universidad de buenos aires facultad de farmacia y …
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Tesis para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires
Lic. Antonela Díaz Nebreda
“Mecanismos moleculares de la regulación cruzada
entre los receptores H1 y H2 a histamina. Relevancia
terapéutica”
Directora: Dra. Carina Shayo Consejera de estudios: Dra. Vanina Medina
Año: 2019
Laboratorio de Patología y Farmacología Molecular Instituto de Biología y Medicina Experimental (IByME)-
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
(CONICET).
Agradecimientos
Ante todo, agradezco a mi directora de tesis Carina, quien, a pesar de no
conocerme inicialmente, apostó por dirigir y apoyarme en estos 5 años de
trabajo juntas. Gracias, por tu paciencia que me enseñó día a día a investigar,
por trabajar conmigo a la par, siempre. Gracias por escucharme y brindarme
cálidos consejos, por acompañarme en los almuerzos y en tantas lindas charlas.
Quiero agradecerte, sobre todo, por ayudarme incondicionalmente con la
realización de los diferentes trabajos y, obvio, la tesis.
A Naty, Fede y Carlos, por ser excelentes personas, muy divertidos y
siempre predispuestos, a ayudarnos en cada momento aportando de su gran
sabiduría. Gracias por compartir conmigo congresos, papers, reuniones, su
amistad y conocimiento incondicional.
A mis compañeros de laboratorio. Los pasados: Fede y Sabri, quienes me
enseñaron las bases del funcionamiento del laboratorio, así que los recuerdo
con mucho afecto. Los actuales: Angy, gracias por ayudarme cuando lo necesité.
Por cuidar mis células en cultivo y ayudarme en las tareas cotidianas del
laboratorio. Gracias por tus palabras de aliento y por ser tan respetuosa y
divertida; Ani, gracias por contagiar a todos de tu alegría y buena onda, por
ayudarme siempre en mesada, leyendo arduamente mis trabajos, y sobre todo
por corregir mi tesis; Luis, salteño como yo, gracias por compartir tonada,
hacía que me sintiera más en mi lugar, por ayudarme y por compartir muchas
charlas divertidas.
A mis amigos del IByME, que afortunadamente no son pocos y con
quienes compartí muchos momentos. Gracias amigos del grupo “juntada” por
hacerme reír tanto, por sus regalos de cumpleaños y permitirme ser parte de
un grupo tan lindo.
A mis alumnas de zumba por compartir la pasión por bailar.
A las personas de cultivo y con las que me cruzo a diario por los pasillos:
Flor, Pao y Marcos, por sus charlas y por hacer que el clima de trabajo sea
mucho más divertido y ameno.
A los chicos del laboratorio de Química Medicinal e ININFA. Gracias Emi,
Gini, Mai, Nato, Sonia, Dani, Nico, Agus, Ale, Vale B y Vale T por su ayuda
constante, su predisposición, buena onda, charlas y salidas compartidas.
Al Dr. Baldi, por abrirme las puertas de su laboratorio y su ayuda.
Al IByME e INGEBI. Gracias por abrirme sus puertas y permitirme
utilizar sus instalaciones.
A CONICET, por las becas y financiación otorgadas para concretar mi
formación.
En lo personal, agradecer al amor de mi vida, Daniel. Gracias por darme
tanto amor, bancarme en los momentos tristes y celebrar mis triunfos. Gracias
por ser tan divertido, compañero en todo e impulsarme a terminar con cada
propósito.
A mi familia salteña y porteña. No me alcanzan las palabras para
agradecerle a mi mamá y mi tio Fede, por apoyarme en todo desde el momento
que decidí dejar mis raíces para progresar profesionalmente. A mis hermanos,
por estar siempre a pesar de la distancia. A mis sobrinos Martiniano y Gino
que los amo con todo mi corazón. A mi papá y Naty por su cariño, apoyo y
palabras alentadoras, siempre presentes. A Emi, gracias por abrirme tu
corazón, aceptarme, acompañarme con palabras tan acertadas y ser tan linda
suegra.
A Chechu, por comenzar una colaboración y terminar siendo mi amiga.
Gracias por abrirme tu corazón y brindarme tu amistad.
A todos, simplemente GRACIAS…
Durante la realización de mi doctorado, he participado en los siguientes
trabajos que forman parte de mi tesis:
PI3K pathway is involved in ERK signaling cascade activation by
histamine H2R agonist in HEK293T cells. Alonso N, Diaz Nebreda A, Monczor
F, Gutkind JS, Davio C, Fernandez N, Shayo C. Biochimica et Biophysica Acta.
2016. (9):1998-2007.
Involvement of histamine H1 and H2 receptor inverse agonists in
receptor’s crossregulation. Díaz Nebreda A, Zappia CD, Rodríguez González A,
Sahores A, Sosa M, Burghi V, Monczor F, Davio C, Fernández N y Shayo C.
European Journal of Pharmacology 2019. (847): 42-52.
Resumen
Resumen
Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) representan la familia
más numerosa de proteínas de membrana implicadas en la transducción de
señales. Los GPCRs regulan una gran variedad de procesos fisiológicos en
mamíferos y se estima que alrededor del 35% de los medicamentos aprobados
están dirigidos hacia estos receptores.
Uno de los numerosos ligandos fisiológicos de los GPCRs, es la histamina.
La histamina ejerce múltiples acciones mediante la interacción con receptores
específicos, habiéndose descrito hasta el momento cuatro subtipos de los
mismos: rH1-rH4. En particular, los rH1 y rH2 a histamina son los únicos
receptores de esta familia que son blancos de fármacos para tratamientos en
humanos. Presentan una distribución ubicua en el organismo y cumplen
funciones en la respuesta alérgica inmediata, inflamación, secreción ácida
gástrica, neuromodulación y en procesos de proliferación y diferenciación
celular, entre otras. En base a esto, ligandos de estos receptores son
ampliamente utilizados para el tratamiento de alergias y acidez gástrica,
respectivamente, y de hecho los antagonistas del sistema histaminérgico se
encuentran entre las veinte drogas más consumidas a nivel mundial. Asimismo,
en los últimos años han surgido diversos estudios con el propósito de
reposicionar a estas drogas para otras patologías. En este sentido, estudios
recientes reportan la potencial utilidad de los antihistamínicos H1 para la
terapéutica del asma, dolor, desórdenes neurodegenerativos, e insomnio, entre
otras y de los antihistamínicos H2 para falla cardíaca crónica, diabetes y cáncer.
Durante varios años hemos realizado numerosos aportes sobre la
señalización y regulación de la respuesta a través de los rH1 y rH2. En relación
al rH2, hemos descripto que luego de su activación, conduciendo a un
incremento en los niveles de AMPc, el receptor es fosforilado y desensibilizado
por la quinasa GRK2 para ser luego internalizado y reciclado a la membrana
Resumen
celular. Demostramos que el dominio quinasa de GRK2 no es necesario para su
desensibilización, pero es indispensable para la internalización y reciclado de
sitios activos. Asimismo, hemos descripto que ligandos antihistamínicos
H2/agonistas inversos H2, además de disminuir la respuesta basal de AMPc,
son capaces de promover la desensibilización e internalización de su receptor y
a su vez, activar la vía de señalización de ERK por un mecanismo diferente al de
los agonistas. Por otra parte, determinamos la existencia de una regulación
cruzada entre los rH1 y rH2, inducida por agonistas, la cual es independiente de
quinasas de segundos mensajeros (PKA y PKC) e involucra la desensibilización
cruzada de los receptores, así como la cointernalización y heterodimerización
de los mismos.
A partir de los antecedentes mencionados, nuestro objetivo general
consiste en profundizar acerca de los mecanismos de regulación cruzada entre
los rH1 y rH2 inducida por sus ligandos (agonistas y antihistamínicos), con el
fin de ampliar los conceptos establecidos y aportar nuevas bases para la
utilización racional de los ligandos histaminérgicos comúnmente utilizados en
la clínica y en ensayos de reposicionamiento de fármacos.
En una primera instancia, utilizando la línea celular HEK293
cotransfectadas con los rH1 y rH2, determinamos la participación de GRK2 en
la regulación cruzada de los receptores inducida por agonistas. Asimismo,
mediante la utilización de dos enfoques experimentales, demostramos que el
dominio quinasa de GRK2, es el responsable de dicha regulación heteróloga. De
esta manera contribuimos al conocimiento del papel de GRK2 en la
desensibilización heteróloga de los GPCRs.
Utilizando la línea celular U937 diferenciada a monocitos, que expresa
endógenamente los rH1 y rH2, así como células HEK293 transfectadas con
ambos receptores, determinamos que la desensibilización heteróloga entre los
rH1 y rH2 activados no sólo modifica la respuesta final mediada por la
Resumen
histamina o ligandos agonistas de ambos receptores, sino que además influye
en la respuesta de los antihistamínicos H1 y H2.
Por otro lado, determinamos que los antihistamínicos H1 y H2 inducen la
desensibilización cruzada entre los rH1 y rH2. En este sentido, describimos la
interferencia promovida por los antihistamínicos H1 y H2 sobre la respuesta
del receptor a su agonista, la cual tiene consecuencias no sólo a nivel de la
señalización, sino que además determina en última instancia la capacidad de
proliferación de las células.
Demostramos, además, la capacidad de los antihistamínicos H1 y H2 de
promover la internalización cruzada de los rH1 y rH2, como parte de su eficacia
pluridimensional. Asimismo, aportamos la primera evidencia acerca de la
internalización del rH1 inducida por antihistamínicos H1. Cabe destacar que
dicha internalización cruzada resultó ser la responsable de la desensibilización
heteróloga promovida por los antihistamínicos H1 y H2.
Finalmente, determinamos para el rH1, que su destino en el interior
celular luego de la internalización cruzada dependerá del ligando H2 que la
desencadene, siendo diferente para los agonistas o agonistas inversos.
Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis demuestran novedosos
mecanismos de señalización para el sistema histaminérgico. Los mismos
aportan nuevos conceptos para la comprensión del efecto de la histamina y de
los antihistamínicos, en diferentes situaciones fisio/patológicas, permitiendo
incrementar su eficacia y mejorar su seguridad. Asimismo, resultarán de
utilidad en futuros estudios de reposicionamiento de ligandos, así como para el
diseño de nuevos fármacos.
Tabla de contenido
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1
1. Receptores acoplados a proteína G ................................................................................... 2
1.1. Aspectos generales de los GPCRs................................................................................. 2
1.2. Vías de señalización clásicas de los GPCRs ............................................................. 5
1.3. Señalización independiente de proteína G ............................................................. 6
1.4. Regulación de la señalización de GPCRs.................................................................. 8
1.4.1. Desensibilización de GPCRs ................................................................................... 9
1.4.2. Internalización de GPCRs .................................................................................... 12
1.4.3. Resensibilización de GPCRs ................................................................................ 13
1.4.4. Regulación cruzada entre GPCRs .................................................................... 14
1.4.4.1. Regulación cruzada a nivel de la señalización intracelular ........ 15
1.4.4.2. Regulación cruzada a nivel de la desensibilización e internalización de otros GPCRs .................................................................................... 16
1.4.4.3. Regulación cruzada a nivel de la interacción física entre GPCRs. “Oligomerización de GPCRs” .......................................................................................... 17
1.5. Ligandos ............................................................................................................................. 20
2. Histamina .................................................................................................................................. 22
2.1. Receptores a histamina ............................................................................................... 23
2.1.1. Receptor H1 (rH1) .................................................................................................. 24
2.1.2. Receptor H2 (rH2) .................................................................................................. 25
2.1.3. Receptor H3 (rH3) .................................................................................................. 27
2.1.4. Receptor H4 (rH4) .................................................................................................. 28
2.2. Antihistamínicos H1 ...................................................................................................... 30
2.3. Antihistamínicos H2 ...................................................................................................... 32
2.4. Reposicionamiento potencial de ligandos histaminérgicos ......................... 33
3. Histamina y proliferación celular ................................................................................... 35
4. Histamina e inflamación ..................................................................................................... 36
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ..................................................................................................... 38
MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................. 41
2. Cultivo y mantenimiento de líneas celulares .............................................................. 42
2.1. Células HEK293 ............................................................................................................... 42
2.2. Células U937, U937-DC6, U937-A2, U937-AD3 y U937-F5 .......................... 43
2.3. Células AGS ....................................................................................................................... 43
2.4. Células HL1 ...................................................................................................................... 43
3. Preparación de ADN plasmídicos .................................................................................... 44
3.1. Purificación de ADN ...................................................................................................... 44
3.2. Construcciones utilizadas ........................................................................................... 45
4. Expresión de ADN foráneo: Transfecciones transientes ........................................ 46
5. Ensayos de desensibilización cruzada rH1/rH2: Medición de AMPc ............... 46
5.1. Células en suspensión ................................................................................................... 46
5.2. Células en adhesión ....................................................................................................... 47
5.3. Ensayo de unión de PKA para el dosaje de AMPc ............................................. 48
5.3.1. Obtención de la proteína ligadora .................................................................. 48
5.3.2. Condiciones del ensayo ......................................................................................... 48
5.3.3. Controles y estándares ......................................................................................... 49
6. Detección de proteínas por Western Blot .................................................................... 50
6.1. Preparación de las muestras ..................................................................................... 50
6.2. Electroforesis y transferencia ................................................................................... 50
6.3. Revelado de proteínas específicas ........................................................................... 50
7. Ensayo de gen reportero de luciferasa .......................................................................... 51
8. Cuantificación de ARN mensajero utilizando PCR en tiempo real (qPCR) .... 52
8.1. Obtención de muestras ................................................................................................. 52
8.1.1. Células U937 diferenciadas con PMA a monocitos................................... 52
8.1.2. Células HL1 ................................................................................................................ 52
8.2. Purificación del ARN ..................................................................................................... 53
8.3. Síntesis del ADN copia (ADNc).................................................................................. 54
8.4. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) .............................................................. 54
8.5. Análisis de los resultados obtenidos de la qPCR ................................................ 56
9. Ensayo de proliferación celular........................................................................................ 57
10. Determinación de marcadores apoptóticos ............................................................. 57
10.1. Análisis del ciclo celular ............................................................................................ 57
10.2. Ensayo de Marcación con Anexina V ................................................................... 58
11. Ensayos de unión de los rH1 y rH2 ............................................................................... 59
11.1. Ensayo de unión a [3H]mepiramina ..................................................................... 59
11.1.1. Células en suspensión ...................................................................................... 59
11.1.2. Células adheridas ............................................................................................... 59
11.2. Ensayo de unión a [3H]tiotidina ............................................................................ 60
12. Análisis Estadístico ............................................................................................................. 61
RESULTADOS .............................................................................................................................. 62
1. La desensibilización cruzada entre los rH1 y rH2 activados es mediada por
GRK2 ................................................................................................................................................. 63
2. La desensibilización cruzada inducida por los rH1 y rH2 activados modula la
respuesta de los antihistamínicos H1 y H2....................................................................... 73
2.1 La activación del rH2 modula la respuesta antiinflamatoria de los
antihistamínicos H1 ................................................................................................................... 74
2.2. La activación del rH1 modula la respuesta inducida por los
antihistamínicos H2 ................................................................................................................... 77
3. Los antihistamínicos H1 y H2 inducen la desensibilización cruzada de los
rH1 y rH2 activados ................................................................................................................... 79
3.1. Los antihistamínicos H1 afectan la respuesta mediada por el rH2
activado ........................................................................................................................................... 80
3.2 Los antihistamínicos H2 afectan la respuesta proinflamatoria del rH1
activado ........................................................................................................................................... 84
3.3. Los antihistamínicos H2 afectan la respuesta antiproliferativa y
proapoptótica del rH1 activado............................................................................................ 88
4. La desensibilización cruzada entre los rH1 y rH2 inducida por los
antihistamínicos H1 y H2 es independiente de GRK2 .................................................. 93
5. Internalización cruzada de los rH1 y rH2 inducida por los antihistamínicos
H1 y H2 ............................................................................................................................................ 95
6. La internalización cruzada de los rH1 y rH2 es el mecanismo responsable de
la desensibilización cruzada promovida por los antihistamínicos H1 y H2 ...... 99
7. Destino de los rH1 luego de la internalización cruzada promovida por
ligandos del rH2 ........................................................................................................................ 103
7.1. Destino de los rH1 luego de la internalización cruzada promovida por
amtamina .................................................................................................................................... 103
7.2. Destino de los rH1 luego de la internalización cruzada promovida por
los antihistamínicos H2 ......................................................................................................... 105
DISCUSIÓN................................................................................................................................. 107
1. GRK2 puede regular la desensibilización cruzada de GPCRs ....................... 108
2. Nuevas eficacias para los antihistamínicos H1 y H2. Desensibilización e
internalización cruzada. ................................................................................................... 113
3. Importancia de la regulación cruzada entre los rH1 y rH2 para el manejo
terapéutico de los antihistamínicos: implicancias en el reposicionamiento y
efectos adversos. ................................................................................................................... 118
REFERENCIAS .......................................................................................................................... 123
ABREVIATURAS ..................................................................................................................... 145
Introducción
1
INTRODUCCIÓN
Introducción
2
1. Receptores acoplados a proteína G
Durante décadas, los organismos han desarrollado complejos
mecanismos de señalización para adaptarse al medio que los rodea, así como
para asegurarse la homeostasis de sus células. Uno de los sistemas de
detección de señales extracelulares con mayor éxito evolutivo es el de los
receptores de membrana acoplados a proteínas G (GPCRs), denominados
también receptores de siete dominios transmembrana (7TMRs).
1.1. Aspectos generales de los GPCRs
Los GPCRs constituyen aproximadamente el 4% de todos los genes del
genoma humano, siendo la familia más numerosa de proteínas de membrana
implicadas en la transducción de señales. Existen aproximadamente unos
800 GPCRs diferentes que se clasifican en cinco familias, en función de su
similitud de secuencia y estructura con respecto al receptor que da nombre
a la familia: la familia de rodopsina (701 miembros), adhesión (24
miembros), Frizzled/taste (24 miembros), glutamato (15 miembros) y
secretina (15 miembros) (Fredriksson, 2003). Debido a su localización en la
membrana celular, los GPCRs reconocen un amplio número y tipo de señales
extracelulares, incluyendo fotones, iones, moléculas pequeñas (entre las que
se encuentran hormonas, neurotransmisores, nucleótidos, lípidos de distinta
complejidad y azúcares), aminas biógenas, péptidos y proteínas. Cumplen un
papel clave en la fisiología celular, controlando procesos tales como la
secreción, la diferenciación, el crecimiento celular, las respuestas
inflamatorias e inmunes y la neurotransmisión. Por este motivo, su
disfunción da lugar a diversas enfermedades como asma, insuficiencia
cardíaca, retinitis pigmentosa, diabetes insípida nefrogénica, obesidad,
enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas y
cáncer, entre otras (Gerthoffer et al., 2013; Heng et al., 2013; Thomsen et al.,
2012).
Introducción
3
Actualmente, 134 GPCRs son blancos (targets) para medicamentos
aprobados en los Estados Unidos y la Unión Europea y se estima que
aproximadamente el 35% de los medicamentos aprobados tienen como
objetivo a los GPCRs. De esta manera, constituyen la familia más grande de
proteínas blanco de los medicamentos aprobados (Sriram and Insel, 2018).
Los GPCRs son cadenas polipeptídicas de alrededor de 300-600
aminoácidos que alternan regiones hidrofílicas e hidrofóbicas. Al ser
proteínas de membrana, las regiones hidrofóbicas definen las siete regiones
transmembrana características de estos receptores. Poseen un extremo
amino terminal orientado hacia el exterior celular, dejando al extremo
carboxilo terminal orientado hacia el citoplasma. Es interesante notar que la
longitud y función de las regiones hidrofílicas, difieren entre los distintos
receptores, proporcionándoles propiedades específicas en cuanto a la unión
al ligando y a la proteína G, mientras que las regiones hidrofóbicas o de
transmembrana brindan al receptor la estructura que le permite una
conformación funcional (Eglen et al., 2007).
Las proteínas G a las cuales se encuentran acoplados los GPCRs,
poseen actividad GTPasa (catalizando la transformación de GTP a GDP y Pi)
y funcionan como interruptores moleculares alternando a la proteína entre
dos estados: activo (unida a GTP), e inactivo (unida a GDP). En este contexto,
activo significa que la molécula se encuentra en condiciones de disparar
otros eventos rio abajo dentro de la célula.
Las proteínas G son heterotriméricas, es decir que están constituidas
por tres subunidades llamadas α (33-46kd), β (37kd) y γ (8kd). En su forma
inactiva, la proteína G existe como un trímero unido a la membrana celular
por las subunidades βγ y con GDP unido en la subunidad α. Tras la
activación por un ligando, los GPCRs experimentan un cambio
conformacional y activan la proteína G, permitiendo el intercambio de GDP
por una molécula de GTP. De esta manera, el trímero se disocia, permitiendo
que la subunidad α difunda por el citoplasma e interactúe con su proteína
Introducción
4
efectora y que el dímero βγ haga lo propio (Tuteja, 2009). Las proteínas
efectoras incluyen canales iónicos y/o enzimas regulatorias intracelulares.
Dado que se conocen varios tipos de subunidades α, β y γ, los efectores que
pueden ser activados son numerosos (Marinissen and Gutkind, 2001).
Además de este modelo clásico de señalización de GPCRs, la complejidad de
las vías de señalización de los GPCRs es aún mayor, ya que descubrimientos
recientes ponen de manifiesto que estos receptores pueden activar vías de
señalización alternativas independientes de la proteína G, donde β-arrestina
(β-Arr) forma parte del andamiaje para diversas proteínas señalizadoras.
(Moore et al., 2007; Wei et al., 2003).
A continuación, puede visualizarse un esquema de la convergencia de
las diferentes señales extracelulares en los GPCRs y de la divergencia de sus
cascadas de señalización (Fig. 1)
Figura 1. Agonistas fisiológicos de los GPCRs y sus cascadas de señalización. Adaptado de Marinissen and Gutkind, 2001 y Foord et al., 2005.
Introducción
5
1.2. Vías de señalización clásicas de los GPCRs
Cuando un GPCR es activado por unión con un ligando, se inicia una
serie de eventos intracelulares que modulan la función celular. Estos
eventos dependen, en general, del tipo de subunidad de la proteína G a la
que se encuentre acoplado el receptor y de la maquinaria molecular
disponible en la célula. Como puede visualizarse en la Figura 1, las proteínas
G presentes en todos los organismos eucariotas poseen un papel esencial en
la transducción de señales celulares, ya que asocian al receptor con las
proteínas efectoras localizadas en el interior celular.
La subunidad Gα, así como el dímero Gβγ, pueden activar o inhibir
enzimas efectoras como la adenilato y guanilato ciclasa, fosfodiesterasas,
fosfolipasas A2 y C y fosfatidilinositol 3 quinasa, entre otros; dando lugar a la
modulación de una gran variedad de segundos mensajeros como AMPc,
GMPc, IP3, DAG, ácido araquidónico y fosfatídico (McCudden et al., 2005;
Wettschureck and Offermanns, 2005). La señalización finaliza con la
hidrólisis del GTP unido a la subunidad α promovida por la actividad la
GTPasa propia de la proteína G. De esta manera, la subunidad α unida
nuevamente a GDP se reasocia con el dímero βγ (Cabrera-Vera et al., 2003;
Preininger and Hamm, 2004). Se conocen cerca de 20 isoformas distintas de
subunidades α, que se agrupan en 4 familias de acuerdo a la homología de
secuencias de aminoácidos, Gs, Gi/G0, Gq/G11 y G12/G13. Por otra parte, los
complejos βγ se ensamblan en alguna combinación entre 6 posibles
subunidades β y 12 subunidades γ (McCudden et al., 2005; Wettschureck
and Offermanns, 2005).
El primer efector de las subunidades Gα descripto fue la adenilato
ciclasa (AC), cuya actividad es regulada de manera positiva por la subfamilia
Gαs, generándose AMPc como activador de la proteína quinasa A (PKA). La
subfamilia Gαi, además de inhibir a la AC, regula canales iónicos y
fosfodiesterasas. En cuanto a la subfamilia Gαq, su estimulación conduce a la
activación de la fosfolipasa C β (PLCβ), generando IP3 y DAG como segundos
Introducción
6
mensajeros. El IP3 provoca la liberación del Ca2+ almacenado en el retículo
endoplasmático, mientras que el DAG activa a las isoformas nóveles de PKC
(nPKCs) o, en conjunto con los iones Ca2+, a las isoformas clásicas de PKC
(Berridge, 1993). Por último, los miembros de la subfamilia Gα12 aún no
tienen un segundo mensajero establecido y, en general, se los asocia con la
activación de proteínas G pequeñas de la familia Rho. La activación de estas
proteínas G pequeñas no es exclusividad de la familia de Gα12/13, sino que,
GPCRs acoplados a Gαq y Gαi pueden también modular la actividad de estas
proteínas (Lutz et al., 2005; Sugimoto et al., 2003). Por su parte, el dímero βγ
regula la actividad de ciertas enzimas, como AC, PLC, PI3K, MAPKs y canales
iónicos (Birnbaumer, 2007; Zamponi and Currie, 2013).
1.3. Señalización independiente de proteína G
Durante los últimos años, numerosas evidencias apuntan a que la
señal originada por un ligando persiste luego de que el receptor es
internalizado. Dichas evidencias apuntan a que los GPCRs pueden transmitir
información al interior de la célula a través de mecanismos que no requieren
de la activación de la proteína G heterotrimérica. La proteína β-Arr, además
de cumplir un papel crucial en la desensibilización e internalización de
GPCRs, ha demostrado funciones como mediador de la señalización una vez
internalizado el receptor (Shukla et al., 2011). La familia de β-Arr se
compone de diversos miembros: la arrestina visual (Arr1) se localiza en
retina, mientras que β1-Arr y β2-Arr (también llamadas Arr2 y Arr3,
respectivamente) son de localización ubicua (Moore et al., 2007; Pitcher et
al., 1998).
Una vez que el receptor es endocitado, β-Arr puede interactuar con
miembros de la familia c-Src como Hck, Fgr y Yes, aproximándolas al
receptor activado (Imamura et al., 2001). Asimismo, β-Arr funciona como
proteína adaptadora reclutando distintos componentes de las cascadas de
señalización de la familia de MAPKs, incluyendo cRAF-1, ERK1/2, p38 y
Introducción
7
JNK3, como así también AKT, PI3K y PDE4, mediando la señalización a largo
plazo en el citosol celular (Fig. 2) (Bologna et al., 2017; Gong et al., 2008;
Lefkowitz and Shenoy, 2005; Luttrell et al., 2001; Miller and Lefkowitz,
2001; Song et al., 2009).
Este descubrimiento ha cambiado la noción clásica de eficacia lineal
mediada por un GPCR, teniendo presente la pluridimensionalidad de
eficacias de un dado ligando. De esta manera, las vías de señalización
promovidas por un ligando pueden estar asociadas a diferentes efectos
biológicos y farmacológicos, siendo algunos de ellos deseados y otros no.
Este hecho ha llevado a los investigadores a estudiar en profundidad la
farmacología de los ligandos con el objetivo de designar o identificar a
aquellos que selectivamente activen la vía de señalización asociada al efecto
buscado, para lograr disminuir y/o eliminar los efectos secundarios
adversos. Esta “selectividad funcional” de “ligandos sesgados” ha
demostrado un uso potencial para diferentes terapias y expande las
posibilidades del descubrimiento de fármacos dirigidos hacia los GPCRs
(Rankovic et al., 2016). Estos nuevos conceptos han sido extensamente
estudiados para diversos GPCRs, incluyendo los receptores H1 y H2 a
histamina (rH1 y rH2) y serán retomados en la sección 1.5 del presente
trabajo.
Introducción
8
Figura 2. Señalización de GPCRs. Se observa la señalización clásica y la señalización mediada por β-Arr. Bologna et al., 2017.
1.4. Regulación de la señalización de GPCRs
La actividad que presenta un GPCR resulta del balance coordinado
entre los mecanismos moleculares que gobiernan los procesos de
señalización, desensibilización y resensibilización.
La desensibilización de un GPCR es la pérdida de respuesta del
receptor ante un estímulo prolongado. Abarca una serie de mecanismos
diferentes, incluyendo: el desacople del receptor de la proteína G por su
fosforilación (en muchas ocasiones el término desensibilización en realidad
hace referencia a este desacople) (Bouvier et al., 1988; Hausdorff et al.,
1989; Lohse et al., 1990), la internalización del receptor (Anborgh et al.,
2000; Trejo et al., 1998) y la disminución en la cantidad de receptores en
membrana, ya sea por la interrupción de la síntesis proteica o por la
degradación de receptores preexistentes (Valiquette et al., 1990). Cada uno
de estos mecanismos posee un intervalo de tiempo determinado que oscila
entre segundos para la fosforilación, minutos para la internalización y horas
para los casos de regulación de la expresión (Chen et al., 1995). En la figura 3
Introducción
9
observamos un esquema general de dichos procesos, los cuales serán
detallados en ítems posteriores.
Figura 3. Esquema generalizado de los mecanismos de desensibilización,
internalización y reciclado en GPCRs. Kliewer et al., 2017.
1.4.1. Desensibilización de GPCRs
La desensibilización de GPCRs puede ser de naturaleza homóloga o
heteróloga; la “desensibilización homóloga” se refiere a la pérdida de
respuesta de un subtipo de GPCR particular en respuesta a su agonista,
mientras que la “desensibilización heteróloga” se refiere a un efecto más
generalizado que implica la pérdida simultánea de la capacidad de respuesta
de múltiples GPCRs, incluso en ausencia de agonistas de los otros receptores.
De esta manera, se suele pensar que la desensibilización homóloga involucra
cambios conformacionales en el propio GPCR, mientras que la
Introducción
10
desensibilización heteróloga también puede involucrar cambios en los
componentes de la señalización que se encuentran río abajo del receptor.
Actualmente, existen tres familias de moléculas bien caracterizadas
que colaboran con la regulación de este proceso: las proteínas quinasas
dependientes de segundos mensajeros como PKA y PKC, las quinasas de
receptores acoplados a proteína G (GRKs) y las β-Arr (Benovic et al., 1985;
Krupnick and Benovic, 1998; Whalen et al., 2011).
Las proteínas PKA y PKC fosforilan indiscriminadamente a GPCRs que
hayan sido expuestos o no al estímulo, dando lugar a la desensibilización
heteróloga. Así, cualquier receptor de la célula que module la señal de AMPc
o de Ca2+ podrá desencadenar la desensibilización de otros GPCRs acoplados
a su misma vía (Chuang et al., 1996; Lefkowitz, 1998; Moore et al., 2007).
En cuanto a la desensibilización homóloga (mediada por el agonista),
la activación del receptor conduce a la fosforilación del mismo por las GRKs.
Esta fosforilación incrementa la afinidad por las β-Arr, que se unen al GPCR e
impiden el acoplamiento adicional a las proteínas G, produciendo la
desensibilización del receptor.
Las GRKs componen un grupo de proteínas serina-treonina quinasas
multidominio que específicamente reconocen y fosforilan a los GPCRs
activados por el agonista. Esta familia se encuentra dividida en tres grupos
principales según su homología de secuencia: la familia de rodopsina
quinasa o GRKs visuales (GRK1 y GRK7), la subfamilia de quinasas del
receptor β2-adrenérgico (β2AR) (GRK2/GRK3) y la subfamilia de GRK4
(GRK4, GRK5 y GRK6). Todas ellas están constituidas por tres dominios bien
diferenciados. Un dominio quinasa central y altamente conservado,
flanqueado por un dominio amino terminal (dominio RH) de alrededor de
185 aminoácidos de homología a reguladores de la señalización por proteína
G (RGS) y un dominio carboxi terminal de longitud variable (PH). Mientras
GRK1 y GRK7 sólo se expresan en retina, y GRK4 en testículo, el resto de las
Introducción
11
GRKs son ubicuas, hallándose distribuidas por todo el organismo (Premont
and Gainetdinov, 2007; Rajagopal and Shenoy, 2018).
Participación de GRK2 en la desensibilización de GPCRs
El descubrimiento de la desensibilización homóloga del receptor βAR
mediante la fosforilación del mismo no atribuible a PKA arrojó los primeros
indicios de la existencia de una quinasa desconocida hasta el momento
(Strasser et al., 1986). Esta proteína fue purificada y llamada quinasa del
receptor beta adrenérgico (βARK), posteriormente renombrada GRK2
(Benovic et al., 1986).
GRK2 es la GRK mejor caracterizada, de expresión ubicua y con
capacidad de fosforilar una gran variedad de GPCRs ocupados por agonistas,
incluyendo receptores αAR y βAR, muscarínicos, de angiotensina,
endotelina, histamina, prostaglandina, esfingosina-1-fosfato y de
quemoquinas, entre otros (Fernández et al., 2002; Menéndez, 2009;
Rockman et al., 2002; Shayo et al., 2001a). De los 3 dominios que la
conforman, mencionados previamente, el carboxi terminal posee homología
a pleckstrina (dominio PH), capaz de interactuar con las subunidades βγ de
la proteína G permitiendo el direccionamiento de GRK2 hacia la membrana
plasmática tras la activación de un GPCR (Ribas et al., 2007) (Fig. 4).
Introducción
12
Figura 4: Representación esquemática de los dominios funcionales de GRK2.
Adaptado de Ribas et al., 2007.
En el modelo canónico de desensibilización de GPCRs, el papel de
GRK2 es el de atenuar la señalización de los receptores activos mediante un
mecanismo dependiente de la fosforilación de los mismos a cargo de su
dominio quinasa. Sin embargo, numerosas investigaciones han demostrado
que GRK2 también es capaz de regular el proceso de señalización celular
mediante mecanismos independientes de su fosforilación (Dicker et al.,
1999; Gärtner et al., 2013; Usui et al., 2000). En este sentido, en las últimas
décadas, el dominio RH ha cobrado importancia en el proceso de
desensibilización de diversos GPCRs, entre los que se encuentran los rH1 y
rH2 (Diviani et al., 1996; Fernandez et al., 2011; Iwata et al., 2005; Kong et
al., 1994; Namkung et al., 2009).
1.4.2. Internalización de GPCRs
La magnitud de la respuesta ejercida por un ligando a través de un
GPCR está dada, entre otras cosas, por la cantidad de receptores accesibles al
ligando. Por consiguiente, la internalización del mismo resulta una etapa
importante en la desensibilización de su señal, ya que conduce a la
disminución del número de receptores en la membrana celular. Este proceso
puede darse a través de dos mecanismos.
Uno de los mecanismos más comunes y quizás el mejor estudiado
para GPCRs fosforilados involucra a β-Arr como molécula encargada de
adaptar componentes claves de la maquinaria endocítica (clatrina, dinamina,
AP2 y fosfoinosítidos), dirigiendo a los receptores hacia vesículas
recubiertas de clatrina. Los GPCRs que utilizan esta vía son internalizados en
endosomas tempranos, permitiendo posteriormente la degradación de los
mismos en lisosomas o bien el reciclado a membrana para responder a un
nuevo estímulo (Kang et al., 2014; Laporte et al., 2000; Moore et al., 2007).
Introducción
13
Por otra parte, resulta importante considerar las vías endocíticas en
las que clatrina no participa. En este sentido, han sido identificados
mecanismos de internalización independientes de β-Arr y clatrina (Claing et
al., 2000; Mayor et al., 2014) y dependientes de β-Arr, pero independientes
de clatrina (Kohout et al., 2001; Zhang et al., 1996). Estas vías endocíticas
aprovechan la heterogeneidad de los lípidos y composición proteica de la
membrana plasmática, formando micro dominios dinámicos, con alto
contenido de esfingolípidos y colesterol que se invaginan en la célula,
conocidos como rafts lipídicos y/o caveolas (Brown and London, 1998;
Vereb et al., 2003). La localización de los GPCRs en los rafts lipídicos es
variable, habiéndose reportado casos donde la acción de agonistas permite
la translocación del receptor tanto adentro como afuera de las caveolas
(Feron et al., 1997; Gagnon et al., 1998; Lasley et al., 2000). Estos cambios en
la localización podrían estar regulando la interacción entre los receptores,
sus correspondientes proteínas G y sistemas efectores que estén
enriquecidos en estos compartimentos. Además, estarían involucrados en la
desensibilización e internalización de dichos receptores.
1.4.3. Resensibilización de GPCRs
La internalización de GPCRs no es un proceso trivial, sino más bien un
proceso complejo con diferentes consecuencias en la fisiología celular. Una
vez endocitado, el receptor puede seguir distintos caminos, ya sea ser
reciclado en forma rápida a la membrana plasmática, en forma más lenta o
bien ser dirigido hacia lisosomas para una futura degradación (Moore et al.,
2007).
Como se describió previamente, el primer paso para que se produzca
la internalización de los GPCRs es la fosforilación del receptor por GRKs, las
cuales incrementan su afinidad por β-Arr y diversas proteínas de andamiaje,
determinando el destino final del receptor endocitado y posibilitando la
Introducción
14
activación de nuevas cascadas de señalización (Gardner et al., 2004; Tian et
al., 2016).
