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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENÍERIA QUÍMICA
CARRERA DE INGENÍERIA QUÍMICA
Obtención y caracterización de colágeno a partir de las escamas de pescados rojo y
pardo
Trabajo de titulación, modalidad proyecto de investigación para la obtención del
título de Ingeniero Químico
Autor: Cristian Darío Ramos Collaguazo
Tutora: Dra. Elvia Victoria Cabrera Maldonado
QUITO
2018
ii
© DERECHOS DE AUTOR
Yo, RAMOS COLLAGUAZO CRISTIAN DARÍO en calidad de autor y titular de los
derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación “OBTENCIÓN Y
CARACTERIZACIÓN DE COLÁGENO A PARTIR DE LAS ESCAMAS DE
PESCADOS ROJO Y PARDO”, modalidad PROYECTO DE INVESTIGACIÓN, de
conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL
DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de
la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva
para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi
favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.
Asimismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad
por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la
Universidad de toda responsabilidad.
En la ciudad de Quito, a los 07 días de mes de noviembre del 2018.
………………………………….
Cristian Darío Ramos Collaguazo
C.C. 1719730267
iii
APROBACION DEL TUTOR
Yo, Dra. Elvia Victoria Cabrera en calidad de tutora del trabajo de titulación, modalidad
proyecto de investigación “OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE COLÁGENO
A PARTIR DE LAS ESCAMAS DE PESCADOS ROJO Y PARDO”, elaborado por el
estudiante CRISTIAN DARÍO RAMOS COLLAGUAZO de la Carrera de Ingeniería
Química, Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador,
considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo
metodológico y en el campo epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte
del jurado examinador que se designe, por lo que le APRUEBO, a fin de que el trabajo
sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la
Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 07 días del mes de noviembre del 2018.
……………………………….
Dra. Elvia Victoria Cabrera
CI: 1757151921
iv
DEDICATORIA
A mis padres Diego y
Norma por haberme
dado la vida y todo su
apoyo en los momentos
cruciales, que me
permitió alcanzar la
meta.
v
AGRADECIMIENTOS
A Dios, quien ha forjado mi camino y me ha dirigido por el sendero correcto de la vida,
con mucho amor y fortaleza.
A la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador, por ser mi
centro de formación y aprendizaje profesional junto con mis educadores, quienes me
guiaron hasta este punto de mi carrera.
A mi tutora Dra. Elvia Victoria Cabrera, un agradecimiento especial por aceptar realizar
esta tesis bajo su dirección. Su apoyo, confianza en mi trabajo y su capacidad para guiar
mis ideas ha sido un aporte invaluable en varios aspectos de mi formación y vida en
general.
A mis padres, Diego y Norma quienes han sido mi apoyo y han sabido guiarme
haciéndome más venideros los malos momentos y celebrando juntos mis alegrías.
A mis abuelitos, por cuidar de mi cuando comencé a dar mis primeros pasos y por
siempre estar pendientes de mis logros y de mis caídas en la vida.
A mis hermanos, por su apoyo por sus palabras de motivación, por ser parte de este
logro en los buenos y malos momentos.
A mis tíos, un agradecimiento muy especial, por su apoyo y sus palabras de aliento en
lo largo de mi carrera y su enseñanza sobre el valor del trabajo honrado.
A mi novia Victoria Orbe, quien me apoyo y motivo cada día para dar este gran paso y
alcanzar este logro tan importante de mi vida.
A todos que de una u otra forma me apoyaron de manera incondicional, mis más
sinceras gracias.
vi
CONTENIDO
pág.
LISTA DE TABLAS……………………………………………………………. ix
LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………… x
LISTA DE GRÁFICOS………………………………………………………….. xi
LISTA DE ANEXOS……………………………………………………………. xii
RESUMEN………………………………………………………………………. xiii
ABSTRACT……………………………………………………………………... xiv
INTRODUCCION ............................................................................................................ 1
1. MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 3
1.1 Situación pesquera del país ..................................................................................... 3
1.2 Producción nacional pesquera en Ecuador .............................................................. 3
1.3 Escamas de pescados............................................................................................... 4
1.3.1 Definición ........................................................................................................ 4
1.3.2 Composición química ...................................................................................... 4
1.4 Tipos de escamas..................................................................................................... 5
1.4.1 Placoides .......................................................................................................... 5
1.4.2 Cosmoides ........................................................................................................ 5
1.4.3 Ganoides .......................................................................................................... 5
1.4.4 Cicloides y ctenoides ..................................................................................... 5
1.5 Aplicación de las escamas de pescado en la industria. ........................................... 6
1.6 Proteína ................................................................................................................... 7
1.6.1 Definición ........................................................................................................ 7
1.7 Colágeno ................................................................................................................. 7
1.7.1 Definición ........................................................................................................ 7
1.7.2 Tipos de colágenos y familias .......................................................................... 8
1.7.3 Tipos de fuentes de colágeno ........................................................................... 9
1.7.4 Formula del colágeno ..................................................................................... 10
1.7.5 Extracción del colágeno ................................................................................. 10
1.7.6 Cuantificación de hidroxiprolina ................................................................... 12
vii
1.8 Determinación de proteínas................................................................................... 13
2. METODOLOGÍA ................................................................................................... 15
2.1 Materiales y Equipos ............................................................................................ 18
2.2 Sustancias y Reactivos .......................................................................................... 18
2.3 Procedimiento ....................................................................................................... 18
2.3.1 Recolección de materia prima ........................................................................ 18
2.3.2 Proceso de tratamiento de lavado de las escamas .......................................... 19
2.3.3 Proceso de secado........................................................................................... 19
2.3.4 Proceso de molienda....................................................................................... 19
2.3.5 Proceso de extracción sólido-líquido ............................................................. 19
2.3.6 Proceso de separación .................................................................................... 20
2.3.7 Caracterización de las muestras obtenidas de colágeno ................................. 20
2.3.8 Cuantificación de las proteínas ...................................................................... 20
2.4 Diagrama de flujo total del proceso para la obtención de colágeno. .................... 21
2.5 Datos obtenidos ..................................................................................................... 22
2.5.1 Volumen final de colágeno ............................................................................ 22
2.5.2 Propiedades organolépticas ............................................................................ 23
2.5.3 Propiedades físicas ......................................................................................... 23
2.5.4 Apariencia del colágeno ................................................................................. 24
2.5.5 pH ................................................................................................................... 24
2.5.6 Nitrógeno total................................................................................................ 25
3. CÁLCULOS Y RESULTADOS ............................................................................. 26
3.1 Cálculo de proteínas totales .................................................................................. 26
3.2 Cálculos de rendimiento de proteínas presentes en los ensayos ........................... 27
3.3 Tendencia del pH en función de la temperatura. .............................................. 28
3.4 Volumen final de colágeno obtenido .................................................................... 28
3.5 Resultados de las encuestas de consumo de pescado ........................................... 29
3.6 Costo de obtención de colágeno ........................................................................... 29
3.7 Resultado del análisis microbiológico de rutina para el ensayo numero 3 ........... 30
4. DISCUSIÓN............................................................................................................ 31
5. CONCLUSIONES .................................................................................................. 34
6. RECOMENDACIONES ......................................................................................... 36
CITAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 38
viii
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 40
ANEXOS .......................................................................................................................... 1
ix
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1. Producción Pesquera en el Ecuador …………………..………………. 3
Tabla 2. Composición de la escama ……………………………….……………. 4
Tabla 3. Condiciones de operación optimas……………………..……………… 22
Tabla 4 Volumen final recuperado de colágeno…………………………………. 22
Tabla 5. Propiedades organolépticas del colágeno……………………………….. 23
Tabla 6. Color del colágeno obtenido……………………………………………. 23
Tabla 7. Aspectos físicos de los ensayos realizados……………………………... 24
Tabla 8. Medición de pH y temperatura de los ensayos………………………….. 25
Tabla 9. Porcentajes de nitrógeno total de los muestras………………………….. 25
Tabla 10. Porcentajes de proteínas totales……………………………………… 26
Tabla 11. Calculo del rendimiento de la obtención de colágeno………………… 27
Tabla 12. Encuesta de consumo de pescado Rojo y Pardo………………………. 29
Tabla 13. Costos de obtención del colágeno…………………………………….. 30
x
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1. Formula estructural de la prolina y la hidroxiprolina ………………. 7
Figura 2. Estructura del colágeno……………………………………………… 10
Figura 3. Esquema general de los métodos empleados para la obtención de los
Diferentes l. 2017)…...........……………………………………………………. 12
Figura 4. Etapas de extracción de colágeno……………………………………... 15
Figura 5. Combinación del diseño experimental para la obtención de colágeno... 17
Figura 6. Diagrama de flujo proceso de obtención del colágeno………………….. 21
xi
LISTA DE GRÁFICOS
pág.
