superficie de lámpara para radiografías

39.Equipo de succión

40.Conector del equipo de succión

- EN LA SALA DE CUIDADOS INTENSIVOS, CAMA 2

41.Filtro de manguera de succión

42.Equipo de succión tapa interna

43.Equipo de succión tapa externa

44.Equipo de succión superficie

45.Monitor signos vitales

46.Bomba para sueros (superior)

47.Bomba para sueros (inferior)

48.Piso esquina 1

49.Piso esquina 2

50.Manija de cortina separadora de camas.

Se decide tomar las muestras en diferentes puntos de cada una de las

áreas, debido a la realidad diferente de cada una de ellas.

- 75 -

La toma de muestras se realizó cumpliendo las condiciones de asepsia

para evitar contaminación, fueron debidamente documentadas y la

descripción gráfica de las mismas se encuentra en la sección de anexos.

Se transporta las muestras al laboratorio y se colocan en incubación a

37°C durante 4 horas para obtener una mayor cantidad de bacterias en

caso de estar presentes en las muestras tomadas.

Una vez se ha cumplido el tiempo de incubación (4h), se siembra en Agar

Manitol Sal para ser incubados por 24 horas a 37°C y los hisopos se

vuelven a sembrar en nuevos eppendorf con Caldo Tripticasa Soya por 18

horas para realizar pruebas comprobatorias, mientras que el producto de

los tubos incubados por cuatro horas se lleva para el proceso de

extracción de ADN. Después de las 24 horas de incubación en Manitol no

se encuentran crecimiento por lo que se deja incubar por 24 horas más.

Con estas colonias se realiza una siembra en agar sangre del que se

toma unas muestras para realizar el antibiograma con discos de

sensibilidad de: Penicilina (P 10U), Amoxicilina (AX 25mcg), Netilmicina

(NET 30 mcg), Cefuroxima (CXM 30 mcg), Ceftriaxone (CRO 30 mcg),

Meticilina (ME 5mcg), Vancomicina (VA 30mcg), Oxacilina (OX 1mcg), y

Cloxacilina (CX 1mcg); y las pruebas de catalasa, coagulasa y DNAsa.

7.8.2 Extracción de ADN. En el laboratorio se realiza la extracción del

ADN mediante el protocolo que se describe a continuación:

Los 50 tubos Eppendorf se coloca en centrifugación por 10 minutos

a 2500 rpm, para precipitar las bacterias (si existieran) en los tubos

incubados por cuatro horas.

Se descarta el sobrenadante y al pellet se agrega 50 µl de solución

de lisis y se lleva a ebullición por 15 minutos.

Se agrega 450 µl de agua destilada libre de nucleasas.

- 76 -

Se centrifuga 20 segundos a 3000 rpm.

Se colocan en congelación hasta el momento de la PCR.

Se repite el mismo procedimiento con los tubos incubados por 18

horas.

7.8.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se realizó la PCR de

las extracciones de ADN del paso 7.7.1, siguiendo el protocolo que se

validó en el literal 7.6.3 (Trabajo simultáneo con las dos cepas ATCC) y

que se describe a continuación:


b. 30 ciclos de:

iv. 1 min X 94ºC para desnaturalización,

v. 1 min X 54ºC para alineamiento,

vi. 1 min X 72ºC para elongación,


Se realiza primero la PCR para amplificar el gen nuc (el que nos permitirá

conocer si las muestras poseen o no S. aureus) desde el ADN extraído

desde las muestras incubadas en Caldo Tripticasa Soya, utilizando 1,5 µl

de ADN pero no se consigue amplicones para el gen nuc por lo que se

intenta con volúmenes de 3µl y 4µl para encontrar la cantidad adecuada

de ADN con el cual se trabajaran las muestras, así se obtuvo que 4µl es

el volumen óptimo para este fin.

7.8.4 Electroforesis horizontal. Se trabaja con el mismo protocolo de

electroforesis validado en los trabajos con la cepa ATCC 11632 y la cepa

ATCC 43300, es decir 70V, 70A y 50 W por 2 horas para lograr una

buena separación de los amplicones y la escalera alélica.