Una vez endocitado, el complejo formado GPCR-β-Arr puede sufrir
modificaciones post-traduccionales a través del proceso de ubiquitinación.
Este proceso, dependiente de ATP, consiste en la unión covalente de cadenas
de ubiquitinas por diferentes enzimas, resultando un paso determinante en
cuanto a si el receptor endocitado se dirige hacia la degradación o
resensibilización (Busillo et al., 2010; Marchese and Benovic, 2001;
Marchese and Trejo, 2013; Rajagopal and Shenoy, 2018). Por ejemplo, varios
estudios llevados a cabo para el receptor β2AR muestran que la
ubiquitinación de β2-Arr se encuentra mediando no sólo las vías de
señalización que dependen de esta molécula, sino también el camino del
complejo hacia lisosomas (Han et al., 2012; Shenoy et al., 2008). Este estudio
se extendió a otros GPCRs determinando que, alrededor de 40 GPCRs
necesitan ser ubiquitinados para regular su tráfico post-endocítico hacia la
formación de lisosomas (Jean-Charles et al., 2016; Marchese and Trejo,
2013).
Para que finalmente el receptor pueda ser reciclado a la membrana
plasmática y el sistema sea receptivo a un nuevo estímulo (resensibilizado),
se requiere no sólo del proceso de desubiquitinación, sino también la
desfosforilación del complejo endocitado. Este proceso incluye, a diferencia
de la fosforilación inicial, proteínas fosfatasas específicas de cada receptor.
Así, el reciclado a membrana de los receptores β2AR y rH2 requiere de PP2A
(Fernandez et al., 2008; Tran et al., 2006), mientras que para el receptor μ-
Opioide es imprescindible PP1γ (Doll et al., 2012).
1.4.4. Regulación cruzada entre GPCRs
Tradicionalmente se pensaba que las vías de señalización
desencadenadas por los GPCRs correspondían a secuencias lineales que
modulaban los niveles intracelulares de segundos mensajeros. Con el
Introducción
15
transcurso de los años, este concepto ha evolucionado y actualmente es
sabido que las cascadas de señalización inducidas por el estímulo de un
GPCR afectan la respuesta generada por otro receptor. Esta respuesta
cruzada, también conocida como “crosstalk” puede resultar por un lado en la
pérdida de función del receptor (desensibilización) o en un aumento o
ganancia de función. Además, incrementa la complejidad de la señalización
de los GPCRs, permitiendo a los sistemas obtener diversas respuestas
biológicas dependiendo del contexto celular en el que se encuentren.
Esta interacción cruzada ha sido descripta a diferentes niveles,
incluyendo interferencias que involucran a segundos mensajeros
(señalización intracelular), a nivel de la desensibilización o internalización
de los receptores o bien, interferencias producidas por la interacción física
entre los mismos.
1.4.4.1. Regulación cruzada a nivel de la señalización intracelular
Ha sido extensamente descripto que las vías de señalización de GPCRs
que activan a PLC, liberando Ca2+, pueden ser reguladas por la activación de
la vía AC-AMPc y viceversa, interactuando a diferentes niveles.
Por un lado, la vía del AMPc puede atenuar o beneficiar la vía de
señalización de receptores acoplados a Gαq. Por ejemplo, Misaki y
colaboradores describieron que la vía de AMPc modula la respuesta del
receptor a N-formil-L-metionil-L-leucil-fenilalanina (fMLP), un receptor
acoplado a Gαq. El pretratamiento de membranas de células HL-60 con PKA
activada en presencia de ATP disminuyó la producción de IP3. A su vez,
demostraron que la activación de PKA condujo a la fosforilación de la
proteína Gαq (Misaki et al., 1989). Otros reportes han demostrado que PKA
no sólo es capaz de desacoplar el receptor de la proteína Gαq, sino que
también puede fosforilar e inactivar directamente a PLC (Dodge and
Sanborn, 1998; Lawler et al., 2001; Yue et al., 1998). Algunos trabajos han
mostrado que el AMPc puede provocar un aumento en los niveles de IP3.
Introducción
16
Así, el pretratamiento de hepatocitos de rata y células submandibulares con
8-bromo AMPc aumentó la acumulación de IP3 ante el estímulo de un
receptor acoplado a Gαq (Martinez and Zhang, 1998; Pittner and Fain,
1989).
Por otra parte, está descripto que el Ca2+generado por el estímulo de
GPCRs acoplados a Gαq puede modular componentes de la maquinaria de
señalización del AMPc, ya sea activando o inhibiendo diferentes tipos de ACs
(Cooper et al., 1995; Mons et al., 1998) y fosfodiesterasas (Kakkar et al.,
1999), o bien a través de la subsecuente activación de PKC, fosforilando y
desensibilizando a los GPCRs acoplados a Gαs (Guimond et al., 2005).
Asimismo, la activación de PKC fosforila diferentes isoformas de AC
regulando positivamente la vía de señalización mediada por Gαs (Jacobowitz
et al., 1993; Kawabe et al., 1994; Lustig et al., 1993).
1.4.4.2. Regulación cruzada a nivel de la desensibilización e
internalización de otros GPCRs
Como se describió previamente, la desensibilización heteróloga entre
GPCRs es un fenómeno que ocurre cuando el estímulo de uno de ellos es
capaz de desensibilizar e internalizar a los otros receptores acoplados a la
misma proteína G. Este hecho podría considerarse una forma de respuesta
cruzada, ya que estimulando un receptor se estaría generando un efecto
sobre la respuesta de otro GPCR (Clark et al., 1988; Dalle et al., 2002). Este
tipo de respuesta cruzada se describió entre el rH1 y el receptor m3
muscarínico, ambos acoplados a proteína Gαq (Miyoshi et al., 2004).
Existen además ejemplos en los que el estímulo de un GPCR conduce a
la fosforilación, desensibilización e internalización de otro receptor que no
se encuentra acoplado a la misma vía de señalización. En particular, se
describió en células ováricas de hámster (CHO) que la activación del
receptor β2AR por isoproterenol promueve la fosforilación heteróloga e
internalización de los rH1 (Kawakami et al., 2004). Por otro lado, estudios de
Introducción
17
nuestro grupo demostraron la existencia de una desensibilización cruzada
entre los rH1 y rH2 en la línea celular de leucemia U937 que expresa los
receptores de manera endógena y en células embrionarias de riñón
HEK293T transfectadas transientemente con ambos receptores. Asimismo, a
través de ensayos de unión y microscopía confocal, demostramos la
existencia de una cointernalización de los receptores inducida por agonistas.
Sorprendentemente, ni las quinasas activadas por segundos mensajeros PKA
y PKC, ni el proceso de internalización son responsables de la
desensibilización cruzada existente (Alonso et al., 2013). Resulta de interés
entonces, determinar el mecanismo involucrado en dicha desensibilización
cruzada, el cual será abordado en la presente tesis.
1.4.4.3. Regulación cruzada a nivel de la interacción física entre GPCRs.
“Oligomerización de GPCRs”
La regulación cruzada entre GPCRs puede ser explicada no sólo a
través de las interacciones entre las vías de señalización intracelulares y
fosforilaciones por quinasas, sino también a través de su interacción física,
logrando complejizar aún más la señalización mediada por los mismos.
Hoy en día, se acepta que la oligomerización entre GPCRs es un
fenómeno común en la biología de los receptores. Los oligómeros formados
adquieren nuevas características funcionales diferentes a las de los
receptores que los constituyen, dando lugar a un nuevo nivel de complejidad
que gobierna la señalización y la regulación de estas proteínas (Kaczor and
Selent, 2011).
En algunos casos, la oligomerización entre GPCRs es esencial para la
función de los mismos, como en el caso de los receptores GABAB y
rodopsina (Filipek et al., 2004; Kniazeff et al., 2004; Pin et al., 2004). Por
otro lado, la oligomerización puede ser constitutiva o inducida por
agonistas, y la relevancia funcional de este proceso ha sido estudiada para
numerosos GPCRs (Breitwieser, 2004).
Introducción
18
A pesar de que los homodímeros suelen ser complejos predominantes
en un dado tejido o tipo celular, existen evidencias que demuestran la
tendencia potencial a la formación de oligómeros de mayor grado, en
particular tetrámeros, dependiendo de la densidad y subtipo de receptor.
Por ejemplo, se reportaron especies monoméricas predominantes para el
β1AR, mientras que el β2AR se encuentra preferentemente como dímero a
bajos niveles de expresión. Asimismo, un incremento en la densidad del
receptor puede dar lugar a la aparición de complejos de mayor grado
(trímeros, tetrámeros y oligómeros de mayor orden) (Ferré et al., 2014).
Homodimerización
Actualmente, existe evidencia suficiente como para afirmar que la
amplia mayoría de los GPCRs transita un estado de homodimerización al
menos en algún estadío de su señalización. Se propone que los sitios de
interacción entre GPCRs involucran a las α-hélices transmembrana, ya que
utilizando un péptido competidor correspondiente a la VI hélice
transmembrana del β2AR se redujo significativamente el índice de
dimerización, así como la actividad de la AC inducida por agonistas (Hebert
et al., 1996). Más aún, mutaciones en la hélice VI de este receptor impidieron
el correcto tráfico del mismo desde su sitio de síntesis hacia la superficie
celular, indicando que la homodimerización constituye un paso clave para la
localización del receptor en la membrana (Salahpour et al., 2004).
La homodimerización ha sido demostrada para varios GPCRs, entre
ellos los receptores α2AR, m2 y m3 muscarínicos, GABAB, μ-, κ-, δ-opioides,
de adenosina, rH1, rH2 y rH4, entre otros (Bakker et al., 2004; Filizola and
Weinstein, 2002; Fukushima et al., 1997; van Rijn et al., 2006; Zeng and
Wess, 1999).
Introducción
19
Heterodimerización
Diversos estudios han demostrado que los GPCRs pueden interactuar
con otros miembros de la familia para formar heterodímeros, aunque en
muchos casos, las consecuencias funcionales de esta interacción son aún
impredecibles. Por ejemplo, la interacción del β2AR con receptores δ- y κ-
opioide no afecta la afinidad de los receptores por sus agonistas, pero altera
el tráfico intracelular de ambos. Cuando el β2AR es coexpresado con el
receptor δ-opioide, los agonistas de ambos receptores internalizan al
receptor δ-opioide, mientras que cuando el β2AR es coexpresado con el
receptor κ-opioide, ninguno de los dos agonistas da lugar a la internalización
del receptor κ-opioide (Jordan et al., 2001).
Recientemente ha sido descripta la heterodimerización del receptor
bradiquinina B2 con receptores Mas, de forma constitutiva tanto en células
HEK293T transfectadas con ambos receptores, como en células endoteliales
glomerulares humanas. Luego de la interacción con sus agonistas, el
complejo formado resulta internalizado en endosomas tempranos, presenta
cambios en las vías de señalización activadas y promueve cambios
funcionales relacionados a la proliferación celular, no observados en células
que sólo expresan uno de los dos receptores (Cerrato et al., 2016).
Además de influir en la internalización y señalización de receptores, la
heterodimerización puede afectar al tráfico de receptores hacia la
membrana plasmática una vez que los mismos son sintetizados. Así, el
receptor α1DAR no se localiza en la superficie celular a menos que dimerice
con receptores α1bAR o β2AR. Estos datos demuestran el papel crucial que
cumple el proceso de heterodimerización (Hague et al., 2005; Uberti et al.,
2004).
En cuanto a los receptores a histamina, se ha descripto mediante la
generación de proteínas de fusión rH1-Gα11 y α1βAR-Gα11, que el rH1 es
capaz de formar heterodímeros con α1βAR. A pesar de haberse demostrado
la heterodimerización de estos receptores en células HEK293 que
Introducción
20
sobreexpresan ambas proteínas y en fibroblastos embrionarios de ratón,
hasta el momento nada puede decirse acerca de cuál es la relevancia
biológica de estos heterodímeros (Carrillo et al., 2003). Por otra parte,
ensayos de coinmunoprecipitación realizados en extractos proteicos de
membranas sinaptosomales estriatales de rata y células HEK293T que
expresan una quimera A2AR302-Gαqi4 del receptor de adenosina (rA2A) y
receptores a histamina (rH3), evidenciaron que la activación del rH3 por el
agonista RAMH condujo a la formación de heterodímeros rA2A-rH3.
(Márquez-Gómez et al., 2018). Resultados aportados por nuestro grupo a
través de experimentos de FRET en células HEK293T utilizando proteínas
quimeras fluorescentes rH1-CFP y rH2-YFP, permitieron determinar la
formación de heterodímeros entre estos receptores luego de la estimulación
con sus agonistas. Dicha dimerización no afecta la maduración y transporte a
la superficie celular de los receptores individuales, pero podría estar
regulando el tráfico y señalización de los mismos una vez cointernalizados
(Alonso et al., 2013).
1.5. Ligandos
Un ligando es una molécula que es capaz de unirse a un receptor de
manera directa, específica y con alta afinidad. Existen dos parámetros
fundamentales que caracterizan la respuesta evocada por un ligando:
potencia y eficacia. La potencia es la concentración de ligando necesaria
para producir un efecto biológico determinado. La expresión utilizada se
encuentra en relación inversa con dicha concentración, por lo que el ligando
más potente será aquel que requiera menor concentración para alcanzar un
determinado efecto. Para definirla se utiliza frecuentemente la
concentración efectiva 50 (CE50), que es la concentración de ligando
necesaria para alcanzar el 50% de la respuesta máxima evocada por el
mismo. La eficacia es un concepto y término numérico utilizado para
expresar el grado de respuesta producido por distintos ligandos, siendo la
Introducción
21
respuesta máxima el indicador de eficacia más utilizado. Cabe destacar que
la eficacia se define como una magnitud vectorial, pudiendo tomar valores
tanto positivos como negativos.
Clasificación de los ligandos
Hasta hace poco tiempo el concepto de agonista y antagonista se
entendía solamente como un mecanismo relativamente simple, en el cual el
agonista se unía al receptor modificándolo y activando procesos en la
membrana y el antagonista sólo actuaba interfiriendo con la unión del
agonista al receptor, compitiendo por afinidad al receptor y evitando su
activación (antagonismo competitivo).
En los últimos años, a partir del desarrollo de metodologías más
sensibles que permitieron detectar la actividad constitutiva de los
receptores, un gran número de ligandos originalmente categorizados como
antagonistas, han sido reclasificados como agonistas inversos dado que son
capaces de disminuir per se, la actividad espontánea basal del receptor
(Costa and Herz, 1989; Kenakin, 2004). De esta manera, la clasificación de
los ligandos sigue un rango de eficacias que va desde (-1) para agonistas
inversos a (1) para agonistas, pasando por (0) para los antagonistas.
La correcta clasificación de los ligandos de los GPCRs resulta aún más
compleja al considerar que el receptor puede encontrarse en múltiples
conformaciones y el ligando al unirse será capaz de estabilizar
selectivamente alguna de ellas en detrimento del resto, activando sólo
algunas de las cascadas de señalización relacionadas a un receptor
particular (Kenakin, 2012). En este sentido, es posible que un antagonista o
agonista inverso estabilice una conformación determinada que bloquea o
inhiba la activación de la proteína G, pero pueda conducir a la
desensibilización, internalización o incluso desencadenar cascadas de
señalización independientes de la misma. Más aún, sabiendo que las vías de
señalización entre GPCRs pueden interactuar, la acción de estos ligandos
Introducción
22
puede inducir la desensibilización o internalización cruzada de otro
receptor, acoplado a la misma o distinta vía de señalización.
A partir de aquí, recientemente han ganado importancia dos
conceptos. Por un lado, el concepto de “eficacia pluridimensional” que hace
referencia a que un ligando puede tener múltiples eficacias, desencadenando
por ejemplo dos señales diferentes (dependiente o independiente de
proteína G). Así, los ligandos pueden ser agonistas o agonistas inversos para
ambas señales o pueden tener eficacias diferentes para las mismas (Costa-
Neto et al., 2016; Galandrin et al., 2007). Por otra parte, el concepto de
“agonismo sesgado” o “selectividad funcional” hace referencia a que un dado
ligando es capaz de activar preferencialmente una (o varias) vías de
señalización de un GPCR (Pupo et al., 2016). Este concepto ha sido
ampliamente estudiado para diversos GPCRs, incluyendo βAR, angiotensina
2 (ATII) (Galandrin and Bouvier, 2006; Wei et al., 2003) y los rH1 y rH2
(Alonso et al., 2014, 2015; Moniri et al., 2004; Reher et al., 2012).
2. Histamina
La histamina [2-(4-imidazol) etilamina, C5H9N3] es una amina
biogénica endógena de corta acción que se distribuye de manera ubicua en
tejidos de mamíferos y está presente en elevadas concentraciones en los
pulmones, piel y en el tracto gastrointestinal (Panula et al., 2015a; Shore et
al., 1959). Se biosintetiza a partir del aminoácido L-histidina mediante su
descarboxilación, catalizada por la enzima histidina decarboxilasa (HDC)
(Schayer and Karjala, 1956). Fue aislada por primera vez a partir de un
hongo, el cornezuelo del centeno (Claviceps purpurea), por Sir Henry Dale y
sus colaboradores en 1907. Sin embargo, esta amina no fue reconocida como
un constituyente natural del cuerpo humano sino hasta 1929.
La histamina es sintetizada por mastocitos, basófilos plaquetas,
neuronas histaminérgicas y células enterocromafines, en donde se almacena
en gránulos de secreción para ser liberada frente al estímulo apropiado. Una
Introducción
23
vez liberada al medio extracelular, la histamina interactúa con sus
respectivos receptores para generar variados efectos. La terminación de
dicha comunicación se produce tanto por la desensibilización de receptores
y la recaptación de la histamina, como por el catabolismo de la misma. La
histamina es excretada por la orina luego de ser transformada a ácido N-
metil-imidazol acético por acción de las enzimas HNMT (histamina metil-
transferasa) y MAO (metil-amino oxidasa) (Rangachari, 1998).
La histamina regula una gran cantidad de procesos fisiológicos y
patológicos como la secreción de ácido gástrico, inflamación, vasodilatación,
broncoconstricción, proliferación, diferenciación y, además, actúa como
neurotransmisor (Notcovich et al., 2010; Nuutinen and Panula, 2010;
Parsons and Ganellin, 2006a; Xu et al., 2017). De esta manera, produce
efectos en diferentes sistemas: sistema nervioso central, sistema inmune,
gastrointestinal, cardiovascular, respiratorio, piel y sistema reproductivo
(Mondillo et al., 2018; Panula et al., 2015a; Tiligada and Ennis, 2018). En los
últimos años se ha asociado a esta molécula con el desarrollo de diferentes
tipos de cáncer incluyendo gástrico, colorrectal, esófago, oral, pancreático,
piel, estómago, pulmones, sangre y de mama (Akdis and Simons, 2006;
Barnes, 1991; Hill, 1992; Massari et al., 2018; Zampeli and Tiligada, 2009).
2.1. Receptores a histamina
Todos los efectos biológicos enumerados anteriormente son
regulados por la activación de cuatro subtipos de receptores, rH1, rH2, rH3 y
rH4, los cuales han sido nombrados de acuerdo al orden cronológico de su
descubrimiento y caracterización (Akdis and Simons, 2006; Alexander et al.,
2017; Oda et al., 2000; Panula et al., 2015a; Parsons and Ganellin, 2006a).
Aunque todos ellos pertenecen a la familia de GPCRs, difieren en la
distribución, unión al ligando, vía de transducción de la señal y función.
Introducción
24
2.1.1. Receptor H1 (rH1)
El rH1 es una proteína glicosilada de 56kd con 487 aminoácidos
descripto por primera vez en 1966 (Ash and Schild, 1966; De Backer et al.,
1993; Gillard et al., 2002; Matsuda et al., 2004). Se expresa en una amplia
variedad de tejidos como sistema nervioso central, músculo liso, tracto
gastrointestinal, sistema cardiovascular, células endoteliales y linfocitos
(Haas et al., 2008; Hill et al., 1997; Shimamura et al., 2011).
La estimulación de estos receptores causa manifestaciones de alergia,
dilatación de los vasos sanguíneos periféricos y liberación de sustancias
bioactivas incluyendo óxido nítrico (Panula et al., 2015a). La activación del
rH1 está relacionada con la respuesta alérgica inmediata como: secreción
nasal, estornudos, picazón de nariz y garganta y en menor grado, las
molestias de la conjuntivitis y de la dificultad respiratoria (Solomon et al.,
2001). Se cree que la histamina es el primer mediador de la cascada
inflamatoria en el shock anafiláctico, dando lugar a la mayoría de los signos
y síntomas en las reacciones anafilácticas.
En relación a otras funciones de este receptor, ensayos in vivo
realizados en ratones que no expresan el rH1 demostraron que los mismos
presentan alteraciones del comportamiento y del sueño y/o vigilia, cuando
fueron expuestos a diferentes condiciones (Parmentier et al., 2016). La
literatura sugiere la existencia de un solapamiento entre las funciones de los
rH1 y rH2 en diversas áreas de estudio, por lo que se ha observado
recientemente que el bloqueo ya sea del rH1 o rH2 decrece la ansiedad
(Chee and Menard, 2013). En otros experimentos, sin embargo, únicamente
el bloqueo del rH1 redujo la ansiedad, mientras que el bloqueo del rH2 no
tuvo efecto alguno (Gianlorenço et al., 2014).
El rH1 se encuentra preferentemente acoplado a proteínas Gαq/11
(Leopoldt et al., 1997; Moniri et al., 2004). A través de este receptor, la
histamina activa a PLC, dando lugar al clivaje del PIP2 y a la formación de
IP3 y DAG. El IP3 lleva a la liberación de Ca2+ desde el retículo
Introducción
25
endoplasmático, incrementando el influjo de Ca2+ desde el espacio
extracelular como un evento secundario. También se ha descripto para este
receptor una respuesta promiscua en numerosos sistemas
hiperproliferativos, como tumores mamarios de rata inducidos
químicamente. Allí el rH1 se acopla directamente a la vía del AMPc (C. Davio
et al., 1995b). Resultados del laboratorio determinaron que tanto histamina
como el agonista específico del rH1 activan, además, a las proteínas GTPasas
pequeñas Rac1 y RhoA en forma dosis dependiente en células CHO que
expresan establemente el rH1 (Notcovich et al., 2010).
El rH1 puede ser fosforilado por muchas quinasas in vitro, incluyendo
PKA y PKC, siendo éste el primer paso en su desensibilización heteróloga
(Kawakami et al., 2003). En relación a su desensibilización homóloga, se ha
descripto en células HEK293 la participación de los dominios RGS y quinasa
de GRK2 en la misma (Iwata et al., 2005). Un estudio realizado en células
CHO-K1 demostró que una vez que el rH1 es estimulado con histamina 100
µM, se produce la fosforilación y rápida internalización del mismo por un
mecanismo dependiente de clatrina (Hishinuma et al., 2010). Por otro lado,
el pretratamiento de las células con filipina o nistatina, los cuales
interrumpen los rafts lipídicos, inhibe completamente la internalización del
receptor inducida por histamina (Self et al., 2005). Estos antecedentes
demuestran controversia en relación al mecanismo de internalización del
rH1 que no han sido clarificados hasta el momento.
2.1.2. Receptor H2 (rH2)
El rH2 es una proteína de 40kd con 359 aminoácidos identificado
farmacológicamente en 1972. Su hallazgo surgió a raíz de que algunas
acciones de la histamina no resultaban bloqueadas por ninguno de los
antihistamínicos H1 utilizados hasta ese momento (Black et al., 1972; Gantz
et al., 1991; Hill et al., 1997).
Introducción
26
Este receptor está vinculado a muchos de los efectos ejercidos por la
histamina, como la relajación del músculo liso en las vías aéreas, regulación
del músculo ventricular y atrial derecho del corazón, inhibición de la
respuesta quimiotáctica en basófilos y distintas acciones sobre células
inmunológicas, entre muchas otras funciones (Hill et al., 1997). Desde un
punto de vista clínico, la acción principal del rH2 está relacionada con su
papel en la secreción ácida gástrica. Se ha observado que los ratones
knockout para este receptor muestran serias alteraciones en la morfología y
estructura de la mucosa gástrica (Kobayashi et al., 2000).
En relación al rH2 y las células inmunológicas, se ha descripto que el
dihidrocloruro de histamina actuando sobre este receptor, inhibe la
formación de especies reactivas de oxígeno en monocitos y protege a las
células natural killer (NK) y linfocitos T del daño oxidativo. Por este motivo,
ensayos clínicos en tumores sólidos y en leucemias mieloides agudas (LMA)
han demostrado muy buenos resultados al aplicar tratamientos que
combinan dihidrocloruro de histamina (Ceplene®), con inmunoterapia.
Pacientes con melanoma maligno metastásico mejoraron las velocidades de
remisión a la vez que mostraron un aumento en la sobrevida (Aurelius et al.,
2012; Buyse et al., 2011; Romero et al., 2009).
Este receptor es expresado por varios tipos celulares, presentando
una distribución ubicua. Junto con el rH1, suelen localizarse en los mismos
tejidos cumpliendo en general un papel antagónico.
El rH2 se acopla a la proteína Gαs, por lo que la histamina estimula la
producción de AMPc por la AC y activa a la PKA, que a su vez fosforila una
amplia variedad de proteínas en muchos tipos celulares (Hill, 1990; Leurs et
al., 1994). Entre ellas: células del sistema nervioso central (SNC) y derivadas
del mismo, mucosa gástrica, miocitos cardíacos, adipocitos, monocitos,
macrófagos, células de músculo liso vascular, basófilos, eosinófilos y
neutrófilos, entre otras (Del Valle and Gantz, 1997; Jutel et al., 2001, 2009;
Introducción
27
Panula et al., 2015a), así como en la línea celular promonocítica humana
U937 (C. Davio et al., 1995b).
Sin embargo, en otros tipos celulares, la histamina a través del rH2 es
capaz de aumentar los niveles intracelulares de iones Ca2+. Esto sucede por
ejemplo en células gástricas parietales, en la línea celular leucémica HL-60,
en tumores mamarios de rata y glándulas mamarias indiferenciadas (C.
Davio et al., 1995a, 1995b; Hill et al., 1997).
El mecanismo de desensibilización e internalización de este receptor
ha sido ampliamente estudiado por nuestro grupo de trabajo. En células
renales COS-7 se ha demostrado que el estímulo con el agonista H2 induce la
fosforilación y desensibilización del receptor mediada por GRK2 y 3 (Shayo
et al., 2001b). Por otro lado, en células U937 se ha descripto una rápida
desensibilización del rH2 mediada por GRK2, impidiendo su diferenciación
al linaje monocítico (Fernández et al., 2002). Más aún, se demostró el papel
de GRK2, β-Arr, dinamina y clatrina en la internalización y resensibilización
del rH2, tanto en células COS-7 como en U937 (Fernandez et al., 2008).
Recientemente, describimos que el mecanismo de desensibilización
homóloga del rH2 inducido por su agonista involucra el dominio RGS de
GRK2, mientras que el dominio quinasa de GRK2 resulta importante para la
internalización y tráfico intracelular del mismo (Fernandez et al., 2011).
2.1.3. Receptor H3 (rH3)
El rH3 es una proteína de 49Kd con 445 aminoácidos descubierto en
1983 (Arrang et al., 1983; Hill et al., 1997; Lovenberg et al., 1999). Para este
receptor, existen variantes de splicing en varias especies, incluyendo
humanos, aunque su relevancia funcional es controversial (Drutel et al.,
2001; Liu et al., 2000). Su expresión se encuentra restringida al SNC,
actuando como autoreceptores presinápticos que inhiben la síntesis de
histamina en las neuronas histaminérgicas (Lovenberg et al., 1999; Parsons
and Ganellin, 2006b). En cerebro de ratón y rata se observa un patrón de
Introducción
28
expresión similar al humano, sin expresión en otros tejidos (Lovenberg et
al., 2000; Morisset et al., 2000). Estudios recientes revelan la presencia de
rH3 postsináptico o heteroreceptores en diferentes poblaciones neuronales,
controlando la liberación de diversos neurotransmisores, incluyendo
histamina, glutamato, ácido γ-aminobutírico, dopamina, noradrenalina y
acetilcolina (Gbahou et al., 2012) e implicados en varias condiciones
patológicas/fisiológicas (Provensi et al., 2018; Sundvik and Panula, 2015;
Tiligada et al., 2011).
Este receptor se acopla a la proteína Gαi/o, cuya activación provoca
una disminución en la producción de AMPc y en la activación de PKA.
También se ha descripto que el estímulo de este receptor deriva en la
activación de fosfolipasa A2, AKT, vías de MAPK y modulación de Ca2+
intracelular y se estima que esto ocurre vía diferentes combinaciones del
dímero Gβγ (Bongers et al., 2007).
Los agonistas del rH3 comúnmente utilizados son la R-α-
metilhistamina (Rα-MeHA) y el Imetit. Sin embargo, ambos ligandos poseen
cierta reactividad cruzada con el rH4. A lo largo de los años, se ha puesto
mayor énfasis en el desarrollo de antagonistas de este receptor, debido a su
utilidad terapéutica. Pitolosant (agonista inverso H3) mostró resultados
prometedores en un ensayo preclínico de narcolepsia, caracterizada por
somnolencia diurna excesiva causada por una neurotransmisión deficiente
de orexina que afecta a las neuronas histaminérgicas (Schwartz, 2011;
Sundvik and Panula, 2015).
2.1.4. Receptor H4 (rH4)
El rH4 es el receptor más recientemente descubierto, siendo una
proteína de 44kd con 390 aminoácidos. Valiéndose de la información
obtenida para el rH3, 6 grupos independientes anunciaron el clonado del
rH4 humano hacia fines del año 2000 (Liu et al., 2001a; Morse et al., 2001;
Nakamura et al., 2000; Nguyen et al., 2001; O’Reilly et al., 2002; Oda et al.,
Introducción
29
2000; Zhu et al., 2001). Este receptor posee un 37-43% de similitud con el
rH3 (Lovenberg et al., 1999). Sin embargo, este nuevo receptor comparte
mayor identidad con el receptor serotoninérgico, el adrenérgico, el
dopaminérgico y el muscarínico (~25%) que con los receptores rH1 o rH2
(~20%) (Nguyen et al., 2001).
Se expresa casi exclusivamente en células hematopoyéticas
(mastocitos, basófilos y eosinófilos, aunque no en neutrófilos) donde, al igual
que el rH3, se acopla a miembros de la familia de proteínas G
heterotriméricas de tipo Gαi/o y, de esta manera, media la inhibición de la
AC. Además, el receptor puede estimular MAPKs y PLC a través de la
subunidad Gβγ e inducir la movilización de Ca2+ intracelular (Deesch et al.,
2005; Jemima et al., 2014).
La histamina ha demostrado ser un potente quimioatractante para
mastocitos, siendo esta actividad mediada por el rH4. Utilizando
antagonistas del rH4, así como mastocitos derivados de ratones rH4-/- y
rH3-/-, se ha demostrado que la histamina induce la movilización de Ca2+
desde reservorios intracelulares vía el rH4. Muchos ligandos conocidos del
rH3 poseen afinidad por el rH4, como Rα-MeHA y el Imetit, actuando como
agonistas. Además, antagonistas del rH3 han mostrado ser agonistas
inversos para el rH4 (Lim et al., 2005; Liu et al., 2001a, 2001b; Oda et al.,
2000). Se ha postulado la utilización de antagonistas de este receptor como
posibles agentes terapéuticos para el tratamiento de asma y rinitis alérgicas
(Hofstra et al., 2003).
La figura 4 resume las principales funciones e implicancias en
procesos fisiológicos y patológicos en los que se encuentra asociada la
histamina y sus receptores.
Introducción
30
Figura 5. Principales funciones de la histamina y sus receptores. La histamina producida en diferentes tipos celulares ejerce diversas funciones a través de sus cuatro receptores (rH1-rH4), acoplados a diferentes proteínas G. Tiligada y Ennis 2018.
2.2. Antihistamínicos H1
El desarrollo de drogas antihistamínicas que actuaban a través de
un receptor aún no reconocido marcó la evolución de la farmacología de la
histamina en la década del 1930 (Emanuel, 1999). Considerando que el
primer antihistamínico H1 para el uso en humanos fue aprobado en 1942,
actualmente se han convertido en el grupo más extenso de medicamentos
utilizados en desordenes alérgicos, existiendo más de 45 antihistamínicos
H1 de uso clínico a nivel mundial.
Inicialmente clasificados como antagonistas del rH1, hoy han sido
reclasificados como agonistas inversos, dado que estabilizan la forma
inactiva del rH1 y antagonizan a la histamina, permitiendo que estos
fármacos interfieran en los procesos de tipo alérgico-inflamatorio (Simons
and Simons, 2011).
Introducción
31
Tradicionalmente, los antihistamínicos H1 se clasificaron en 6 grupos
químicos: alquilaminas, etanolaminas, etilendiaminas, fenotiazinas,
piperazinas y piperidinas. Actualmente, el sistema de clasificación
comúnmente utilizado hace referencia a la funcionalidad de estos ligandos,
dividiéndolos en 2 grupos. Los antihistamínicos de primera generación son
capaces de atravesar la barrera hemato-encefálica, causando sedación y/o
efectos anticolinérgicos (Hill, 1990; Nicholson et al., 1991). Los
antihistamínicos de segunda generación tienen escasa penetración a nivel
del SNC, permitiéndoles mejorar considerablemente su perfil terapéutico
(Simons and Simons, 2011). No obstante, hay más de 40 antihistamínicos H1
que se usan mundialmente no sólo para tratar los síntomas de rinitis
alérgica, conjuntivitis y urticaria (Simon and Simons, 2008), sino también
para la aplicación local en la mucosa o piel, disminuyendo los síntomas
causados por la histamina localizada o sistémica (Ostrom, 2014; Solelhac
and Charpin, 2014).
En la siguiente tabla se resume la clasificación química y funcional de
los antihistamínicos H1.
Clase química
Clase funcional
Primera generación Segunda generación
Alquilaminas
Bromfeniramina,
clorfeniramina,
dimetindeno, feniramina,
triprolidina
Acrivastina
Piperazinas
buclizina, ciclizina,
hidroxizina, meclizina,
oxatomida
ceterizina, levoceterizina
Piperidinas
Azatadina,
ciproheptadina,
difenilpiralina, ketotifen
Astemizol, bilastina,
desloratadina, ebastina,
fexofenadina,
levocabastina, loratadina,
Introducción
32
mizolastina, olopatadina,
rupatidina, terfenadina
Etanolaminas
Carbinoxadina,
clemastina,
dimenhidramina,
difenhidramina,
doxilamina,
feniltoloxamina
-
Etilendiaminas Antazolina, pirilamina,
tripelenamina -
Fenotiazinas Metdilazina, prometazina -
Otros Doxepina Azelastina, emedastina,
epinastina
Adaptada de Simons y Simons 2011.
2.3. Antihistamínicos H2
A partir de 1964 comenzó una extensa búsqueda de sustancias que
fueran capaces de bloquear los efectos de la histamina sobre la secreción
ácida gástrica, ya que los antihistamínicos comunes conocidos no lograban.
Luego de varios años, James Black y colaboradores publicaron evidencia del
primer antihistamínico H2 comercial aprobado por la US-FDA en 1976 para
su uso clínico, cimetidina (Black et al., 1972; Ganellin, 1981). Seguido a su
descubrimiento y aprobación, otros antihistamínicos H2 fueron
desarrollados, mostrando ser más potentes y tolerables que cimetidina
(Bradshaw et al., 1979; Parsons and Ganellin, 2006b). Entre ellos, famotidina
ha demostrado ser el antagonista más potente, siendo 20-50 veces más
potente que cimetidina y 6-10 veces más potente que ranitidina (Berardi et
al., 1988) Existen otros antagonistas del rH2 que han sido desarrollados,
pero no han sido introducidos en la terapia convencional, como lupitidina y
oxmetidina (Brown et al., 1990; Dobrilla et al., 1989).
Introducción
33
Al igual que los antihistamínicos H1, los antihistamínicos H2
clásicamente conocidos por ser antagonistas neutrales, han sido
reclasificados como agonistas inversos con eficacia negativa (Monczor et al.,
2003). Actualmente, cimetidina, ranitidina, nizatidina y famotidina son
fármacos bien establecidos y de venta libre que se utilizan para el
tratamiento de dispepsia, úlceras gástricas y duodenales, reflujo, esofagitis y
síndrome de Zollinger-Ellison (Hershcovici and Fass, 2011; Panula et al.,
2015b; Sigterman et al., 2013). Estos ligandos, a diferencia de los
antihistamínicos H1, no se clasifican en grupos y, a pesar de diferir
ligeramente en su estructura, poseen propiedades farmacológicas similares.