Grafico 1. Porcentaje de proteínas totales……………………………………….. 26
Grafico 2. Rendimiento del proceso de extracción de colágeno…………………. 27
Grafico 3. Tendencia del pH en función de la temperatura………………………. 28
Grafico 4. Volumen final de colágeno…………………………………………….. 29
xii
LISTA DE ANEXOS
pág.
Anexo A. Proceso de recolección de las escamas……………………………...... 42
Anexo B. Lavado de escamas……………………………………………………. 43
Anexo C. proceso de secado de las escamas…………………………………….. 44
Anexo D. Molienda de las escamas……………………………………………… 45
Anexo E. Proceso de extracción del colágeno…………………………………… 46
Anexo F. Separación del colágeno extraído……………………………………… 47
Anexo G. Almacenamiento frio…………………………………………………. 48
Anexo H. Análisis de rutina microbiológico para el ensayo 3 de colágeno…….. 49
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA……………….. 50
xiii
Obtención y caracterización de colágeno a partir de las escamas de pescados rojo y
pardo.
RESUMEN
Se obtuvo colágeno mediante Extracción solido–líquido, utilizando como materia prima
las escamas de los pescados rojo y pardo; el producto obtenido fue caracterizado.
Las escamas de pescado rojo y pardo, recolectadas en recipientes se mantuvieron
congeladas en cuartos fríos. Para la experimentación las muestras se sometieron a
continuos lavados para obtener escamas sin impurezas, con las cuales se prepararon
mezclas de escamas/solvente (agua) a diferentes relaciones 10:90 y 2:98, a diferentes
condiciones de temperatura 20 y 90 ºC, y con diámetros de partícula entre 2 y 10 mm.
Las mezclas se sometieron a extracción solido-líquido, obteniendo el colágeno que
luego fue caracterizado mediante pruebas físico-químicas y organolépticas. La
cuantificación se realizó mediante el cálculo de proteínas utilizando el método Kjeldahl,
obteniendo un rendimiento del 60 %.
De los resultados obtenidos se concluye que las mejores condiciones para la extracción
solido-líquido de colágeno fue con la relación escamas/solvente (10:90), 90 y tamaño
de partícula 2 mm, con un rendimiento del 60 %. Las características del colágeno
obtenido son aceptables para su consumo y su control técnico como lo establece la
Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria – ARCSA.
PALABRAS CLAVES: /COLÁGENO/ PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS/
PROPIEDADES ORGANOLÉPTICAS/EXTRACCIÓN SÓLIDO – LÍQUIDO/
ESCAMAS/
xiv
Obtaining and characterization of collagen from de scales of red and brown fish.
ABSTRACT
Collagen was obtained by solid- liquid extraction using red and brown fish scales as raw
material; he product was characterized.
The red and brown fish scales collected in containers were kept frozen in cold
rooms.For the experimentation the samples were subjected to continuos washing to
obtain scales without impurities.With which mixtures of solvent flakes (water) were
prepared at different relationships 10:90 y 2:98.To different temperature conditions 20 y
90°C,and with particle diameters 2 y 10 mm. The mixtures were subjected solid and
liquid extraccion, obtaining the collagen that was then characterized by physical and
chemical organoleptic tests. The quantification was done by calculating proteins using
the method Kjeldahl obtaining a yield of 60%.
Of the results obtained, it is concluded that the best conditions for the solid-liquid
extraction of the collagen was the relationship scales/solvent (10:90) and 90°C and
particle size 2 mm with a yield of 60 %. The characteritics of the obtained collagen are
acceptable for consumption and its technical control as it establishes the National
Agency of Health Regulation, Control and Surveillance - ARCSA.
EY WORDS: / COLLAGEN / PHYSICAL-CHEMICAL PROPERTIES /
ORGANOLEPTIC PROPERTIES / SOLID EXTRACTION - LIQUID / FLAKES /
1
INTRODUCCION
El colágeno es un derivado que se obtiene de diferentes fuentes naturales como son: el
colágeno de origen porcino (cerdos), el colágeno de origen bovino (vacas) y el colágeno
de origen marino (peces).
De acuerdo a la información emitida en La Organización de las Naciones Unidas para la
Alimentación y la Agricultura FAO (2014), indica que los recursos pesqueros se han
convertido en uno de los más importantes en la economía de varios países alrededor del
mundo. Se estima que la producción mundial de recursos pesqueros es de 157969
millones de toneladas, de las cuales 86,2% son para consumo humano, considerándose
el restante 13,8%, 21700 millones de toneladas correspondiente a desechos no
alimentarios, como esqueletos, vísceras y escamas.
La industria pesquera genera un volumen mayor de desperdicios, que mediante procesos
de trasformación se pueden utilizar como materia prima, para varios procesos
industriales como la obtención de hidrolizados de gelatina, así como también
elaboración de harinas de residuos de pescado que han sido ampliamente utilizadas en
alimentación animal, debido a su elevado contenido proteico y a su completa
composición de aminoácidos esenciales (Hurtado, N. y Libardo, V. 2013).
Investigaciones han revelado que a partir del proceso de fileteo de los peces se generan
piel, espinas y escamas, que constituyen residuos con impactos ambientales
importantes. Basados en esta problemática, a nivel mundial se han adelantado estudios
para la obtención de colágeno de diferentes tipos de peces a partir de sus escamas
(Ikoma et al., 2003; Nagai et al., 2002; Serrano, 2011), piel (Serrano, 2011), espinas
(Gómez et al., 2011) y huesos (Wang et al., 2013).
En el Ecuador tenemos un alto consumo de pescado, lo que genera un considerable
porcentaje de residuos, al filetear el pescado y retirar las escamas, este último producto
que normalmente se direcciona a los basureros no se le ha dado un tratamiento para
transformarlo en materia prima.
2
Por lo tanto, bajo estos antecedentes en la siguiente investigación se planteó como
objetivo dar un valor agregado a los residuos de pescados como son las escamas
obteniendo colágeno a partir de los peces de la variedad rojo y pardo aplicado procesos
de extracción a diferentes condiciones operacionales, que permita un buen porcentaje de
colágeno, seguido de la cuantificación del producto final.
Con estos antecedentes, es importante dar un valor agregado a estos desechos con la
obtención de un producto que sea generado a partir de las escamas de los pescados para
la industria farmacéutica obteniendo colágeno del tipo 1 que sea apto para el consumo
humano.
3
1. MARCO TEÓRICO
1.1 Situación pesquera del país
La captura de especies de géneros Lutjanus campechanus (rojo) y Labrus bergylta
(pardo), junto a Coryphaena hippurus (dorado), y miembros de la familia Istiophoridae
(picudos), constituyen principalmente las especies que sustentan las exportaciones de
pescado fresco congelado y conservas. (Pro Ecuador, 2013).
Se estima que la pesca comercial de se inició en la década de los 60`s, gran parte de
embarcaciones con casco de acero y de mayor autonomía fueron adquiridas por
empresas ecuatorianas, lo que provocó un significativo incremento de la capacidad de
pesca de esta flota. Paralelamente se desarrolló la ampliación y mejoras en la
infraestructura de las fábricas harineras y conserveras ya existentes. (Pro Ecuador,
2013).
1.2 Producción nacional pesquera en Ecuador
En la tabla 1 se describe de una manera detallada la producción pesquera nacional para
los años 1980 al 2011, reportadas el Instituto de Promoción, Exportación e Inversiones.