- 77 -

7.8.5 Flujograma de toma de muestras y extracciónde ADN

1 mlCaldo

TripticasaSoya

Tomar lamuestra

conhisopoestéril

Incubarpor 4

horas a37°C

Colocarel hisopo

en eltubo

Centrifugarpor 10

minutos a2500 rpm

Descartar elsobrenadante

Colocar50 µl desoluciónde lisis

Vortex,luegoebulliciónpor 15 min

Colocar450 µl de

aguaultrapura

Centrifugar 20 seg. a3000 rpm y congelar

hasta la PCR

Incubar enManitol por 24

horas a 37°C

Incubar enManitol por 24

horas más a 37°C

Antibiograma

Incubar en CTSpor 18 horas a

37°C

- 78 -

7.8.6 Flujograma de PCR

Preparación de master mixColocar 10µl demaster mixpor cadareacción

Agregar1,5 µldeprimerF y R

Añadir 5,5µl de agualibre deDNAsas

DarVortex

Dispensar18,5 µl demezcla encadapocillo

Adicionar1.5 µl deADN

Sellar yetiquetarLlevar al

termociclador

Revelar conelectroforesis

- 79 -

CAPÌTULO VIII

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

8.1 Resultados del Diseño Metodológico

Fig. 26. Staphylococcus aureus cepa ATCC 11632 en agar sangre.

Fig. 27 Resultado de PCR y electroforesis con el amplicón obtenido de la

cepa ATCC 11632.

- 80 -

Fig. 28. Staphylococcus aureus cepa ATCC 43300 en agar sangre.

Fig. 29. Resultado de PCR y electroforesis de la cepa ATCC 43300. Para

un volumen final de PCR de 20 µL se probó con volúmenes diferentes de

ADN (1 a 4 µL), obteniendo buena amplificación con todos los volúmenes.

Fig. 30. Resultado de la prueba de diferentes protocolos de amplificación.

- 81 -

Fig. 31. Electroforesis muestra presencia de los genes blaZ y nuc en lacepa ATCC 11632, amplicones del gen mecA y nuc en la cepa ATCC43300, amplicones de los genes blaZ, mecA y nuc en la muestra delmanipulador y ausencia de amplicones para los genes blaZ, mecA y nucen la cepa ATCC 12344 de Streptococcus pyogenes (control negativo).

8.2 Resultados de la Centrifugación.

Tras la centrifugación de las muestras incubadas por cuatro horas se

encontró pellet en 7 tubos y al realizar la centrifugación de los Eppendorf

de las mismas muestras incubados por 18 horas tenemos mayor

crecimiento.

Fig. 32 Tubos eppendorf con pellet que corresponden a las muestras 2,31, 33, 37, 39, 41 y 48.

- 82 -

Estos tubos son llevados para la extracción de ADN, posterior PCR y

finalmente Electroforesis horizontal.

8.3 Resultados de siembra en agar Manitol Salado.

Después de 24 horas de incubación a 37ºC, no hubo crecimiento en

ninguna de las 50 muestras sembradas en agar manitol.

Fig. 33. No se encuentra crecimiento en manitol salado tras 24 horas deincubación.

Se dejó incubar por 24 horas más y se revisó a las 48 horas de

incubación, encontrando crecimiento en las cajas correspondientes a las

muestras un número 2, 31 y 39, y que coinciden con las muestras que

presentaron pellet en el Caldo Tripticasa Soya.

- 83 -

8.4 Resultados de antibiograma, prueba de coagulasa y catalasa, delas muestras positivas para S. Aureus:

2 31 39

Fig. 35. Antibiograma de muestras positivas para Staphylococcus aureusse trabajó con los siguientes antibióticos: 1. Penicilina (P 10U), 2.Ceftriaxone (CRO 30 mcg), 3. Amoxicilina (AX 25mcg), 4. Netilmicina

Fig. 34 Tras 48 horas de incubación se aprecia poco crecimiento en 3muestras (número: 2, 31 y 39), lo que indica pocas colonias en lassuperficies donde se tomó las muestras.

- 84 -

(NET 30 mcg), 5. Cefuroxima (CXM 30 mcg), 6. Oxacilina (OX 1mcg), 7.Cloxacilina (CX 1mcg), 8. Meticilina (ME 5mcg), y 9. Vancomicina (VA30mcg). Se revela sensibilidad de la muestra #2 a: Penicilina, Amoxicilina,Netilmicina, Meticilina y Vancomicina; y resistencia a Cefuroxima,mientras que las Muestras # 31 y 39 presentan resistencia prácticamentea todos los antibióticos probados, apenas se aprecia un pequeño halo deinhibición alrededor de Netilmicina.

8.5 Resultados de electroforesis horizontal de muestras 2, 31 y 39.

Las muestras que resultaron positivas para Staphylococcus aureus tanto

en los métodos tradicionales como con PCR, fueron:

a) La muestra número 2 tomada de la Mascarilla de anestesia general

(azul) en el quirófano 1

b) La muestra número 31, tomada en el Equipo de intubación de la cama

1 de la sala de cuidados intensivos

c) La muestra número 39 tomada en el Equipo de succión de la cama 1

de la sala de cuidados intensivos

2 31 39

Fig. 36 Superficies que dieron positivo para S. aureus, en las muestras

tomadas

- 85 -

Fig.37. Electroforesis de amplicones del gen nuc, resultado de PCRcon 3µl y 4 µl de ADN extraído desde las muestras incubadas enCaldo Tripticasa Soya, se busca identificar la cantidad óptima de ADNpara amplificación. Se opta por trabajar con 4µl por que se obtieneresultados homogéneos.