En los últimos años se ha observado que los inhibidores de la bomba
de protones (IPP), como el omeprazol, pantoprazol, iansoprazol, entre otros,
han ganado importancia en el tratamiento de úlceras peptídicas y
desórdenes relacionados a la secreción ácida gástrica. Sin embargo, los
antihistamínicos H2 aún se utilizan comúnmente como medicamentos
seguros y confiables para el tratamiento de estas patologías (Panula et al.,
2015b).
2.4. Reposicionamiento potencial de ligandos histaminérgicos
Desarrollar un nuevo fármaco para llevarlo al mercado tiene un
costo sustancial (de millones de dólares) y requiere de mucho tiempo. Este
hecho ha impulsado la búsqueda activa de nuevas estrategias para facilitar
el reposicionamiento de drogas antiguas o incluso para utilizar fármacos que
hayan fallado en un primer momento (Huang et al., 2011; Nosengo, 2016).
En este contexto, los ligandos histaminérgicos que poseen bajo costo, con
perfiles de seguridad establecidos y sin protección de patente, están siendo
potencialmente reconsiderados para su reutilización, ya sea solos o en
combinación con otros fármacos.
Por su parte, los antihistamínicos H1 pueden ser potencialmente
reposicionados para diferentes terapias. Por ejemplo, para terapias
Introducción
34
relacionadas a la inflamación en combinación con corticoides, con el objetivo
de disminuir tanto los efectos adversos observados, como la dosis
administrada de corticoides (Monczor and Fernandez, 2016; Zappia et al.,
2015), analgesia (Stein et al., 2016), desórdenes neurodegenerativos (Dong
et al., 2014; Kim and Song, 2017; Rocha et al., 2014), terapias del sueño
(Krystal, 2015; Neubauer, 2014) y terapias anti-filovirus (virus del Ébola y
Marburgo) (Schafer et al., 2018).
En adición a la regulación de la secreción ácida gástrica clásicamente
conocida, la señalización a través del rH2 ha sido implicada en el desarrollo
de enfermedades cardiovasculares. Elevadas concentraciones de histamina
han sido encontradas en tejidos cardíacos y los efectos mediados por la
estimulación del rH2 pueden ser importantes para el desarrollo de
enfermedades cardiovasculares (Eckel et al., 1982; Hattori, 1999; Kirch et
al., 1992; Shi et al., 2015). De hecho, el bloqueo del rH2 por antihistamínicos
H2 previene la insuficiencia cardíaca (IC) en conejos con cardiomiopatía
inducida por doxorrubicina y perros con taquicardia atrial sostenida
(Takahama et al., 2010). Además, ratones knockout para el rH2 presentan
resistencia a la IC y una disminución en los niveles de fibrosis cardíaca
cuando fueron sometidos a constricción aórtica transversa (Zeng et al.,
2014). Asimismo, en un estudio prospectivo multi étnico realizado por Leary
y colaboradores, concluyeron que el uso de los antihistamínicos H2 previene
la aparición de la IC (Leary et al., 2016).
Además, los antihistamínicos H2 están siendo considerados para
mejorar condiciones diabéticas y para el tratamiento de algunos tipos de
neoplasias como glioblastoma, melanoma maligno, cáncer renal, de las vías
biliares, colorrectal y gástrico (Dana et al., 2017; Pantziarka et al., 2014; Pini
et al., 2016).
Introducción
35
3. Histamina y proliferación celular
Durante la última década surgió una gran cantidad de evidencia
vinculando a la histamina con el proceso de proliferación celular
(Hernández-Angeles et al., 2001; Maintz and Novak, 2007), aunque ya desde
los años 60 existía la hipótesis de que la histamina podría estar involucrada
en el proceso de proliferación tumoral y carcinogénesis. En 1972, Kahlson y
Rosengren postularon que la histamina sintetizada de novo por los tejidos
está involucrada en los procesos de reparación y rápido crecimiento de los
mismos (Kahlson and Rosengren, 1972). Más aún, hace aproximadamente
50 años se demostró por primera vez que la histamina, así como la
serotonina, son angiogénicas en tejido de córnea de conejo (Zauberman et
al., 1969).
Actualmente, se acepta que el rol de la histamina en el proceso de
proliferación celular es dual, ya que se ha descripto a esta molécula no sólo
promoviendo, sino también inhibiendo la proliferación. Por ejemplo, tanto
en células de músculo liso (Panettieri et al., 1990), como en condrocitos
articulares humanos (Tetlow and Woolley, 2003), en células precursoras de
la corteza cerebral (NPC) (Molina-Hernndez and Velasco, 2008) y en células
de carcinoma mamario (Bowrey et al., 2000), se observó un marcado
aumento en la proliferación provocado por el tratamiento con histamina. Sin
embargo, la misma fue capaz de reducir el crecimiento de células de
carcinoma hepatocelular HuH-6 (Lampiasi et al., 2007). Por otro lado, en
células WM35 de melanoma, el arresto celular inducido por IL-6 es mediado
en parte por una elevación del contenido de histamina producida localmente
y por una alteración en el patrón de expresión característico de los
receptores de histamina. Además, en este mismo sistema, se ha demostrado
que altas concentraciones de histamina conducen a la inhibición de la
proliferación vía el rH1, mientras que el tratamiento con bajas
concentraciones de histamina determina un efecto proliferativo (Lázár-
Molnár et al., 2002). Más recientemente, se ha demostrado que la histamina
Introducción
36
inhibe la proliferación de células T de ratón in vitro, reduciendo los niveles
de ERK activado e incrementando los niveles de p27, inhibidor de la
progresión del ciclo celular, actuando a través de los rH1 y rH2 (Lapilla et al.,
2011).
Finalmente, nuestro grupo de trabajo ha descripto que la histamina,
actuando a través del rH1, inhibe la proliferación de células CHO por un
mecanismo que involucra la activación de JNK y Rac (Notcovich et al., 2010).
Más aún, determinamos que el tratamiento de 48 h con el agonista del rH1
inhibe la proliferación celular e induce apoptosis en la línea celular U937,
proceso que es inhibido por la activación del rH2 (Alonso et al., 2013).
4. Histamina e inflamación
La inflamación es un proceso que se produce en respuesta a un daño
intracelular generado por numerosos agentes o situaciones, como injurias
físicas, daño tisular, infecciones o reacciones autoinmunes, cuya función es
remover la lesión y restaurar la estructura y función tisular.
En respuesta a la inflamación, las células sintetizan y liberan
numerosos mediadores inflamatorios que disparan y sostienen el proceso
actuando sobre la vasculatura, promoviendo vasodilatación, aumento en la
permeabilidad capilar, extravasación de plasma y, finalmente, infiltración y
activación de leucocitos en el tejido inflamado. Entre los diversos
mediadores inflamatorios se encuentran citoquinas, quemoquinas,
prostaglandinas e histamina, entre otros (Bergmann et al., 1989; White,
1999).
En particular, la histamina liberada a partir de mastocitos y basófilos
durante una reacción inflamatoria puede influenciar en la respuesta inmune
y funciones inflamatorias a través de su interacción con los 4 subtipos de
receptores (Akdis and Simons, 2006; Jutel et al., 2002; Jutel and Akdis,
2007). Actualmente es sabido que la histamina no sólo posee efectos
proinflamatorios, sino que también puede tener efectos antinflamatorios,
Introducción
37
dependiendo del subtipo de receptor por el cual actúe y del tipo de célula
estimulada (Thangam et al., 2018; Thurmond, 2015).
En relación a los efectos proinflamatorios, la histamina contribuye a la
activación y liberación de diversas citoquinas proinflamatorias como IL-1α,
IL-1β, IL-6e y quemoquinas como RANTES e IL-8 en varios tipos celulares
(Jeannin et al., 1994; Li et al., 2001; Merétey et al., 1991; Vannier and
Dinarello, 1993). Por ejemplo, utilizando sistemas de expresión transiente,
ha sido reportado que las subunidades Gαq/11 y Gβγ del rH1 pueden activar
el factor nuclear-kβ (NF-kβ), un factor de transcripción prominente en
inflamación (Bakker et al., 2001). Además, se observó el efecto sinérgico del
cotratamiento de histamina y otros estímulos inflamatorios, como LPS y
TNF-α, en la inducción de IL-6 e IL-8 en células endoteliales de la arteria
coronaria humana (HCAEC). Yuai Li y colaboradores reportaron que este
cotratamiento permite la translocación de NF-kβ (activado a través del rH1)
hacia el núcleo, induciendo un incremento en la expresión de IL-6 e IL-8 (Li
et al., 2001). Asimismo, ha sido reportado que la histamina induce la
expresión de la enzima COX-2 (ciclooxigenasa-2) a través del rH1 e induce la
homeostasis prostanoide en células del endotelio vascular (Tan et al., 2007).
Los efectos antiinflamatorios promovidos por la histamina son
menores respecto de los inflamatorios y, en general, independientes del rH1.
Por ejemplo, en linfocitos TH2 la histamina estimula la producción de la
citoquina antiinflamatoria IL-10 de manera dosis dependiente, siendo
suprimida por la acción de antagonistas de los rH1 y rH2 e inhibidores de
PKA (Osna et al., 2001). Más aún, en un modelo murino de asma, Morgan y
colaboradores demostraron que la administración de 4-metilhistamina (4-
mHA), agonista del rH4, redujo la hiperreactividad e inflamación de las vías
respiratorias, incrementando el reclutamiento de las células T regulatorias
(TR) en el pulmón. Este hecho sugiere un papel antiinflamatorio e
inmunomodulador de la histamina a través del rH4. (Morgan et al., 2007).
38
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Hipótesis y Objetivos
39
En base a los antecedentes mencionados a lo largo de la introducción,
proponemos la siguiente hipótesis para el presente trabajo:
“La regulación cruzada entre los rH1 y rH2 inducida por agonistas y
antagonistas/agonistas inversos del sistema histaminérgico, modula la
respuesta final de los mismos a través de mecanismos determinados por el tipo
de ligando unido, aportando información de relevancia terapéutica”.
Establecemos como objetivo general “Profundizar acerca de los
mecanismos de regulación cruzada entre los rH1 y rH2 inducida por sus
ligandos, con el fin de ampliar los conceptos establecidos y aportar nuevas
bases para la utilización racional de los ligandos histaminérgicos comúnmente
utilizados en la clínica y en ensayos de reposicionamiento de fármacos.”
En el marco de este trabajo de tesis planteamos los siguientes
objetivos específicos:
Objetivo 1: Dado que GRK2 es la quinasa responsable de la
desensibilización homóloga de los rH1 y rH2 activados por sus agonistas,
evaluaremos el papel de esta proteína en la desensibilización cruzada entre
ambos receptores inducida por sus agonistas.
Objetivo 2: Sabiendo que la activación de un receptor afecta la
respuesta generada por el otro receptor, determinaremos si la
desensibilización cruzada inducida por agonistas de ambos receptores
afecta la respuesta individual de los mismos frente al tratamiento con
diferentes antihistamínicos.
Objetivo 3: Teniendo presente que los antihistamínicos H2/agonistas
inversos H2 son capaces de promover la desensibilización e internalización
del rH2, evaluaremos la capacidad de los antihistamínicos de ambos
receptores de desencadenar procesos de desensibilización cruzada entre los
mismos y estudiaremos sus mecanismos.
Hipótesis y Objetivos
40
Objetivo 4: Debido a que existe una cointernalización de los rH1 y rH2
inducida por sus agonistas y que los antihistamínicos H2/agonistas inversos
H2 son capaces de internalizar a su propio receptor, analizaremos la
existencia de una internalización cruzada de los receptores inducida por
antihistamínicos H1 y H2 y el destino de los mismos una vez internalizados.
41
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
42
1. Materiales
El agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina), ceterizina,
clorfeniramina, difenhidramina, cimetidina, ranitidina, famotidina, albúmina
sérica bovina, tween-20, PMA (forbol 12-miristato 14-acetato), LPS
(lipopolisacárido bacteriano de Escherichia Coli), DMEM (Dulbeco’s modified
Eagle’s medium), RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute medium),
Claycomb (Claycomb médium), MEM (Minimum Essential Medium)
cicloheximida (CHX), así como el metil-isobutilxantina (IBMX), AMPc, PGE2,
gentamicina y ampicilina fueron adquiridos en Sigma Chemical Company (St.
Louis, MO).
Mepiramina, triprolidina, tiotidina, amtamina y el inhibidor dynasore
fueron obtenidos de Tocris Cookson Inc. (Ballwin, MO).
La tripsina fue adquirida en GIBCO, Life Technologies (Gaithersburg,
MD). El kit de anexina V-FITC fue provisto por BD Biosciences (Estados
Unidos). El suero fetal bovino (SFB) fue obtenido de Natocor (Argentina).
El anticuerpo anti-GRK2 fue adquirido en Santa Cruz Biotechnology,
Inc. (Santa Cruz, CA). El anticuerpo secundario fue obtenido en Vector Labs
(California, USA).
Los compuestos radiactivos, [3H]AMPc, [3H]mepiramina y
[3H]tiotidina fueron adquiridos en Perkin Elmer, Life Sciences (Boston, MA).
El resto de los reactivos utilizados fueron de grado analítico.
2. Cultivo y mantenimiento de líneas celulares
2.1. Células HEK293
Las células HEK293 (derivadas de riñón embrionario humano, ATCC #
CRL-1573) fueron crecidas en adhesión, en estufa con atmósfera
humidificada, conteniendo 5% CO2, a 37°C, en medio DMEM suplementado
con 10% de SFB y 50μg/ml de gentamicina. Las células fueron subcultivadas
mediante el agregado de una solución 0,05% de tripsina y 0,3mM de EDTA.
Materiales y Métodos
43
2.2. Células U937, U937-DC6, U937-A2, U937-AD3 y U937-F5
Las células U937 (derivadas de un linfoma histiocítico humano,
ATCC# CRL-1593.2) fueron crecidas en suspensión, en estufa con atmósfera
humidificada con 5% CO2, a 37°C, en medio RPMI 1640 suplementado con
10% de SFB y 50μg/ml de gentamicina. Las mismas fueron mantenidas a
una densidad entre 2x105 y 1,5x106 células/ml.
Los clones U937-DC6, U937-A2, U937-AD3 y U937-F5 fueron
obtenidos a partir de células U937 por transfección estable con plásmidos
codificantes de una mutante dominante negativa de dinamina, una
construcción con secuencia antisentido de GRK2, una mutante dominante
negativa de arrestina y el rH1, respectivamente. Fueron crecidos en
suspensión en estufa con atmósfera humidificada con 5% CO2, a 37°C, en
medio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB, 50μg/ml de gentamicina y
0,8mg/ml de geneticina y mantenidas a una densidad entre 2x105 y 1,5x106
células/ml. Estos clones fueron previamente obtenidos y caracterizados en
nuestro laboratorio (Fernandez et al., 2008, 2011; Fernández et al., 2002).
2.3. Células AGS
Las células AGS (derivadas de adenocarcinoma gástrico humano,
ATCC# CRL-1739) fueron crecidas en adhesión, en estufa con atmósfera
humidificada con 5% CO2 a 37ºC en medio RPMI con 10% de SFB y 50 μg/ml
de gentamicina. Las mismas fueron subcultivadas mediante el agregado de
una solución de tripsina 0,05% y EDTA 0,3mM.
2.4. Células HL1
Las células HL1 (derivadas de músculo cardíaco de ratón, ATCC# CRL-
1458) fueron crecidas en adhesión, en estufa con atmósfera humidificada
con 5% CO2 a 37ºC en medio Claycomb con 10% de SFB y 50μg/ml de
gentamicina. Las mismas fueron subcultivadas mediante el agregado de una
solución de tripsina 0,05% y EDTA 0,3mM.
Materiales y Métodos
44
3. Preparación de ADN plasmídicos
3.1. Purificación de ADN
Para la obtención de los plásmidos con las distintas construcciones,
bacterias E. Coli XL1-Blue transformadas fueron crecidas durante toda la
noche (ON) a 37°C en 30ml de medio LB (bacto-triptona 5g/l, extracto de
levadura 10g/l, NaCl 10g/l) suplementado con ampicilina (todos los
vectores utilizados contienen el gen de resistencia a este antibiótico). Las
bacterias se recolectaron por centrifugación a 6000rpm durante 15 min y se
resuspendieron en 4ml de buffer P1 (Tris-HCl 50mM, pH 8; EDTA 10mM;
100μg/ml de RNasa A). Estas bacterias fueron lisadas por agregado de 4ml
de buffer P2 (NaOH 200mM; 1% SDS) mezclando por inversión la
preparación. Se incubó 5 min a temperatura ambiente agregándose
posteriormente 4ml de buffer P3 (acetato de potasio 3M, pH 5,5). Luego de
15 min en hielo, se centrifugaron a 12000rpm por 30 min a 4°C y el
sobrenadante conteniendo el ADN plasmídico fue sembrado en una columna
de QIAGEN-TIP previamente equilibrada con 4ml de buffer QBT (NaCl
750mM; MOPS 50mM, pH 7; 15% isopropanol; 0,15% Triton X-100). La
columna fue lavada dos veces con 10ml de buffer QC (NaCl 1 M; MOPS
50mM, pH 7; 15% isopropanol) y el ADN plasmídico fue eluído con 5 ml de
buffer QF (NaCl 1,25 M; Tris-HCl 50mM, pH 8,5; 15% isopropanol). Luego,
fue precipitado por adición de 0,7 volúmenes de isopropanol a temperatura
ambiente y posterior centrifugación a 12000rpm durante 30 min a 4°C. El
precipitado se lavó con 70% de etanol, se dejó secar y se resuspendió en
100μl de buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 1mM).
Los plásmidos así obtenidos fueron analizados por electroforesis en
geles de agarosa al 0,8% en buffer TAE (Tris-acetato 0,4 M, pH 8; EDTA
1mM), expuestos a 100V y teñidos con una solución de Bromuro de Etidio
1μg/ml, para su posterior visualización por fluorescencia a la luz U.V. (300
nm). Luego de confirmar la integridad del ADN plasmídico, el mismo fue
Materiales y Métodos
45
cuantificado utilizando Nanodrop 2000 Spectrophotometer (Thermo
Scientific) a una longitud de onda de 260nm.
3.2. Construcciones utilizadas
Para la realización del presente trabajo se utilizaron plásmidos con
sus insertos previamente clonados o subclonados en nuestro laboratorio o
donados, como se detalla a continuación:
✓ pCEFL-rH1 humano: Subclonado previamente en nuestro laboratorio
(Notcovich et al., 2010).
✓ pCEFL-HA-rH2: Clonado previamente en nuestro laboratorio (Shayo et
al., 2001b). El plásmido pCEFL-HA fue cedido por el Dr. O. Coso, del
laboratorio de Fisiología y Biología Molecular y Celular de la Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales, UBA.
✓ pCEFL-HA-GRK2; Obtenido previamente en nuestro laboratorio
(Shayo et al., 2001b).
✓ pcDNA3-GRK2-K220R: Facilitado por el Dr. J. Benovic del
departamento de Microbiología e Inmunología. Centro Kimmel Cancer.
Universidad Thomas Jefferson, Philadelphia, USA.
✓ pcDNA3-GRK2-D110A: Cedido por la Dra. R. Sterne-Marr del
departamento de Biología. Siena College, Loudonville, New York.
✓ PCEFL-HA-RH, PCEFL-HA-RH-PH y PCEFL-HA-KINK220R-PH: Obtenidos
previamente en nuestro laboratorio (Fernandez et al., 2011).
✓ p(IL6κB)-350hu.IL6P-luc+: Cedido por el Dr. Karolien De Bosscher del
departamento Medical Protein Research de la Universidad de Gent,
Bélgica.
La correcta secuencia de todos los plásmidos fue confirmada por
secuenciación (Macrogen).
Materiales y Métodos
46
4. Expresión de ADN foráneo: Transfecciones transientes
Células HEK293 fueron transfectadas con las construcciones indicadas
en cada figura utilizando el reactivo K2 Transfection System (BIONTEX)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células fueron plaqueadas el
día anterior a la transfección en medio DMEM suplementado con SFB 10% a
una densidad 0,2x105 células/cm2 de la placa utilizada.
Para una placa de 35mm de diámetro se emplearon 24μl del reactivo
Multiplier, una mezcla A de 2μg de ADN total y 150μl de DMEM base, y una
mezcla B de 4μl del reactivo de transfección K2 y 150μl de DMEM base y se
procedió de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad de
ADN y los volúmenes de reactivos son proporcionales al área de la placa. Al
día siguiente, las células se subcultivaron en placas de 12, 24, 48 o 96
pocillos dependiendo del ensayo a realizar. Los mismos fueron realizados
48h después de la transfección.
5. Ensayos de desensibilización cruzada rH1/rH2: Medición de AMPc
5.1. Células en suspensión
Las células U937, DC6, AD3 y F5 fueron cultivadas hasta una densidad
de 1x106 células/ml en frascos de 75cm2, centrifugadas a 1000rpm durante
5 min y resuspendidas en medio RPMI base suplementado con 5% SFB. Las
mismas fueron pretratadas durante los tiempos indicados en cada figura con
el agonista H1 o los diferentes antihistamínicos H1 (ceterizina, mepiramina,
clorfeniramina, triprolidina y difenhidramina) en la concentración indicada
en cada figura a 37°C, lavadas dos veces con PBS, centrifugadas y
resuspendidas a una densidad de 1x106 células/ml en RPMI sin rojo fenol
conteniendo IBMX 1mM durante 3 min. Finalmente, fueron estimuladas con
el agonista H2 (amtamina) 10µM, con los diferentes antihistamínicos H2
(cimetidina, ranitidina y famotidina) 10µM o bien con PGE2 1µM durante 10
min y la reacción fue detenida por el agregado de 1ml de etanol absoluto.
Materiales y Métodos
47
La fase etanólica conteniendo el AMPc fue llevada a sequedad en baño
termostatizado a 70-80°C y resuspendida en buffer de ensayo (Tris-HCl
50mM pH 7,4; EDTA 4mM; 0,1% albúmina bovina y 0,1% azida sódica). El
contenido de AMPc fue determinado por un ensayo de competición con [3H]
AMPc por PKA, como se describe más adelante.
5.2. Células en adhesión
Las células HEK293 transfectadas de manera transiente con las
construcciones indicadas en cada figura, fueron sembradas en placas de 24 o
48 pocillos el día anterior al ensayo. Las mismas se pretrataron con el
agonista H1 o los diferentes antihistamínicos H1 (ceterizina, mepiramina,
clorfeniramina, triprolidina y difenhidramina) en las concentraciones
indicadas en cada figura, en DMEM suplementado con 5% SFB durante 30
min a 37°C. Luego, el medio fue aspirado y las células fueron lavadas dos
veces con PBS e incubadas en DMEM sin rojo fenol conteniendo IBMX 1mM
durante 3 min. Finalmente, fueron estimuladas con el agonista H2
(amtamina) 10µM o bien con los diferentes antihistamínicos H2 (cimetidina,
ranitidina y famotidina) 10µM durante 10 min y la reacción fue detenida por
el agregado de 1 ml de etanol absoluto.
Las células AGS fueron transferidas a placas de 6 pocillos el día
anterior al ensayo. Las mismas se pretrataron con el agonista H1 10μM en
RPMI suplementado con 5% SFB durante 30 min a 37°C. Luego, el medio fue
aspirado y las células fueron lavadas dos veces con PBS e incubadas en RPMI
sin rojo fenol conteniendo IBMX 1mM durante 3 min. Finalmente fueron
estimuladas con los diferentes antihistamínicos H2 (cimetidina, ranitidina y
famotidina) 10µM durante 10 min y la reacción fue detenida por el agregado
de 1 ml de etanol absoluto.
La fase etanólica conteniendo el AMPc fue sometida al mismo
tratamiento descripto anteriormente (sección 5.1.).
Materiales y Métodos
48
5.3. Ensayo de unión de PKA para el dosaje de AMPc
5.3.1. Obtención de la proteína ligadora
La cuantificación del AMPc en las muestras se realizó mediante una
adaptación de la técnica de unión a proteína ligadora (Gilman, 1970) según
(C. A. Davio et al., 1995).
La proteína quinasa específica de AMPc (PKA) se obtuvo de tejido
muscular bovino según la siguiente técnica: se homogenizó el tejido en
buffer fosfato 50mM, pH 7,4 y EDTA 5mM, trabajando en frío sobre baño de
hielo. Se centrifugó a 27000 x g durante 20 min y el sobrenadante resultante
se dejó sedimentar durante un día en heladera. Posteriormente, se precipitó
con (NH4)2SO4 en una relación de 32,4 g por cada 100 ml de solución y se
centrifugó a 16000 x g por 20 min. El precipitado obtenido se resuspendió
en 6% del volumen inicial en buffer fosfato 5mM. Posteriormente se dializó
durante dos días a 4°C en el mismo buffer, se centrifugó a 27000 x g por 20
min y el sobrenadante así obtenido se utilizó como fuente de proteína
ligadora para el ensayo. El rendimiento fue de aproximadamente 60 ml de
una solución cuya concentración proteica fue de 30mg/ml.
Para determinar la concentración óptima de proteína ligadora se
realizaron curvas de unión máxima en función de distintas diluciones de
proteína, desde 1/10 hasta 1/500 en presencia de 40000 dpm de [3H]AMPc.
La proteína ligadora así titulada se utilizó en una dilución capaz de unir
entre el 35 y 50% del trazador.
5.3.2. Condiciones del ensayo
Como trazador se utilizó [3H]AMPc en concentración final de 3nM en
el medio de incubación (0,205 ng/tubo) equivalente a 40000 dpm/tubo. El
buffer de incubación utilizado fue Tris-HCl 50mM pH 7,4; 0,1% albúmina
bovina; EDTA 4mM y 0,1% de azida sódica.
Materiales y Métodos
49
El ensayo se realizó incubando 50μl de [3H]AMPc, 100μl de una
dilución de proteína ligadora y 50μl de los distintos estándares o muestras a
analizar en tubos de vidrio por triplicado. Luego de 2 h a 4°C se separó el
AMPc unido del libre mediante precipitación con carbón-dextrán. Para ello,
se agregaron 300μl de una suspensión de carbón-dextrán, seguido de 15 min
de incubación a 4°C y posterior centrifugación a 3000rpm durante 15 min a
igual temperatura. Los sobrenadantes fueron transferidos a viales con
solución centelladora y la actividad unida se midió en un equipo de centelleo
líquido. Para el cálculo de unión inespecífica se trabajó con una
concentración 1mM de AMPc en el medio de incubación.
5.3.3. Controles y estándares
En los distintos ensayos realizados se incluyeron los siguientes tubos:
B0: Para determinar la máxima unión del trazador a la proteína
ligadora.
I: Inespecífico, unión en presencia de una concentración 1mM de
AMPc.
Curva Standard: Se construyó procesando 10 (diez) estándares de
AMPc en concentraciones entre 0,18 y 91 pmol/tubo.
Muestras problema: Al igual que el resto de los tubos, se procesaron
por triplicado. Las distintas muestras se diluyeron de forma tal que la
concentración de AMPc de las mismas se encontrara dentro del rango lineal
de la curva estándar. Para ello, se resuspendió el residuo seco procedente de
la evaporación del etanol en el volumen correspondiente de buffer de
incubación.
Materiales y Métodos
50
6. Detección de proteínas por Western Blot
6.1. Preparación de las muestras
Las células U937 y U937-A2 en fase exponencial de crecimiento (6.105
células/ml) o células HEK293 previamente plaqueadas y transfectadas
fueron lisadas en buffer de lisis (Tris-HCl 50mM pH 6,8, dodecil sulfato de
sodio (SDS) 2 %, 2-mercaptoetanol 100mM, glicerol 10 % y azul de
bromofenol 0,05 %) y posteriormente sonicadas para provocar la disrupción
del ADN.
6.2. Electroforesis y transferencia
Los extractos proteicos fueron analizados en geles de poliacrilamida
al 12%, en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). El buffer de
electroforesis utilizado contenía Tris 25mM; glicina 192mM; 0,1% SDS, pH
8,3. La electroforesis se desarrolló en mini geles a voltaje constante de 100V
en una cuba “Trans-Blot Turbo™ Transfer System” asistida por una fuente de
tensión (Bio-Rad laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos). Al
finalizar el fraccionamiento, el gel fue equilibrado en buffer de transferencia
(Tris-HCl 25mM, pH 8,3, glicina 150mM; 20% metanol) durante 15 min y
transferido a membranas de nitrocelulosa (Amersham Life Science,
Inglaterra) a 100V, durante 1,5 h a 4°C. Las proteínas transferidas fueron
teñidas en una solución conteniendo 0,2% Ponceau y 0,5% ácido acético
para visualizar las proteínas totales y constatar la eficiencia de la
transferencia en todas las calles. Posteriormente, las membranas fueron
lavadas en PBS hasta la desaparición de la tinción.
6.3. Revelado de proteínas específicas
Luego de tratar las membranas con solución de bloqueo (5% leche en
TBS-0,05% Tween) durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente,
fueron incubadas durante toda la noche a 4º C con el anticuerpo anti-GRK2
Materiales y Métodos
51
0.5-1 μg/ml en TBS–0,05% Tween y posteriormente lavadas 3 veces con una
solución TBS-0,05%Tween. La detección se llevó a cabo incubando con 0,2
μg/ml de anticuerpo secundario anti-conejo (Vector Labs) conjugado a
peroxidasa durante 1 h, seguido de una exposición a una solución sustrato
de la peroxidasa y amplificadora de la quimioluminiscencia (Amersham Life
Science, Inglaterra). El resultado se visualizó por autorradiografía.
7. Ensayo de gen reportero de luciferasa
Las células HEK293 fueron sembradas en placas de 24 pocillos y se
transfectaron utilizando el reactivo K2 Transfection System (BIONTEX) con
los plásmidos correspondientes mediante el protocolo descripto
anteriormente (sección 4). En algunos experimentos, las células fueron
cotransfectadas con alguno de los plásmidos de interés o con un vector vacío
para mantener la cantidad total de ADN. Después de 4 h, las células se
sembraron en placas de 96 pocillos y luego de 24 h fueron hambreadas
durante la noche reemplazando el medio completo por DMEM base con
gentamicina. Las células fueron pretratadas con amtamina o con los
diferentes antihistamínicos H2 (cimetidina, ranitidina o famotidina) 10µM
durante 10 min y luego estimuladas con el agonista H1 o con los
antihistamínicos H1 (ceterizina, mepiramina, clorfeniramina, triprolidina o
difenhidramina) 10µM y la actividad de luciferasa fue medida a las 6 h de
estimulación, utilizando el kit de luciferasa Steady-Glo (Promega Biosciences
Inc, CA, EE.UU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando el
lector de microplacas GloMax 96 Microplate Luminometer (Promega
Biosciences Inc, CA, EE.UU).
Materiales y Métodos
52
8. Cuantificación de ARN mensajero utilizando PCR en tiempo real
(qPCR)
8.1. Obtención de muestras
8.1.1. Células U937 diferenciadas con PMA a monocitos
Se plaquearon las células U937 en una cantidad equivalente a 1.5x106
células/punto experimental en medio RPMI suplementado con 10% SFB y
50 µg/ml de gentamicina en frascos de 75cm2 de área y se les agregó PMA
100nM como factor diferenciante. A las 24 h, las células diferenciadas dejan
de proliferar y se encuentran adheridas a la base del frasco. Las células se
levantaron, resuspendieron en RPMI base suplementado con gentamicina y
se plaquearon en placas de 6 pocillos, durante 24 h. Luego, se
preestimularon las células durante 15 min agregándose posteriormente los
estímulos correspondientes por 18 h y dependiendo del ensayo, LPS por 4 h.
Para cortar los estímulos, se centrifugaron las células a 1000rpm y se
agregaron 0,5ml del reactivo Quick-Zol (Kalium Technologies) sobre el
pellet, a fin de realizar una lisis celular activa. Los tubos conteniendo dicho
lisado fueron inmediatamente llevados a un freezer de –80°C, donde se
conservaron hasta el momento de la purificación del ARN.
8.1.2. Células HL1
Se plaquearon las células en placas de 12 pocillos (P12) en una
cantidad equivalente a 8x105 células/ml en medio Claycomb, suplementado
con 10% SFB el día anterior al ensayo. Luego, se cambió el medio por MEM
suplementado con 3% de SFB, se preestimularon las células durante 15 min
y, posteriormente, se agregaron los estímulos correspondientes por 6 h.
Para cortar los estímulos se extrajo el medio y se agregó 500 µl del reactivo
Quick-Zol (Kalium Technologies) a fin de realizar la lisis celular activa. Los
tubos conteniendo dicho lisado fueron inmediatamente llevados a un freezer
Materiales y Métodos
53
de –80°C, donde se conservaron hasta el momento de la purificación del
ARN.
8.2. Purificación del ARN
Los tubos conteniendo el lisado celular fueron retirados del freezer a
–80°C e incubados a temperatura ambiente por 5 min. Luego de dicha
incubación, se agregaron 200μl de cloroformo a cada tubo, se agitó
vigorosamente de manera manual por 15 seg y se incubó a temperatura
ambiente por 5 min. Inmediatamente después de esta segunda incubación,
se centrifugaron por 15 min a 12000 x g en centrífuga refrigerada a 4°C.
Mediante dicha centrifugación se logró la separación de las fases acuosa y
orgánica (superior e inferior, respectivamente). La fase acuosa conteniendo
el ARN fue transferida a otro tubo de centrífuga y la fase orgánica
descartada. Luego, el ARN fue precipitado por el agregado de 500μl de
isopropanol a la fase acuosa, incubación a temperatura ambiente durante 10
min e inmediata centrifugación a 12000 x g por 10 min en centrífuga
refrigerada. El precipitado fue lavado con 500μl de etanol al 75%,
centrifugado a 7000 x g por 5 min en centrífuga refrigerada, secado a
temperatura ambiente por 30 min y resuspendido en 50μl de agua libre de
nucleasas. El ARN así resuspendido fue conservado a –80°C hasta el
momento de ser utilizado. En todos los pasos de este procedimiento se
utilizaron materiales y reactivos libres de nucleasas.
El contenido de ARN de cada muestra fue cuantificado utilizando el
Nanodrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific) por absorbancia a
260nm y la ausencia de contaminación proteica fue verificada por la relación
de absorbancias a 260nm/280nm (preparaciones puras de ARN tienen una
relación A260/A280 de 2.0).
Materiales y Métodos
54
8.3. Síntesis del ADN copia (ADNc)
Para la síntesis de ADNc se partió de 2μg de ARN y se agregaron 2μl
de primers hexaméricos al azar (0,5μg/μl) y cantidad suficiente de agua
libre de nucleasas para alcanzar un volumen final de 12μl. Esta mezcla se
incubó 5 min a 70°C e inmediatamente después, se colocó la muestra en
hielo y se procedió a la síntesis del ADNc por agregado de 8μl de una
solución conteniendo 4μl de buffer RT Buffer (5X-Promega); 1μl de
transcriptasa reversa M-MLV 200U/μl (Promega); 0,8μl de dNTPs 25mM
(Invitrogen) y 2,2μl de agua libre de nucleasas. La mezcla de reacción así
preparada fue homogeneizada y sometida en el termociclador a un ciclo de:
1) 10 min a 25°C
2) 90 min a 42°C
3) 15 min a 70°C
4) 4°C ∞
8.4. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)
Para la cuantificación relativa del ARNm se utilizaron los siguientes
pares de primers específicos:
Nombre Especie Orientación Secuencia
de oligonucleótidos
Tm
(ºC)
COX-2 Humano
Sentido
Antisentido
5’-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3’
5’-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3´
56
IL-8 Humano
Sentido
Antisentido
5´-CTGCGCCAACACAGAAATTA-3´
5´-ATTGCATCTGGCAACCCTAC-3´
56
IL-6 Ratón
Sentido
Antisentido
5’-CCTCTCTGCAAGAGACTTCCAT-3’
5’-ACAGGTCTGTTGGGAGTGGT-3’
58
Materiales y Métodos
55
β-Actina Ratón
Sentido
Antisentido
5’-AAGATCATTGCTCCTCCTGAGC-3’
5’-CATACTCCTGCTTGCTGATCCA-3’
60
β-Actina Humano
Sentido
Antisentido
5’-AGCGAGAAGGCATCACTTTC-3’
5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’
61
Resulta importante mencionar que, tanto los primers como la
secuencia blanco, pueden afectar la eficiencia de la qPCR. Es por ello que los
primers utilizados fueron elegidos debido a que reúnen las condiciones que
se describen en el manual de Biorad (Real-Time PCR Applications Guide),
entre las que se destacan:
✓ La secuencia blanco debe ser de 75-200 pb.