Tabla 1. Producción Pesquera en el Ecuador
Fuente: Pro Ecuador 2013
4
1.3 Escamas de pescados
1.3.1 Definición
Las escamas son: "laminas duras, más o menos flexibles, que trazan un gran número de
líneas concéntricas y de estrías radicadas, superpuestas como las tejas de un tejado"
formado el exoesqueleto de los peces. (Miranda, R. 2002)
Las escamas son huesos tegumentarios laminares de origen dérmico incluidos en una
bolsa epidérmica de tejido conjuntivo fibrilar, derivadas del exoesqueleto de los
primitivos Ostracodermos y los Peces Placodermos. Tanto la cara interna como la
externa están cubiertas por una lámina de osteoblastos, activos en los márgenes de la
escama que provocan su crecimiento continuo. (Miranda, R. 2002).
1.3.2 Composición química
Según los diferentes autores definen a la escama de pescado, como un subproducto
altamente proteico que contiene sustancias inorgánicas como fosfato de calcio
(hidroxiapatita) y carbonato de calcio de potencial uso en la alimentación animal. La
escama en estado crudo y procesado de rojo y tilapia contiene 40% de calcio y 10% de
fósforo. (Gómez, J. y Benítez, M. 2011).
Por otra parte, Benítez y Gómez al realizar el análisis de la composición química de las
escamas, obtuvieron los resultados que se aprecian en la siguiente tabla 2. (Quintero, J y
Zapata, J. 2016).
Tabla 2. Composición de la escama
Composición Escamas Piel Espinas
% Humedad 15,18 ± 0,27 69,94 ± 0,04 53,46 ± 0,07
% Extracto etéreo* 1,05 ± 0,17 18,37 ± 0,13 7,36 ± 0,09
% Cenizas* 32,08 ± 0,23 1,26 ± 0,10 22,91 ± 0,09
% Proteínas* 67,96 ± 0,19 82,27 ± 0,66 55,54 ± 0,22
Fuente: (Gómez, J. y Benítez M. 2011)
5
1.4 Tipos de escamas
1.4.1 Placoides
También llamadas dentículos dérmicos, las escamas placoides se encuentran en los
peces cartilaginosos: tiburones y rayas, a excepción de las quimeras. Estructuralmente,
son homólogas a los dientes de los vertebrados ("dentículo" se traduce como "diente
pequeño"), que tienen una pulpa dentaria central con vasos sanguíneos, rodeada por una
capa cónica de dentina, que se encuentra en la parte superior de una placa basal
rectangular que descansa en la dermis. La capa más externa está compuesta por
Vitrodernia una fusión de la capa media con la sangre, una sustancia inorgánica en gran
medida similar al del esmalte dental. Las escamas placoides no pueden crecer en
tamaño, sino que se van añadiendo a medida que aumenta el tamaño del pez. (Quintero,
J y Zapata, J. 2016).
1.4.2 Cosmoides
Las escamas cosmoides son las que se encuentran en los sarcopterigios: celacantos y
peces pulmonados, probablemente se derivaron de la fusión de escamas placoides. Están
compuestas de una capa de denso hueso laminar llamado isopedina, sobre la que se
dispone una capa de hueso esponjoso con vasos sanguíneos. Las capas de hueso están
cubiertas por una sustancia similar a la dentina llamada cosmina y un recubrimiento
superficial exterior de vitrodentina. (Sharpe, P. 2001)
1.4.3 Ganoides
Las escamas ganoides se encuentran en los esturiones, peces espátula, pejes lagartos,
amias calva y bichires. Se derivan de las escamas cosmoides, con una capa de dentina
en lugar de cosmina y una capa de sal inorgánica del hueso llamada ganoina, en lugar de
vitrodentina. La mayoría tienen forma de diamante y están unidas por articulaciones tipo
clavija y zócalo, (Mathews, C. et al. 2002).
1.4.4 Cicloides y ctenoides
Las escamas cicloides y ctenoides se encuentran en los teleósteos, derivado de los peces
con espinas óseas en sus aletas. Las escamas cicloides tienen bordes lisos, mientras que
las escamas ctenoides tienen dientes diminutos en el borde posterior llamados ctenii, lo
que les da una textura áspera, en forma de peine. Estas escamas casi no contienen hueso,
6
estando compuestas de una capa superficial que contiene hidroxiapatita y carbonato de
calcio y una capa más profunda, compuesta en su mayoría de colágeno. El esmalte de
los otros tipos de escama se reduce a crestas superficiales y ctenii. La mayoría de los
actinopterigios tienen escamas ctenoides. (Pérez, Z. y García, M. 2009).
En los peces planos, algunas especies tienen escamas ctenoides en el lado de los ojos y
escamas cicloides en el lado ciego, mientras que otras especies tienen escamas ctenoides
en los machos y escamas cicloides en las hembras, (Pérez, Z. y García, M. 2009).
A su vez, las escamas ctenoides pueden subdividirse en tres tipos:
Escamas crenadas, donde el margen de la escama tiene muescas y proyecciones.
Escamas espinoides, donde la escama tiene espinas que se continúan con la
misma escama.
Escamas ctenoides "verdaderas", donde las espinas en la escama son estructuras
diferentes.
Las escamas cicloides y ctenoides se superponen, haciéndolas más flexibles que las
escamas cosmoides y ganoides. Crecen en tamaño a través de adiciones al margen
creando bandas de crecimiento estacional desigual llamados annuli. Estas bandas se
pueden utilizar para calcular la edad de los peces, al modo como de manera similar se
hace con los troncos de los árboles. Así, varias bandas muy espaciadas, indicarán un
crecimiento rápido, (Pérez, Z. y García, M. 2009).
1.5 Aplicación de las escamas de pescado en la industria.
En la actualidad las escamas de pescado no son explotadas a nivel industrial,
destinándose sus usos a otros tipos de fines como en alimentación animal, ejemplo es el
caso de productores avícolas en donde incorporan escamas de pescado en la
alimentación de sus codornices quienes, al buscar una mejora en los huevos, adicionan
este subproducto en polvo en busca de un mejoramiento de las cáscaras de sus huevos.
Por otra parte, las escamas son tan poco explotadas que en la actualidad en nuestro país
se las usa como bisutería, creando desde cadenas hasta pulseras y aretes que son
altamente comercializados en la zona costera del país, no dándole un uso realmente
relevante a este subproducto. (Pérez, Z. y García, M. 2009).
7
1.6 Proteína
1.6.1 Definición
Las proteínas son biomoléculas complejas que desempeñan un papel fundamental en la
estructura y funciones de las células, donde pueden llegar a representar más de 50 % de
su peso seco. No en vano, su denominación derivada de la palabra griega proteos, que
significa “primero”, “fundamental”. Desde el punto de vista químico, las proteínas son
biopolímeros formados por carbono, nitrógeno, oxigeno, hidrogeno y, generalmente,
azufre; en ocasiones, pueden contener además hierro, fósforo, cobre o zinc. (M.
Hernández Rodríguez, 1999)
Entre los aminoácidos que más se destacan en las escamas de pescado se encuentra la
prolina, que sufre reacción enzimática en medio básico y forma la hidroxiprolina, como
se puede observar en la figura 1
Figura 1. Formula estructural de la prolina y la hidroxiprolina (Mathews, C. et al.
2002).
1.7 Colágeno
1.7.1 Definición
El colágeno es una de las proteínas más abundantes en la matriz extracelular, es la
proteína más abundante de origen animal que constituye aproximadamente el 25 - 30%
de todas las proteínas de los organismos animales, es un componente importante de
todos los tejidos conectivos del cuerpo (músculos, dientes, huesos y piel) pero se
concentra especialmente en los tejidos asociados a la piel, los huesos y también se
encuentra en el tejido intersticial de prácticamente todos los órganos donde pueden
8
contribuir a la estabilidad de los tejidos, órganos y mantener su estructura e integridad.
(Muyonga, D. 2008).
El colágeno consta de tres cadenas de aminoácidos enlazadas o triple hélice, lo que le
confiere una alta resistencia mecánica y capacidad a la retención de humedad. La
principal función del colágeno es mantener la estructura de los tejidos animales y
mejorar la fuerza, resistencia y flexibilidad de los tejidos, (Gelse, K. et al. 2003).