Fig.38. Resultado de la Electroforesis en la que se puede identificaramplicones para los genes blaZ y mecA en las cepas control y lasmuestras 2, 31 y 39:

1.-El gen blaZ presente en la cepa ATCC 11632 (control positivo),muestra 31 y muestra 39 y ausente en la cepa ATCC 12344 deStreptococcus pyogenes (control negativo) y muestra 2.

2.- El gen mecA presente en la cepa ATCC 43300 (control positivo),muestra 31 y muestra 39; y ausente en la cepa ATCC 12344 deStreptococcus pyogenes (control negativo) y muestra 2.

- 86 -

Grafico 1: Muestras positivas para S. aureus de las muestras tomadas enel Hospital Docente Universitario Católico.

- 87 -

GEN nuc PRUEBASMICROBIOLÓGICAS

MUESTRAS POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO1 X X2 X X3 X X4 X X5 X X6 X X7 X X8 X X9 X X

10 X X11 X X12 X X13 X X14 X X15 X X16 X X17 X X18 X X19 X X20 X X21 X X22 X X23 X X24 X X25 X X26 X X27 X X28 X X29 X X30 X X31 X X32 X X33 X X34 X X35 X X36 X X37 X X38 X X39 X X40 X X41 X X42 X X43 X X44 X X45 X X46 X X47 X X48 X X49 X X50 X X

Cuadro 8: Concordancia 100% de los resultados por PCR y métodos

tradicionales en la identificación de S. aureus

- 88 -

Grafico 2: se aprecia presencia de los genes blaZ y mecA en los controlespositivos y las muestras # 31 y 39, y ausencia en la muestra 2 y controlnegativo.

8.6 Conclusiones.

1.- Utilizando como control positivo las cepas ATCC 11632 y 43300 de

Staphylococcus aureus y como control negativo la Cepa ATCC 12344 de

Streptococcus pyogenes, se implementó la técnica de Reacción en

Cadena de la Polimerasa para la detección de los genes blaZ y mecA en

S. aureus productores de β Lactamasa y PBP2a, encontrando que el

protocolo que logra la amplificación simultanea de los genes antes

mencionados más el gen “nuc” es el siguiente: 5 minutos a 94°C para la

desnaturalización inicial, seguido de 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C para

desnaturalización, 1 minuto a 54 °C para alineamiento y 1 minuto a 72 °C

para elongación. La elongación final fue de 10 minutos a 72 °C.

2.- De un total de cincuenta muestras tomadas en los quirófanos y salas

de cuidados intensivos del Hospital Universitario Católico de Cuenca,

mediante PCR se identificó en dos muestras los genes nuc, blaZ y mecA

ATCC11632

ATCC12344

Muestra2

Muestra31

Muestra39

IDENTIFICACION DEL GENblaZ

PRESENCIA AUSENCIA

ATCC43300

ATCC12344

Muestra2

Muestra31

Muestra39

IDENTIFICACION DEL GENmecA

PRESENCIA AUSENCIA

- 89 -

lo que indica que son cepas de Staphylococcus aureus productoras de β-

Lactamasas y PBP2a. Se encontró también una muestra positiva de S.

aureus sensible a los β Lactámicos, en la que se amplifica ni únicamente

el gen nuc, lo cual fue comprobado mediante los métodos tradicionales

como siembra en manitol y el antibiograma, así pues, se observó que la

PCR es un método 100% sensible y específico para detección de este

patógeno.

3.- Se estableció que el área más afectada por la presencia de

Staphylococcus aureus productores de β-Lactamasas y PBP2a en el

Hospital Universitario Católico de Cuenca, es la sala de cuidados

intensivos en donde se encontraron dos (muestras # 31 y 39) de las tres

muestras positivas del total de 50 muestras tomadas y la tercera muestra

positiva (muestra# 2) se encontró en una de las mascarillas de anestesia

general del quirófano # 1.

- 90 -

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Anexos.QUIRÓFANO 1

1 2 3 4

5 6 7 8

9 10 11 12

13 14 15

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QUIRÓFANO 2

16 17 18 19

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CAMAS 1 Y 2 DE LA SALA DE CUIDADOS INTENSIVOS

31 32 33 34

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