✓ Los primers deben tener un contenido de GC de 50-60%
✓ La temperatura de melting (Tm) de los primers debe encontrarse en
el rango de 50-65°C
La cuantificación fue realizada utilizando como sistema de detección
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories Inc.,
California, Estados Unidos). Cada muestra de ARN fue cuantificada por
triplicado, en una mezcla de reacción preparada de la siguiente forma:
✓ 0,25μl de primer sentido 10μM
✓ 0,25μl de primer antisentido 10μM
✓ 4μl de HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (Solis BioDyne)
✓ 13,5μl de agua libre de nucleasas
✓ 1,5μl de ADNc (previamente diluido)
Las mezclas de reacción así preparadas fueron procesadas de acuerdo
al siguiente protocolo:
Desnaturalización inicial 15 min a 95°C
Desnaturalización 30 seg a 95°C
Hibridación 30 seg a 60°C
Elongación 30 seg a 72°C
45 ciclos
Materiales y Métodos
56
La especificidad de cada par de primers fue chequeada por el análisis
de la curva de disociación realizada mediante una rampa de temperatura de
72 a 95°C, aumentando 1°C en cada 5 seg.
8.5. Análisis de los resultados obtenidos de la qPCR
La cantidad relativa del ARNm fue calculada utilizando el método de
ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001) normalizado por β-Actina como gen de
referencia para los experimentos con líneas celulares.
En una primera instancia, se realizó una curva de calibración para
determinar la eficacia de cada par de primers. Se realizaron mezclas en
partes iguales de las muestras de ADNc que se deseaba comparar (dilución
1). Luego se realizaron 5 diluciones seriadas al medio (dilución 2, 3, 4, 5 y 6)
y, siguiendo el mismo protocolo que el indicado para las muestras en el
punto anterior, se determinó el valor de Ct tanto para el gen de interés (X)
como para el gen de referencia (β-Actina). Estos valores se graficaron en
función del logaritmo de cada dilución, obteniéndose una función lineal con
su correspondiente ecuación (y=m.x+b). De esta forma, se obtuvieron dos
gráficos: uno para el gen de interés (y1=m1.x+b1) y el otro para β-Actina
(y2=m2.x+b2). Finalmente, la eficiencia (E) fue calculada utilizando la
siguiente ecuación:
E= 10(-1/m), donde E debe ser cercana a 2
Una vez conocido el valor de eficiencia para cada primer, la
cuantificación relativa de una muestra incógnita se calcula con la siguiente
ecuación:
R2/1= , donde
Materiales y Métodos
57
R2/1 es la expresión de X normalizada a β-Actina de la muestra 2 relativa a la
muestra 1,
ΔCtX = Ct (X muestra 2) – Ct (X muestra 1)
ΔCt βactina = Ct (actina muestra 2) – Ct (actina muestra 1)
(Una revisión más exhaustiva de este análisis de datos se encuentra en la
guía de aplicaciones de BioRad “Real-Time PCR Applications Guide”).
9. Ensayo de proliferación celular
Las células U937 en etapa exponencial de crecimiento (1x105
células/ml) fueron sembradas en placas de 24 pocillos e incubadas a 37°C,
en atmósfera conteniendo 5% de CO2. Las células fueron tratadas durante
24, 48 o 72h con las distintas drogas solas o combinadas, según se indica en
las figuras correspondientes, utilizando DMSO 2% (v/v) como control
positivo de inhibición del crecimiento. Luego, las células fueron recolectadas
a distintos tiempos según se indica y el número total de células se determinó
empleando una cámara de Neubauer.
10. Determinación de marcadores apoptóticos
10.1. Análisis del ciclo celular
Las células U937 en etapa exponencial de crecimiento (4x105
células/ml) a 37°C, en atmosfera conteniendo 5% de CO2 fueron tratadas
con los distintos compuestos que se mencionan en la figura correspondiente
o con DMSO 2% (v/v) (control positivo de inhibición de crecimiento). Luego,
fueron centrifugadas a 1000rpm por 5 min y lavadas dos veces con PBS.
Nuevamente, se centrifugaron y el precipitado celular fue resuspendido en
100μl de PBS y 900μl de etanol 70% (v/v), agregado gota a gota mientras se
vortexea el tubo y, luego, incubado a -20ºC durante al menos 24 h. A
continuación, las células se centrifugaron a 3000rpm por 5 min, se lavaron
Materiales y Métodos
58
con PBS y al precipitado celular se le agregaron 100 μl de una solución de
ioduro de propidio (IP) y RNAsa (IP 20 μg/ml, RNAsa a 100 μg/ml en PBS
pH=7,4) y se incubó en oscuridad por 30 min.
El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular para los distintos
tratamientos fue determinado utilizando el citómetro de flujo BD FACS
Canto II (Becton, Dickinson and Company, Estados Unidos). Para cada
muestra se adquirieron 10000 eventos y los resultados de al menos tres
ensayos independientes, fueron analizados utilizando el programa FlowJo
V10 Workspace.
10.2. Ensayo de Marcación con Anexina V
Las células U937 en fase exponencial de crecimiento (4x105
células/ml) fueron tratadas durante 72 h con los distintos compuestos según
se menciona en la figura correspondiente, a 37°C en estufa con atmósfera
humidificada conteniendo 5% de CO2. Luego del lavado con PBS frío, 2,5x105
células fueron incubadas con anexina V marcada con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) e IP de acuerdo a lo descripto en el kit “FITC Annexin V
apoptosis detection kit” provisto por BD Biosciences (Estados Unidos) y
analizadas en el citómetro de flujo BD FACS Canto II (Becton, Dickinson and
Company, Estados Unidos).
Las diferentes subpoblaciones celulares fueron determinadas de
acuerdo con el patrón de marcación. Las células marcadas únicamente con
anexina V-FITC fueron consideradas en etapas tempranas del proceso
apoptótico. Las marcadas tanto con anexina V-FITC como con IP fueron
consideradas en la fase tardía del proceso apoptótico, las células marcadas
sólo con IP fueron consideradas como células necróticas y aquellas células
sin marcar fueron consideradas viables o no apoptóticas. Para este análisis
se utilizó el programa FlowJo V10 Workspace.
Materiales y Métodos
59
11. Ensayos de unión de los rH1 y rH2
11.1. Ensayo de unión a [3H]mepiramina
En los estudios de unión para caracterizar los rH1 se utilizó como
ligando radiactivo [3H]mepiramina, ligando específico H1 con una AE=24,8
Ci/mmol. Inicialmente, se realizó un estudio de la cinética de unión de
[3H]mepiramina a 4°C, determinándose que el equilibrio entre unión y
disociación se alcanza a los 30 min y se mantiene constante durante al
menos 4 h. Los experimentos fueron llevados a cabo en células enteras a 4°C
a fin de evitar la internalización del ligando. Los valores de Kd y unión
máxima fueron calculados utilizando una ecuación para un sólo sitio.
11.1.1. Células en suspensión
Los ensayos en la línea celular U937 fueron realizados con 1x106
células/tubo resuspendidas en buffer Tris-HCl 50mM, pH 7,4. En un
volumen final de 200μl se enfrentó el pellet celular con concentraciones
crecientes de radioligando y se incubó a 4°C durante 60 min. Los ensayos se
finalizaron filtrando la solución rápidamente a través de membranas de
fibra de vidrio GF-B y tres lavados posteriores con 3 ml de buffer frío cada
uno. La unión inespecífica se determinó utilizando 1μM de ligando no
marcado. Las membranas se secaron a temperatura ambiente durante 20 h y
posteriormente fueron transferidas a viales con solución centelladora. La
radioactividad se midió en un contador de centelleo líquido.
11.1.2. Células adheridas
Las células HEK293, previamente transfectadas, fueron transferidas a
placas de 48 pocillos el día anterior al ensayo (utilizándose 24 pocillos por
curva). Las incubaciones con el radioligando fueron llevadas a cabo por
duplicado en 50 μl de buffer Tris-HCl 50mM, pH 7,4 durante 60 min a 4°C y
finalizadas por 3 lavados con al menos 3 ml de buffer frío. La radioactividad
Materiales y Métodos
60
unida se extrajo de la placa con 1 ml de etanol, que fue transferido a viales
con solución centelladora. La radioactividad se midió en un contador de
centelleo líquido.
11.2. Ensayo de unión a [3H]tiotidina
En los estudios de unión para analizar el número de sitios rH2 se
utilizó como ligando radiactivo [3H]tiotidina, ligando específico H2 con una
AE=75 Ci/mmol. Inicialmente, se realizó un estudio de la cinética de unión
de [3H]tiotidina a 4°C, determinándose que el equilibrio entre unión y
disociación se alcanza a los 30 min y se mantiene constante durante al
menos 4 h. Los experimentos fueron llevados a cabo en células enteras a 4°C
a fin de evitar la internalización del ligando. Los valores de Kd y unión
máxima fueron calculados utilizando una ecuación para un sólo sitio.
Células en suspensión
Los ensayos en la línea celular U937 fueron realizados con 1x106
células/tubo resuspendidas en buffer Tris-HCl 50mM, pH 7,4. En un
volumen final de 200μl se enfrentó el pellet celular con concentraciones
crecientes de radioligando y se incubó a 4°C durante 60 min. Los ensayos se
finalizaron filtrando la solución rápidamente a través de membranas de
fibra de vidrio GF-B y 3 lavados posteriores con 3 ml de buffer frío cada uno.
La unión inespecífica se determinó utilizando 10μM de ligando no marcado.
Las membranas se secaron a temperatura ambiente durante 20 h y
posteriormente fueron transferidas a viales con solución centelladora. La
radioactividad se midió en un contador de centelleo líquido.
Materiales y Métodos
61
12. Análisis Estadístico
Todas las curvas fueron analizadas y sus parámetros ajustados
utilizando el programa GraphPad Prism 6.00 para Windows (GraphPad
Software, Inc., San Diego, CA, Estados Unidos).
Los resultados mostrados provienen de al menos tres ensayos
independientes realizados por triplicado. Los supuestos de normalidad y
homogeneidad de varianzas se verificaron estadísticamente con el test de
Shapiro-Wilks y el test de Levene respectivamente. Las diferencias
estadísticas fueron determinadas con la prueba de análisis de la varianza
ANOVA de un factor, seguido de la prueba a posteriori de Dunnett
(comparación de cada tratamiento con el control) o ANOVA de dos factores,
seguido de la prueba a posteriori Bonferroni (comparación de datos
múltiples). Un valor de significancia p<0,05 fue adoptado para definir
diferencias estadísticamente significativas. Los asteriscos indican que lo
señalado difiere significativamente, ya sea de su control o del tratamiento
correspondiente con p<0,05 (*), p<0,01 (**) y p<0,005 (***).
62
RESULTADOS
Resultados
63
1. La desensibilización cruzada entre los rH1 y rH2 activados es mediada
por GRK2
Trabajos previos de nuestro grupo describen que tanto en la línea
celular promonocítica U937 que expresa endógenamente los rH1 y rH2,
como en células CHO transfectadas con ambos receptores existe una
cointernalización y desensibilización cruzada (o heteróloga) entre los rH1 y
rH2 luego del estímulo prolongado con sus agonistas. Dichos procesos son
independientes, dado que, al inhibir el proceso de internalización mediante
diferentes mecanismos, la desensibilización cruzada entre estos receptores
sigue resultando evidente (Alonso et al., 2013). Asimismo, dicha
desensibilización heteróloga es independiente de las proteínas quinasas
activadas por segundos mensajeros PKA y PKC.
En relación a la regulación de la respuesta del rH2 mediada por su
agonista (amtamina), describimos la participación del dominio RGS de GRK2
en la desensibilización homóloga del receptor estimulado y del dominio
quinasa de GRK2 en el proceso de internalización, importante para el tráfico
intracelular del receptor (Fernandez et al., 2011). A su vez, se encuentra
descripto que el rH1 necesita tanto de la actividad quinasa como de la
función RGS de GRK2 para su desensibilización (Iwata et al., 2005).
A partir de estos antecedentes, nos planteamos evaluar la
participación de la proteína GRK2 en la desensibilización heteróloga de los
rH1 y rH2 inducida por agonistas, a pesar de que su actividad se encuentra
generalmente asociada a la desensibilización homóloga.
En primera instancia, validamos en células HEK293 transfectadas
con los rH1 y rH2 (HEK293-rH1-rH2) la existencia de una desensibilización
cruzada inducida por el pretratamiento con el agonista H1 (2,3-
trifluormetilhistamina) sobre la respuesta del rH2 al estímulo con amtamina
10µM. Esta concentración corresponde a la máxima respuesta observada
frente al tratamiento. La cinética de desensibilización (Fig. 6) muestra que
Resultados
64
dicho pretratamiento reduce la capacidad de respuesta del rH2,
observándose que, luego de 30 min de preestímulo con el agonista H1, la
respuesta de AMPc inducida por amtamina disminuye un 50% respecto a la
respuesta inicial.
Con el fin de confirmar que la desensibilización cruzada observada
es producto de la interacción específica del agonista H1 con su receptor,
realizamos este ensayo, pero utilizando células HEK293 transfectadas
únicamente con el rH2 (HEK293-rH2). En la misma figura puede apreciarse
que en ausencia del rH1 el preestímulo con su agonista es incapaz de
modificar la respuesta del rH2 en los tiempos ensayados, demostrándose
que la desensibilización del rH2 observada es producida por la activación
específica del rH1.
Figura 6. Cinética de desensibilización inducida por el agonista H1 sobre la respuesta del rH2. Células HEK293 transfectadas con rH1 y rH2 (●) o sólo con rH2 (○) fueron incubadas con el agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM por diferentes tiempos, lavadas con PBS y estimuladas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta de amtamina sin pretratamiento. E/B corresponde a la relación entre el estímulo de amtamina y su basal. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,001 respecto a la respuesta de amtamina sin pretratamiento.
Resultados
65
Tomando como referencia estos resultados, evaluamos el efecto de
la sobreexpresión de GRK2 en la desensibilización cruzada del rH2 por el
estímulo del rH1. Para ello, pretratamos por diferentes tiempos con el
agonista H1 a las células HEK293 transfectadas con ambos receptores y una
construcción que codifica para GRK2 y evaluamos la respuesta del rH2 a
amtamina. En presencia de GRK2 sobreexpresada, la desensibilización
cruzada del rH2 inducida por el agonista H1 resultó más marcada. A los 30
min de pretratamiento, la respuesta del rH2 disminuyó del 50% (células que
expresan MOCK) al 30% (células que sobreexpresan GRK2) con respecto a la
respuesta sin pretratamiento. Asimismo, el t1/2 de desensibilización en
presencia de GRK2 sobreexpresada disminuyó de 12,5 min a 6,2 min (Fig.
7A).
Por otro lado, en el clon U937-A2 que expresa establemente una
construcción anti sentido de GRK2 disminuyendo sus niveles, se observa una
inhibición de la desensibilización cruzada respecto a la observada en células
U937 (línea control), resultando en una mayor producción de AMPc por
amtamina, luego de 30 min de pretratamiento con el agonista H1 (Fig. 7B).
Tanto la sobreexpresión de GRK2 en las células HEK293-rH1-rH2, como la
disminución de sus niveles en el clon U937-A2 fueron verificados por
Western Blot (Fig. 7C).
Resultados
66
Figura 7. Efecto de GRK2 en la desensibilización cruzada del rH2 por el estímulo del rH1. A. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 y MOCK (vector vacío) (●) o rH1, rH2 y GRK2 (○) fueron incubadas con el agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM por diferentes tiempos, lavadas con PBS y estimuladas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Los datos fueron calculados como la media ± S.D. de un ensayo representativo. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. Panel derecho: Porcentaje de respuesta del rH2 luego de 30 min de pretratamiento con el agonista H1. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,001 respecto a las células MOCK. B. Células U937 y U937-A2 fueron incubadas durante 30 min con el agonista H1, lavadas con PBS y estimuladas con amtamina 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,001 respecto a las células U937. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta de amtamina sin pretratamiento. E/B corresponde a la relación entre el estímulo de amtamina y su basal. C. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 y MOCK o GRK2, y células
Resultados
67
U937 y U937-A2, fueron lisadas e iguales cantidades de proteína fueron analizadas por Western Blot utilizando el anticuerpo específico anti-GRK2.
De esta manera, podemos concluir que la desensibilización cruzada
inducida por el estímulo del rH1 sobre la respuesta del rH2 a amtamina se
encuentra mediada por la proteína GRK2.
Seguido a esto, evaluamos la participación de GRK2 en la regulación
cruzada de la respuesta del rH1 inducida por la activación del rH2.
Se encuentra ampliamente reportado que la histamina, actuando a
través del rH1, cumple un papel fundamental en la inducción de síntomas
alérgicos y reacciones inflamatorias. Dicha activación regula de manera
positiva la producción de citoquinas, quemoquinas y moléculas de adhesión
en células inflamatorias, epiteliales y endoteliales (Asako et al., 1994;
Kimura et al., 2004; Kordulewska et al., 2017; Yamauchi et al., 2007).
Asimismo, ha sido reportada la inducción de la producción de la citoquina
proinflamatoria IL-6 por la interacción de la histamina con el rH1, en
diversos sistemas (Cadman et al., 1994; Delneste et al., 1994; IH Park, 2014;
Kohda et al., 2002). En base a esta información, evaluamos la respuesta del
rH1 a nivel de la transcripción de IL-6 utilizando un ensayo de gen
reportero.
Para analizar el efecto de GRK2 sobre dicha regulación cruzada,
transfectamos células HEK293 con ambos receptores, el plásmido que
codifica para MOCK o GRK2 y el sistema reportero IL-6-Luc. En este ensayo,
la activación del promotor de IL-6-Luc se evidencia a través de la actividad
de luciferasa. La figura 8 pone de manifiesto que el pretratamiento con
amtamina, sin efecto per se sobre el sistema reportero, disminuye la
respuesta del rH1 inducida por el estímulo con su agonista 10µM
(concentración correspondiente a la máxima respuesta observada).
Asimismo, al sobreexpresar GRK2, esta disminución resulta más marcada
que en las células transfectadas con MOCK.
Resultados
68
Figura 8. Efecto de GRK2 en la regulación cruzada del rH1 inducida por amtamina. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2, IL-6-Luc y MOCK (barras negras) o GRK2 (barras grises) fueron tratadas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min y estimuladas con el agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM por 6 h. Se determinó la actividad de luciferasa según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta del agonista H1 sin pretratamiento. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,001; **p˂0,01 respecto a la respuesta del agonista H1. #p˂0,05.
En conjunto, los resultados presentados hasta el momento
confirman la existencia de una regulación cruzada entre los rH1 y rH2
inducida por agonistas en células HEK293 transfectadas con ambos
receptores. Dicha regulación heteróloga es observada tanto a nivel de
segundos mensajeros (AMPc) como a nivel de la inducción del gen
proinflamatorio IL-6 e involucra la participación de la proteína GRK2.
El dominio quinasa de GRK2 es responsable de la desensibilización
cruzada entre los rH1 y rH2 activados.
Como se mencionó en la introducción, GRK2 es una proteína con 3
dominios funcionales bien definidos: el amino terminal de homología a RGS
o dominio RH, el central con actividad quinasa, y el carboxi terminal de
homología a pleckstrina o dominio PH.
Resultados
69
Con el fin de determinar cuál de estos dominios se encuentra
involucrado en la desensibilización cruzada de los rH1 y rH2 activados,
cotransfectamos células HEK293 con ambos receptores y con alguna de las
dos construcciones de GRK2 mutada: GRK2-D110A con su dominio RGS
mutado, incapaz de desensibilizar homólogamente a los receptores, pero
con capacidad de fosforilar a los mismos, y GRK2-K220R con su dominio
quinasa mutado, sin actividad quinasa, pero con actividad RGS conservada
(Iwata et al., 2005; Kong et al., 1994) (Fig. 9A). Dichas mutantes funcionan
como dominantes negativas que compiten con la proteína GRK2 endógena
cuando se activan los receptores. Su correcta expresión fue evaluada por
ensayos de Western Blot (Fig. 9A Inset).
En una primera instancia, evaluamos el efecto de la sobreexpresión
de GRK2-D110A y GRK2-K220R sobre la desensibilización de la respuesta
del rH2 a amtamina generada por la activación del rH1 (Fig. 9B). En
presencia de la mutante GRK2-D110A, la pérdida de respuesta del rH2 por el
preestímulo de 30 min con el agonista H1 es aún mayor que en las células
control (MOCK). Por su parte, al sobreexpresar la mutante GRK2-K220R, no
se observa perdida de respuesta a amtamina por el pretratamiento,
sugiriendo que el dominio quinasa de GRK2 es necesario para que se
produzca la desensibilización heteróloga del rH2 por el estímulo del rH1. En
relación a la desensibilización cruzada del rH2 potenciada en presencia de la
mutante GRK2-D110A, podría ser explicada dada la existencia de una mayor
fosforilación del rH2 promovida por el dominio quinasa sobreexpresado,
comparable a lo observado por sobreexpresión de GRK2 (Fig. 7A).
Seguido a esto, evaluamos la desensibilización cruzada del rH1
inducida por la activación del rH2 en presencia de la sobreexpresión de
dichas mutantes, a través del ensayo de gen reportero. En presencia de la
mutante GRK2-D110A, el pretratamiento con amtamina redujo la respuesta
al agonista H1 de igual forma que ocurre en las células control (MOCK) (Fig.
9C). Sin embargo, y al igual que se muestra en la figura 9B, no se observó
Resultados
70
desensibilización cruzada cuando se realizó este ensayo en presencia de la
mutante GRK2-K220R.
Figura 9. Efecto de los dominios de GRK2 en la desensibilización cruzada de los rH1 y rH2 activados. A. Representación esquemática de la estructura de GRK2 que muestra los dominios de homología a RGS, quinasa y pleckstrina. Se destacan las mutaciones puntuales D110A y K220R dentro de los dominios RGS y quinasa, respectivamente. Inset. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 y MOCK (vector vacío), GRK2-D110A o GRK2-K220R fueron lisadas e iguales cantidades de proteína fueron analizadas por Western Blot utilizando el anticuerpo específico anti-GRK2 según se describe en la sección Materiales y Métodos. B. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 y MOCK, GRK2-D110A o GRK2-K220R fueron incubadas durante 30 min con el agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM, lavadas con PBS y estimuladas con amtamina 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta de amtamina sin pretratamiento. E/B corresponde a la relación entre el estímulo de amtamina y su basal. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,001 respecto a las células MOCK. C. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 y MOCK, GRK2-D110A o GRK2-K220R fueron incubadas con amtamina 10μM por 10 min y luego tratadas con el agonista H1 10μM por 6 h. Se determinó la actividad de luciferasa según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde
Resultados
71
a la respuesta del agonista H1 sin pretratamiento. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,001; ns. no significativo respecto a la respuesta del agonista H1 luego del pretratamiento con amtamina, en células MOCK.
Estos resultados, sugieren que el dominio central de GRK2, encargado
de la fosforilación de GPCRs es el principal mediador de la desensibilización
heteróloga entre los rH1 y rH2 inducida por los agonistas H1 y H2.
Con el objetivo de comprobar este hecho, transfectamos células
HEK293 con ambos receptores y diferentes dominios de la proteína GRK2,
clonados previamente en el laboratorio. Se utilizaron los dominios RH sólo,
como también RH o quinasa (KINK220R) fusionados al dominio con
homología a pleckstrina (RH-PH o KINK220R-PH) obtenidos a partir de la
construcción mutada GRK2-K220R, cuya representación esquemática se
muestra en la figura 10A (Fernandez et al., 2011). De esta manera,
evaluamos el efecto de la sobreexpresión de los dominios RH, RH-PH y
KINK220R-PH sobre la desensibilización cruzada.
La sobreexpresión de las 3 construcciones condujo a una pérdida de
la desensibilización cruzada inducida tanto por el agonista H1 sobre la
respuesta del rH2 (Fig. 10B) como por amtamina sobre la respuesta del rH1
(Fig. 10C).
Resultados
72
Figura 10. Efecto de los dominios de GRK2 en la desensibilización cruzada de los rH1 y rH2. A. Representación esquemática de los dominios funcionales de GRK2. Se muestran los dominios RH, quinasa central donde se identifica la mutación puntual en el residuo 220 y con homología a pleckstrina. Se muestran las construcciones de expresión RH, KINK220R-PH y RH-PH. B. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 y MOCK (vector vacío), RH, RH-PH o KINK220R-PH, fueron incubadas por 30 min con el agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM, lavadas con PBS y estimuladas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta de amtamina sin pretratamiento. E/B corresponde a la relación entre el estímulo de amtamina y su basal. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,001 respecto a las células MOCK. C. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 y MOCK, RH, RH-PH o KINK220R-PH fueron incubadas con amtamina 10μM por 10 min y luego tratadas con el agonista H1 10μM por 6 h. Se determinó la actividad de luciferasa según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta del agonista H1 sin pretratamiento. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,001 respecto a la respuesta del agonista H1 luego del pretratamiento con amtamina, en células MOCK.
Resultados
73
El hecho de que la construcción KINK220R-PH, al igual que GRK2-
K220R, inhiba la desensibilización cruzada confirma que la actividad
quinasa es necesaria para la desensibilización heteróloga inducida por
agonistas. En cuanto a la inhibición de la desensibilización cruzada en
presencia de RH o RH-PH, podría explicarse por competencia de los
dominios proteicos codificados por las construcciones con la proteína GRK2
endógena, impidiendo de esta manera, que su dominio quinasa fosforile al
receptor.
En su conjunto, los resultados obtenidos en esta sección indican que
GRK2, comprometida en la desensibilización homóloga de varios GPCRs, es
responsable de la desensibilización heteróloga entre los rH1 y rH2 inducida
por sus agonistas. Asimismo, sugieren que el dominio quinasa de GRK2 es el
principal mediador de este proceso que involucra modificaciones a
diferentes niveles de la señalización de estos receptores.
2. La desensibilización cruzada inducida por los rH1 y rH2 activados
modula la respuesta de los antihistamínicos H1 y H2
Previamente, observamos que la activación de un subtipo de receptor
a histamina modula la respuesta generada por el agonista del otro receptor,
resultando en la pérdida de respuesta o desensibilización del mismo.
Teniendo presente este hecho, hipotetizamos que la regulación cruzada
existente entre dichos subtipos de receptores a histamina no sólo afecta la
respuesta desencadenada por la histamina (ligando endógeno) o ligandos
agonistas, sino que también regula de manera negativa la respuesta mediada
por los antihistamínicos de ambos receptores.
Los antihistamínicos H1 representan actualmente el grupo más
extenso de medicamentos utilizados para el tratamiento de diversos
desordenes alérgicos, como rinoconjuntivitis, urticaria, y dermatitis atópica
(Church, 2016). Durante muchos años, se han estudiado ampliamente
características de estos fármacos, como la eficacia y seguridad, logrando
Resultados
74
posicionarlos dentro de las drogas de venta libre y bajo receta más
consumidas a nivel mundial (Simon and Simons, 2008).
Por su parte, los antihistamínicos H2 también conocidos como
bloqueantes H2, se usan comúnmente para el tratamiento de patologías
gástricas, úlceras gástricas, dispepsia, reflujo y síndrome de Zollinger–
Ellison, entre otras (Hershcovici and Fass, 2011; Sigterman et al., 2013).
Debido a que los antihistamínicos H1 y H2 son medicamentos de bajo
costo, con buenos perfiles de seguridad establecidos y sin protección de
patente (lo que permite un rápido avance a los ensayos clínicos en
humanos), existe un gran interés en facilitar su reposicionamiento para
tratar otras patologías. Por este motivo, resulta importante estudiar en
profundidad las vías de señalización desencadenadas por estos ligandos y
cómo se encuentran reguladas.
2.1 La activación del rH2 modula la respuesta antiinflamatoria de los
antihistamínicos H1
En un principio, evaluamos si la acción farmacológica inducida por los
antihistamínicos H1 se encuentra afectada por la activación del rH2.
Utilizando células HEK293 transfectadas con ambos receptores y el sistema
reportero IL-6-Luc, observamos que tanto ceterizina, clorfeniramina,
triprolidina y difenhidramina reducen de manera significativa la actividad
basal del promotor de IL-6-Luc, consistente con su clasificación como
agonistas inversos. Sin embargo, para mepiramina no se observan
diferencias significativas al compararlo con los niveles basales, en las
condiciones ensayadas (Fig. 11A). Interesantemente, el pretratamiento con
amtamina impide la acción de los antihistamínicos H1 ensayados, lo que
claramente indica que la activación del rH2 no sólo afecta la respuesta de
ligandos agonistas del rH1 (Fig. 8), sino que, además modula la respuesta
antiinflamatoria mediada por antihistamínicos H1 (Fig. 11A).
Resultados
75
Con el propósito de confirmar que amtamina afecta esta respuesta a
través de la unión específica a su receptor, realizamos este ensayo en células
HEK293 transfectadas únicamente con el rH1 (HEK293-rH1). Como puede
evidenciarse, la respuesta inducida por los antihistamínicos H1 no es
modificada por el preestímulo con amtamina, indicando que la interferencia
sobre la respuesta antiinflamatoria del rH1 se produce únicamente a través
de la activación del rH2 (Fig. 11B).
Figura 11. Efecto de la activación del rH2 sobre la respuesta de los
antihistamínicos H1. Células HEK293 transfectadas rH1, rH2 e IL-6-Luc A. o con
rH1 e IL-6-Luc B. fueron tratadas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min
(barras grises) o no (barras blancas) y luego incubadas con mepiramina (MEP)
10μM, ceterizina (CET) 10μM, clorfeniramina (CLOR) 10μM, triprolidina (TRIP)
10μM o difenhidramina (DIF) 10μM por 6 h. Se determinó la actividad de luciferasa según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la
actividad basal sin pretratamiento con amtamina (control). Los datos fueron
calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ns. no significativo; *p˂0,05; **p˂0,01;
***p˂0,001 respecto al control sin pretratamiento. ##p<0,01; ###p<0,001.
Luego, seleccionamos células U937, precursoras de monocitos y
macrófagos para evaluar dicho efecto, dado que resulta un modelo de
relevancia fisiopatológica ampliamente utilizado (Ghosh et al., 2010;
Grkovich et al., 2006; Nishida et al., 1988; Schreiber et al., 2006). Esta línea
Resultados
76
celular puede ser diferenciada a macrófagos con PMA, para inducir la
expresión de diversos genes proinflamatorios con LPS, una endotoxina
presente en la membrana externa de las bacterias Gram negativas.
Para evaluar la respuesta inflamatoria, medimos los niveles de ARNm
de dos genes endógenos: la enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2) e inteleuquina-
8 (IL-8), utilizando la técnica de PCR en tiempo real (qPCR). A pesar de tener
diferentes eficacias, los antihistamínicos H1 mepiramina, ceterizina,
clorfeniramina, triprolidina y difenhidramina, disminuyen la expresión de
COX-2 e IL-8 y al igual que lo observado en el sistema de expresión
heteróloga (HEK293-rH1-rH2), el pretratamiento con amtamina revierte
este efecto (Fig.12A y 12B).
Figura 12. Efecto de la activación del rH2 sobre la respuesta antiinflamatoria del rH1. Células U937 incubadas con PMA 100nM por 24 h fueron tratadas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min (barras grises) o no (barras blancas) y luego tratadas con mepiramina (MEP) 10μM, ceterizina (CET) 10μM, clorfeniramina (CLOR) 10μM, triprolidina (TRIP) 10μM o difenhidramina (DIF) 10μM por 18 h y estimuladas con 1 μg/ml LPS por 4 h. Los niveles de ARNm de COX-2 A. e IL-8 B. fueron cuantificados según se describe en la sección Materiales y Métodos. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ns. no significativo; *p˂0,05; **p˂0,01; ***p˂0,001 respecto al control sin pretratamiento. #p<0,05; ##p<0,01; ###p<0,001.
Resultados
77
Estos resultados indican que, tanto en la línea celular HEK293
transfectadas con los rH1 y rH2, como en las células monocíticas, la
respuesta antiinflamatoria mediada por el rH1 es regulada por la activación
del rH2.
2.2. La activación del rH1 modula la respuesta inducida por los
antihistamínicos H2
Dado que la regulación cruzada inducida por amtamina no sólo afecta
la actividad del rH1 frente a su agonista, sino también frente a los
antihistamínicos H1, nos propusimos evaluar en esta ocasión si la activación
del rH1 es capaz de modificar la respuesta inducida por los antihistamínicos
H2.
En células HEK293 transfectadas con ambos receptores, el
tratamiento con los antihistamínicos H2 cimetidina, ranitidina y famotidina
disminuye los niveles de AMPc, como era de esperarse dada su clasificación
como agonistas inversos (Fig. 13A). Sin embargo, este efecto resulta ser
menos marcado luego de pretratar a las células durante 30 min con el
agonista H1, indicando que la activación del rH1 estaría interfiriendo con la
respuesta del rH2 mediada por sus antihistamínicos.
Con el propósito de determinar si el agonista H1 afecta esta respuesta
por la unión específica a su receptor, realizamos este ensayo en células
HEK293 que expresan únicamente el rH2 (HEK293-rH2). Así, observamos
que la disminución de los niveles de AMPc inducidos por los
antihistamínicos H2 no se modifica luego el pretratamiento con el agonista
H1 (Fig. 13B), evidenciando que el efecto se produce por la especificidad de
unión entre el agonista H1 y su receptor.
Resultados
78
Figura 13. Efecto de la activación del rH1 sobre la respuesta de los antihistamínicos H2. Células HEK293 transfectadas con rH1 y rH2 A. o sólo con rH2 B. fueron incubadas durante 30 min con el agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM (barras grises) o no (barras blancas), lavadas con PBS y tratadas con cimetidina (CIM) 10μM, ranitidina (RAN) 10μM o famotidina (FAM) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,001 respecto a los niveles basales sin pretratamiento con el agonista H1. ns. no significativo; #p˂0,05; ##p˂0,01; ###p˂0,001 respecto a los niveles basales luego del pretratamiento con el agonista H1.
La activación del rH1 también afectó la respuesta de los
antihistamínicos H2 en las líneas celulares U937 y AGS que expresan
endógenamente a los rH1 y rH2. La disminución en la producción de AMPc
inducida por los antihistamínicos H2 se vio significativamente modificada
cuando se activa previamente el rH1 (Fig. 14A y 14B). La línea celular AGS
(Adenocarcinoma gástrico) constituye un modelo de relevancia clínica, dado
que las células de la mucosa gástrica son blanco tanto de la histamina como
de los bloqueantes H2, controlando la producción de ácido gástrico en el
sistema digestivo.
Estos resultados señalan que la vía de señalización promovida por los
antihistamínicos H2 es regulada por la activación del rH1.
Resultados
79
Figura 14. Efecto de la activación del rH1 sobre la respuesta de los antihistamínicos H2. Células U937 A. o AGS B. fueron incubadas durante 30 min con el agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM (barras grises) o no (barras blancas), lavadas con PBS y tratadas con cimetidina (CIM) 10μM, ranitidina (RAN) 10μM o famotidina (FAM) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), *p˂0,05; **p˂0,01; ***p˂0,001 respecto a los niveles basales sin pretratamiento con el agonista H1. ns. no significativo; #p˂0,05 respecto a los niveles basales luego del pretratamiento con el agonista H1.
En conjunto, los resultados expuestos en la presente sección del
trabajo demuestran que la respuesta o eficacia de los antihistamínicos H1 y
H2 se encuentra estrechamente regulada por la desensibilización heteróloga
existente entre los rH1 y rH2 activados.
3. Los antihistamínicos H1 y H2 inducen la desensibilización cruzada de
los rH1 y rH2 activados
Publicaciones previas realizadas por nuestro grupo demostraron que
los antihistamínicos H2 poseen eficacia pluridimensional dado que, además
de actuar como agonistas inversos disminuyendo los niveles de AMPc a
través de la unión específica al rH2, son capaces de inducir la
Resultados
80
desensibilización e internalización de dicho receptor (Alonso et al., 2014,
2015). Por otra parte, en la sección anterior, demostramos que la respuesta
de los antihistamínicos H1 y H2 puede ser modificada de manera cruzada
por la activación previa del otro receptor.
En base a estos hallazgos, nos preguntamos si los antihistamínicos H1
y H2 son capaces de modificar en forma cruzada la respuesta de los rH1 y
rH2 activados, induciendo la desensibilización heteróloga. Para responder a
nuestro interrogante, evaluamos el efecto de los antihistamínicos sobre la
respuesta de los agonistas de los rH1 y rH2 a diferentes niveles de la
señalización.
3.1. Los antihistamínicos H1 afectan la respuesta mediada por el rH2
activado
En una primera instancia, evaluamos el efecto del pretratamiento con
el antihistamínico H1, ceterizina, sobre la respuesta del rH2 a amtamina. En
células U937 pretratadas con este ligando, la producción de AMPc inducido
por amtamina, decrece de manera tiempo y dosis dependiente (Fig. 15A y
15B). La desensibilización máxima se alcanzó con una concentración de 10
µM luego de 30 min de pretratamiento con ceterizina.