El colágeno es un conjunto de proteínas fibrosas se encuentra formando la matriz de los
huesos, dientes, cartílagos, tendones uñas, piel y vasos sanguíneos. La unidad
fundamental del colágeno es el tropocolágeno formado por tres cadenas de polipéptidos
de similar tamaño cada una de ellas es una hélice levógira y se van entrelazando entre
sí; el tipo de cadena forma el tropocolágeno que determina el tipo de colágeno. El
colágeno está formado por glicina 33%, prolina 12%, hidroxiprolina 20% e hidroxisilina
10%, presente en solo algunas proteínas. (Stryer, L. 2008).
1.7.2 Tipos de colágenos y familias
Se conocen 19 clases de colágeno que están designadas como tipo I al tipo XIX, aunque
en otros artículos se habla de 26 tipos de colágeno genéticamente distintos, que varían
considerablemente en su complejidad y la diversidad de su estructura. (Bae, I et. 2008).
Cada uno de estos tipos de colágeno se encuentra en un lugar diferente del cuerpo y con
características específicas. La familia más abundante de colágeno con alrededor del
90% del total es el colágeno fibrilar, el cual incluye el colágeno tipo I, II, III, V y XI.
(Gelse, K. et al. 2003).
El colágeno tipo I, es el más abundante y el más estudiado, que forma más del 90% de
la masa orgánica de los huesos, y es el principal en la piel, los tendones, ligamentos, la
córnea y muchos tejidos conectivos. Su función es la de proporcionar rigidez y tracción
en especial en los tendones, huesos y en la mayoría de órganos, este define las
propiedades biomecánicas de carga, rigidez torsional y resistencia a la tracción. (Gelse,
K. et al. 2003).
El tipo II se encuentra especialmente en el cartílago, cuerpo vítreo y núcleo pulposo; es
el componente predominante del cartílago hialino, y además define propiedades
biomecánicas como el colágeno tipo I. El colágeno tipo III hace parte importante de las
fibras reticulares en los tejidos intersticiales de los pulmones, el hígado, la dermis y el
bazo. El tipo V y XI se consideran una subfamilia del colágeno fibrilar pues se mezclan
9
con los tipos mencionados anteriormente y forman condiciones específicas, es el caso de
la unión del colágeno tipo V con el tipo I y III, contribuyendo a la matriz orgánica del
hueso, el hígado, los pulmones, la placenta y en la córnea. El colágeno tipo II y el tipo
XI se distribuyen en el cartílago articular, proveyendo estabilidad de torsión y fuerza de
tracción a sus tejidos, (Gelse, K. et al. 2003).
Otra familia del colágeno está comprendida por los tipos IX, XII, XIV, XIX, XX y XXI,
los cuales se distribuyen especialmente en el cartílago, córnea y humor vítreo (IX):
ligamentos y tendones (XII), la dermis, pared del vaso, placenta, pulmones e hígado
(XIV); epitelio de la córnea, piel embrionaria, cartílago esternal y tendón (XX); pared
de los vasos sanguíneos (XXI) (Gelse, K. et. 2003). Existen otros tipos de colágeno
como el VI, llamado microfibrilar, que se encuentra en la dermis, cartílago, placenta, los
pulmones, la pared del vaso y en el disco intervertebral. El tipo IV, que se encuentra en
las membranas basales y el colágeno de anclaje tipo VII, ubicado especialmente en la
piel, en la mucosa oral, en el cuello uterino y en las uniones dermo – epidérmica,
(Gelse, K. et al. 2003).
1.7.3 Tipos de fuentes de colágeno
El colágeno se obtiene principalmente de origen porcino y bovino, pero la comunidad
científica en la última década ha buscado nuevas fuentes de extracción debido al
rechazo asociado a creencias religiosas y enfermedades bovinas, como los brotes de
encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y fiebre aftosa (FA) que pueden pasar de los
bovinos a los humanos (Liu y Huand, 2016).
Recientemente, el colágeno extraído de pescado ha ganado más atención debido a que
los productos provenientes de pescado tienen más colágeno y se consideran una fuente
más segura en comparación con otros animales (El et al., 2015).
En el mercado actualmente se oferta colágeno de origen bovino y marino. El primero es
fabricado y comercializado por laboratorios, el segundo es importado principalmente de
Alemania, Japón, Países Bajos, Francia y Canadá (Liu y Huand, 2016).
A partir del proceso de fileteo se produce piel, espinas y escamas de pescado, que
constituyen residuos con impactos ambientales importantes. A nivel global se han
adelantado estudios para la obtención de colágeno de diferentes tipos de peces a partir
de sus escamas (Serrano, 2011).
10
1.7.4 Formula del colágeno
El colágeno es el mayor componente del tejido animal, forma parte de la familia de las
proteínas fibrosas, su principal función es la de soporte estructural y celular. La
molécula de colágeno está constituida por tres cadenas polipeptidicas denominadas
cadenas α, dos cadenas α idénticas designadas como α1 y una cadena de α diferente α2
que se enrollan sobre sí mismas formando una súper cadena de una longitud de 300 nm,
un diámetro de 1.5 nm y un peso molecular de 300 kDa (Gómez-Lizárraga. et al, 2011).
La anterior secuencia está compuesta por unidades repetitivas de tres aminoácidos, esta
unidad repetitiva es Gly-X-Y, en donde la posición X está ocupada por el aminoácido
prolina y en la posición Y generalmente se encuentra el aminoácido hidroxiprolina. La
hidroxiprolina constituye aproximadamente entre el 10 y 14 % de la composición del
colágeno y se encuentra exclusivamente en este tipo de proteínas (colágenas) (Dull y
Henneman, 1963; Platt. et al,1964).
Figura 2. Estructura del colágeno, (Lehninger & Nelson, 1995 y Gatta, Badea, &
Saczuk, 2010)
1.7.5 Extracción del colágeno
Existen varios métodos para la extracción de colágeno y a continuación se hace un
resumen de los procesos de extracción de colágeno a partir de escamas de pescado:
11
El método (M1), consistió en: Desproteinización: se eliminan las proteínas no
constitutivas de colágeno y otros residuos superficiales, usando una solución
ajustada a pH 7,5 de NaCl 1,0M, Tris-HCl 0,05M, EDTA 20mM en agitación
mecánica por 48 horas. Decationización: para remover compuestos minerales,
las escamas se trataron con una solución de EDTA 0,44M (pH 7,5), durante 48
horas, en agitación magnética constante y manteniendo una temperatura por
debajo de 15 ºC. seguidamente la extracción y recuperación de colágeno: las
escamas recuperadas, se trataron con una solución de ácido acético 0,5M por 72
horas en agitación mecánica, a una temperatura por debajo de los 15 ºC.
Después, se separó el licor del material sólido (escamas), la fracción líquida
contiene el colágeno soluble en ácido. Finalmente hicieron neutralización a
cambio del pH con NaOH 1M, para precipitar el colágeno, se centrifugó,
liofilizó y se secó en estufa a vacío a una temperatura de 40 ºC por 24 horas.