Figura 15. Efecto de ceterizina sobre la respuesta del rH2. Células U937 fueron incubadas con ceterizina (CET) 10μM por diferentes tiempos A. o por 30 min B. lavadas con PBS y estimuladas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe
Resultados
81
en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta de amtamina sin pretratamiento. E/B corresponde a la relación entre el estímulo de amtamina y su basal. Los datos fueron calculados como la media ± S.D. de un ensayo representativo. Resultados similares fueron obtenidos a partir de tres experimentos independientes.
Asimismo, el pretratamiento con mepiramina, clorfeniramina,
triprolidina y difenhidramina (10 µM, 30 min), indujo una desensibilización
significativa del rH2 a la respuesta de amtamina (Fig. 16A).
Por otra parte, y con el propósito de evaluar la especificidad de la
desensibilización cruzada inducida por los antihistamínicos H1,
determinamos el efecto de dicho pretratamiento sobre la señalización
mediada por el receptor PGE2, otro GPCR que se encuentra acoplado a
proteína Gs. La figura 16B pone en evidencia que la respuesta de dicho
receptor a su agonista (PGE2) permanece inalterada luego del
pretratamiento con los antihistamínicos H1.
Estos resultados sugieren que el efecto inducido por los diferentes
antihistamínicos H1 no afecta a los GPCRs de forma generalizada, sino que
resulta ser específico entre los rH1 y rH2.
Resultados
82
Figura 16. Efecto de los antihistamínicos H1 sobre la respuesta del rH2. Células U937 fueron incubadas con mepiramina (MEP) 10μM, ceterizina (CET) 10μM, clorfeniramina (CLOR) 10μM, triprolidina (TRIP) 10μM o difenhidramina (DIF) 10μM por 30 min, lavadas con PBS y estimuladas con el agonista H2 (amtamina) 10μM A. o PGE2 1μM B. por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos.100% corresponde a la respuesta de amtamina o PGE2 sin pretratamiento (control). E/B corresponde a la relación entre el estímulo y su basal. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3). ns. no significativo; **p˂0,01; ***p˂0,001 respecto al control.
Para confirmar que los antihistamínicos H1 evaluados desensibilizan
la respuesta del rH2 a través de la unión específica con el rH1, realizamos el
mismo ensayo utilizando células HEK293 transfectadas únicamente con el
rH2 (HEK293-rH2). Como puede observarse en la figura 17A, la
desensibilización cruzada en ausencia del rH1 no resulta evidente. Como era
de esperarse, al expresar ambos receptores en este sistema (HEK293-rH1-
rH2), el pretratamiento con todos los antihistamínicos H1 ensayados
desensibiliza significativamente la respuesta del rH2 a su agonista (Fig.
17B).
Figura 17. Efecto de los antihistamínicos H1 sobre la respuesta del rH2. Células HEK293 transfectadas con rH2 A. o con rH1 y rH2 B. fueron incubadas con mepiramina (MEP) 10μM, ceterizina (CET) 10μM, clorfeniramina (CLOR) 10μM, triprolidina (TRIP) 10μM o difenhidramina (DIF) 10μM por 30 min, lavadas con
Resultados
83
PBS y estimuladas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta de amtamina sin pretratamiento (control). E/B corresponde a la relación entre el estímulo con amtamina y su basal. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3). ns. no significativo; ***p˂0,001 respecto al control.
Nuestro próximo paso fue analizar el efecto de la estequiometria de
los receptores expresados en la membrana de las células U937 sobre la
desensibilización promovida por los antihistamínicos H1 sobre la respuesta
del rH2. Para ello, evaluamos en clones F5 derivados de la línea celular U937
(U937-F5) que poseen mayores niveles del rH1, la capacidad de ceterizina,
clorfeniramina y triprolidina de promover la desensibilización cruzada
sobre la respuesta del rH2 a su agonista. En estas células, observamos que el
pretratamiento de 30 min con los antihistamínicos H1 potencia la
desensibilización de la respuesta del rH2. Este efecto se evidencia ya que los
niveles de AMPc producidos por amtamina en los clones U937-F5 son
significativamente menores que en las células U937 (Fig. 18).
Figura 18. Efecto de la sobreexpresión del rH1 sobre la desensibilización cruzada del rH2. Células U937 (barras blancas) y clones U937-F5 (barras grises) fueron incubadas con ceterizina (CET) 10μM, clorfeniramina (CLOR) 10μM, triprolidina (TRIP) 10μM por 30 min, lavadas con PBS y estimuladas con el
Resultados
84
agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta de amtamina sin pretratamiento (control). E/B corresponde a la relación entre el estímulo con amtamina y su basal. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), **p˂0,01; ***p˂0,001.
Los resultados obtenidos en esta sección claramente demuestran que
los antihistamínicos H1, actuando de manera selectiva a través de su
receptor, son capaces de inducir la desensibilización del rH2, observada
tanto en un sistema de expresión heteróloga (HEK293-rH1-rH2) como en la
línea celular monocítica U937. Más aún, en los clones U937-F5 la
sobreexpresión del rH1 permite que los antihistamínicos H1 potencien la
desensibilización cruzada sobre la respuesta del rH2 activado.
3.2 Los antihistamínicos H2 afectan la respuesta proinflamatoria del
rH1 activado
En la sección anterior determinamos la capacidad de los
antihistamínicos H1 de inducir la desensibilización cruzada del rH2
activado. En la presente sección, evaluaremos la capacidad de los
antihistamínicos H2 cimetidina, ranitidina y famotidina de interferir con la
respuesta proinflamatoria del rH1, evaluada por la actividad del promotor
de IL-6-Luc. En células HEK293 transfectadas con ambos receptores y el
sistema reportero, se observa que el pretratamiento con los tres
antihistamínicos H2, a pesar de no tener efecto por si solos, evitan la
activación del promotor de IL-6-Luc inducido por el agonista H1 (Fig. 19A).
Sin embargo, en ausencia del rH2 (células HEK293-rH1), esta interferencia
no ocurre, demostrándose que el efecto de estos ligandos sobre la respuesta
del rH1 se produce a través de la unión específica a su receptor (Fig. 19B).
Resultados
85
Figura 19. Efecto de los antihistamínicos H2 sobre la respuesta proinflamatoria del rH1. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 e IL-6-Luc A. o sólo con rH1 e IL-6-Luc B. fueron tratadas con cimetidina (CIM) 10μM, ranitidina (RAN) 10μM o famotidina (FAM) 10μM por 10 min y luego tratadas con el agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM (barras grises) o no (barras blancas) por 6 h. Se determinó la actividad de luciferasa según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la actividad basal sin pretratamiento (control). Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ###p<0,001, ns. no significativo respecto al estímulo con el agonista H1 sin pretratamiento. ***p˂0,001.
En línea con los resultados obtenidos utilizando el sistema reportero,
observamos que el agonista H1 es capaz de activar los genes de COX-2 e IL-8
en la línea celular U937 diferenciada con PMA, mientras que en presencia de
los antihistamínicos H2 utilizados, dicha respuesta es significativamente
menor para el gen de COX-2 y no observable para IL-8 (Fig. 20A y 20B).
Resultados
86
Figura 20. Efecto de los antihistamínicos H2 sobre la respuesta
proinflamatoria del rH1. Células U937 incubadas con PMA 100nM por 24 h
fueron tratadas con cimetidina (CIM) 10μM, ranitidina (RAN) 10μM o famotidina
(FAM) 10μM por 10 min y luego tratadas con el agonista H1 (2,3-
trifluormetilfenilhistamina) 10μM por 18 h. Los niveles de RNA mensajero de COX-
2 A. e IL-8 B. fueron cuantificados según se describe en la sección Materiales y
Métodos. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ###p<0,001
respecto a la respuesta del agonista H1 sin pretratamiento. ***p˂0,001.
Algunos estudios clínicos indican que el bloqueo de los rH2 resulta
beneficioso para la insuficiencia cardíaca crónica (ICC) (Kim et al., 2006;
Leary et al., 2016). Asimismo, Takahama y colaboradores demostraron que
famotidina, antihistamínico H2, mejora la performance cardíaca luego de
una ICC inducida por arritmia en perros, asociado a un decrecimiento en los
niveles de AMPc en el miocardio (Takahama et al., 2010). Este efecto resultó
aditivo al efecto de los β-bloqueantes, sugiriendo que algún mecanismo
independiente a la inhibición de la AC pudiera estar involucrado.
Con el fin de aportar nuevos datos en el tema, evaluamos en la línea
celular HL1, derivada de músculo cardíaco de ratón (cardiomiocitos), la
regulación que ejercen los antihistamínicos H2 sobre la respuesta
inflamatoria a través del rH1. Así, observamos que el agonista H1 induce un
Resultados
87
incremento en la expresión del gen de IL-6, mientras que la presencia de los
antihistamínicos H2 modula negativamente dicha activación, resultando ser
más marcado con famotidina (Fig. 21). Estos resultados indican que, en el
tejido cardiaco, los antihistamínicos H2 podrían estar actuando como
reguladores de la síntesis de citoquinas inflamatorias.
Figura 21. Efecto de los antihistamínicos H2 sobre la respuesta
proinflamatoria del rH1. Células HL1 fueron tratadas con ranitidina (RAN) 10μM
o famotidina (FAM) 10μM por 10 min y luego tratadas con el agonista H1 (2,3-
trifluormetilfenilhistamina) 10μM por 18 h. Los niveles de ARNm de IL-6 fueron
cuantificados según se describe en la sección Materiales y Métodos. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), #p<0,05 respecto a la respuesta del
agonista H1 sin pretratamiento. *p˂0,05.
En conjunto, los resultados obtenidos en las secciones 3.1 y 3.2 demuestran
que los antihistamínicos H1 y H2 son capaces de interferir de manera
cruzada con la respuesta mediada por el receptor activado, promoviendo así
la desensibilización heteróloga entre los rH1 y rH2 en los modelos celulares
utilizados.
Resultados
88
3.3. Los antihistamínicos H2 afectan la respuesta antiproliferativa y
proapoptótica del rH1 activado
Como se mencionó en la introducción, la activación del rH1 mediada
por la histamina regula procesos de proliferación y apoptosis en diferentes
tipos celulares (Hur et al., 2003; Lázár-Molnár et al., 2002; Notcovich et al.,
2010). En particular, en la línea celular U937, reportamos que la
estimulación con el agonista H1 inhibe la proliferación celular e induce
apoptosis luego de 48h de tratamiento, siendo este proceso inhibido por la
activación del rH2 (Alonso et al., 2013).
Tomando como base este antecedente y con el objetivo de profundizar
en el papel que cumplen los antihistamínicos, evaluamos el efecto de los
antihistamínicos H2 sobre la respuesta antiproliferativa y proapoptótica
inducidas por el agonista H1 en las células U937. Como se observa en la
figura 22, el agonista H1 induce una inhibición del 60% de la proliferación
celular luego de 72 h de tratamiento, la cual es bloqueada parcialmente al
tratarse de manera conjunta con los antihistamínicos H2. Este hecho
demuestra que la regulación cruzada inducida por los antihistamínicos H2
no sólo afecta la respuesta inflamatoria evocada por el agonista H1, sino que
también es capaz de producir modificaciones sobre la respuesta
antiproliferativa mediada por el rH1.
Resultados
89
Figura 22. Efecto de los antihistamínicos H2 sobre la respuesta antiproliferativa del rH1. Células U937 fueron tratadas con el agonista H1 (2, 3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM sólo o en combinación con cimetidina (CIM) 10μM, ranitidina (RAN) 10μM o famotidina (FAM) 10μM por 24, 48 y 72 h A. o sólo por 72 h B. y la proliferación celular se determinó según se describe en la sección Materiales y Métodos. A. Los datos fueron calculados como la media ± S.D. de un ensayo representativo. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. B. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3). ***p˂0,001 respecto a las células control; ###p˂0,001 respecto a células tratadas con el agonista H1. 100% corresponde a la proliferación de las células control.
Posteriormente, dado que existe una correlación directa entre la
inhibición de la proliferación y el arresto del ciclo celular en la fase subG0
por el tratamiento con el agonista H1 (Alonso et al., 2013), evaluamos el
efecto de los antihistamínicos H2 en la regulación del ciclo celular. Para ello,
tratamos a las células U937 durante 72 h con los diferentes ligandos
histaminérgicos, teñimos las células con IP 20μg/ml y evaluamos por
citometría de flujo la distribución de las poblaciones celulares en cada una
de las distintas fases del ciclo celular. El contenido de ADN y la distribución
del ciclo celular para 10.000 células individuales fueron cuantificados y se
analizaron utilizando el programa FlowJo V10 Workspace.
En presencia de los antihistamínicos H2, no observamos el
incremento porcentual de células arrestadas en la fase subG0 ni la
disminución en la proporción de células en la fase S producidos por el
tratamiento con el agonista H1. (Fig. 23A y 23B). Estos resultados
demuestran la existencia de una estrecha regulación de la respuesta
antiproliferativa mediada por el agonista H1 por parte de los
antihistamínicos H2, la cual impide el arresto en la fase subG0 y permite a
las células proliferar, de acuerdo con los resultados obtenidos en la figura
22. Cabe destacar que el tratamiento con los antihistamínicos H2 solos no
altera la proporción de células en cada fase del ciclo celular en comparación
al control.
Resultados
90
Figura 23. Efecto de los antihistamínicos H2 sobre el ciclo celular. Células U937 fueron tratadas con el agonista H1 (2, 3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM sólo o en combinación con cimetidina (CIM) 10μM, ranitidina (RAN) 10μM o famotidina (FAM) 10μM por 72 h y se determinó el ciclo celular según se describe en la sección Materiales y Métodos. A. Histogramas representativos mostrando el contenido de ADN y la distribución celular en los diferentes estadios del ciclo celular, fase G0/G1 (gris), fase de síntesis (S, rojo) y fase de mitosis (G2, azul). B. Porcentaje de células en los distintos estadíos del ciclo celular. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3). **p˂0,01 respecto a las células control.
Resultados
91
Finalmente, evaluamos el efecto de los antihistamínicos H2 sobre la
respuesta proapoptótica mediada por el rH1 activado, utilizando el mismo
sistema celular.
Existen diversos eventos que ocurren en la célula durante el proceso
de apoptosis o muerte celular programada. Uno de ellos incluye la
translocación de moléculas de fosfatidilserina (biomarcador de apoptosis)
desde la cara interna de la membrana plasmática hacia la parte externa de la
misma, donde son reconocidas por la molécula proteica anexina V,
permitiendo la detección de los niveles de apoptosis celular mediante la
técnica de citometría de flujo. De esta manera, con los diferentes
tratamientos determinamos la marcación de las células con anexina V
conjugada a la fluoresceína (FITC) y el marcador catiónico IP, la cual permite
discriminar la distribución de las células en las distintas subpoblaciones
celulares del proceso apoptótico: células no apoptóticas o viables (anexina V-
FICT negativo / IP negativo), células en apoptosis temprana (anexina V-FICT
positivo / IP negativo), células en apoptosis tardía (anexina V-FICT positivo/
IP positivo) y células necróticas (anexina V-FICT negativo / IP positivo).
En las figuras 24A y 24B se evidencia que, tanto la disminución en la
proporción de células viables como el incremento del porcentaje de células
en las etapas de apoptosis temprana y tardía inducidos por el tratamiento
con el agonista H1, no ocurren en presencia de los antihistamínicos H2
cimetidina, ranitidina y famotidina.
Resultados
92
Figura 24. Efecto de los antihistamínicos H2 sobre la respuesta proapoptótica del rH1. Células U937 fueron tratadas con el agonista H1 (2, 3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM sólo o en combinación con cimetidina (CIM) 10μM, ranitidina (RAN) 10μM o famotidina (FAM) 10μM por 72 h y se determinó la marcación con Anexina V-FITC y la viabilidad celular con IP, según se describe en la sección Materiales y Métodos A. Representación en gráficos de puntos de un análisis FACS representativo de tres ensayos independientes realizados por triplicado. B. Porcentaje de subpoblación celular en las distintas etapas del proceso de apoptosis. Las células positivas para Anexina V-FITC se encuentran en etapas tempranas de apoptosis. Las células positivas tanto para Anexina V-FITC como
Resultados
93
para IP se encuentran en la fase tardía de apoptosis, mientras que las células positivas para IP se encuentran en la fase de necrosis. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3). ***p˂0,001 respecto a las células control.
A partir de los resultados obtenidos en esta sección, determinamos
que tanto la respuesta antiproliferativa, el arresto del ciclo celular en la fase
SubG0 y la respuesta proapoptótica inducidas por el tratamiento con el
agonista H1 en células U937, son bloqueados por el tratamiento conjunto
con los antihistamínicos H2. Más aún, estos resultados resaltan la
importancia de la regulación cruzada entre los rH1 y rH2 a histamina en la
respuesta final celular desencadenada por los ligandos histaminérgicos.
4. La desensibilización cruzada entre los rH1 y rH2 inducida por los
antihistamínicos H1 y H2 es independiente de GRK2
Teniendo en cuenta que en la sección 1 del presente trabajo de tesis
determinamos que el dominio quinasa de GRK2 se encuentra involucrado en
la desensibilización cruzada de los rH1 y rH2 activados y, además, que los
antihistamínicos de ambos receptores son capaces de modificar la respuesta
promovida por el agonista del otro receptor, nos propusimos evaluar si
GRK2 se encuentra involucrada en la desensibilización cruzada de estos
subtipos de receptores inducida por los antihistamínicos H1 y H2.
Por un lado, evaluamos la producción de AMPc como respuesta del
rH2 en células HEK293 transfectadas con ambos receptores y diferentes
construcciones de GRK2: salvaje o mutantes (GRK2-D110A y GRK2-K220R).
Asimismo, evaluamos la activación del promotor de IL-6-Luc como
respuesta del rH1 en células HEK293 transfectadas con los mismos
plásmidos y el sistema reportero. Interesantemente, el hecho de que GRK2 o
sus mutantes se encuentren sobreexpresadas no modifica la
Resultados
94
desensibilización cruzada de los rH1 y rH2 inducida por los diferentes
antihistamínicos H1 y H2 (Fig. 25A y 25B).
Estos resultados nos indican que GRK2 no participa en el proceso de
desensibilización cruzada de estos receptores inducido por ligandos
antihistamínicos. Podríamos pensar entonces, que existe un mecanismo
alternativo, el cual es responsable de regular dicho proceso.
Figura 25. Efecto de los dominios de GRK2 en la desensibilización cruzada inducida por antihistamínicos H1 y H2. A. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 y MOCK (vector vacío), GRK2 o GRK2-D110A o GRK2-K220R fueron incubadas durante 30 min con ceterizina (CET) 10μM, clorfeniramina (CLOR) 10μM o triprolidina (TRIP) 10μM, lavadas con PBS y estimuladas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta de amtamina sin pretratamiento. E/B corresponde a la relación entre el estímulo de amtamina y su basal. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3). ns. no significativo respecto a la respuesta de amtamina luego del pretratamiento, en células MOCK. B. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 e IL-6-Luc y MOCK, GRK2, GRK2-D110A o GRK2-K220R, fueron incubadas con cimetidina (CIM) 10μM, ranitidina (RAN) 10μM o famotidina
Resultados
95
(FAM) 10μM por 10 min y luego tratadas con el agonista H1 10μM por 6 h. Se determinó la actividad de luciferasa según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta del agonista H1 sin pretratamiento. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3). ns. no significativo respecto a la respuesta del agonista H1 luego del pretratamiento en las células MOCK. ***p˂0,001.
5. Internalización cruzada de los rH1 y rH2 inducida por los
antihistamínicos H1 y H2
En estudios previos, reportamos que tanto en la línea celular U937
como en células CHO y HEK293T transfectadas con ambos receptores, la
estimulación con los agonistas H1 y H2 promueve la cointernalización de los
rH1 y rH2. Por otra parte, observamos que el tratamiento con los
antihistamínicos H2 cimetidina, ranitidina y tiotidina en células HEK293T
transfectadas únicamente con el rH2 inducen la internalización de dicho
receptor (Alonso et al., 2014, 2013).
Con el objetivo de estudiar la existencia de un mecanismo de
internalización cruzada entre los receptores inducido por los
antihistamínicos H1 y H2, células U937 fueron tratadas por 90 min con el
antihistamínico H1 ceterizina y el número de rH1 y rH2 en la superficie de la
membrana fue evaluado por ensayos de unión con [3H]mepiramina y
[3H]tiotidina. Este tiempo fue utilizado dado que ensayos previos de nuestro
laboratorio demostraron que este tiempo es suficiente para lograr una
máxima internalización del rH2 inducida tanto por agonistas H2 como
antihistamínicos H2.
Interesantemente, la exposición a ceterizina no sólo redujo el número
de sitios del rH1 en membrana (58% respecto a células no tratadas), sino
que además disminuyó el número de sitios del rH2 (65 % respecto a células
no tratadas) (Fig. 26A y 26B).
Resultados
96
Figura 26. Internalización cruzada de los rH1 y rH2 inducida por ceterizina.
Ensayos de unión por saturación con [3H]mepiramina para determinar sitios rH1
A. o [3H]tiotidina para determinar sitios rH2 B. se llevaron a cabo en células U937
control (●) o tratadas durante 90 min con ceterizina (CET) 10μM (■), según se
detalla en la sección Materiales y Métodos. Los datos fueron calculados como la
media ± S.D. de un ensayo representativo. Resultados similares fueron obtenidos
en tres experimentos independientes. Panel derecho: Representa el porcentaje del valor Bmax obtenido a partir de la regresión no lineal de los ensayos de
saturación, calculado como la media ± S.E.M. (n=3). 100% corresponde a las células
sin tratamiento (control). ***p˂0,001 respecto a las células control.
De esta manera, los resultados obtenidos muestran por primera vez
que ceterizina es capaz de inducir la pérdida de sitios de unión de su
receptor, y a su vez, genera la internalización cruzada del rH2.
Seguido a esto, evaluamos la capacidad de los antihistamínicos H2
ranitidina y famotidina de inducir la internalización del rH1. Observamos
que el tratamiento de 90 min con estos ligandos promueve la internalización
cruzada de los sitios de unión rH1 en un 43% y 31% respectivamente,
respecto de las células sin tratamiento (Fig. 27).
Resultados
97
[3
H ]M ep ira m in a lib re (n M )
[3H
]Me
pir
am
ina
un
ido
(sit
ios/c
elu
la)
0 2 5 5 0 7 5 1 0 0
0
1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 0 0
4 0 0 0 0
5 0 0 0 0
C o n tro l
R A N
F A M
Bm
ax
(%
re
sp
ec
to a
l c
on
tro
l)
RA
N
FA
M
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
* * *
* * *
Figura 27. Internalización cruzada del rH1 por antihistamínicos H2 en células U937. Ensayos de unión por saturación con [3H]mepiramina se llevaron a cabo en células U937 control (●) o tratadas durante 90 min con ranitidina (RAN)
10μM (◻) o famotidina (FAM) 10μM (○), según se detalla en la sección Materiales y Métodos. Los datos fueron calculados como la media ± S.D. de un ensayo representativo. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. Panel derecho: Representa el porcentaje del valor Bmax obtenido a partir de la regresión no lineal del ensayo de saturación, calculado como la media ± S.E.M. (n=3). 100% corresponde a las células sin tratamiento (control). ***p˂ 0,001 respecto a las células control.
Con la intención de evaluar si la internalización cruzada del rH1 es
inducida por la especificidad de unión entre los antihistamínicos H2 y su
receptor, realizamos los ensayos de unión con [3H]mepiramina para
determinar el número de rH1 en la superficie en células HEK293
transfectadas únicamente con el rH1 (HEK293-rH1). Así, determinamos que
los antihistamínicos H2 ranitidina y famotidina no son capaces de
internalizar al rH1 en ausencia del rH2, mientras que ceterizina
(antihistamínico H1) lo hace en aproximadamente un 45% (Fig. 28A). Sin
embargo, en el sistema que expresa ambos receptores (HEK293-rH1-rH2) y,
al igual que lo observado para U937, ranitidina y famotidina son capaces de
inducir la internalización cruzada del rH1 en un 32% y 29%
respectivamente, con respecto de las células sin tratamiento (Fig. 28B).
Resultados
98
Figura 28. Internalización cruzada del rH1 por antihistamínicos H2 en células HEK293. Ensayos de unión por saturación con [3H]mepiramina se llevaron a cabo en células HEK293 transfectadas con rH1 control (●) o tratadas durante 90
min con ceterizina (CET) 10μM (■), ranitidina (RAN) 10μM (◻) o famotidina (FAM) 10μM (○) A. y células HEK293 transfectadas con rH1 y rH2 control (●) o
tratadas durante 90 min con ranitidina (RAN) 10μM (◻) o famotidina (FAM) 10μM (○) B. según se detalla en la sección Materiales y Métodos. Los datos fueron calculados como la media ± S.D. de un ensayo representativo. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. Panel derecho A-B: Representa el porcentaje del valor Bmax obtenido a partir de la regresión no lineal del ensayo de saturación, calculado como la media ± S.E.M. (n=3). 100% corresponde a las células sin tratamiento (control). **p˂0,01; ***p˂0,001 respecto a las células control.
En conjunto, los resultados obtenidos en esta sección revelan la
existencia de una internalización cruzada entre los rH1 y rH2 inducida por
ligandos antihistamínicos, la cual se encuentra formando parte del
mecanismo de regulación cruzada entre dichos receptores.
Resultados
99
6. La internalización cruzada de los rH1 y rH2 es el mecanismo
responsable de la desensibilización cruzada promovida por los
antihistamínicos H1 y H2
A partir de los ensayos de unión realizados en la sección anterior,
concluimos que los antihistamínicos H1 y H2 son capaces de inducir la
internalización cruzada de los receptores. Además, determinamos que la
desensibilización cruzada promovida por estos ligandos histaminérgicos es
independiente de GRK2, por lo que nos propusimos evaluar si la
internalización cruzada inducida por los antihistamínicos H1 y H2 es
responsable de la regulación cruzada existente entre los rH1 y rH2.
Se encuentra descripto que las proteínas β-Arr y dinamina son
mediadores esenciales de la internalización de diversos GPCRs, entre los que
se encuentran los rH1 y rH2 (Fernandez et al., 2008; Wolfe and Trejo, 2007).
Por este motivo, inhibimos dichas moléculas de manera farmacológica y/o
genética y evaluamos el efecto de esta inhibición sobre la desensibilización
cruzada de los rH1 y rH2 inducida por los antihistamínicos de ambos
receptores.
Inicialmente, determinamos en células U937 la respuesta del rH2
evaluando los niveles de AMPc inducidos por amtamina luego del
pretratamiento por 30 min con los antihistamínicos H1 ceterizina,
clorfeniramina y triprolidina en presencia de 80µM de dynasore, un
inhibidor farmacológico de dinamina. La respuesta del rH2 no se vio
afectada por ninguno de los antihistamínicos H1 utilizados en presencia del
inhibidor farmacológico, bloqueando de esta manera la desensibilización
cruzada (Fig. 29A izquierda). En el panel derecho de la figura 29A, se
evidencia que la internalización es bloqueada de forma eficiente con la
concentración utilizada de dynasore.
Seguido a esto, utilizamos clones derivados de la línea celular U937
que presentan bloqueado el proceso de internalización mediante diferentes
mecanismos. El clon U937-DC6 fue obtenido por transfección estable con la
Resultados
100
construcción dominante negativa de dinamina, mientras que el clon U937-
AD3 expresa una dominante negativa de arrestina (Fernandez et al., 2008).
En dichos clones observamos que ceterizina, clorfeniramina y triprolidina
son incapaces de inducir la desensibilización cruzada del rH2 (Fig. 29B),
sugiriendo que el proceso de internalización es necesario para que se
produzca la desensibilización cruzada del rH2 promovida por los
antihistamínicos H1.
Figura 29. La internalización cruzada está involucrada en la desensibilización cruzada del rH2 por antihistamínicos H1. Células U937 preincubadas por 30 min con dynasore (Dyn) 80μM (barras grises) o no (barras blancas) A (izquierda). y células U937, U937-DC6 y U937-AD3 B. fueron incubadas con ceterizina (CET) 10μM, clorfeniramina (CLOR) 10μM o triprolidina
Resultados
101
(TRIP) 10μM por 30 min, lavadas con PBS y estimuladas con el agonista H2 (amtamina) 10μM por 10 min en presencia de IBMX 1mM. Se determinó la producción de AMPc según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la respuesta de amtamina sin pretratamiento (control). E/B corresponde a la relación entre el estímulo con amtamina y su basal. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ***p˂0,00; ns. no significativo respecto al control. A (derecha). Células U937 control (●) o tratadas durante 90
min con ceterizina (CET) 10μM (◼) o con ceterizina (CET) 10μM en presencia de
dynasore (Dyn) 80μM (◻). Se determinaron los sitios rH1 por ensayos de saturación con [3H]mepiramina según se detalla en la sección Materiales y Métodos. Los datos fueron calculados como la media ± S.D. de un ensayo representativo. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes.
Por otro lado, evaluamos el efecto de dynasore sobre la regulación
cruzada de la respuesta inflamatoria mediada por el rH1, inducida por los
antihistamínicos H2 cimetidina, ranitidina y famotidina. En células HEK293
transfectadas con ambos receptores observamos que cuando el proceso de
internalización es bloqueado por dynasore, ninguno de los ligandos H2
evaluados es capaz de reducir la actividad del promotor de IL-6-Luc
inducido por el agonista H1 (Fig. 30). Los resultados obtenidos indican que
la internalización inducida por los antihistamínicos H2 se encuentra
involucrada en la pérdida de respuesta inflamatoria del rH1.
Resultados
102
Figura 30. La internalización cruzada está involucrada en la desensibilización cruzada del rH1 por antihistamínicos H2. Células HEK293 transfectadas con rH1, rH2 e IL-6-Luc, fueron incubadas por 30 min con dynasore (Dyn) 80μM (barras grises) o no (barras blancas), luego con cimetidina (CIM) 10μM, ranitidina (RAN) 10μM o famotidina (FAM) 10μM por 10 min y posteriormente tratadas con el agonista H1 (2,3-trifluormetilfenilhistamina) 10μM por 6 h. Se determinó la actividad de luciferasa según se describe en la sección Materiales y Métodos. 100% corresponde a la actividad basal sin pretratamiento con los antihistamínicos H2. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3), ns. no significativo, #p<0,05; ##p<0,01; ###p<0,001 respecto al estímulo con el agonista H1 sin pretratamiento. ***p˂0,001.
En conjunto, los resultados obtenidos en esta sección indican que el
bloqueo del proceso de internalización previene la desensibilización cruzada
entre los rH1 y rH2 promovida por los antihistamínicos H1 y H2. Por lo
tanto, podemos concluir que la internalización cruzada inducida por los
antihistamínicos H1 y H2 es el mecanismo responsable de la regulación
cruzada existente entre dichos receptores.
Resultados
103
7. Destino de los rH1 luego de la internalización cruzada promovida por
ligandos del rH2
Está ampliamente aceptado que luego de la estimulación con
agonistas, los GPCRs experimentan cambios conformacionales que dan
inicio, en su mayoría, a su desensibilización e internalización. Una vez
producida la endocitosis en compartimentos intracelulares, estos GPCRs
pueden ser reciclados y relocalizados en la membrana plasmática para
funcionar normalmente frente a un nuevo estímulo con su ligando, o pueden
ser degradados en el interior celular y depender de la síntesis de novo para
recuperar los sitios en membrana.
En relación a los receptores histaminérgicos podemos mencionar que,
luego del estímulo con agonistas, los rH1 y rH2 son internalizados mediante
un mecanismo dependiente de arrestina y dinamina, pero el destino de los
mismos es diferente: el rH1 es degradado en lisosomas mientras que el rH2
es reciclado a la membrana celular (Fernandez et al., 2008; Hishinuma et al.,
2010). Asimismo, en un trabajo reciente hemos descripto que los agonistas
inversos del rH2 también pueden inducir la internalización de su receptor,
aunque en este caso los receptores son degradados y dependen de la síntesis
de novo para la resensibilización (Alonso et al., 2014).
En esta ocasión nuestro interés se centró en estudiar el destino de los
rH1 luego de la internalización inducida por agonistas o por agonistas
inversos del rH2, utilizando la línea celular HEK293 transfectada con los rH1
y rH2.
7.1. Destino de los rH1 luego de la internalización cruzada promovida
por amtamina
Se llevaron a cabo ensayos de recuperación de los sitios rH1, en
presencia o ausencia del inhibidor de la síntesis proteica, cicloheximida. Las
células fueron tratadas durante 90 min con amtamina, lavadas con PBS e
Resultados
104
incubadas en medio fresco por 60 min y el número de sitios rH1 fue
determinado.
En la figura 31 es posible apreciar que la sustracción de amtamina
promueve la rápida recuperación de los sitios rH1 en la membrana
plasmática, aún en presencia de cicloheximida, la cual no afecta el proceso
de internalización (Fig. 31A y 31B). Este hecho nos indica que la
recuperación de los sitios de unión del rH1 en la membrana plasmática no
depende de la síntesis de nuevas proteínas receptoras, sino del reciclado de
los rH1 internalizados.
Figura 31. Internalización y recuperación de los sitios rH1 por amtamina. Células HEK293 fueron transfectadas con rH1 y rH2, tratadas durante 90 min con el agonista H2 (Amta) 10μM, lavadas e incubadas 60 min en medio DMEM fresco. El inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida (CHX) 50μM fue adicionado 30 min antes del estímulo. Se determinaron los sitios rH1 por ensayos de unión por saturación con [3H]mepiramina según se detalla en la sección Materiales y Métodos. A. Los datos fueron calculados como la media ± S.D. de un ensayo representativo. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes B. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3). 100% corresponde a las células sin tratamiento (control). ns. no significativo respecto a las células tratadas en ausencia de cicloheximida.
Resultados
105
7.2. Destino de los rH1 luego de la internalización cruzada promovida
por los antihistamínicos H2
Para evaluar la recuperación de los sitios rH1 luego de la internalización
inducida por los antihistamínicos H2, se trataron las células durante 90 min
con ranitidina y famotidina, se lavaron e incubaron durante 60 min con
medio fresco para finalmente determinar los sitios rH1. Observamos que la
remoción de estos ligandos H2 promueve la recuperación de los sitios de
unión rH1 en la membrana plasmática. Este proceso, sin embargo, es
bloqueado en presencia de cicloheximida, indicando que la síntesis de novo
es responsable de la recuperación de los rH1 en membrana (Fig. 32).
Figura 32. Internalización y recuperación de los sitios rH1 en presencia de cicloheximida. Células HEK293 fueron transfectadas con rH1 y rH2, tratadas
durante 90 min con ranitidina (RAN) 10μM (◻) o famotidina (FAM) 10μM (○), lavadas e incubadas 60 min en medio DMEM fresco. El inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida (CHX) 50μM fue adicionado 30 min antes de los estímulos. Se determinaron los sitios rH1 por ensayos de unión por saturación con [3H]mepiramina según se detalla en la sección Materiales y Métodos. Los datos fueron calculados como la media ± S.E.M. (n=3). 100% corresponde a las células sin tratamiento (control). *p˂0,05 respecto a las células tratadas en ausencia de cicloheximida.
Los resultados obtenidos en esta sección nos permiten concluir que a
pesar de que los sitios rH1 se recuperan en la membrana celular luego de la
Resultados
106
remoción del ligando H2 resensibilizando al sistema, el mecanismo
involucrado es diferente de acuerdo al tipo de ligando H2 involucrado
(agonista o agonista inverso).
107
DISCUSIÓN
Discusión
108
Los principales hallazgos del presente trabajo de tesis en relación al
sistema histaminérgico nos indican que: 1) el dominio central de GRK2
participa en la desensibilización cruzada de los rH1 y rH2 activados por sus
agonistas, 2) la respuesta inducida por los antihistamínicos H1 y H2 se
encuentra regulada de manera cruzada por la activación de los rH1 y rH2, 3)
los antihistamínicos H1 y H2 inducen la desensibilización cruzada de la
respuesta mediada por agonistas de los rH1 y rH2, 4) los antihistamínicos
H1 y H2 inducen la internalización cruzada de los rH1 y rH2, 5) el proceso
de internalización cruzada es responsable de la desensibilización cruzada
entre los rH1 y rH2 inducida por antihistamínicos de ambos receptores y 6)
el mecanismo de resensibilización del rH1 depende del tipo de ligando H2
responsable de su internalización (agonista o agonista inverso).
1. GRK2 puede regular la desensibilización cruzada de GPCRs
Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) se encuentran dentro
de los principales reguladores de numerosos procesos fisiológicos en los
mamíferos. Las vías de señalización promovidas por sus ligandos son
complejas y se encuentran reguladas por diferentes mecanismos
moleculares. Es así que la desensibilización homóloga se asoció clásicamente
a proteínas de la familia de las GRKs, las cuales fosforilan al receptor en
sitios específicos, incrementando su afinidad por β-Arr y evitando, de esta
manera, un nuevo acople con la proteína G. Este proceso no sólo permite que
la respuesta desencadenada sea atenuada, sino que además posibilita la
generación de nuevas respuestas independientes de proteína G, abriendo
nuevos conceptos en el campo de la señalización de GPCRs.
En este contexto, varios estudios han demostrado que GRK2 es la
principal quinasa que participa en la desensibilización homóloga de los rH1
y rH2, luego de un estímulo repetido o prolongado con su agonista. En línea
con lo mencionado, ha sido demostrada la participación de los dominios RGS
y quinasa de GRK2 en la desensibilización del rH1 activado, mientras que, la
Discusión
109
regulación de la respuesta del rH2 a su agonista involucra al dominio RGS de
GRK2 para su desensibilización homóloga y al dominio quinasa para el
proceso de internalización y tráfico intracelular del receptor (Fernandez et
al., 2011; Fernández et al., 2002; Iwata et al., 2005; Shayo et al., 2001b).
Por otro lado, se encuentra clásicamente aceptado que la
desensibilización heteróloga de GPCRs es el resultado de un
entrecruzamiento o crosstalk entre las señales intracelulares, las cuales
involucran cambios en los receptores, las proteínas G o sus efectores e
intervienen las proteínas quinasas activadas por segundos mensajeros
(Ferguson, 2001). Sin embargo, y como se mencionó en la introducción,
experimentos realizados anteriormente por nuestro grupo en células U937,
indicaron que la activación de la AC, PLC, PKA o PKC no se encuentra
involucrada en la desensibilización heteróloga de los rH1 y rH2 activados.
Asimismo, a pesar de que determinamos que los rH1 y rH2 cointernalizan
luego del estímulo con agonistas, un mecanismo independiente es el que
regula la desensibilización heteróloga entre los mismos (Alonso et al., 2013).
Este hecho nos llevó a postular nuestro primer objetivo que plantea la
participación de GRK2, a través de alguno de sus dominios, en el crosstalk
entre estos receptores. Los experimentos aquí presentados, mostraron que
en células HEK293 cotransfectadas con los rH1, rH2 y GRK2, el t1/2 de
desensibilización y la respuesta del rH2 disminuyen significativamente
respecto de las células transfectadas únicamente con ambos receptores, al
activarse previamente el rH1. Por otra parte, al disminuir los niveles de
GRK2 en el clon U937-A2, observamos una menor desensibilización cruzada
del rH2, indicando la importancia de GRK2 como mediadora de esta
desensibilización heteróloga (Fig. 7).
De forma similar, a través de un ensayo de gen reportero, evaluamos
la respuesta del rH1 luego de activar previamente al rH2 en presencia de
GRK2 sobreexpresada, observando que esta respuesta también se encuentra
significativamente disminuida respecto a la observada en las células
Discusión
110
transfectadas con MOCK (Fig. 8). Esta modificación en la señalización del
rH1 por el agonista H2 a nivel de la transcripción del gen de IL-6 resultó
similar a la observada a nivel de la producción de IP3 (Alonso et al., 2013),
indicando que la respuesta observada a este nivel depende del efector
activado río arriba en la cascada de señalización clásica del rH1. Estos
resultados nos permitieron confirmar que GRK2 se encuentra mediando la
desensibilización heteróloga de los rH1 y rH2 activados.
Como se mencionó en la introducción, GRK2 posee 3 dominios
funcionales bien definidos: el amino terminal de homología a RGS o dominio
RH, el central con actividad quinasa y el carboxi terminal de homología a
pleckstrina o dominio PH. El dominio de GRK2 involucrado en el modelo
canónico de desensibilización homóloga de GPCRs es el central con
capacidad de fosforilar a los receptores. Sin embargo, para muchos GPCRs y
en particular los rH1 y rH2, el dominio RGS o RH resulta imprescindible para
la desensibilización homóloga del receptor activado, mientras que para la
internalización y tráfico del rH2 el dominio quinasa central resulta
importante (Day et al., 2004; Dhami et al., 2002; Fernandez et al., 2011;
Iwata et al., 2005).
Con el propósito de responder a nuestro interrogante, utilizamos dos
enfoques experimentales. Por un lado, utilizamos construcciones de GRK2
mutadas, que actúan como dominantes negativas: GRK2-D110A (dominio
RGS mutado) incapaz de desensibilizar homólogamente a los receptores,
pero capaz de fosforilar a los mismos y GRK2-K220R (dominio quinasa
mutado) sin actividad catalítica, pero con actividad RGS conservada (Fig.
9A). Por otra parte, utilizamos diferentes dominios de GRK2: RH sólo y RH o
quinasa (KINK220R) fusionados al dominio con homología a pleckstrina
(RH-PH o KINK220R-PH) obtenidos a partir de la construcción mutada
GRK2-K220R (Fig. 10A). De manera interesante, los resultados obtenidos en
células HEK293 transfectadas con ambos receptores, GRK2-K220R o
KINK220R-PH demuestran que la fosforilación de los receptores es
Discusión
111
necesaria para que se produzca la desensibilización heteróloga, dado que al
encontrarse mutado el dominio central encargado de dicha fosforilación el
crosstalk no ocurre. Más aún, en presencia de la mutante GRK2-D110A, la
pérdida de respuesta del rH2 por la activación del rH1 se encuentra
exacerbada, probablemente por una mayor fosforilación del receptor a cargo
del dominio quinasa sobreexpresado.
Nuestros resultados están en concordancia con estudios llevados a
cabo por otros investigadores que plantean la participación de GRK2 en la
desensibilización heteróloga de GPCRs, a través del proceso de fosforilación.
En este sentido, Heijink y colaboradores determinaron que la activación con
el agonista TARC del receptor a quemoquina tipo 4 (CCR4) acoplado a Gαi,
impide que el agonista del receptor β2AR (acoplado a Gαs) promueva la
acumulación de AMPc en linfocitos T de sangre periférica. El mecanismo por
el cual se produce dicha desensibilización heteróloga involucra la
fosforilación del receptor β2AR por GRK2, la cual es activada y translocada a
membrana por quinasas de la familia Scr inducidas por TARC (Heijink et al.,
2005). En adición, ha sido reportado que GRK2 promueve la fosforilación del
receptor μ-opiode (MOR) en el residuo Ser-377 del extremo carboxi
terminal, cuando el receptor del neuropéptido FF2 (NPFF2) es estimulado. A
pesar de que el residuo fosforilado es conocido por desensibilizar e
internalizar a MOR luego de la activación con su agonista DAMGO (Chu et al.,
2008; Schulz et al., 2004), los resultados obtenidos por los autores indican
que la fosforilación inducida por la activación del NPFF2 contribuye a la
pérdida de función de MOR pero no es suficiente para su internalización.
Este hecho apoya la hipótesis de que una fosforilación inicial en el residuo
Ser-377 lleva a la pérdida de señal de MOR no sólo por una desensibilización
homóloga, sino también por una desensibilización heteróloga, necesitando
de una múltiple fosforilación (en otros residuos) para lograr el
reclutamiento de β-Arr e inducir su internalización (Moulédous et al., 2012).
Discusión
112
En nuestro caso, los resultados presentados indican que el agonista
H1 promueve la fosforilación del rH2 por GRK2 induciendo la
desensibilización de su respuesta, mientras que, en resultados previos
(Fernandez et al., 2011), la fosforilación del rH2 por GRK2 inducida por su
agonista está relacionada al proceso de internalización y no a su
desensibilización. Este hecho nos lleva a pensar que el rH2 podría ser
fosforilado por GRK2 en sitios o residuos diferentes. Así, la activación de
GRK2 por el agonista H1 fosforilaría al rH2 en sitios específicos
promoviendo un cambio conformacional del mismo, que daría lugar a su
desensibilización, mientras que GRK2 activada por el agonista H2
fosforilaría al receptor en sitios diferentes, induciendo su internalización.
Sabiendo que tanto el dominio RGS como el dominio quinasa de GRK2 se
encuentran mediando la desensibilización del rH1 activado por su agonista,
entonces la activación de GRK2 por el agonista H2 podría o no, estar
fosforilando el mismo sitio que el inducido por su propio agonista.
En adición, pudimos observar que la desensibilización cruzada de los
rH1 y rH2 activados resultó inhibida al sobreexpresar los dominios RH y RH-
PH de GRK2 (Fig. 10). Esto nos lleva a especular la existencia de una
asociación directa entre el dominio RH (o RGS) de GRK2 y los receptores
activados, que al estar sobreexpresado impide estéricamente la fosforilación
cruzada de los receptores mediada por del dominio catalítico de la GRK2
endógena y, por lo tanto, no se produce la desensibilización heteróloga de
los mismos. En línea con lo mencionado, ha sido descripta la unión del
dominio RH de GRK2 con el extremo carboxi terminal del receptor
metabotrópico de glutamato 1a (Dhami et al., 2005), con el receptor de
dopamina D2 (Namkung et al., 2009) y además, la asociación de GRK2 al rH2
luego del estímulo con el agonista de este receptor (Fernandez et al., 2011).
Dado que los rH1 y rH2 interactúan físicamente formando
heterómeros luego de la unión con el agonista H1 o amtamina (Alonso et al.,
2013), la fosforilación heteróloga descripta en el presente trabajo podría ser
Discusión
113
el resultado del reclutamiento de GRK2 por los receptores activados dentro
del heterómero rH1/rH2 formado a través de dos posibles mecanismos: 1)
GRK2 podría ser reclutada por el receptor activado y, dada la estrecha
proximidad entre los receptores dentro del complejo, podría fosforilar
heterólogamente al receptor complementario, y 2) la activación de un
receptor podría modificar alostéricamente la conformación del otro receptor
dentro del heterodímero formado, incrementando así su capacidad para
reclutar a GRK2. Sin embargo, la precisa estequiometría del complejo rH1-
rH2-GRK2, el sitio específico de fosforilación heteróloga de los receptores,
como también la capacidad del complejo de reclutar a β-Arr para la
generación de vías de señalización en el interior celular, resultan
interesantes para ser evaluadas en futuros estudios.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo aportan evidencias
respecto al papel de GRK2 en la desensibilización heteróloga de los rH1 y
rH2, en adición a su contribución conocida en la desensibilización homóloga
de los mismos. Asimismo, describimos la importancia de la fosforilación
cruzada a través del dominio quinasa de GRK2 para la regulación de dicho
crosstalk. Este mecanismo de fosforilación cruzada mediado por GRK2
presentado por primera vez para el sistema histaminérgico, contribuye al
conocimiento de la regulación cruzada de la respuesta entre estos
receptores y, por otra parte, refuerza las funciones poco descriptas para
GRK2 con relación a la desensibilización heteróloga. Este estudio, a su vez,
podría ser ampliado para explicar la desensibilización heteróloga entre
otros GPCRs.
2. Nuevas eficacias para los antihistamínicos H1 y H2. Desensibilización
e internalización cruzada
En la actualidad, 134 GPCRs son blancos para medicamentos
aprobados en los Estados Unidos y la Unión Europea y se estima que
aproximadamente el 35% de los medicamentos aprobados tienen como
Discusión
114
objetivo a los GPCRs. Entre los receptores con mayor número de drogas
aprobadas se encuentran los rH1 y rH2 a histamina (Sriram and Insel, 2018).
Los antagonistas de los rH1 y rH2, los cuales han sido reclasificados
como agonistas inversos y muchos de ellos son fármacos de venta libre, son
en la actualidad ampliamente utilizados en la clínica, a pesar de sus efectos
adversos, logrando obtener respuestas favorables al tratamiento. El
concepto de agonismo inverso surgió de observaciones experimentales, las
cuales demostraron que ciertos medicamentos eran capaces de reducir la
actividad del receptor en sistemas donde el mismo se encontraba activo aún
en ausencia de agonistas. Es sabido que estos ligandos se unen y estabilizan
preferencialmente la conformación inactiva de los receptores, sin embargo,
aún no se sabe con exactitud si esta característica es esencial para que los
ligandos ejerzan sus acciones farmacológicas. Desde el momento de
implementación de estas drogas hasta la actualidad, varios conceptos han
cambiado incluyendo el de eficacia pluridimensional de los ligandos y
regulación cruzada entre GPCRs, dirigiendo a la investigación hacia el
descubrimiento de nuevos aspectos relacionados al mecanismo de acción de
dichos ligandos.
Hasta el momento, es sabido que los antihistamínicos H1 y H2
interfieren con la respuesta de otros GPCRs acoplados a la misma vía de
señalización (misma proteína G). Por ejemplo, el antihistamínico H2,
tiotidina, modifica la señalización de otros GPCRs acoplados a proteína Gαs,
como los receptores β2AR, calcitonina y PGE2, a través de su interacción con
el rH2. De la misma manera, se ha reportado que mepiramina a través del
rH1 interfiere con la señalización del receptor ATP acoplado a proteína Gαq.
Estos ligandos estabilizan una conformación del receptor que, a pesar de ser
inactiva, es capaz de acoplar y reclutar a la proteína G, logrando que se
encuentre menos disponible para otros receptores que señalizan a través de
la misma vía (Monczor et al., 2003; Tubio et al., 2010).
Discusión
115
En este trabajo de tesis describimos otro tipo de interferencia ejercida
por los antihistaminicos H1 y H2, involucrando a receptores acoplados a
diferentes proteinas G (rH1-Gαq, rH2-Gαs) y puntualizamos en el
mecanismo de internalización cruzada. Esta interferencia promueve la
desensibilización cruzada de los receptores y presenta consecuencias sobre
la respuesta celular a la histamina. En línea con lo anterior, demostramos
que el tratamiento con el agonista H1 como única droga o en combinación
con antihistamínicos H2 específicos determinan en última instancia si las
células U937 van a dirigirse hacia un arresto del ciclo celular/apoptosis o si
continúan con el ciclo (Fig. 22, 23 y 24). Más aun, determinamos que la
respuesta proinflamatoria mediada por el rH1 se encuentra igualmente
afectada por la presencia de los antihistamínicos H2, evaluada a través de la
activación de genes endógenos en diferentes sistemas (Fig. 19, 20 y 21). Por
otro lado, demostramos que los antihistamínicos H1 interfieren con la
respuesta del rH2 a su agonista (Fig. 15, 16 y 17). Resulta importante
destacar que las concentraciones de antihistamínicos utilizadas en este
trabajo para describir la regulación cruzada, son similares a las utilizadas
para antagonizar a su propio receptor. Estudios farmacocinéticos realizados
en pacientes adultos, luego de la administración oral de una dosis de
ceterizina (10mg/día), reportaron una máxima concentración en plasma
sanguíneo de 311ng/ml. Nuestros estudios demuestran que la IC50 de
ceterizina necesaria para lograr la desensibilización del rH2 fue de 0,43µM,
equivalente a 170ng/ml (Fig. 15B), por lo que resultaría de relevancia
clínica.
Diversos GPCRs regulan sus funciones a través de la cointernalización,
la cual explica la desensibilización cruzada de la señalización entre los
receptores de somatostatina 2A/opioides y receptores adenosina
A2A/dopamina D2, e incluso pueden dar origen a nuevas vías de
señalización intracelulares (Hillion et al., 2002; Pfeiffer et al., 2002). En este
sentido, Smith y colaboradores describieron que la cointernalización del
Discusión
116
heterodímero formado por el receptor 4 activado por proteasa (PAR4) y el
receptor purinérgico P2Y12 es necesaria para el reclutamiento de β-Arr y la
activación de Akt (Smith et al., 2017). Por otra parte, hemos descripto
previamente que los rH1 y rH2 cointernalizan y heterodimerizan luego del
estímulo con agonistas, aunque en este caso, la cointernalización de los
receptores no es el único mecanismo de la desensibilización heteróloga
(Alonso et al., 2013).
Los antihistamínicos H2 (cimetidina, ranitidina y famotidina) han
demostrado la capacidad de inducir la internalización del rH2 como parte de
su eficacia pluripotencial de manera dependiente de arrestina y dinamina
(Alonso et al., 2014). En este trabajo de tesis, aportamos por primera vez
evidencia acerca de la capacidad de los antihistamínicos H1 de internalizar a
su propio receptor. En línea con este hallazgo, ceterizina indujo la
internalización del rH1, tanto en células que expresan endógenamente este
receptor (U937), como en un sistema de sobreexpresión (HEK293-rH1 y
HEK293-rH1-rH2). Más aún, en relación a la regulación cruzada entre los
rH1 y rH2, describimos una nueva eficacia para varios de los
antihistamínicos H1 y H2, dado que inducen la internalización cruzada de
ambos receptores, interfiriendo en sus cascadas de señalización (Fig. 26, 27
y 28).
Al igual que la cointernalización de los GPCRs, el tráfico intracelular
resulta crucial para regular aspectos espaciales y temporales que tienen
relación con la respuesta del receptor. De esta manera, la regulación de la
expresión de los receptores en la superficie celular permite que las señales
intracelulares mediadas por un ligando posean la magnitud, duración y
especificidad adecuadas. En línea con lo anterior, en líneas celulares CHO-K1
y HEK293 que fueron transfectadas con un sólo receptor (rH1 o rH2), ha
sido reportado que la internalización de los mismos inducida por su agonista
involucra un mecanismo dependiente de clatrina. Una vez internalizado, el
rH1 es degradado en el interior celular en lisosomas, mientras que el rH2 es
Discusión
117
reciclado a la membrana plasmática luego de su desfosforilación (Fernandez
et al., 2008; Hishinuma et al., 2010). Por otra parte, estudios previos del
laboratorio permitieron determinar que los antihistamínicos H2 son capaces
de internalizar al rH2 utilizando la misma maquinaria endocítica que el
agonista H2, aunque el tráfico/destino del receptor difiere
considerablemente. En este sentido, los rH2 internalizados por el estímulo
con amtamina son reciclados a la membrana plasmática, mientras que el
tratamiento con antihistamínicos H2 dirige a los receptores a la degradación
en lisosomas en el citosol, requiriendo de la síntesis de novo para la
recuperación de nuevos sitios “sensibles” en la superficie celular (Alonso et
al., 2014; Fernandez et al., 2008).
En esta oportunidad, nos enfocamos en determinar el destino de los
rH1 una vez endocitados por la acción del agonista H2 o de los
antihistamínicos H2. Nuestros resultados, utilizando células HEK293
transfectadas con ambos receptores, mostraron que una vez internalizados
por acción de amtamina, los sitios de unión del rH1 son reciclados a la
membrana plasmática, mientras que la acción de los antihistamínicos H2
conduce a los receptores a la degradación, siendo la síntesis de novo el
mecanismo por el cual los rH1 resensibilizan (Fig. 31 y 32). Estos resultados
determinan que el mecanismo involucrado en el tráfico/destino de los rH1
en el interior celular depende del ligando H2 que desencadene la
internalización. Es posible que, el mecanismo que determina el destino de
los rH2 dependa, al igual que el destino de los rH1, del ligando H1 (agonista
o agonista inverso) que promueve su internalización. Así, podríamos pensar
que los rH2 internalizados por los antihistamínicos H1 (Fig. 26B) podrían
ser dirigidos a lisosomas para su degradación o ser reciclados a la
membrana plasmática.
Dado que los agonistas promueven la cointernalización de los rH1 y
rH2, acompañada de la formación de heterodímeros rH1/rH2, no podemos
descartar la existencia de estos complejos al producirse la cointernalización
Discusión
118
por acción de los ligandos antihistamínicos. Futuros ensayos, tanto en
sistemas de sobreexpresión como de expresión endógena de los receptores,
serán necesarios para dilucidar este hecho.
3. Importancia de la regulación cruzada entre los rH1 y rH2 para el
manejo terapéutico de los antihistamínicos: implicancias en el
reposicionamiento y efectos adversos
La incorporación de un nuevo fármaco al sistema biomédico es el
resultado de un proceso largo, complejo y extremadamente costoso que
lleva entre 13 y 15 años y entre 2 y 3 mil millones de dólares en promedio
(Monczor and Fernandez, 2016). En los últimos años, el reposicionamiento
de drogas bien caracterizadas y toleradas, o el descubrimiento de nuevas
indicaciones para fármacos ya conocidos por sus efectos clásicos, cumple un
papel muy importante en la búsqueda de nuevos tratamientos para
enfermedades, dado que insume menos tiempo y resulta más económico. De
esta manera, reposicionar a los ligandos histaminérgicos resulta una idea
prometedora ya que la histamina ejerce una variedad de acciones a través
del cuerpo y los antihistamínicos de los rH1 y rH2 son fármacos de venta
libre, con buenos perfiles de seguridad y sin protección de patente, lo que los
hace excelentes candidatos para su utilización para otras patologías.
Como se mencionó en la introducción, nuevas aplicaciones clínicas de
los antihistamínicos H1 están siendo estudiadas para tratar diferentes
situaciones patológicas, actuando como únicas drogas o en combinación con
otros fármacos comúnmente utilizados, como los glucocorticoides. De la
misma manera, estudios prometedores de los antihistamínicos H2 se
encuentran en potencial desarrollo para su utilización en diferentes terapias
relacionadas al cáncer y a enfermedades cardiovasculares, como la
insuficiencia cardíaca crónica (ICC,) entre otras. Por este motivo y para
lograr una visión más profunda de la acción de los ligandos antihistamínicos
en nuevas situaciones patológicas, resulta importante conocer en detalle los
Discusión
119
mecanismos de acción de los mismos, entre los que se encuentra el crosstalk
entre los rH1 y rH2.
Según se detalla en la introducción, en trabajos anteriores hemos
descripto que los agonistas H1 y H2 interfieren con la respuesta del otro
receptor a su agonista. Esta regulación cruzada forma parte de un fino
mecanismo que regula la respuesta final a histamina y ha sido descripta
tanto en sistemas nativos (células U937) como recombinantes (HEK293 que
sobreexpresan ambos receptores) (Alonso et al., 2013). En este trabajo,
demostramos que la desensibilización heteróloga inducida por los agonistas
de los rH1 y rH2 también influye en la respuesta de los antihistamínicos H1
y H2. Es así que la activación de cualquiera de los receptores modifica de
forma cruzada la respuesta inducida por los antihistamínicos H1 y H2 en
diferentes sistemas. Por un lado, utilizando HEK293 transfectadas con los
rH1 y rH2 o monocitos activados con LPS (U937 diferenciados con PMA),
observamos que la respuesta antiinflamatoria mediada por el rH1 se ve
afectada por la activación del rH2. En este aspecto, el efecto de los
antihistamínicos H1 evaluado a través de la disminución basal del gen
reportero de IL-6-Luc como también la reducción en los niveles de expresión
de ARNm de COX-2 e IL-8, resultó menos pronunciado cuando el rH2 fue
activado por amtamina (Fig. 11 y 12). Por otro lado, y al igual que lo
observado para la respuesta antiinflamatoria, la activación específica del
rH1 afecta a la respuesta mediada por los antihistamínicos H2. Así, en líneas
celulares de expresión heteróloga y endógena de ambos receptores, el
pretratamiento durante 30 min con el agonista H1 reduce el efecto de los
antihistamínicos H2 sobre la respuesta de AMPc (Fig. 13 y 14). A través de
los resultados obtenidos, aportamos evidencias de cómo la eficacia de los
antihistamínicos H1 y H2 se encuentra afectada por la presencia y activación
del otro subtipo de receptor a histamina. Esta desensibilización heteróloga
puede explicar el hecho de que los antihistamínicos presenten diferentes
eficacias en diferentes tipos celulares/tejidos. Por consiguiente, resulta
Discusión
120
crucial considerar no sólo la selectividad, afinidad y el tiempo de residencia
de dichos ligandos al momento de utilizarlos como fármacos
específicamente dirigidos hacia un receptor particular, sino también evaluar
los niveles de expresión de ambos receptores y la posible existencia de un
crosstalk entre ellos como factores clave para lograr obtener el efecto clínico
deseado.
Resulta interesante notar que la estequiometría de los receptores
podrá influir también sobre la regulación cruzada inducida por los
antihistamínicos, a nivel de la respuesta de los agonistas. Los ensayos
llevados a cabo en los clones F5 derivados de la línea U937, demuestran que
la sobreexpresión del rH1 potencia la desensibilización de los
antihistamínicos H1 sobre la respuesta del rH2, comparada a la observada
en las células U937 (Fig. 18).
Dado el interés en el reposicionamiento de antihistamínicos H2 para
la ICC y la escasa información acerca de los efectos de la histamina en los
diferentes tipos celulares del tejido cardíaco, analizamos el efecto del
crosstalk entre los rH1 y rH2 en cardiomiocitos con el fin de evaluar si los
efectos benéficos del uso de los antihistamínicos H2 podía estar relacionado
en parte a la modulación negativa sobre los rH1. Para ello, utilizamos la línea
celular de cardiomiocitos de ratón HL1, la cual expresa ambos receptores.
Los resultados obtenidos en estas células demostraron que, en presencia de
ranitidina y famotidina, la inducción de la expresión de la citoquina
proinflamatoria IL-6 por el agonista H1 es menos pronunciada, comparada
con las células control (Fig. 21). En vista que las citoquinas inflamatorias
influyen en el desarrollo de patologías cardíacas, podríamos inferir que los
efectos benéficos descriptos para los antihistamínicos H2 en diferentes
trabajos relacionados a la progresión de la ICC, son logrados, al menos en
parte, por la desensibilización e internalización cruzada existente entre los
rH1 y rH2. Estos resultados que aportan información relevante acerca del
Discusión
121
mecanismo de acción de los antihistaminicos H2 en el tejido cardíaco,
merecen ser profundizados en el futuro.
En la actualidad, muchos ligandos pueden unirse e interactuar con
receptores que no son su objetivo previsto (lo que se conoce como unión
“off-target”) y activar nuevas vías de señalización que dan lugar a eficacias
terapéuticas positivas o bien pueden explicar sus efectos adversos (Edwards
and Aronson, 2000; Guengerich, 2011). Ésta heterogeneidad funcional ha
sido descripta para los ligandos antihistamínicos H1 y H2. Por ejemplo, ha
sido observado que algunos antihistamínicos H1 poseen propiedades anti-
filovirus. Es así como difenhidramina (Benadril) y clorciclicina (Ahist) son
candidatos potenciales a ser reposicionados como agentes anti-filovirus, ya
que ejercen sus efectos a través de un mecanismo que no involucra su unión
al rH1, sino a través de un blanco intracelular aún no descripto (Schafer et
al., 2018). Por otra parte, cimetidina (antihistamínico H2) ha demostrado
tener efectos antiproliferativos y apoptóticos en ensayos in vitro llevados a
cabo en la línea celular de cáncer colorrectal humano Caco-2, los cuales no
se encuentran relacionados a su vía de señalización a través del rH2
(Rajendra et al., 2004).
Resulta importante mencionar que los efectos del crosstalk inducido
por los ligandos tanto agonistas como agonistas inversos H1 yH2 descriptos
en este trabajo son efectos “on-target”, o sea que se producen por la unión de
los ligandos a sus receptores. En varios ensayos demostramos que si el
receptor no está presente, la interferencia hacia el otro receptor no ocurre
(Fig. 11B, 13B y 17A).
Como se discutió anteriormente, el crosstalk entre los rH1 y rH2
podría contribuir a los efectos benéficos de los antihistamínicos H2 en las
patologías cardíacas y a su vez explicar efectos no deseados de estas drogas
en otros tejidos. En este sentido, Allen y colaboradores reportaron una
reacción anafiláctica en una mujer de 19 años con síndrome de activación de
mastocitos, síndrome de hipermovilidad de Ehlers-Danlos y síndrome de
Discusión
122
taquicardia postural, al cesar la administración de una dosis alta de
ranitidina (Allen et al., 2018). Los autores sugieren que los pacientes que
toman ranitidina, una vez retirada, pueden sufrir un efecto exacerbado
causado por la histamina endógena debido a la upregulación del rH2 en
membrana y además de la histamina inducida por la enzima histidina
descarboxilasa, lo cual está en concordancia con resultados previos
realizados in vitro (Alonso et al., 2015; Monczor and Fernandez, 2016; Smit
et al., 1996). Considerando los resultados obtenidos en esta tesis, sería
factible pensar que, de la misma manera que la internalización sostenida del
rH2 lleva a una upregulación de sus niveles, la internalización cruzada del
rH1 por el tratamiento con ranitidina podría también ocasionar una
upregulación del rH1, lo cual explicaría la reacción anafiláctica observada
luego de dejar el tratamiento con ranitidina.
En conjunto, nuestros resultados sostienen que la regulación cruzada
entre los rH1 y rH2 no se restringe únicamente a ligandos agonistas e
impacta profundamente en el tratamiento con antihistamínicos H1 y H2.
Asimismo, los antihistamínicos H1 y H2 inducen la internalización cruzada
de los receptores, siendo éste el mecanismo responsable de la regulación
cruzada.
Teniendo en cuenta la cantidad de tipos celulares en diferentes tejidos
que expresan a los rH1 y rH2, el amplio uso de los antihistamínicos en la
clínica para el tratamiento de diversas enfermedades y el avance en el
reposicionamiento de medicamentos, la correcta caracterización de los
mecanismos de acción de estos ligandos permitirá crear nuevas estrategias
terapéuticas con el objetivo de aumentar su eficacia y evitar o reinterpretar
sus efectos secundarios, como también atribuirle nuevos usos clínicos.
Referencias
123
REFERENCIAS
Referencias
124
Akdis, C.A., Simons, F.E.R., 2006. Histamine receptors are hot in immunopharmacology. Eur. J. Pharmacol. 533, 69–76. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2005.12.044
Alexander, S.P., Christopoulos, A., Davenport, A.P., Kelly, E., Marrion, N. V, Peters, J.A., Faccenda, E., Harding, S.D., Pawson, A.J., Sharman, J.L., Southan, C., Davies, J.A., CGTP Collaborators, 2017. THE CONCISE GUIDE TO PHARMACOLOGY 2017/18: G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 174, S17–S129. https://doi.org/10.1111/bph.13878
Allen, S.J., Chazot, P.L., Dixon, C.J., 2018. Can H2 -receptor upregulation and raised histamine explain an anaphylactoid reaction on cessation of ranitidine in a 19-year-old female? A case report. Br. J. Clin. Pharmacol. 84, 1611–1616. https://doi.org/10.1111/bcp.13578
Alonso, N., Fernandez, N., Notcovich, C., Monczor, F., Simaan, M., Baldi, A., Gutkind, J.S., Davio, C., Shayo, C., 2013. Cross-Desensitization and Cointernalization of H1 and H2 Histamine Receptors Reveal New Insights into Histamine Signal Integration. Mol. Pharmacol. 83, 1087–1098. https://doi.org/10.1124/mol.112.083394
Alonso, N., Monczor, F., Echeverría, E., Davio, C., Shayo, C., Fernández, N., 2014. Signal transduction mechanism of biased ligands at histamine H 2 receptors. Biochem. J. 459, 117–126. https://doi.org/10.1042/BJ20131226
Alonso, N., Zappia, C.D., Cabrera, M., Davio, C.A., Shayo, C., Monczor, F., Fernández, N.C., 2015. Physiological implications of biased signaling at histamine H2 receptors. Front. Pharmacol. 6, 45. https://doi.org/10.3389/fphar.2015.00045
Anborgh, P.H., Seachrist, J.L., Dale, L.B., Ferguson, S.S.G., 2000. Receptor/β-Arrestin Complex Formation and the Differential Trafficking and Resensitization of β2-Adrenergic and Angiotensin II Type 1A Receptors. Mol. Endocrinol. 14, 2040–2053. https://doi.org/10.1210/mend.14.12.0565
Arrang, J.M., Garbarg, M., Schwartz, J.C., 1983. Auto-inhibition of brain histamine release mediated by a novel class (H3) of histamine receptor. Nature 302, 832–7.
Asako, H., Kurose, I., Wolf, R., DeFrees, S., Zheng, Z.L., Phillips, M.L., Paulson, J.C., Granger, D.N., 1994. Role of H1 receptors and P-selectin in histamine-induced leukocyte rolling and adhesion in postcapillary venules. J. Clin. Invest. 93, 1508–15. https://doi.org/10.1172/JCI117129
Ash, A.S., Schild, H.O., 1966. Receptors mediating some actions of histamine. Br. J. Pharmacol. Chemother. 27, 427–39.
Aurelius, J., Martner, A., Brune, M., Palmqvist, L., Hansson, M., Hellstrand, K., Thoren, F.B., 2012. Remission maintenance in acute myeloid leukemia: impact of functional histamine H2 receptors expressed by leukemic cells. Haematologica 97, 1904–1908. https://doi.org/10.3324/haematol.2012.066399
Bakker, R.A., Dees, G., Carrillo, J.J., Booth, R.G., López-Gimenez, J.F., Milligan, G., Strange, P.G., Leurs, R., 2004. Domain Swapping in the Human Histamine H1 Receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 311, 131–138. https://doi.org/10.1124/jpet.104.067041
Bakker, R.A., Schoonus, S.B., Smit, M.J., Timmerman, H., Leurs, R., 2001. Histamine H(1)-receptor activation of nuclear factor-kappa B: roles for G beta gamma- and G alpha(q/11)-subunits in constitutive and agonist-mediated signaling.
Referencias
125
Mol. Pharmacol. 60, 1133–42. Barnes, P.J., 1991. Histamine receptors in the lung. Agents Actions. Suppl. 33, 103–
22. Benovic, J.L., Pike, L.J., Cerione, R.A., Staniszewski, C., Yoshimasa, T., Codina, J.,
Caron, M.G., Lefkowitz, R.J., 1985. Phosphorylation of the mammalian beta-adrenergic receptor by cyclic AMP-dependent protein kinase. Regulation of the rate of receptor phosphorylation and dephosphorylation by agonist occupancy and effects on coupling of the receptor to the stimulatory guanine nucleotide regulatory protein. J. Biol. Chem. 260, 7094–101.
Benovic, J.L., Strasser, R.H., Caron, M.G., Lefkowitz, R.J., 1986. Beta-adrenergic receptor kinase: identification of a novel protein kinase that phosphorylates the agonist-occupied form of the receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, 2797–801.
Berardi, R.R., Tankanow, R.M., Nostrant, T.T., 1988. Comparison of famotidine with cimetidine and ranitidine. Clin. Pharm. 7, 271–84.
Bergmann, U., Scheffer, J., Köller, M., Schönfeld, W., Erbs, G., Müller, F.E., König, W., 1989. Induction of inflammatory mediators (histamine and leukotrienes) from rat peritoneal mast cells and human granulocytes by Pseudomonas aeruginosa strains from burn patients. Infect. Immun. 57, 2187–95.
Berridge, M.J., 1993. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature 361, 315–325. https://doi.org/10.1038/361315a0
Birnbaumer, L., 2007. Expansion of signal transduction by G proteins. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1768, 772–793. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2006.12.002
Black, J.W., Duncan, W.A., Durant, C.J., Ganellin, C.R., Parsons, E.M., 1972. Definition and antagonism of histamine H 2 -receptors. Nature 236, 385–90.
Bologna, Z., Teoh, J.-P., Bayoumi, A.S., Tang, Y., Kim, I.-M., 2017. Biased G Protein-Coupled Receptor Signaling: New Player in Modulating Physiology and Pathology. Biomol. Ther. (Seoul). 25, 12–25. https://doi.org/10.4062/biomolther.2016.165
Bongers, G., Bakker, R.A., Leurs, R., 2007. Molecular aspects of the histamine H3 receptor. Biochem. Pharmacol. 73, 1195–1204. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2007.01.008
Bouvier, M., Hausdorff, W.P., Blasi, A. De, O’Dowd, B.F., Kobilka, B.K., Caron, M.G., Lefkowitz, R.J., 1988. Removal of phosphorylation sites from the β2-adrenergic receptor delays onset of agonist-promoted desensitization. Nature 333, 370–373. https://doi.org/10.1038/333370a0
Bowrey, P.F., King, J., Magarey, C., Schwartz, P., Marr, P., Bolton, E., Morris, D.L., 2000. Histamine, mast cells and tumour cell proliferation in breast cancer: does preoperative cimetidine administration have an effect? Br. J. Cancer 82, 167–170. https://doi.org/10.1054/bjoc.1999.0895
Bradshaw, J., Brittain, R.T., Clitherow, J.W., Daly, M.J., Jack, D., Price, B.J., Stables, R., 1979. Ranitidine (AH 19065): a new potent, selective histamine H2-receptor antagonist [proceedings]. Br. J. Pharmacol. 66, 464P.