(Paty et al, 2010)
El método (M2), se realizó de la siguiente manera: Desproteinización: para
eliminar las proteínas no constitutivas de colágeno y otros residuos superficiales
se usó una solución de NaOH 0,1M por 6 horas. Decationización: las escamas
provenientes de la etapa anterior se trataron con una solución de EDTA 0,44M
(pH 7,5), durante 24 horas, en agitación magnética y a una temperatura por
debajo de 15 ºC. La extracción y recuperación de colágeno: las escamas
provenientes de la etapa anterior se trataron con una solución de ácido acético
0,5M por 96 horas, en agitación mecánica, a una temperatura por debajo de 15
ºC. Finalmente se separó el licor del material sólido (escamas), la fracción
líquida contiene el colágeno soluble en ácido este se neutralizo el pH con NaOH
1M, para precipitar el colágeno, se centrifugó, liofilizó y se secó en estufa de
vacío a una temperatura de 40 ºC por 24 horas. (Duan, et al, 2009)
El método (M3) está basado en el propuesto por Duan y colaboradores: Se
invirtió el orden de los procesos, como primer paso se realizó la decationización
(mismas condiciones descritas para M2), posteriormente la desproteinización fue
por un tiempo de 3 horas, y para la extracción ácida de colágeno se sustituyó el
ácido acético por ácido cítrico; después de las primeras 24 horas en agitación, se
retiró el sobrenadante que contenía hidroxiapatita, se continuó con el tratamiento
12
ácido durante 48 horas más, para obtener el colágeno, mediante el mismo
procedimiento descrito para M2. (Jurnal. 2017)
Figura 3. Esquema general de los métodos empleados para la obtención de
colágeno (Jurnal. 2017)
1.7.6 Cuantificación de hidroxiprolina
La hidroxiprolina es el aminoácido característico del colágeno, es producido por la
hidroxilación en presencia de la prolina y la glicina (Figura 1). Su cuantificación se
realizó aplicando el método colorimétrico descrito en la Norma Técnica Colombiana
NTC 3750 (ICONTEC, 2002). Las muestras fueron sometidas a una hidrolisis acida con
HCl 6,0 M durante 12 horas a 90 °C, posteriormente se diluyo una alícuota del
hidrolizado en relación 1:20 con agua destilada seguidamente 1 ml de la solución se
mezcló con una relación igual de sulfato cúprico 0,01N, hidróxido de sodio 2,5 M,
peróxido de hidrogeno al 6% y 0,1 ml de sulfato ferroso 0,05 M, luego de agitar
13
vigorosamente la muestra hasta que desaparecieran las burbujas de gas, se adicionó 4,0
ml de ácido sulfúrico 3N y 2 ml de la solución de p-dimetilaminobenzaldehído al 5%.
Se calentó durante 16 min a 70 °C con un posterior choque térmico en un baño de hielo,
se midió la absorbancia en un espectrofotómetro UV/VIS Genesys 10s marca Thermo a
540nm. (Tang et ai, 2015).
1.8 Determinación de proteínas
El método más utilizado para la determinación de proteína es el método de Kjeldahl, el
cual determina la proteína total. En general, el procedimiento de referencia Kjeldahl
determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no proteínas como las
proteínas verdaderas.
El método de Kjeldahl consta de las siguientes etapas (1):
(1)
En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el punto de ebullición
y un catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el
destilado se retiene o bien por un ácido normalizado y se valora por retroceso, o en
ácido bórico y valora directamente. El método Kjeldahl no determina, sin embargo,
todas las formas de nitrógeno a menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye
nitratos y nitritos. (Pearson, 1993)
La mayoría de las proteínas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrógeno (2).
(2)
%N2 X factor = % Proteína cruda (3)
El método se basa en la determinación de la cantidad de Nitrógeno orgánico contenido
en los productos, compromete dos pasos consecutivos:
14
a) La descomposición de la materia orgánica bajo calentamiento en presencia de ácido
sulfúrico concentrado.
b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra
Durante el proceso de descomposición ocurre la deshidratación y carbonización de la
materia orgánica combinada con la oxidación de carbono a dióxido de carbono. El
nitrógeno orgánico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolución como
sulfato de amonio. La velocidad del proceso puede incrementarse adicionando sales que
aumenten la temperatura de descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de
oxidantes (peróxido de hidrógeno, tetracloruro, persulfatos o ácido crómico) y por la
adición de un catalizador. (Nollet, 1996)
15
2. METODOLOGÍA
El desarrollo de los experimentos se realizó en el Laboratorio de Investigación de la
Facultad de Ingeniería Química, Universidad Central del Ecuador a cargo del Ing. Pablo
Londoño. Además, se realizaron ciertos análisis en el Laboratorio de LASA ubicado en
la ciudad de Quito, donde se cuantificó el nitrógeno total de nuestros ensayos.
Para la obtención del colágeno, la metodología utilizada consta de cinco subprocesos.
Se inicia con la recolección de la materia prima (escamas), proporcionadas por la
distribuidora de mariscos Quito, ubicado en el mercado de San Roque del Distrito
Metropolitano de Quito (DMQ).
En el primer subproceso se realiza un tratamiento de lavado en 3 etapas donde se retira
impurezas, partículas extrañas y se desinfecta a las escamas. La segunda etapa se realiza
el secado de las escamas. El tercero proceso es la molienda de la escama para obtener
un diámetro de partícula adecuado. El cuarto proceso es la extracción del colágeno
aplicando una operación de extracción solido-líquido. El quinto proceso es la
cuantificación del colágeno a nivel de las proteínas y los nitrógenos totales, esta parte se
realiza en el Laboratorio externo a la Universidad y a su vez se calcula aplicando el
factor de trasformación del método Kjeldahl,
Figura 4. Diagrama del proceso de extracción de colágeno
RECOLECCIÓN LAVADOS SECADO
MOLIENDA EXTRACCIÓN
16
Para el desarrollo del proyecto de investigación se realizó la revisión bibliográfica de
artículos científicos y trabajos sobre el tema para poder establecer el diseño
experimental que se observa en la figura 5, con el cual se estableció la cantidad de
ensayos a realizar, y se estableció los parámetros de operación:
Variables Dependientes: 2 tipos de diámetro de partícula (escamas), 2 relaciones
volumétricas en la extracción (solvente: muestra)
Variables Independientes: 2 medidas de temperaturas
Para un total de 8 ensayos y haciendo una réplica del resultado que genere la mayor
concentración, como se ilustra en la siguiente figura 5:
D1= diámetro de partícula 2mm
D2= diámetro de partícula 10mm
T1= temperatura de 20ºC
T2= temperatura de 90ºC
R1= relación solvente: muestra 90:10
R2= relación solvente: muestra 98:2
17
Figura 5. Diagrama de flujo diseño experimental para la obtención de colágeno
Escamas de
pescado
Lutjanus
campechanus
(rojo) y
Labrus
bergylta
(pardo)
D1
D2
T1
T1
T2
T2
R1
R1
R1
R1
R2
R2
R2
R2
Ensayo 1
Ensayo 2
Ensayo 3
Ensayo 4
Ensayo 5
Ensayo 6
Ensayo 7
Ensayo 8
18
2.1 Materiales y Equipos
Matraz Erlenmeyer V=250 ml Ap: ± 50 ml
Vasos de precipitación V=500 ml Ap: ± 50 ml
V=1000 ml Ap: ± 250 ml
Probeta graduada V=100 ml Ap: ± 1 ml
Recipientes de plástico V=500 ml
Plancha de calentamiento Rango= 0-550ºC Ap: ± 0,5 ºC
Molino ultra centrifugo SM300 Rango= 0-1500 rpm
Potenciómetro pH= 0-14 Ap: ± 0,001
Balanza analítica Rango= 0-250g Ap: ± 0,01g
Papel aluminio
Agitadores
Termómetro Rango= 10-200ºC Ap: ± 10 ºC
Cronometro digital Sony
Tamizador Rango= 1mm
Refrigerador Rango=-10 a 15 ºC Ap: ± 5ºC
Estufa Memmert Rango= 0-220ºC Ap: ± 0,5ºC
Embudos de vidrio
Pinzas metálicas
Espátula
2.2 Sustancias y Reactivos
Ácido Acético CH3COOH(l) 4%(v/v)
Agua purificada H2O(l)
Escama de pescado rojo
Escama de pescado pardo
Agua potable H2O(l)
Tripteina Soya Agar (TSA)
Agua de peptona
Agar nutritivo
2.3 Procedimiento
2.3.1 Recolección de materia prima
Se recolectaron las escamas de los pescados en el mercado de San Roque del Distrito
Metropolitano de Quito (DMQ), los días de feria que son el martes y el jueves de cada
19
semana. Las escamas se colocan en recipientes de plástico y se llevaron a un
refrigerador a una temperatura de -10ºC.
2.3.2 Proceso de tratamiento de lavado de las escamas
Se colocó las escamas en un vaso de precipitación, y se procede a realizar el lavado
cubriendo con agua potable y se retira las partículas extrañas a las escamas, se vota el
agua con mucho cuidado sin dejar escapar nuestra materia prima. Se repite el proceso de
lavado realizando el cambio de agua potable por agua purificada. Se coloca las escamas
en un recipiente de acero inoxidable y se le adiciona ácido acético se realiza
movimientos circulares y se deja reposar por unos 20 minutos, en esta etapa se trata de
reducir la carga microbiana que las escamas adquieren durante la recolección.
Finalmente, se realiza un tercer lavado, en este paso se retira el exceso de ácido que
pudieron quedar en el proceso anterior, se toma las precauciones para no eliminar
materia prima al momento de retirar el agua de lavado.
2.3.3 Proceso de secado
Se realizó el proceso en una estufa Memmert en un rango de 50 -60 ºC por un tiempo de
8 horas, el equipo se encuentra en el Laboratorio de Investigación de la Facultad de
Ingeniería Química (UCE), en este paso se endurece y se retira la humedad de las
escamas en un 95%, y se obtiene un producto sólido.
2.3.4 Proceso de molienda
Después de transcurridas las 8 horas se procede a moler las escamas en un molino ultra
centrifugo SM300 a una velocidad de 1200 rpm el equipo se encuentra en las
instalaciones del Laboratorio de Investigación de la Facultad de Ingeniería Química
(UCE), para reducir el diámetro de partícula a 10 mm y 2 mm, se realizó la molienda de
aproximadamente 3 libras de escama.
2.3.5 Proceso de extracción sólido-líquido
Se preparan las escamas en pesos y volumen con las relaciones ya establecidas en la
figura 5. Para los 8 ensayos se procede a colocar el agua purificada, con la ayuda de una
20
plancha de calentamiento se procede al aumento de temperatura para los ensayos que
requieran, los que no se deja reposar por 4 horas.
Todo este proceso se realiza en el Laboratorio de Investigación de la Facultad de
Ingeniería Química (UCE) con toda la parte instrumental que requiere el proceso de
extracción.
2.3.6 Proceso de separación
Una vez que se realizó el proceso de extracción, se separó la materia que no se ha
disuelto para este proceso se utiliza un tamiz de 1 mm y el líquido se coloca en vasos de
precipitación y se deja en el refrigerador a una temperatura de 13ºC por 12 horas.
2.3.7 Caracterización de las muestras obtenidas de colágeno
Se procede a realizar las pruebas físico-químicas y organolépticas, tales como: pH,
apariencia, olor, sabor, estas pruebas se hacen para cada ensayo y los datos se presentan
en tablas.
Después de realizados los ensayos y verificando los resultados para nuestra mejor
experimentación se realiza un análisis microbiológico de rutina al ensayo N3, esto se lo
realiza en la Universidad Politécnica Salesiana del Ecuador Facultad de Biotecnología.
Para la parte microbiológica se procedió a pesar 10 gramos de la muestra del ensayo 3
luego se añadió 90 ml de agua de peptona (mezcla A), se toma una alícuota de 10 ul de
mezcla A y se coloca en las cajas Petri que están con el medio Tripteina Soya Agar
(TSA) y agar nutritivo.
Se procede a encubra las muestras de TSA a 35 ºC después de 3 días se verificará los
resultados para la presenta de bacterias aerobias mesófilas, la muestra de agar nutritivo
se encuba 25 ºC después de 5 días se verifica los resultados para la presencia de hongos
y levaduras.
2.3.8 Cuantificación de las proteínas
La cuantificación de las proteínas se calcula mediante la multiplicación del nitrógeno
total que se obtuvo de la aplicación del método Kjeldahl a las muestras por el factor
6,25, y se obtiene el valor de las proteínas totales.
El ensayo de nitrógeno total se lo realiza en las instalaciones del Laboratorio LASA
Ubicado en la Ciudad de Quito sector Parque Ingles.
21
2.4 Diagrama de flujo total del proceso para la obtención de colágeno.
Figura 6. Diagrama de flujo proceso de obtención del colágeno.
22
2.5 Datos obtenidos
Los resultados obtenidos fueron tabulados en tablas, para facilitar la visualización de los
procesos de la investigación.
2.5.1 Volumen final de colágeno
El volumen final obtenido de colágeno después de ser sometido a las condiciones de
extracción es tabulado en la Tabla 4.
El volumen inicial que se ocupó para los 8 ensayos es de 1000 mL, como podemos
observar en la tabla 3 el volumen final es menor, esto debido a la temperatura a la cual
son sometidos los ensayos de 90ºC.
Tabla 3. Condiciones de operación optimas
Escamas de pescado Lutjanus campechanus (rojo) y Labrus bergylta (pardo)
D1= 10 mm D2= 2 mm
T2= 90ºC T1= 20ºC T2= 90ºC T1= 20ºC
R2=
98:2
R1=
90:10
R2=
98:2
R1=
90:10
R2=
98:2
R1=
90:10
R2=
98:2
R1=
90:10
Ensayo
8
Ensayo
7
Ensayo
6
Ensayo
5
Ensayo
4
Ensayo
3
Ensayo
2
Ensayo
1
Luego de seleccionado los parámetros que dieron los mejores valores de obtención de
volumen final de colágeno, como son: mezcla (90:10), temperatura de 90ºC y diámetro
de partícula 2mm, los resultados se muestran en la tabla 3, los cuales dieron un
porcentaje de recuperación entre 95 y 40%.
Tabla 4 Volumen final recuperado de colágeno
Ensayos Volumen (mL) % Recuperación
E1 750 75
E2 950 95
E3 400 40
E4 480 48
E5 750 75
E6 950 95
E7 570 57
E8 660 66
23
2.5.2 Propiedades organolépticas
La organoléptica es un factor importante en la caracterización del colágeno, por su
origen marino, la escama tiende a adquirir un olor desagradable; por lo que se debe
controlar esta propiedad para no tener un colágeno con mal olor.
En la Tabla 5. se indica las propiedades organolépticas de los 8 ensayos, esta propiedad
como se observa en la tabla da para casi todos los ensayos un resultado característico.
Tabla 5. Propiedades organolépticas del colágeno
Ensayos Olor
E1 Característico (escamas de pescado)
E2 Característico (escamas de pescado)
E3 Característico (escamas de pescado)
E4 Característico (escamas de pescado)
E5 Sin olor
E6 Sin olor
E7 Característico (escamas de pescado)
E8 Característico (escamas de pescado)
2.5.3 Propiedades físicas
El aspecto del producto final es de gran importancia, en la Tabla 6 se tabulan los datos
obtenidos del color en cada uno de los ensayos. El mismo que podemos observar que
tiene un patrón de repetición del color plomo el cual es característico de las escamas.
Tabla 6. Color del colágeno obtenido.
Ensayos Color
E1 Plomo
E2 Plomo
E3 Café
E4 Amarillo
E5 Plomo
E6 Casi transparente
E7 Amarillo
E8 Plomo
24
2.5.4 Apariencia del colágeno
Las soluciones obtenidas deben mostrar una apariencia muy acorde al producto de
extracción que es colágeno, en la Tabla 7 se muestra las observaciones obtenidas en la
extracción final del colágeno, indicando que no se tiene presencia de partículas extrañas
y fue solución homogénea.
Tabla 7. Aspectos físicos de los ensayos realizados.
Ensayos Aspecto
E1 Solución homogénea sin presencia de
partículas extrañas
E2 Solución homogénea sin presencia de
partículas extrañas
E3 Solución homogénea sin presencia de
partículas extrañas
E4 Solución homogénea sin presencia de
partículas extrañas
E5 Solución homogénea sin presencia de
partículas extrañas
E6 Solución homogénea sin presencia de
partículas extrañas
E7 Solución homogénea sin presencia de
partículas extrañas
E8 Solución homogénea sin presencia de
partículas extrañas
2.5.5 pH
El pH del colágeno es un factor importante, el cual se debe mantener entre pH 7 y 8 casi
neutro, en la tabla 8 se puede ver los datos obtenidos y la temperatura a la cual fueron
medidos las soluciones.
Para la obtención de los datos se trató de que casi todos los ensayos tengan la misma
temperatura o una variación no muy significativa.