Breitwieser, G.E., 2004. G Protein–Coupled Receptor Oligomerization. Circ. Res. 94, 17–27. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000110420.68526.19
Brown, D.A., London, E., 1998. Functions of lipids rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111–136. https://doi.org/10.1146/annurev.cellbio.14.1.111
Referencias
126
Brown, T., Armitage, M., Blakemore, R., Blurton, P., Durant, G., Ganellin, C., Ife, R., Parsons, M., Rawlings, D., Slingsby, B., 1990. Isocytosine H2-receptor histamine antagonists. III. The synthesis and biological activity of lupitidine (SK&F 93479) and related compounds. Eur. J. Med. Chem. 25, 217–226. https://doi.org/10.1016/0223-5234(90)90204-G
Busillo, J.M., Armando, S., Sengupta, R., Meucci, O., Bouvier, M., Benovic, J.L., 2010. Site-specific Phosphorylation of CXCR4 Is Dynamically Regulated by Multiple Kinases and Results in Differential Modulation of CXCR4 Signaling. J. Biol. Chem. 285, 7805–7817. https://doi.org/10.1074/jbc.M109.091173
Buyse, M., Michiels, S., Squifflet, P., Lucchesi, K.J., Hellstrand, K., Brune, M.L., Castaigne, S., Rowe, J.M., 2011. Leukemia-free survival as a surrogate end point for overall survival in the evaluation of maintenance therapy for patients with acute myeloid leukemia in complete remission. Haematologica 96, 1106–1112. https://doi.org/10.3324/haematol.2010.039131
Cabrera-Vera, T.M., Vanhauwe, J., Thomas, T.O., Medkova, M., Preininger, A., Mazzoni, M.R., Hamm, H.E., 2003. Insights into G Protein Structure, Function, and Regulation. Endocr. Rev. 24, 765–781. https://doi.org/10.1210/er.2000-0026
Cadman, E.D., Witte, D.G., Lee, C.M., 1994. Regulation of the release of interleukin-6 from human astrocytoma cells. J. Neurochem. 63, 980–7.
Carrillo, J.J., Pediani, J., Milligan, G., 2003. Dimers of Class A G Protein-coupled Receptors Function via Agonist-mediated Trans-activation of Associated G Proteins. J. Biol. Chem. 278, 42578–42587. https://doi.org/10.1074/jbc.M306165200
Cerrato, B.D., Carretero, O.A., Janic, B., Grecco, H.E., Gironacci, M.M., 2016. Heteromerization Between the Bradykinin B2 Receptor and the Angiotensin-(1-7) Mas Receptor: Functional Consequences. Hypertens. (Dallas, Tex. 1979) 68, 1039–48. https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.116.07874
Chee, S.-S.A., Menard, J.L., 2013. The histaminergic H1, H2, and H3 receptors of the lateral septum differentially mediate the anxiolytic-like effects of histamine on rats’ defensive behaviors in the elevated plus maze and novelty-induced suppression of feeding paradigm. Physiol. Behav. 116–117, 66–74. https://doi.org/10.1016/j.physbeh.2013.03.016
Chen, J., Makino, C.L., Peachey, N.S., Baylor, D.A., Simon, M.I., 1995. Mechanisms of rhodopsin inactivation in vivo as revealed by a COOH-terminal truncation mutant. Science 267, 374–7.
Chu, J., Zheng, H., Loh, H.H., Law, P.-Y., 2008. Morphine-induced μ-opioid receptor rapid desensitization is independent of receptor phosphorylation and β-arrestins. Cell. Signal. 20, 1616–1624. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2008.05.004
Chuang, T.T., Iacovelli, L., Sallese, M., De Blasi, A., 1996. G protein-coupled receptors: heterologous regulation of homologous desensitization and its implications. Trends Pharmacol. Sci. 17, 416–21.
Church, M.K., 2016. Allergy, Histamine and Antihistamines. https://doi.org/10.1007/164_2016_85
Claing, A., Perry, S.J., Achiriloaie, M., Walker, J.K., Albanesi, J.P., Lefkowitz, R.J., Premont, R.T., 2000. Multiple endocytic pathways of G protein-coupled receptors delineated by GIT1 sensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 1119–24.
Referencias
127
Clark, R.B., Kunkel, M.W., Friedman, J., Goka, T.J., Johnson, J.A., 1988. Activation of cAMP-dependent protein kinase is required for heterologous desensitization of adenylyl cyclase in S49 wild-type lymphoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 1442–6.
Cooper, D.M.F., Mons, N., Karpen, J.W., 1995. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature 374, 421–424. https://doi.org/10.1038/374421a0
Costa-Neto, C.M., Parreiras-E-Silva, L.T., Bouvier, M., 2016. A Pluridimensional View of Biased Agonism. Mol. Pharmacol. 90, 587–595. https://doi.org/10.1124/mol.116.105940
Costa, T., Herz, A., 1989. Antagonists with negative intrinsic activity at delta opioid receptors coupled to GTP-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 7321–5.
Dalle, S., Imamura, T., Rose, D.W., Worrall, D.S., Ugi, S., Hupfeld, C.J., Olefsky, J.M., 2002. Insulin induces heterologous desensitization of G-protein-coupled receptor and insulin-like growth factor I signaling by downregulating beta-arrestin-1. Mol. Cell. Biol. 22, 6272–85.
Dana, P., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R., Matsuda, K., Wongkham, S., Okada, S., 2017. Repurposing cimetidine for cholangiocarcinoma: Antitumor effects in vitro and in vivo. Oncol. Lett. 13, 1432–1436. https://doi.org/10.3892/ol.2017.5563
Davio, C., Baldi, A., Mladovan, A., Cricco, G., Fitzsimons, C., Bergoc, R., Rivera, E., 1995a. Expression of histamine receptors in different cell lines derived from mammary gland and human breast carcinomas. Inflamm. Res. 44 Suppl 1, S70-1.
Davio, C., Baldi, A., Shayo, C., Brodsky, A., Cricco, G., Bergoc, R., Rivera, E., 1995b. H1 and H2 histamine receptors in histiocytic lymphoma cell line U-937. Inflamm. Res. 44 Suppl 1, S72-3.
Davio, C.A., Cricco, G.P., Bergoc, R.M., Rivera, E.S., 1995. H1 and H2 histamine receptors in N-nitroso-N-methylurea (NMU)-induced carcinomas with atypical coupling to signal transducers. Biochem. Pharmacol. 50, 91–6.
Day, P.W., Wedegaertner, P.B., Benovic, J.L., 2004. Analysis of G-Protein-Coupled Receptor Kinase RGS Homology Domains, in: Methods in Enzymology. pp. 295–310. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(04)90019-5
De Backer, M.D., Gommeren, W., Moereels, H., Nobels, G., Van Gompel, P., Leysen, J.E., Luyten, W.H., 1993. Genomic cloning, heterologous expression and pharmacological characterization of a human histamine H1 receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, 1601–8.
Deesch, I., Thurmond, R., Jongejan, A., Leurs, R., 2005. The histamine H4 receptor as a new therapeutic target for inflammation. Trends Pharmacol. Sci. 26, 462–9. https://doi.org/10.1016/j.tips.2005.07.002
Del Valle, J., Gantz, I., 1997. Novel insights into histamine H2 receptor biology. Am. J. Physiol. 273, G987-96.
Delneste, Y., Lassalle, P., Jeannin, P., Joseph, M., Tonnel, A.B., Gosset, P., 1994. Histamine induces IL-6 production by human endothelial cells. Clin. Exp. Immunol. 98, 344–9.
Dhami, G.K., Anborgh, P.H., Dale, L.B., Sterne-Marr, R., Ferguson, S.S.G., 2002. Phosphorylation-independent regulation of metabotropic glutamate receptor signaling by G protein-coupled receptor kinase 2. J. Biol. Chem. 277, 25266–
Referencias
128
72. https://doi.org/10.1074/jbc.M203593200 Dhami, G.K., Babwah, A. V., Sterne-Marr, R., Ferguson, S.S.G., 2005.
Phosphorylation-independent Regulation of Metabotropic Glutamate Receptor 1 Signaling Requires G Protein-coupled Receptor Kinase 2 Binding to the Second Intracellular Loop. J. Biol. Chem. 280, 24420–24427. https://doi.org/10.1074/jbc.M501650200
Dicker, F., Quitterer, U., Winstel, R., Honold, K., Lohse, M.J., 1999. Phosphorylation-independent inhibition of parathyroid hormone receptor signaling by G protein-coupled receptor kinases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 5476–81.
Diviani, D., Lattion, A.L., Larbi, N., Kunapuli, P., Pronin, A., Benovic, J.L., Cotecchia, S., 1996. Effect of different G protein-coupled receptor kinases on phosphorylation and desensitization of the alpha1B-adrenergic receptor. J. Biol. Chem. 271, 5049–58.
Dobrilla, G., de Pretis, G., Chilovi, F., Comberlato, M., 1989. Oxmetidine in the short term treatment of active duodenal ulcer. A review and commentary. Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 167, 71–80.
Dodge, K.L., Sanborn, B.M., 1998. Evidence for Inhibition by Protein Kinase A of Receptor/Gαq /Phospholipase C (PLC) Coupling by a Mechanism Not Involving PLCβ2. Endocrinology 139, 2265–2271. https://doi.org/10.1210/endo.139.5.5963
Doll, C., Pöll, F., Peuker, K., Loktev, A., Glück, L., Schulz, S., 2012. Deciphering µ-opioid receptor phosphorylation and dephosphorylation in HEK293 cells. Br. J. Pharmacol. 167, 1259–1270. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2012.02080.x
Dong, H., Zhang, W., Zeng, X., Hu, G., Zhang, H., He, S., Zhang, S., 2014. Histamine induces upregulated expression of histamine receptors and increases release of inflammatory mediators from microglia. Mol. Neurobiol. 49, 1487–500. https://doi.org/10.1007/s12035-014-8697-6
Drutel, G., Peitsaro, N., Karlstedt, K., Wieland, K., Smit, M.J., Timmerman, H., Panula, P., Leurs, R., 2001. Identification of rat H3 receptor isoforms with different brain expression and signaling properties. Mol. Pharmacol. 59, 1–8.
Eckel, L., Gristwood, R.W., Nawrath, H., Owen, D.A., Satter, P., 1982. Inotropic and electrophysiological effects of histamine on human ventricular heart muscle. J. Physiol. 330, 111–23.
Edwards, I.R., Aronson, J.K., 2000. Adverse drug reactions: definitions, diagnosis, and management. Lancet 356, 1255–1259. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(00)02799-9
Eglen, R.M., Bosse, R., Reisine, T., 2007. Emerging Concepts of Guanine Nucleotide-Binding Protein-Coupled Receptor (GPCR) Function and Implications for High Throughput Screening. Assay Drug Dev. Technol. 5, 425–452. https://doi.org/10.1089/adt.2007.062
Emanuel, M.B., 1999. Histamine and the antiallergic antihistamines: a history of their discoveries. Clin. Exp. Allergy 29, 1–11. https://doi.org/10.1046/j.1365-2222.1999.00004.x-i1
Ferguson, S.S., 2001. Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis: the role in receptor desensitization and signaling. Pharmacol. Rev. 53, 1–24.
Fernandez, N., Gottardo, F.L., Alonso, M.N., Monczor, F., Shayo, C., Davio, C., 2011. Roles of Phosphorylation-dependent and -independent Mechanisms in the Regulation of Histamine H2 Receptor by G Protein-coupled Receptor Kinase 2.
Referencias
129
J. Biol. Chem. 286, 28697–28706. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.269613 Fernandez, N., Monczor, F., Baldi, A., Davio, C., Shayo, C., 2008. Histamine H2
Receptor Trafficking: Role of Arrestin, Dynamin, and Clathrin in Histamine H2 Receptor Internalization 74, 1109–1118. https://doi.org/10.1124/mol.108.045336.cumulation
Fernández, N., Monczor, F., Lemos, B., Notcovich, C., Baldi, A., Davio, C., Shayo, C., 2002. Reduction of G protein-coupled receptor kinase 2 expression in U-937 cells attenuates H2 histamine receptor desensitization and induces cell maturation. Mol. Pharmacol. 62, 1506–14.
Feron, O., Smith, T.W., Michel, T., Kelly, R.A., 1997. Dynamic targeting of the agonist-stimulated m2 muscarinic acetylcholine receptor to caveolae in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 17744–8.
Ferré, S., Casadó, V., Devi, L.A., Filizola, M., Jockers, R., Lohse, M.J., Milligan, G., Pin, J.-P., Guitart, X., 2014. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacol. Rev. 66, 413–34. https://doi.org/10.1124/pr.113.008052
Filipek, S., Krzysko, K.A., Fotiadis, D., Liang, Y., Saperstein, D.A., Engel, A., Palczewski, K., 2004. A concept for G protein activation by G protein-coupled receptor dimers: the transducin/rhodopsin interface. Photochem. Photobiol. Sci. 3, 628. https://doi.org/10.1039/b315661c
Filizola, M., Weinstein, H., 2002. Structural models for dimerization of G-protein coupled receptors: The opioid receptor homodimers. Biopolymers 66, 317–325. https://doi.org/10.1002/bip.10311
Fredriksson, R., 2003. The G-Protein-Coupled Receptors in the Human Genome Form Five Main Families. Phylogenetic Analysis, Paralogon Groups, and Fingerprints. Mol. Pharmacol. 63, 1256–1272. https://doi.org/10.1124/mol.63.6.1256
Fukushima, Y., Asano, T., Saitoh, T., Anai, M., Funaki, M., Ogihara, T., Katagiri, H., Matsuhashi, N., Yazaki, Y., Sugano, K., 1997. Oligomer formation of histamine H2 receptors expressed in Sf9 and COS7 cells. FEBS Lett. 409, 283–286. https://doi.org/10.1016/S0014-5793(97)00531-0
Gagnon, A.W., Kallal, L., Benovic, J.L., 1998. Role of clathrin-mediated endocytosis in agonist-induced down-regulation of the beta2-adrenergic receptor. J. Biol. Chem. 273, 6976–81.
Galandrin, S., Bouvier, M., 2006. Distinct Signaling Profiles of beta1 and beta2 Adrenergic Receptor Ligands toward Adenylyl Cyclase and Mitogen-Activated Protein Kinase Reveals the Pluridimensionality of Efficacy. Mol. Pharmacol. 70, 1575–1584. https://doi.org/10.1124/mol.106.026716
Galandrin, S., Oligny-Longpré, G., Bouvier, M., 2007. The evasive nature of drug efficacy: implications for drug discovery. Trends Pharmacol. Sci. 28, 423–430. https://doi.org/10.1016/j.tips.2007.06.005
Ganellin, R., 1981. 1980 Award in Medicinal Chemistry: Medicinal chemistry and dynamic structure-activity analysis in the discovery of drugs acting at histamine H2 receptors. J. Med. Chem. 24, 913–20.
Gantz, I., Munzert, G., Tashiro, T., Schäffer, M., Wang, L., DelValle, J., Yamada, T., 1991. Molecular cloning of the human histamine H2 receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 1386–92.
Gardner, L.A., Santos, N.M.D., Matta, S.G., Whitt, M.A., Bahouth, S.W., 2004. Role of the Cyclic AMP-dependent Protein Kinase in Homologous Resensitization of
Referencias
130
the β1-Adrenergic Receptor. J. Biol. Chem. 279, 21135–21143. https://doi.org/10.1074/jbc.M313652200
Gärtner, F., Seidel, T., Schulz, U., Gummert, J., Milting, H., 2013. Desensitization and Internalization of Endothelin Receptor A. J. Biol. Chem. 288, 32138–32148. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.461566
Gbahou, F., Rouleau, A., Arrang, J.-M., 2012. The histamine autoreceptor is a short isoform of the H3 receptor. Br. J. Pharmacol. 166, 1860–1871. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2012.01913.x
Gerthoffer, W.T., Solway, J., Camoretti-Mercado, B., 2013. Emerging targets for novel therapy of asthma. Curr. Opin. Pharmacol. 13, 324–30. https://doi.org/10.1016/j.coph.2013.04.002
Ghosh, C.C., Ramaswami, S., Juvekar, A., Vu, H.-Y., Galdieri, L., Davidson, D., Vancurova, I., 2010. Gene-specific repression of proinflammatory cytokines in stimulated human macrophages by nuclear IκBα. J. Immunol. 185, 3685–93. https://doi.org/10.4049/jimmunol.0902230
Gianlorenço, A.C.L., Serafim, K.R., Canto-de-Souza, A., Mattioli, R., 2014. Effect of histamine H1 and H2 receptor antagonists, microinjected into cerebellar vermis, on emotional memory consolidation in mice. Brazilian J. Med. Biol. Res. 47, 135–143. https://doi.org/10.1590/1414-431X20133429
Gillard, M., Van der Perren, C., Massingham, R., Chatelain, P., 2002. Binding characteristics of [3H]levocetirizine to cloned human H1-histamine-receptors expressed in CHO cells. Inflamm. Res. 51 Suppl 1, S77-8.
Gilman, A.G., 1970. A protein binding assay for adenosine 3’:5’-cyclic monophosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 67, 305–12.
Gong, K., Li, Z., Xu, M., Du, J., Lv, Z., Zhang, Y., 2008. A Novel Protein Kinase A-independent, β-Arrestin-1-dependent Signaling Pathway for p38 Mitogen-activated Protein Kinase Activation by β2-Adrenergic Receptors. J. Biol. Chem. 283, 29028–29036. https://doi.org/10.1074/jbc.M801313200
Grkovich, A., Johnson, C.A., Buczynski, M.W., Dennis, E.A., 2006. Lipopolysaccharide-induced cyclooxygenase-2 expression in human U937 macrophages is phosphatidic acid phosphohydrolase-1-dependent. J. Biol. Chem. 281, 32978–87. https://doi.org/10.1074/jbc.M605935200
Guengerich, F.P., 2011. Mechanisms of drug toxicity and relevance to pharmaceutical development. Drug Metab. Pharmacokinet. 26, 3–14.
Guimond, J., Mamarbachi, A.M., Allen, B.G., Rindt, H., Hébert, T.E., 2005. Role of specific protein kinase C isoforms in modulation of β1- and β2-adrenergic receptors. Cell. Signal. 17, 49–58. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2004.05.012
Haas, H.L., Sergeeva, O.A., Selbach, O., 2008. Histamine in the Nervous System. Physiol. Rev. 88, 1183–1241. https://doi.org/10.1152/physrev.00043.2007
Hague, C., Lee, S.E., Chen, Z., Prinster, S.C., Hall, R.A., Minneman, K.P., 2005. Heterodimers of 1B and 1D-adrenergic receptors form a single functional entity. Mol. Pharmacol. 69, 45–55. https://doi.org/10.1124/mol.105.014985
Han, S.-O., Kommaddi, R.P., Shenoy, S.K., 2012. Distinct roles for β-arrestin2 and arrestin-domain-containing proteins in β2 adrenergic receptor trafficking. EMBO Rep. 14, 164–171. https://doi.org/10.1038/embor.2012.187
Hattori, Y., 1999. Cardiac histamine receptors: their pharmacological consequences and signal transduction pathways. Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 21, 123–31.
Referencias
131
Hausdorff, W.P., Bouvier, M., O’Dowd, B.F., Irons, G.P., Caron, M.G., Lefkowitz, R.J., 1989. Phosphorylation sites on two domains of the beta 2-adrenergic receptor are involved in distinct pathways of receptor desensitization. J. Biol. Chem. 264, 12657–65.
Hebert, T.E., Moffett, S., Morello, J.P., Loisel, T.P., Bichet, D.G., Barret, C., Bouvier, M., 1996. A peptide derived from a beta2-adrenergic receptor transmembrane domain inhibits both receptor dimerization and activation. J. Biol. Chem. 271, 16384–92.
Heijink, I.H., Vellenga, E., Oostendorp, J., de Monchy, J.G.R., Postma, D.S., Kauffman, H.F., 2005. Exposure to TARC alters β2-adrenergic receptor signaling in human peripheral blood T lymphocytes. Am. J. Physiol. Cell. Mol. Physiol. 289, L53–L59. https://doi.org/10.1152/ajplung.00357.2004
Heng, B.C., Aubel, D., Fussenegger, M., 2013. An overview of the diverse roles of G-protein coupled receptors (GPCRs) in the pathophysiology of various human diseases. Biotechnol. Adv. 31, 1676–1694. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.08.017
Hernández-Angeles, A., Soria-Jasso, L.-E., Ortega, A., Arias-Montaño, J.-A., 2001. Histamine H1 Receptor Activation Stimulates Mitogenesis in Human Astrocytoma U373 MG Cells. J. Neurooncol. 55, 81–89. https://doi.org/10.1023/A:1013338515229
Hershcovici, T., Fass, R., 2011. Gastro-Oesophageal Reflux Disease: beyond proton pump inhibitor therapy. Drugs 71, 2381–2389. https://doi.org/10.2165/11597300-000000000-00000
Hill, S.J., 1992. Multiple histamine receptors: properties and functional characteristics. Biochem. Soc. Trans. 20, 122–5.
Hill, S.J., 1990. Distribution, properties, and functional characteristics of three classes of histamine receptor. Pharmacol. Rev. 42, 45–83.
Hill, S.J., Ganellin, C.R., Timmerman, H., Schwartz, J.C., Shankley, N.P., Young, J.M., Schunack, W., Levi, R., Haas, H.L., 1997. International Union of Pharmacology. XIII. Classification of histamine receptors. Pharmacol. Rev. 49, 253–78.
Hillion, J., Canals, M., Torvinen, M., Casadó, V., Scott, R., Terasmaa, A., Hansson, A., Watson, S., Olah, M.E., Mallol, J., Canela, E.I., Zoli, M., Agnati, L.F., Ibáñez, C.F., Lluis, C., Franco, R., Ferré, S., Fuxe, K., 2002. Coaggregation, Cointernalization, and Codesensitization of Adenosine A2A Receptors and Dopamine D2 Receptors. J. Biol. Chem. 277, 18091–18097. https://doi.org/10.1074/jbc.M107731200
Hishinuma, S., Komazaki, H., Fukui, H., Shoji, M., 2010. Ubiquitin/proteasome-dependent down-regulation following clathrin-mediated internalization of histamine H1-receptors in Chinese hamster ovary cells. J. Neurochem. 113, 990–1001. https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2010.06669.x
Hofstra, C.L., Desai, P.J., Thurmond, R.L., Fung-Leung, W.-P., 2003. Histamine H4 Receptor Mediates Chemotaxis and Calcium Mobilization of Mast Cells. J. Pharmacol. Exp. Ther. 305, 1212–1221. https://doi.org/10.1124/jpet.102.046581
Huang, R., Southall, N., Wang, Y., Yasgar, A., Shinn, P., Jadhav, A., Nguyen, D.-T., Austin, C.P., 2011. The NCGC Pharmaceutical Collection: A Comprehensive Resource of Clinically Approved Drugs Enabling Repurposing and Chemical Genomics. Sci. Transl. Med. 3, 80ps16-80ps16. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3001862
Referencias
132
Hur, J., Kang, M.-K., Park, J.-Y., Lee, S.-Y., Bae, Y.-S., Lee, S.-H., Park, Y.-M., Kwak, J.-Y., 2003. Pro-apoptotic effect of high concentrations of histamine on human neutrophils. Int. Immunopharmacol. 3, 1491–1502. https://doi.org/10.1016/S1567-5769(03)00162-0
IH Park, et al;, 2014. Histamine promotes the release of Interleukin-6 via H1R/p38 and NF-Kb pathways in nasal fibroblasts. Allergy Asthma Immunol Res. 6, 567–572. https://doi.org/10.4168/aair.2014.6.6.567
Imamura, T., Huang, J., Dalle, S., Ugi, S., Usui, I., Luttrell, L.M., Miller, W.E., Lefkowitz, R.J., Olefsky, J.M., 2001. β-Arrestin-mediated Recruitment of the Src Family Kinase Yes Mediates Endothelin-1-stimulated Glucose Transport. J. Biol. Chem. 276, 43663–43667. https://doi.org/10.1074/jbc.M105364200
Iwata, K., Luo, J., Penn, R.B., Benovic, J.L., 2005. Bimodal regulation of the human H1 histamine receptor by G protein-coupled receptor kinase 2. J. Biol. Chem. 280, 2197–204. https://doi.org/10.1074/jbc.M408834200
Jacobowitz, O., Chen, J., Premont, R.T., Iyengar, R., 1993. Stimulation of specific types of Gs-stimulated adenylyl cyclases by phorbol ester treatment. J. Biol. Chem. 268, 3829–32.
Jean-Charles, P.-Y., Snyder, J.C., Shenoy, S.K., 2016. Chapter One - Ubiquitination and Deubiquitination of G Protein-Coupled Receptors, in: Progress in Molecular Biology and Translational Science. pp. 1–55. https://doi.org/10.1016/bs.pmbts.2016.05.001
Jeannin, P., Delneste, Y., Gosset, P., Molet, S., Lassalle, P., Hamid, Q., Tsicopoulos, A., Tonnel, A., 1994. Histamine induces interleukin-8 secretion by endothelial cells. Blood 84.
Jemima, E.A., Prema, A., Thangam, E.B., 2014. Functional characterization of histamine H4 receptor on human mast cells. Mol. Immunol. 62, 19–28. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2014.05.007
Jordan, B.A., Trapaidze, N., Gomes, I., Nivarthi, R., Devi, L.A., 2001. Oligomerization of opioid receptors with beta 2-adrenergic receptors: A role in trafficking and mitogen-activated protein kinase activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 343–348. https://doi.org/10.1073/pnas.011384898
Jutel, M., Akdis, C.A., 2007. Histamine as an immune modulator in chronic inflammatory responses. Clin. Exp. Allergy 37, 308–310. https://doi.org/10.1111/j.1365-2222.2007.02666.x
Jutel, M., Akdis, M., Akdis, C.A., 2009. Histamine, histamine receptors and their role in immune pathology. Clin. Exp. Allergy 39, 1786–1800. https://doi.org/10.1111/j.1365-2222.2009.03374.x
Jutel, M., Watanabe, T., Akdis, M., Blaser, K., Akdis, C.A., 2002. Immune regulation by histamine. Curr. Opin. Immunol. 14, 735–40.
Jutel, M., Watanabe, T., Klunker, S., Akdis, M., Thomet, O.A.R., Malolepszy, J., Zak-Nejmark, T., Koga, R., Kobayashi, T., Blaser, K., Akdis, C.A., 2001. Histamine regulates T-cell and antibody responses by differential expression of H1 and H2 receptors. Nature 413, 420–425. https://doi.org/10.1038/35096564
Kaczor, A.A., Selent, J., 2011. Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods. Curr. Med. Chem. 18, 4606–34.
Kahlson, G., Rosengren, E., 1972. Histamine: entering physiology. Experientia 28, 993–1002.
Kakkar, R., Raju, R. V, Sharma, R.K., 1999. Calmodulin-dependent cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE1). Cell. Mol. Life Sci. 55, 1164–86.
Referencias
133
Kang, D.S., Tian, X., Benovic, J.L., 2014. Role of β-arrestins and arrestin domain-containing proteins in G protein-coupled receptor trafficking. Curr. Opin. Cell Biol. 27, 63–71. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2013.11.005
Kawabe, J., Iwami, G., Ebina, T., Ohno, S., Katada, T., Ueda, Y., Homcy, C.J., Ishikawa, Y., 1994. Differential activation of adenylyl cyclase by protein kinase C isoenzymes. J. Biol. Chem. 269, 16554–8.
Kawakami, N., Miyoshi, K., Horio, S., Fukui, H., 2004. Beta(2)-adrenergic receptor-mediated histamine H(1) receptor down-regulation: another possible advantage of beta(2) agonists in asthmatic therapy. J. Pharmacol. Sci. 94, 449–58.
Kawakami, N., Miyoshi, K., Horio, S., Yoshimura, Y., Yamauchi, T., Fukui, H., 2003. Direct phosphorylation of histamine H1 receptor by various protein kinases in vitro. Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 25, 685–93.
Kenakin, T., 2004. Efficacy as a Vector: the Relative Prevalence and Paucity of Inverse Agonism. Mol. Pharmacol. 65, 2–11. https://doi.org/10.1124/mol.65.1.2
Kenakin, T.P., 2012. Biased signalling and allosteric machines: new vistas and challenges for drug discovery. Br. J. Pharmacol. 165, 1659–1669. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2011.01749.x
Kim, J., Ogai, A., Nakatani, S., Hashimura, K., Kanzaki, H., Komamura, K., Asakura, M., Asanuma, H., Kitamura, S., Tomoike, H., Kitakaze, M., 2006. Impact of Blockade of Histamine H2 Receptors on Chronic Heart Failure Revealed by Retrospective and Prospective Randomized Studies. J. Am. Coll. Cardiol. 48, 1378–1384. https://doi.org/10.1016/j.jacc.2006.05.069
Kim, J., Song, J.-H., 2017. Inhibitory effects of antihistamines, diphenhydramine and chlorpheniramine, on proton currents in BV2 microglial cells. Eur. J. Pharmacol. 798, 122–128. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2017.01.032
Kimura, S., Wang, K.-Y., Tanimoto, A., Murata, Y., Nakashima, Y., Sasaguri, Y., 2004. Acute inflammatory reactions caused by histamine via monocytes/macrophages chronically participate in the initiation and progression of atherosclerosis. Pathol. Int. 54, 465–74. https://doi.org/10.1111/j.1440-1827.2004.01653.x
Kirch, W., Halabi, A., Hinrichsen, H., 1992. Hemodynamic effects of quinidine and famotidine in patients with congestive heart failure. Clin. Pharmacol. Ther. 51, 325–33.
Kniazeff, J., Saintot, P.-P., Goudet, C., Liu, J., Charnet, A., Guillon, G., Pin, J.-P., 2004. Locking the Dimeric GABAB G-Protein-Coupled Receptor in Its Active State. J. Neurosci. 24, 370–377. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3141-03.2004
Kobayashi, T., Tonai, S., Ishihara, Y., Koga, R., Okabe, S., Watanabe, T., 2000. Abnormal functional and morphological regulation of the gastric mucosa in histamine H2 receptor–deficient mice. J. Clin. Invest. 105, 1741–1749. https://doi.org/10.1172/JCI9441
Kohda, F., Koga, T., Uchi, H., Urabe, K., Furue, M., 2002. Histamine-induced IL-6 and IL-8 production are differentially modulated by IFN-gamma and IL-4 in human keratinocytes. J. Dermatol. Sci. 28, 34–41.
Kohout, T.A., Lin, F.S., Perry, S.J., Conner, D.A., Lefkowitz, R.J., 2001. beta -Arrestin 1 and 2 differentially regulate heptahelical receptor signaling and trafficking. Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 1601–1606. https://doi.org/10.1073/pnas.041608198
Referencias
134
Kong, G., Penn, R., Benovic, J.L., 1994. A beta-adrenergic receptor kinase dominant negative mutant attenuates desensitization of the beta 2-adrenergic receptor. J. Biol. Chem. 269, 13084–7.
Kordulewska, N.K., Kostyra, E., Cieślińska, A., Matysiewicz, M., Fiedorowicz, E., Sienkiewicz-Szłapka, E., 2017. Changes in gene expression induced by histamine, fexofenadine and osthole: Expression of histamine H1 receptor, COX-2, NF-κB, CCR1, chemokine CCL5/RANTES and interleukin-1β in PBMC allergic and non-allergic patients. Immunobiology 222, 571–581. https://doi.org/10.1016/j.imbio.2016.11.004
Krupnick, J.G., Benovic, J.L., 1998. THE ROLE OF RECEPTOR KINASES AND ARRESTINS IN G PROTEIN–COUPLED RECEPTOR REGULATION. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 38, 289–319. https://doi.org/10.1146/annurev.pharmtox.38.1.289
Krystal, A.D., 2015. Current, emerging, and newly available insomnia medications. J. Clin. Psychiatry 76, e1045. https://doi.org/10.4088/JCP.14046tx2c
Lampiasi, N., Azzolina, A., Montalto, G., Cervello, M., 2007. Histamine and spontaneously released mast cell granules affect the cell growth of human hepatocellular carcinoma cells. Exp. Mol. Med. 39, 284–294. https://doi.org/10.1038/emm.2007.32
Lapilla, M., Gallo, B., Martinello, M., Procaccini, C., Costanza, M., Musio, S., Rossi, B., Angiari, S., Farina, C., Steinman, L., Matarese, G., Constantin, G., Pedotti, R., 2011. Histamine regulates autoreactive T cell activation and adhesiveness in inflamed brain microcirculation. J. Leukoc. Biol. 89, 259–267. https://doi.org/10.1189/jlb.0910486
Laporte, S.A., Oakley, R.H., Holt, J.A., Barak, L.S., Caron, M.G., 2000. The Interaction of β-Arrestin with the AP-2 Adaptor Is Required for the Clustering of β 2 -Adrenergic Receptor into Clathrin-coated Pits. J. Biol. Chem. 275, 23120–23126. https://doi.org/10.1074/jbc.M002581200
Lasley, R.D., Narayan, P., Uittenbogaard, A., Smart, E.J., 2000. Activated cardiac adenosine A(1) receptors translocate out of caveolae. J. Biol. Chem. 275, 4417–21. https://doi.org/10.1074/JBC.275.6.4417
Lawler, O.A., Miggin, S.M., Kinsella, B.T., 2001. Protein Kinase A-mediated Phosphorylation of Serine 357 of the Mouse Prostacyclin Receptor Regulates Its Coupling to G s -, to G i -, and to G q -coupled Effector Signaling. J. Biol. Chem. 276, 33596–33607. https://doi.org/10.1074/jbc.M104434200
Lázár-Molnár, E., Hegyesi, H., Pállinger, E., Kovács, P., Tóth, S., Fitzsimons, C., Cricco, G., Martin, G., Bergoc, R., Darvas, Z., Rivera, E.S., Falus, A., 2002. Inhibition of human primary melanoma cell proliferation by histamine is enhanced by interleukin-6. Eur. J. Clin. Invest. 32, 743–9.
Leary, P.J., Tedford, R.J., Bluemke, D.A., Bristow, M.R., Heckbert, S.R., Kawut, S.M., Krieger, E. V, Lima, J.A., Masri, C.S., Ralph, D.D., Shea, S., Weiss, N.S., Kronmal, R.A., 2016. Histamine H2 Receptor Antagonists, Left Ventricular Morphology, and Heart Failure Risk: The MESA Study. J. Am. Coll. Cardiol. 67, 1544–1552. https://doi.org/10.1016/j.jacc.2016.01.045
Lefkowitz, R.J., 1998. G protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J. Biol. Chem. 273, 18677–80.
Lefkowitz, R.J., Shenoy, S.K., 2005. Transduction of Receptor Signals by B-Arrestins. Science (80-. ). 308, 512–517. https://doi.org/10.1126/science.1109237
Referencias
135
Leopoldt, D., Harteneck, C., Nürnberg, B., 1997. G Proteins endogenously expressed in Sf 9 cells: interactions with mammalian histamine receptors. Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. 356, 216–224. https://doi.org/10.1007/PL00005044
Leurs, R., Smit, M.J., Menge, W.M., Timmerman, H., 1994. Pharmacological characterization of the human histamine H2 receptor stably expressed in Chinese hamster ovary cells. Br. J. Pharmacol. 112, 847–54.
Li, Y., Chi, L., Stechschulte, D.J., Dileepan, K.N., 2001. Histamine-Induced Production of Interleukin-6 and Interleukin-8 by Human Coronary Artery Endothelial Cells Is Enhanced by Endotoxin and Tumor Necrosis Factor-α. Microvasc. Res. 61, 253–262. https://doi.org/10.1006/mvre.2001.2304
Lim, H.D., van Rijn, R.M., Ling, P., Bakker, R.A., Thurmond, R.L., Leurs, R., 2005. Evaluation of Histamine H1-, H2-, and H3-Receptor Ligands at the Human Histamine H4 Receptor: Identification of 4-Methylhistamine as the First Potent and Selective H4 Receptor Agonist. J. Pharmacol. Exp. Ther. 314, 1310–1321. https://doi.org/10.1124/jpet.105.087965
Liu, C., Ma, X., Jiang, X., Wilson, S.J., Hofstra, C.L., Blevitt, J., Pyati, J., Li, X., Chai, W., Carruthers, N., Lovenberg, T.W., 2001a. Cloning and pharmacological characterization of a fourth histamine receptor (H(4)) expressed in bone marrow. Mol. Pharmacol. 59, 420–6.
Liu, C., Wilson, S.J., Kuei, C., Lovenberg, T.W., 2001b. Comparison of human, mouse, rat, and guinea pig histamine H4 receptors reveals substantial pharmacological species variation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 299, 121–30.
Liu, S., Xia, Y., Hu, H. z, Ren, J., Gao, C., Wood, J.D., 2000. Histamine H3 receptor-mediated suppression of inhibitory synaptic transmission in the submucous plexus of guinea-pig small intestine. Eur. J. Pharmacol. 397, 49–54.
Livak, K.J., Schmittgen, T.D., 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods 25, 402–408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
Lohse, M.J., Benovic, J.L., Caron, M.G., Lefkowitz, R.J., 1990. Multiple pathways of rapid beta 2-adrenergic receptor desensitization. Delineation with specific inhibitors. J. Biol. Chem. 265, 3202–11.
Lovenberg, T.W., Pyati, J., Chang, H., Wilson, S.J., Erlander, M.G., 2000. Cloning of rat histamine H(3) receptor reveals distinct species pharmacological profiles. J. Pharmacol. Exp. Ther. 293, 771–8.
Lovenberg, T.W., Roland, B.L., Wilson, S.J., Jiang, X., Pyati, J., Huvar, A., Jackson, M.R., Erlander, M.G., 1999. Cloning and functional expression of the human histamine H3 receptor. Mol. Pharmacol. 55, 1101–7.