25
Tabla 8. Medición de pH y temperatura de los ensayos
Ensayos pH Temperatura
(ºC)
E1 7,885 20,4
E2 7,582 20,1
E3 8,030 20,9
E4 8,012 21,4
E5 7,765 19,9
E6 7,244 19,7
E7 7,709 20,2
E8 7,627 20,2
2.5.6 Nitrógeno total
Los datos de nitrógeno total fueron obtenidos en el laboratorio LASA, mediante
métodos internos certificados, estos análisis se observan en la parte final de los anexos.
A continuación, la tabla 9 resume los datos para los 8 ensayos.
El nitrógeno teórico es de 10,87 % con el cual se tiene un rendimiento del 100%
Tabla 9. Porcentajes de nitrógeno total de las muestras.
Ensayos % N2
E1 1
E2 0,3
E3 6,5
E4 1,8
E5 0,3
E6 0,3
E7 2,3
E8 1,1
26
3. CÁLCULOS Y RESULTADOS
3.1 Cálculo de proteínas totales
Para realizar el cálculo de las proteínas totales se multiplica el valor obtenido de los
ensayos de nitrógenos totales por el factor que nos da el método Kjeldahl 6,25, en la
tabla 10 se observa los valores obtenidos una vez que se aplicó el factor del método
Kjeldahl y tenemos el porcentaje de proteínas presentes en cada ensayo.
Tabla 10. Porcentajes de proteínas totales
Ensayos % N2 % Proteínas totales
E1 1 6,25
E2 0,3 1,875
E3 6,5 40,625
E4 1,8 11,25
E5 0,3 1,875
E6 0,3 1,875
E7 2,3 14,375
E8 1,1 6,875
Gráfico 1. Porcentaje de proteínas totales
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
% P
rote
inas
Ensayos
Porcentaje de proteinas totales
27
3.2 Cálculos de rendimiento de proteínas presentes en los ensayos
Para realizar el cálculo del rendimiento se toma una base de cálculo de los resultados
obtenidos en la tabla 2, donde se detalla el porcentaje de proteína para las escamas con
un valor de 67,96 %. A continuación, se detalla en la tabla 11 los resultados del
porcentaje de rendimiento obtenido para los ensayos.
Tabla 11. Calculo del rendimiento de la obtención de colágeno
Ensayos % Proteínas
totales
% Rendimiento
E1 6,25 9,20
E2 1,875 2,75
E3 40,625 60.00
E4 11,25 16,55
E5 1,875 2,75
E6 1,875 2,75
E7 14,375 21,15
E8 6,875 10,11
Gráfico 2. Rendimiento del proceso de extracción de colágeno
0
10
20
30
40
50
60
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
% R
end
imie
nto
Ensayos
Rendimiento del proceso de extracción de colágeno
28
3.3 Tendencia del pH en función de la temperatura.
Tomando los datos de la tabla 8 se verifica la tendencia que presenta el proceso de
extracción del colágeno, tomando en cuenta el pH de las soluciones finales en función
de la temperatura.
A continuación, el gráfico 3 nos refleja la tendencia obtenida.
Gráfico 3. Tendencia del pH en función de la temperatura
3.4 Volumen final de colágeno obtenido
El volumen final después de realizar la extracción dio el volumen final del colágeno. En
el gráfico N4, se observa el volumen que se recuperó a las diferentes condiciones de
operación en cada uno de los ensayos.
Grafico 4. Volumen final de colágeno
20,4
20,1
20,9
21,4
19,9 19,7
20,2 20,2
19,619,8
2020,220,420,620,8
2121,221,421,6
7,2 7,4 7,6 7,8 8 8,2
Tem
per
atu
ra º
C
Escala de pH
Tendencia del pH en función de la temperatura
0
200
400
600
800
1000
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
Vo
lum
en (
mL)
Ensayos
Volumen final de colágeno
29
3.5 Resultados de las encuestas de consumo de pescado
Se verifico el consumo de las dos especiales de pescados en el Distrito Metropolitano de
Quito en tres mercados de la cuidad:
Mercado Iñaquito
Mercado de San Roque
Mercado de Santa Clara
En estos tres establecimientos se realizó una encuesta a los comerciantes de los locales
durante tres meses que fueron mayo, junio y julio del año 2018, en los cuales indicaron
la cantidad de pescado vendido a los consumidores.
En la tabla 12 se tabularon los datos obtenidos y se presenta a continuación:
Tabla 12. Encuesta de consumo de pescado Rojo y Pardo
Establecimiento
Mayo Junio Julio
Rojo Pardo Rojo Pardo Rojo Pardo
ton ton Ton ton ton ton
Mercado
Iñaquito
350 200 400 380 370 300
Mercado San
Roque
480 320 500 400 450 380
Mercado Santa
Clara
320 380 400 430 280 350
3.6 Costo de obtención de colágeno
En la tabla 13 se analiza los gastos que genero la obtención de colágeno en este
proyecto de investigación, los factores que se tomaron en cuenta fueron materia prima,
mano de obra, recursos utilizados, análisis físico-químicos y cuantificación de colágeno.
30
Tabla 13. Costos de obtención del colágeno
Nº Factores Costo (dólares)
1 Escama de pescado 0,00
2 Reactivos 3,00
3 Análisis de nitrógeno total 20,00
4 Equipo instrumental 30,00
5 Gastos energéticos 10,00
6 Material de recolección 2,00
7 Varios 15,00
8 Análisis microbiológicos 45,00
TOTAL 122,00
Base de muestra analizada 400 ml de colágeno.
3.7 Resultado del análisis microbiológico de rutina para el ensayo numero 3
El análisis microbiológico de rutina dio resultados negativos para la presencia de
bacterias aerobias mesófilas, hongos y levaduras. Esto se evaluó en dos medios
Tripteina Soya Agar (TSA) y agar nutritivo. En las cajas petri no se visualiza unidades
formadoras de colonias, como se puede ver en el anexo H (figura H1 y H2).
31
4. DISCUSIÓN
Selección de la materia prima
Antes de iniciar la investigación, se realizó un estudio basado en encuestas en
tres mercados del Distrito Metropolitano de Quito (DMQ), los resultados
arrojaron que las especias de pescado que más se consume son rojo y pardo, por
lo que los desechos generados son altos y producen una contaminación. Con el
objetivo de dar un valor agregado a estos desechos con la extracción del
colágeno a partir de las escamas, se planteó esta investigación la cual luego de
una revisión bibliográfica se procedió con toda la fase de experimentación la
cual se muestra en la tabla 12.
Extracción del colágeno
La composición y la concentración de colágeno presente en las escamas de
pescado rojo y pardo, está relacionada directamente con la especie del cual
provienen las escamas, la cantidad de colágeno obtenido tiene variación de
acuerdo a las condiciones de extracción.
La extracción del colágeno está acompañada de impurezas, se realiza una
remoción de las mismas por continuos lavados y posterior secado. Estos
procesos pueden alterar el rendimiento de la extracción del colágeno generando
una pobre extracción del mismo.
Condiciones de extracción del colágeno
La reducción del diámetro de partícula fue un aparte esencial del proceso de
extracción del colágeno, en primera instancia se realiza la molienda en un
molino centrifugo, pero debido a que las condiciones físicas de las escamas no
permitieron que el rendimiento fuera el adecuado, ya que el tamaño de partícula
obtenido no fue homogéneo, se cambió a un molino ultra centrifugo en el que se
obtuvo mayor rendimiento con un diámetro de partícula de 2mm que permitió
una mejor superficie de contacto con la mezcla de solvente dando una mayor
extracción de colágeno.
32
La relación agua-escama que se ocupó para los ensayos fueron: R1=90:10 y
R2=98:2. Para establecer estas relaciones se realizaron pruebas de humectación a
las escamas.
Caracterización del colágeno
La caracterización del colágeno, se realizó en base a pruebas físico-químicas,
organolépticas y de cuantificación de nitrógeno y proteínas. La cuantificación de
nitrógeno se realizó en el Laboratorio LASA, el cual tiene métodos internos
validados y certificados, ver anexo I (figura I9 e I10). En el caso de proteínas se
ocupó la ecuación de método Kjeldahl para obtener el porcentaje total, cuyos
resultados, se observa en la tabla 10.