Lustig, K.D., Conklin, B.R., Herzmark, P., Taussig, R., Bourne, H.R., 1993. Type II adenylylcyclase integrates coincident signals from Gs, Gi, and Gq. J. Biol. Chem. 268, 13900–5.
Luttrell, L.M., Roudabush, F.L., Choy, E.W., Miller, W.E., Field, M.E., Pierce, K.L., Lefkowitz, R.J., 2001. Activation and targeting of extracellular signal-regulated kinases by B-arrestin scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 2449–2454. https://doi.org/10.1073/pnas.041604898
Lutz, S., Freichel-Blomquist, A., Yang, Y., Rumenapp, U., Jakobs, K.H., Schmidt, M., Wieland, T., 2005. The Guanine Nucleotide Exchange Factor p63RhoGEF, a Specific Link between Gq/11-coupled Receptor Signaling and RhoA. J. Biol. Chem. 280, 11134–11139. https://doi.org/10.1074/jbc.M411322200
Referencias
136
Maintz, L., Novak, N., 2007. Histamine and histamine intolerance. Am. J. Clin. Nutr. 85, 1185–1196. https://doi.org/10.1093/ajcn/85.5.1185
Marchese, A., Benovic, J.L., 2001. Agonist-promoted Ubiquitination of the G Protein-coupled Receptor CXCR4 Mediates Lysosomal Sorting. J. Biol. Chem. 276, 45509–45512. https://doi.org/10.1074/jbc.C100527200
Marchese, A., Trejo, J., 2013. Ubiquitin-dependent regulation of G protein-coupled receptor trafficking and signaling. Cell. Signal. 25, 707–716. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2012.11.024
Marinissen, M.J., Gutkind, J.S., 2001. G-protein-coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms. Trends Pharmacol. Sci. 22, 368–76.
Márquez-Gómez, R., Robins, M.T., Gutiérrez-Rodelo, C., Arias, J.-M., Olivares-Reyes, J.-A., van Rijn, R.M., Arias-Montaño, J.-A., 2018. Functional histamine H 3 and adenosine A 2A receptor heteromers in recombinant cells and rat striatum. Pharmacol. Res. 129, 515–525. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2017.11.036
Martinez, J.R., Zhang, G.H., 1998. Cross-talk in signal transduction pathways of rat submandibular acinar cells. Eur. J. Morphol. 36 Suppl, 190–3.
Massari, N.A., Nicoud, M.B., Medina, V.A., 2018. Histamine receptors and cancer pharmacology: an update. Br. J. Pharmacol. https://doi.org/10.1111/bph.14535
Matsuda, N., Jesmin, S., Takahashi, Y., Hatta, E., Kobayashi, M., Matsuyama, K., Kawakami, N., Sakuma, I., Gando, S., Fukui, H., Hattori, Y., Levi, R., 2004. Histamine H1 and H2 Receptor Gene and Protein Levels Are Differentially Expressed in the Hearts of Rodents and Humans. J. Pharmacol. Exp. Ther. 309, 786–795. https://doi.org/10.1124/jpet.103.063065
Mayor, S., Parton, R.G., Donaldson, J.G., 2014. Clathrin-independent pathways of endocytosis. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a016758
McCudden, C.R., Hains, M.D., Kimple, R.J., Siderovski, D.P., Willard, F.S., 2005. G-protein signaling: back to the future. Cell. Mol. Life Sci. 62, 551–577. https://doi.org/10.1007/s00018-004-4462-3
Menéndez, F., 2009. El interactoma de la quinasa GRK2 y sus implicaciones fisiopatológicas.
Merétey, K., Falus, A., Taga, T., Kishimoto, T., 1991. Histamine influences the expression of the interleukin-6 receptor on human lymphoid, monocytoid and hepatoma cell lines. Agents Actions 33, 189–91.
Miller, W.E., Lefkowitz, R.J., 2001. Expanding roles for beta-arrestins as scaffolds and adapters in GPCR signaling and trafficking. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 139–45.
Misaki, N., Imaizumi, T., Watanabe, Y., 1989. Cyclic AMP-dependent protein kinase interferes with GTP gamma S stimulated IP3 formation in differentiated HL-60 cell membranes. Life Sci. 45, 1671–8.
Miyoshi, K., Kawakami, N., Wakayama, Y., Izumi, N., Horio, S., Fukui, H., 2004. Histamine H1 receptor down-regulation mediated by M3 muscarinic acetylcholine receptor subtype. J. Pharmacol. Sci. 95, 426–34.
Molina-Hernndez, A., Velasco, I., 2008. Histamine induces neural stem cell proliferation and neuronal differentiation by activation of distinct histamine receptors. J. Neurochem. 106, 706–717. https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2008.05424.x
Monczor, F., Fernandez, N., 2016. Current Knowledge and Perspectives on
Referencias
137
Histamine H1 and H2 Receptor Pharmacology: Functional Selectivity, Receptor Crosstalk, and Repositioning of Classic Histaminergic Ligands. Mol. Pharmacol. 90, 640–648. https://doi.org/10.1124/mol.116.105981
Monczor, F., Fernandez, N., Legnazzi, B.L., Riveiro, M.E., Baldi, A., Shayo, C., Davio, C., 2003. Tiotidine, a histamine H2 receptor inverse agonist that binds with high affinity to an inactive G-protein-coupled form of the receptor. Experimental support for the cubic ternary complex model. Mol. Pharmacol. 64, 512–20. https://doi.org/10.1124/mol.64.2.512
Mondillo, C., Varela, M.L., Abiuso, A.M.B., Vázquez, R., 2018. Potential negative effects of anti-histamines on male reproductive function. Reproduction 155, R221–R227. https://doi.org/10.1530/REP-17-0685
Moniri, N.H., Covington-Strachan, D., Booth, R.G., 2004. Ligand-Directed Functional Heterogeneity of Histamine H1 Receptors: Novel Dual-Function Ligands Selectively Activate and Block H1-Mediated Phospholipase C and Adenylyl Cyclase Signaling. J. Pharmacol. Exp. Ther. 311, 274–281. https://doi.org/10.1124/jpet.104.070086
Mons, N., Decorte, L., Jaffard, R., Cooper, D.M., 1998. Ca2+-sensitive adenylyl cyclases, key integrators of cellular signalling. Life Sci. 62, 1647–52.
Moore, C.A.C., Milano, S.K., Benovic, J.L., 2007. Regulation of Receptor Trafficking by GRKs and Arrestins. Annu. Rev. Physiol. 69, 451–482. https://doi.org/10.1146/annurev.physiol.69.022405.154712
Morgan, R.K., McAllister, B., Cross, L., Green, D.S., Kornfeld, H., Center, D.M., Cruikshank, W.W., 2007. Histamine 4 receptor activation induces recruitment of FoxP3+ T cells and inhibits allergic asthma in a murine model. J. Immunol. 178, 8081–9.
Morisset, S., Rouleau, A., Ligneau, X., Gbahou, F., Tardivel-Lacombe, J., Stark, H., Schunack, W., Ganellin, C.R., Arrang, J.-M., Arrang, J.M., 2000. High constitutive activity of native H3 receptors regulates histamine neurons in brain. Nature 408, 860–864. https://doi.org/10.1038/35048583
Morse, K.L., Behan, J., Laz, T.M., West, R.E., Greenfeder, S.A., Anthes, J.C., Umland, S., Wan, Y., Hipkin, R.W., Gonsiorek, W., Shin, N., Gustafson, E.L., Qiao, X., Wang, S., Hedrick, J.A., Greene, J., Bayne, M., Monsma, F.J., 2001. Cloning and characterization of a novel human histamine receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 296, 1058–66.
Moulédous, L., Froment, C., Dauvillier, S., Burlet-Schiltz, O., Zajac, J.-M., Mollereau, C., 2012. GRK2 Protein-mediated transphosphorylation contributes to loss of function of μ-Opioid Receptors induced by Neuropeptide FF (NPFF2) Receptors. J. Biol. Chem. 287, 12736–12749. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.314617
Nakamura, T., Itadani, H., Hidaka, Y., Ohta, M., Tanaka, K., 2000. Molecular Cloning and Characterization of a New Human Histamine Receptor, HH4R. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279, 615–620. https://doi.org/10.1006/bbrc.2000.4008
Namkung, Y., Dipace, C., Urizar, E., Javitch, J.A., Sibley, D.R., 2009. G Protein-coupled Receptor Kinase-2 Constitutively Regulates D2 Dopamine Receptor Expression and Signaling Independently of Receptor Phosphorylation. J. Biol. Chem. 284, 34103–34115. https://doi.org/10.1074/jbc.M109.055707
Neubauer, D.N., 2014. New and emerging pharmacotherapeutic approaches for insomnia. Int. Rev. Psychiatry 26, 214–224.
Referencias
138
https://doi.org/10.3109/09540261.2014.888990 Nguyen, T., Shapiro, D.A., George, S.R., Setola, V., Lee, D.K., Cheng, R., Rauser, L., Lee,
S.P., Lynch, K.R., Roth, B.L., O’Dowd, B.F., 2001. Discovery of a novel member of the histamine receptor family. Mol. Pharmacol. 59, 427–33.
Nicholson, A.N., Pascoe, P.A., Turner, C., Ganellin, C.R., Greengrass, P.M., Casy, A.F., Mercer, A.D., 1991. Sedation and histamine H1-receptor antagonism: studies in man with the enantiomers of chlorpheniramine and dimethindene. Br. J. Pharmacol. 104, 270–6.
Nishida, T., Takano, M., Kawakami, T., Nishino, N., Nakai, S., Hirai, Y., 1988. The transcription of the interleukin 1 beta gene is induced with PMA and inhibited with dexamethasone in U937 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 269–74.
Nosengo, N., 2016. Can you teach old drugs new tricks? Nature 534, 314–316. https://doi.org/10.1038/534314a
Notcovich, C., Diez, F., Tubio, M.R., Baldi, A., Kazanietz, M.G., Davio, C., Shayo, C., 2010. Histamine acting on H1 receptor promotes inhibition of proliferation via PLC, RAC, and JNK-dependent pathways. Exp. Cell Res. 316, 401–411. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2009.11.002
Nuutinen, S., Panula, P., 2010. Histamine in neurotransmission and brain diseases. Adv. Exp. Med. Biol. 709, 95–107.
O’Reilly, M., Alpert, R., Jenkinson, S., Gladue, R.P., Foo, S., Trim, S., Peter, B., Trevethick, M., Fidock, M., 2002. Identification of a histamine H4 receptor on human eosinophils-role in eosinophil chemotaxis. J. Recept. Signal Transduct. 22, 431–448. https://doi.org/10.1081/RRS-120014612
Oda, T., Morikawa, N., Saito, Y., Masuho, Y., Matsumoto, S., 2000. Molecular Cloning and Characterization of a Novel Type of Histamine Receptor Preferentially Expressed in Leukocytes. J. Biol. Chem. 275, 36781–36786. https://doi.org/10.1074/jbc.M006480200
Osna, N., Elliott, K., Khan, M.M., 2001. Regulation of interleukin-10 secretion by histamine in TH2 cells and splenocytes. Int. Immunopharmacol. 1, 85–96.
Ostrom, N.K., 2014. The history and progression of treatments for allergic rhinitis. Allergy Asthma Proc. 35, 3–10. https://doi.org/10.2500/aap.2014.35.3758
Panettieri, R.A., Yadvish, P.A., Kelly, A.M., Rubinstein, N.A., Kotlikoff, M.I., 1990. Histamine stimulates proliferation of airway smooth muscle and induces c-fos expression. Am. J. Physiol. Cell. Mol. Physiol. 259, L365–L371. https://doi.org/10.1152/ajplung.1990.259.6.L365
Pantziarka, P., Bouche, G., Meheus, L., Sukhatme, V., Sukhatme, V.P., 2014. Repurposing drugs in oncology (ReDO)-cimetidine as an anti-cancer agent. Ecancermedicalscience 8, 485. https://doi.org/10.3332/ecancer.2014.485
Panula, P., Chazot, P.L., Cowart, M., Gutzmer, R., Leurs, R., Liu, W.L.S., Stark, H., Thurmond, R.L., Haas, H.L., 2015a. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. XCVIII. Histamine Receptors. Pharmacol. Rev. 67, 601–655. https://doi.org/10.1124/pr.114.010249
Panula, P., Chazot, P.L., Cowart, M., Gutzmer, R., Leurs, R., Liu, W.L.S., Stark, H., Thurmond, R.L., Haas, H.L., 2015b. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. XCVIII. Histamine Receptors. Pharmacol. Rev. 67, 601–655. https://doi.org/10.1124/pr.114.010249
Parmentier, R., Zhao, Y., Perier, M., Akaoka, H., Lintunen, M., Hou, Y., Panula, P., Watanabe, T., Franco, P., Lin, J.-S., 2016. Role of histamine H1-receptor on
Referencias
139
behavioral states and wake maintenance during deficiency of a brain activating system: A study using a knockout mouse model. Neuropharmacology 106, 20–34. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2015.12.014
Parsons, M.E., Ganellin, C.R., 2006a. Histamine and its receptors. Br. J. Pharmacol. 147 Suppl 1, S127-35. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706440
Parsons, M.E., Ganellin, C.R., 2006b. Histamine and its receptors. Br. J. Pharmacol. 147 Suppl 1, S127-35. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706440
Pfeiffer, M., Koch, T., Schröder, H., Laugsch, M., Höllt, V., Schulz, S., 2002. Heterodimerization of somatostatin and opioid receptors cross-modulates phosphorylation, internalization, and desensitization. J. Biol. Chem. 277, 19762–72. https://doi.org/10.1074/jbc.M110373200
Pin, J.-P., Kniazeff, J., Binet, V., Liu, J., Maurel, D., Galvez, T., Duthey, B., Havlickova, M., Blahos, J., Prézeau, L., Rondard, P., 2004. Activation mechanism of the heterodimeric GABAB receptor. Biochem. Pharmacol. 68, 1565–1572. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2004.06.035
Pini, A., Obara, I., Battell, E., Chazot, P.L., Rosa, A.C., 2016. Histamine in diabetes: Is it time to reconsider? Pharmacol. Res. 111, 316–324. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2016.06.021
Pitcher, J.A., Freedman, N.J., Lefkowitz, R.J., 1998. G protein-coupled receptor kinases. Annu. Rev. Biochem. 67, 653–692. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.67.1.653
Pittner, R.A., Fain, J.N., 1989. Exposure of cultured hepatocytes to cyclic AMP enhances the vasopressin-mediated stimulation of inositol phosphate production. Biochem. J. 257, 455–60.
Preininger, A.M., Hamm, H.E., 2004. G Protein Signaling: Insights from New Structures. Sci. Signal. 2004, re3-re3. https://doi.org/10.1126/stke.2182004re3
Premont, R.T., Gainetdinov, R.R., 2007. Physiological Roles of G Protein–Coupled Receptor Kinases and Arrestins. Annu. Rev. Physiol. 69, 511–534. https://doi.org/10.1146/annurev.physiol.69.022405.154731
Provensi, G., Passani, M.B., Costa, A., Izquierdo, I., Blandina, P., 2018. Neuronal histamine and the memory of emotionally salient events. Br. J. Pharmacol. https://doi.org/10.1111/bph.14476
Pupo, A.S., Duarte, D.A., Lima, V., Teixeira, L.B., Parreiras-e-Silva, L.T., Costa-Neto, C.M., 2016. Recent updates on GPCR biased agonism. Pharmacol. Res. 112, 49–57. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2016.01.031
Rajagopal, S., Shenoy, S.K., 2018. GPCR desensitization: Acute and prolonged phases. Cell. Signal. 41, 9–16. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2017.01.024
Rajendra, S., Mulcahy, H., Patchett, S., Kumar, P., 2004. The effect of H2 antagonists on proliferation and apoptosis in human colorectal cancer cell lines. Dig. Dis. Sci. 49, 1634–40.
Rangachari, P.K., 1998. The fate of released histamine: reception, response and termination. Yale J. Biol. Med. 71, 173–82.
Rankovic, Z., Brust, T.F., Bohn, L.M., 2016. Biased agonism: An emerging paradigm in GPCR drug discovery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 241–250. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2015.12.024
Reher, T.M., Brunskole, I., Neumann, D., Seifert, R., 2012. Evidence for ligand-specific conformations of the histamine H2-receptor in human eosinophils
Referencias
140
and neutrophils. Biochem. Pharmacol. 84, 1174–1185. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2012.08.014
Ribas, C., Penela, P., Murga, C., Salcedo, A., García-Hoz, C., Jurado-Pueyo, M., Aymerich, I., Mayor, F., 2007. The G protein-coupled receptor kinase (GRK) interactome: Role of GRKs in GPCR regulation and signaling. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1768, 913–922. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2006.09.019
Rocha, S.M., Pires, J., Esteves, M., Graça, B., Bernardino, L., 2014. Histamine: a new immunomodulatory player in the neuron-glia crosstalk. Front. Cell. Neurosci. 8, 120. https://doi.org/10.3389/fncel.2014.00120
Rockman, H.A., Koch, W.J., Lefkowitz, R.J., 2002. Seven-transmembrane-spanning receptors and heart function. Nature 415, 206–212. https://doi.org/10.1038/415206a
Romero, A.I., Thorén, F.B., Aurelius, J., Askarieh, G., Brune, M., Hellstrand, K., 2009. Post-consolidation Immunotherapy with Histamine Dihydrochloride and Interleukin-2 in AML. Scand. J. Immunol. 70, 194–205. https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.2009.02303.x
Salahpour, A., Angers, S., Mercier, J.-F., Lagacé, M., Marullo, S., Bouvier, M., 2004. Homodimerization of the β2-Adrenergic Receptor as a Prerequisite for Cell Surface Targeting. J. Biol. Chem. 279, 33390–33397. https://doi.org/10.1074/jbc.M403363200
Schafer, A., Cheng, H., Xiong, R., Soloveva, V., Retterer, C., Mo, F., Bavari, S., Thatcher, G., Rong, L., 2018. Repurposing potential of 1st generation H 1 -specific antihistamines as anti-filovirus therapeutics. Antiviral Res. 157, 47–56. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2018.07.003
Schayer, R.W., Karjala, S.A., 1956. Ring N methylation; a major route of histamine metabolism. J. Biol. Chem. 221, 307–13.
Schreiber, J., Jenner, R.G., Murray, H.L., Gerber, G.K., Gifford, D.K., Young, R.A., 2006. Coordinated binding of NF-kappaB family members in the response of human cells to lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 5899–5904. https://doi.org/10.1073/pnas.0510996103
Schulz, S., Mayer, D., Pfeiffer, M., Stumm, R., Koch, T., Höllt, V., 2004. Morphine induces terminal μ-opioid receptor desensitization by sustained phosphorylation of serine-375. EMBO J. 23, 3282–3289. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600334
Schwartz, J.-C., 2011. The histamine H3 receptor: from discovery to clinical trials with pitolisant. Br. J. Pharmacol. 163, 713–721. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2011.01286.x
Self, T.J., Oakley, S.M., Hill, S.J., 2005. Clathrin-independent internalization of the human histamine H 1 -receptor in CHO-K1 cells. Br. J. Pharmacol. 146, 612–624. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706337
Shayo, C., Fernandez, N., Legnazzi, B.L., Monczor, F., Mladovan, A., Baldi, A., Davio, C., 2001a. Histamine H2 receptor desensitization: involvement of a select array of G protein-coupled receptor kinases. Mol. Pharmacol. 60, 1049–56.
Shayo, C., Fernandez, N., Legnazzi, B.L., Monczor, F., Mladovan, A., Baldi, A., Davio, C., 2001b. Histamine H2 receptor desensitization: involvement of a select array of G protein-coupled receptor kinases. Mol. Pharmacol. 60, 1049–56.
Shenoy, S.K., Xiao, K., Venkataramanan, V., Snyder, P.M., Freedman, N.J., Weissman, A.M., 2008. Nedd4 Mediates Agonist-dependent Ubiquitination, Lysosomal
Referencias
141
Targeting, and Degradation of the β2-Adrenergic Receptor. J. Biol. Chem. 283, 22166–22176. https://doi.org/10.1074/jbc.M709668200
Shi, G.-P., Bot, I., Kovanen, P.T., 2015. Mast cells in human and experimental cardiometabolic diseases. Nat. Rev. Cardiol. 12, 643–658. https://doi.org/10.1038/nrcardio.2015.117
Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G.W., Kobayashi, T., Stevens, R.C., Iwata, S., 2011. Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin. Nature 475, 65–70. https://doi.org/10.1038/nature10236
Shore, P.A., BURKHALTER, A., COHN, V.H., 1959. A method for the fluorometric assay of histamine in tissues. J. Pharmacol. Exp. Ther. 127, 182–6.
Shukla, A.K., Xiao, K., Lefkowitz, R.J., 2011. Emerging paradigms of β-arrestin-dependent seven transmembrane receptor signaling. Trends Biochem. Sci. 36, 457–69. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2011.06.003
Sigterman, K.E., van Pinxteren, B., Bonis, P.A., Lau, J., Numans, M.E., 2013. Short-term treatment with proton pump inhibitors, H2-receptor antagonists and prokinetics for gastro-oesophageal reflux disease-like symptoms and endoscopy negative reflux disease. Cochrane Database Syst. Rev. CD002095. https://doi.org/10.1002/14651858.CD002095.pub5
Simon, F.E.R., Simons, K.J., 2008. H1 Antihistamines: Current Status and Future Directions. World Allergy Organ. J. 1, 145. https://doi.org/10.1186/1939-4551-1-9-145
Simons, F.E.R., Simons, K.J., 2011. Histamine and H1-antihistamines: Celebrating a century of progress. J. Allergy Clin. Immunol. 128, 1139–1150.e4. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2011.09.005
Smit, M.J., Leurs, R., Alewijnse, A.E., Blauw, J., Van Nieuw Amerongen, G.P., Van De Vrede, Y., Roovers, E., Timmerman, H., 1996. Inverse agonism of histamine H2 antagonist accounts for upregulation of spontaneously active histamine H2 receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 6802–7.
Smith, T.H., Li, J.G., Dores, M.R., Trejo, J., 2017. Protease-activated receptor-4 and purinergic receptor P2Y12 dimerize, co-internalize, and activate Akt signaling via endosomal recruitment of β-arrestin. J. Biol. Chem. 292, 13867–13878. https://doi.org/10.1074/jbc.M117.782359
Solelhac, G., Charpin, D., 2014. Management of allergic rhinitis. F1000Prime Rep. 6, 94. https://doi.org/10.12703/P6-94
Solomon, A., Pe’er, J., Levi-Schaffer, F., 2001. Advances in ocular allergy: basic mechanisms, clinical patterns and new therapies. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 1, 477–82.
Song, X., Coffa, S., Fu, H., Gurevich, V. V., 2009. How Does Arrestin Assemble MAPKs into a Signaling Complex? J. Biol. Chem. 284, 685–695. https://doi.org/10.1074/jbc.M806124200
Sriram, K., Insel, P.A., 2018. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs? Mol. Pharmacol. 93, 251–258. https://doi.org/10.1124/mol.117.111062
Stein, T., Souza-Silva, E., Mascarin, L., Eto, C., Fin, F.E., Tonussi, C.R., 2016. Histaminergic Pharmacology Modulates the Analgesic and Antiedematogenic Effects of Spinally Injected Morphine. Anesth. Analg. 123, 238–43. https://doi.org/10.1213/ANE.0000000000001326
Strasser, R.H., Sibley, D.R., Lefkowitz, R.J., 1986. A novel catecholamine-activated
Referencias
142
adenosine cyclic 3’,5’-phosphate independent pathway for beta-adrenergic receptor phosphorylation in wild-type and mutant S49 lymphoma cells: mechanism of homologous desensitization of adenylate cyclase. Biochemistry 25, 1371–7.
Sugimoto, N., Takuwa, N., Okamoto, H., Sakurada, S., Takuwa, Y., 2003. Inhibitory and stimulatory regulation of Rac and cell motility by the G12/13-Rho and Gi pathways integrated downstream of a single G protein-coupled sphingosine-1-phosphate receptor isoform. Mol. Cell. Biol. 23, 1534–45.
Sundvik, M., Panula, P., 2015. Interactions of the orexin/hypocretin neurones and the histaminergic system. Acta Physiol. 213, 321–333. https://doi.org/10.1111/apha.12432
Takahama, H., Asanuma, H., Sanada, S., Fujita, M., Sasaki, H., Wakeno, M., Kim, J., Asakura, M., Takashima, S., Minamino, T., Komamura, K., Sugimachi, M., Kitakaze, M., 2010. A histamine H2 receptor blocker ameliorates development of heart failure in dogs independently of β-adrenergic receptor blockade. Basic Res. Cardiol. 105, 787–794. https://doi.org/10.1007/s00395-010-0119-y
Tan, X., Essengue, S., Talreja, J., Reese, J., Stechschulte, D.J., Dileepan, K.N., 2007. Histamine directly and synergistically with lipopolysaccharide stimulates cyclooxygenase-2 expression and prostaglandin I(2) and E(2) production in human coronary artery endothelial cells. J. Immunol. 179, 7899–906.
Tetlow, L.C., Woolley, D.E., 2003. Histamine stimulates the proliferation of human articular chondrocytes in vitro and is expressed by chondrocytes in osteoarthritic cartilage. Ann. Rheum. Dis. 62, 991–4. https://doi.org/10.1136/ARD.62.10.991
Thangam, E.B., Jemima, E.A., Singh, H., Baig, M.S., Khan, M., Mathias, C.B., Church, M.K., Saluja, R., 2018. The Role of Histamine and Histamine Receptors in Mast Cell-Mediated Allergy and Inflammation: The Hunt for New Therapeutic Targets. Front. Immunol. 9, 1873. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01873
Thomsen, M., Dahl, M., Tybjaerg-Hansen, A., Nordestgaard, B.G., 2012. β2-adrenergic receptor Thr164IIe polymorphism, blood pressure and ischaemic heart disease in 66 750 individuals. J. Intern. Med. 271, 305–314. https://doi.org/10.1111/j.1365-2796.2011.02447.x
Thurmond, R.L., 2015. The histamine H4 receptor: from orphan to the clinic. Front. Pharmacol. 6, 65. https://doi.org/10.3389/fphar.2015.00065
Tian, X., Irannejad, R., Bowman, S.L., Du, Y., Puthenveedu, M.A., von Zastrow, M., Benovic, J.L., 2016. The α-Arrestin ARRDC3 Regulates the Endosomal Residence Time and Intracellular Signaling of the β2-Adrenergic Receptor. J. Biol. Chem. 291, 14510–14525. https://doi.org/10.1074/jbc.M116.716589
Tiligada, E., Ennis, M., 2018. Histamine pharmacology: from Sir Henry Dale to the 21st century. Br. J. Pharmacol. https://doi.org/10.1111/bph.14524
Tiligada, E., Kyriakidis, K., Chazot, P.L., Passani, M.B., 2011. Histamine Pharmacology and New CNS Drug Targets. CNS Neurosci. Ther. 17, 620–628. https://doi.org/10.1111/j.1755-5949.2010.00212.x
Tran, T.M., Friedman, J., Baameur, F., Knoll, B.J., Moore, R.H., Clark, R.B., 2006. Characterization of beta2-Adrenergic Receptor Dephosphorylation: Comparison with the Rate of Resensitization. Mol. Pharmacol. 71, 47–60. https://doi.org/10.1124/mol.106.028456
Referencias
143
Trejo, J., Hammes, S.R., Coughlin, S.R., 1998. Termination of signaling by protease-activated receptor-1 is linked to lysosomal sorting. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 13698–702.
Tubio, M.R., Fernandez, N., Fitzsimons, C.P., Copsel, S., Santiago, S., Shayo, C., Davio, C., Monczor, F., 2010. Expression of a G protein-coupled receptor (GPCR) leads to attenuation of signaling by other GPCRs: experimental evidence for a spontaneous GPCR constitutive inactive form. J. Biol. Chem. 285, 14990–8. https://doi.org/10.1074/jbc.M109.099689
Tuteja, N., 2009. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal. Behav. 4, 942–7.
Uberti, M.A., Hague, C., Oller, H., Minneman, K.P., Hall, R.A., 2004. Heterodimerization with 2-Adrenergic Receptors Promotes Surface Expression and Functional Activity of 1D-Adrenergic Receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 313, 16–23. https://doi.org/10.1124/jpet.104.079541
Usui, H., Nishiyama, M., Moroi, K., Shibasaki, T., Zhou, J., Ishida, J., Fukamizu, A., Haga, T., Sekiya, S., Kimura, S., 2000. RGS domain in the amino-terminus of G protein-coupled receptor kinase 2 inhibits Gq-mediated signaling. Int. J. Mol. Med. 5, 335–40.
Valiquette, M., Bonin, H., Hnatowich, M., Caron, M.G., Lefkowitz, R.J., Bouvier, M., 1990. Involvement of tyrosine residues located in the carboxyl tail of the human beta 2-adrenergic receptor in agonist-induced down-regulation of the receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 5089–93.
van Rijn, R.M., Chazot, P.L., Shenton, F.C., Sansuk, K., Bakker, R.A., Leurs, R., 2006. Oligomerization of Recombinant and Endogenously Expressed Human Histamine H4 Receptors. Mol. Pharmacol. 70, 604–615. https://doi.org/10.1124/mol.105.020818
Vannier, E., Dinarello, C.A., 1993. Histamine enhances interleukin (IL)-1-induced IL-1 gene expression and protein synthesis via H2 receptors in peripheral blood mononuclear cells. Comparison with IL-1 receptor antagonist. J. Clin. Invest. 92, 281–287. https://doi.org/10.1172/JCI116562
Vereb, G., Szöllősi, J., Matkó, J., Nagy, P., Farkas, T., Vígh, L., Mátyus, L., Waldmann, T.A., Damjanovich, S., 2003. Dynamic, yet structured: The cell membrane three decades after the Singer–Nicolson model. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 8053–8058. https://doi.org/10.1073/pnas.1332550100
Wei, H., Ahn, S., Shenoy, S.K., Karnik, S.S., Hunyady, L., Luttrell, L.M., Lefkowitz, R.J., 2003. Independent -arrestin 2 and G protein-mediated pathways for angiotensin II activation of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 10782–10787. https://doi.org/10.1073/pnas.1834556100
Wettschureck, N., Offermanns, S., 2005. Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions. Physiol. Rev. 85, 1159–1204. https://doi.org/10.1152/physrev.00003.2005
Whalen, E.J., Rajagopal, S., Lefkowitz, R.J., 2011. Therapeutic potential of β-arrestin- and G protein-biased agonists. Trends Mol. Med. 17, 126–139. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2010.11.004
White, M., 1999. Mediators of inflammation and the inflammatory process. J. Allergy Clin. Immunol. 103, S378-81.
Wolfe, B.L., Trejo, J., 2007. Clathrin-Dependent Mechanisms of G Protein-coupled Receptor Endocytosis. Traffic 8, 462–470. https://doi.org/10.1111/j.1600-
Referencias
144
0854.2007.00551.x Xu, L., Cheng, D., Huang, Z., Ding, S., Zhang, W., Tan, H., Shi, H., Chen, R., Zou, Y.,
Wang, T.C., Yang, X., Ge, J., 2017. Histamine promotes the differentiation of macrophages from CD11b + myeloid cells and formation of foam cells through a Stat6-dependent pathway. Atherosclerosis 263, 42–52. https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2017.05.024
Yamauchi, Y., Fujikura, T., Shimosawa, T., 2007. The effect of H1 antagonists carebastine and olopatadine on histamine induced expression of CC chemokines in cultured human nasal epithelial cells. Allergol. Int. 56, 171–7. https://doi.org/10.2332/allergolint.O-06-446
Yue, C., Dodge, K.L., Weber, G., Sanborn, B.M., 1998. Phosphorylation of serine 1105 by protein kinase A inhibits phospholipase Cbeta3 stimulation by Galphaq. J. Biol. Chem. 273, 18023–7.
Zampeli, E., Tiligada, E., 2009. The role of histamine H4 receptor in immune and inflammatory disorders. Br. J. Pharmacol. 157, 24–33. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2009.00151.x
Zamponi, G.W., Currie, K.P.M., 2013. Regulation of Ca(V)2 calcium channels by G protein coupled receptors. Biochim. Biophys. Acta 1828, 1629–43. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2012.10.004
Zappia, C.D., Granja-Galeano, G., Fernández, N., Shayo, C., Davio, C., Fitzsimons, C.P., Monczor, F., 2015. Effects of histamine H1 receptor signaling on glucocorticoid receptor activity. Role of canonical and non-canonical pathways. Sci. Rep. 5, 17476. https://doi.org/10.1038/srep17476
Zauberman, H., Michaelson, I.C., Bergmann, F., Maurice, D.M., 1969. Stimulation of neovascularization of the cornea by biogenic amines. Exp. Eye Res. 8, 77–83. https://doi.org/10.1016/S0014-4835(69)80083-7
Zeng, F.Y., Wess, J., 1999. Identification and molecular characterization of m3 muscarinic receptor dimers. J. Biol. Chem. 274, 19487–97. https://doi.org/10.1074/JBC.274.27.19487
Zeng, Z., Shen, L., Li, X., Luo, T., Wei, X., Zhang, J., Cao, S., Huang, X., Fukushima, Y., Bin, J., Kitakaze, M., Xu, D., Liao, Y., 2014. Disruption of histamine H2 receptor slows heart failure progression through reducing myocardial apoptosis and fibrosis. Clin. Sci. 127, 435–448. https://doi.org/10.1042/CS20130716
Zhang, J., Ferguson, S.S., Barak, L.S., Ménard, L., Caron, M.G., 1996. Dynamin and beta-arrestin reveal distinct mechanisms for G protein-coupled receptor internalization. J. Biol. Chem. 271, 18302–5. https://doi.org/10.1074/JBC.271.31.18302
Zhu, Y., Michalovich, D., Wu, H., Tan, K.B., Dytko, G.M., Mannan, I.J., Boyce, R., Alston, J., Tierney, L.A., Li, X., Herrity, N.C., Vawter, L., Sarau, H.M., Ames, R.S., Davenport, C.M., Hieble, J.P., Wilson, S., Bergsma, D.J., Fitzgerald, L.R., 2001. Cloning, expression, and pharmacological characterization of a novel human histamine receptor. Mol. Pharmacol. 59, 434–41.
Abreviaturas
145
ABREVIATURAS
Abreviaturas
146
A
AC: adenilato ciclasa
ADNc: ADN copia
AE: actividad específica
AMPc: adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico
ATP: adenosina trifosfato
B
β-Arr: β-arrestina
βAR: β-adrenérgico
Bmax: unión máxima
C
CE50: concentración efectiva 50
D
DAG: 1,2-diacilglicerol
DMSO: dimetil sulfóxido
DYN: dynasore
E
EDTA: ácido etilendiamino tetraacético, sal disódica 141
F
FITC: isotiocianato de fluoresceína
FRET: förster resonance energy transfer
G
GDP: guanosina difosfato
GPCRs: receptores de membrana acoplados a proteínas G
GRKs: quinasas de receptores acoplados a proteínas G
Abreviaturas
147
GTP: guanosina trifosfato
H
h: horas
HDC: histidina decarboxilasa
HNMT: histamina N-metil Transferasa
I
IBMX: 1-metil-3-isobutylxantina
IC: insuficiencia cardíaca
ICC: insuficiencia cardíaca crónica
IL-6: interleuquina 6
IL-8: interleuquina 8
IP: ioduro de propidio
IP3: inositol 1,4,5-trifosfato
IPP: inhibidor de la bomba de protones
K
Kd: constante de disociación
L
LPS: lipopolisacárido bacteriano
M
MAPKs: quinasa activada por mitógenos
min: minutos
N
N: número de experimentos
NF-κβ: factor nuclear κβ
O
Abreviaturas
148
ON: overnight
P
PBS: buffer fosfato salino
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PGE2: prostaglandina E2
PH: dominio con homología pleckstrina
PI3K: fosfatidil-inositol 3 quinasa
PIP2: fosfatidil inositol, 4,5-bifosfato
PKA: proteína quinasa A
PKC: proteína quinasa C
PKI: péptido inhibidor de PKA
PLC: fosfolipasa C
PMA: forbol 12-miristato 14-acetato
R
RGS: regulator of G-protein signaling
RH: dominio con homología RGS
rH1: receptor de histamina 1
rH2: receptor de histamina 2
rH3: receptor de histamina 3
rH4: receptor de histamina 4
Rpm: revoluciones por minutos
S
SD: desvío estándar
SDS: duodecil sulfato de sodio
Seg: segundos
Abreviaturas
149
SEM: error estándar de la media
SFB: suero fetal bovino
SNC: sistema nervioso central
T
7TMR: receptores de siete dominios transmembrana
t1/2: tiempo medio de desensibilización
U
U.V.: ultravioleta
V
V: volts
W
WB: western blot