La parte microbiológica se realizó con bases en la experiencia adquirida en las
practicas pre-profesionales realizadas en la Empresa Grunenthal del Ecuador en
el área de Microbiología, donde se manejó medios de cultivo, se activó bacterias
y se verificaba los ensayos para proceder a la elaboración de informes
microbiológicos
El análisis de los ensayos tabulados en la tabla 10 y comparados con los
reportados, muestran que el porcentaje obtenido de proteína 40,625 % es similar
al reportado por Benitez cuyo valor era 67,96. Esto demuestra que en este
estudio el rendimiento total de colágeno es de 60%, lo que indica que es
considerablemente buena la técnica a aplicada.
Basado en los resultados por el método Kjeldahl de proteína se pudo cuantificar
el colágeno extraído sin tener que hacer uso de la cuantificación por HPLC que
implica costos altos por la adquisición de estándares, columnas y solventes.
En el gráfico N3 se observa la tendencia del pH en función de la temperatura,
observando que esta aumenta de una manera creciente, se debe mencionar que
para los 8 ensayos se trató de tener un rango no muy grande para evitar datos
erróneos o a su vez tener que suprimir datos para que no afecte los resultados.
Los rangos de temperatura fueron de 19,6 a 21,6 y del pH 7,2 a 8,2.
33
Los análisis de costos están basados en el ensayo N3 como se observa en la tabla
N11 fue la que presento los mejores resultados de extracción de colágeno, es
decir 400 ml que equivale a un 60 % de producto recuperado de colágeno.
El ensayo que reporto mayor porcentaje de nitrógeno y proteína total fue el
número 3, lo que demuestra que las condiciones empleadas como un diámetro de
partícula de 2 mm y una temperatura de 90 ºC favorece la extracción del
colágeno.
34
5. CONCLUSIONES
En el presente trabajo de investigación se obtuvo colágeno mediante la operación
unitaria de extracción solido-líquido a partir de las escamas de pescado de la variedad
rojo (Lutjanus campechanus) y pardo (Labrus bergylta) con un rendimiento de 60%,
constituyendo una alternativa innovadora para el procesamiento de estos desechos y
generar un producto con propiedades para la industria farmacéutica.
La extracción del colágeno y la cuantificación de sus propiedades que generaron
mejores condiciones, de acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 10 y el grafico
2, fueron las del ensayo N3 donde se tiene las siguientes condiciones de extracción D1:2
mm, T2:90ºC, R1:90:10, esto nos da un porcentaje de proteína de 40,625%.
El diámetro de partícula es determinante para un buen proceso de extracción sólido–
líquido, como se presentan en los resultados de la tabla 11, el diámetro de partícula que
genero mayor rendimiento fue la de 2mm, porque al tener mayor contacto de solvente
este puede extraer de mejor forma el colágeno.
La mayor concentración de proteína se obtuvo a un pH de 8,3 como se muestra en la
tabla 8 y grafica 3, luego de realizar 8 ensayos, y esto depende de mantener una
temperatura a 90ºC.
El color de las muestras obtenidas según la tabla 6, nos indica que la temperatura 1 se
obtiene en colores plomo y transparentes, mientras que a la temperatura 2, se presentan
colores más fuertes como café y amarillo, debido a que tenemos un mayor rompimiento
de la escama y toma el color de su parte central que es plomo intenso, esta cambio de
coloración se debe a la composición de la escama que tiene presencia de carbonato de
calcio y de fosfato de calcio también se atribuye a las fibrillas de las cuales está
compuesto el colágeno.
35
Se obtuvo un rendimiento total de extracción de colágeno de 60 %, lo que hace ver que
la materia prima se encuentra enriquecida en esta proteína que se la puede aprovechar
para la obtención de productos a base de colágeno de origen marino, el cual es muy
bueno frente a los otros colágenos que son porcino y bovino.
En la parte microbiológica se concluye que el proceso de extracción del colágeno es
muy bueno porque no presento pruebas positivas para la presencia de colonias
formadoras de microorganismos, esto se debe a las condiciones de almacenamiento frio,
al proceso de lavado con ácido acético y su extracción a 90 ºC.
36
6. RECOMENDACIONES
Analizar las características de otros tipos de escama de pescados provenientes de
otros tipos de especies para definir la cantidad de colágeno expresado en
proteínas.
Optimizar las condiciones de extracción del colágeno, en un reactor con sensores
de temperatura digital, sistema de agitación continua y cronometrar el tiempo,
para mantener las condiciones constantes mientras se realiza la extracción
sólido-líquido, esta recomendación se la puede implementar en una empresa y
así se puede financiar el estudiante, tomando en cuenta que los costos de diseño
y construcción para un reactor son elevados.
Realizar investigaciones sobre la extracción de colágeno reemplazando el
solvente por un medio básico o a su vez un medio ácido, luego realizar una
comparación de rendimiento de proteínas, para saber cuál método es mejor.
Al tener un residuo de escama realizar una caracterización de esta materia y
verificar que componentes quedan después de la extracción del colágeno, este
residuo puede tener trazas mínimas de colágeno o a su vez servir como materia
prima para otros procesos, todo dependerá de que componentes está constituido.
Se recomienda aplicar un método de cuantificación de colágeno aplicando la
farmacopea USP-34, el cual indica que se debe trabajar con la enzima
colagenaza, para lo cual se debe extraerla una vez obtenido el colágeno,
posterior se debe adquirir los estándares de materia prima que se va a utilizar,
todo el ensayo se lo realiza en un equipo de HPLC el cual debe estar adecuado
con su columna para la prueba de colágeno.
Se recomienda realizar estudios donde se analice la influencia de otras variables,
como la velocidad de reacción, el tiempo de extracción, la agitación,
maximizando la cantidad de colágeno extraído que se puede obtener por muestra
de escamas.
37
Se recomienda realizar los ensayos de cuantificación de colágeno para el
presente proyecto de investigación con la escama de pescado de las mismas
especies, pero llegando a un estado de polvo fino con el fin de no tener residuos
después de la extracción, debido a que las escamas generan una cantidad de
residuos que no han sido aprovechados.
En vista que el colágeno obtenido tiene un porcentaje que sobre pasa el 50 % de
proteínas totales fijo en su composición, se recomienda realizar un estudio de las
posibles aplicaciones para el aprovechamiento del mismo en el campo cosmético
y alimenticio.
38
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ANEXOS
42
Anexo A. Proceso de recolección de las escamas
Figura A1. Descamación de pescado rojo
Figura A2. Descamación de pescado pardo
43
Anexo B. Lavado de escamas
Figura B1. Lavado 1 retiro de impurezas de las escamas
Figura B2. Lavado 2 con ácido acético 4% (v/v)
Figura B3. Lavado 3 con agua destilada
44
Anexo C. Proceso de secado de las escamas realizado en una Estufa Memmert
Figura C1. Colocación de las escamas en las bandejas de secado.
Figura C2. Colocación de las escamas en el horno de secado
Figura C3. Escama seca
45
Anexo D. Molienda de las escamas
Figura D1. Proceso de reducción de partícula utilizando el molino ultra centrifugo
SM300 que está ubicado en el Laboratorio de Investigación de la Facultad de
Ingeniería química UCE.
46
Anexo E. Proceso de extracción del colágeno.
Figura E1. Extracción del colágeno con ayuda de la temperatura a 90ºC
Figura E2. Extracción del colágeno a temperatura de 20ºC
47
Anexo F. Separación del residuo de la extracción de colágeno
Figura F1. Separación del colágeno del pescado
Figura F2. Separación del colágeno del pescado
48
Anexo G. Almacenamiento frio
Figura G1. Almacenamiento del colágeno obtenido
Figura G2. Volumen final obtenidos de colágeno
Figura G3. Muestras de los 8 ensayos para análisis
49
Anexo H. Análisis de rutina microbiológico para el ensayo 3 de colágeno
Figura H1. Prueba de rutina para el ensayo N3 análisis microbiológico en Agar
Nutritivo, realizados en la Universidad Pontifica Salesiana del Ecuador, Facultad
de Biotecnología.
Figura H2. Prueba de rutina para el ensayo N3 análisis microbiológico en TSA,
realizados en la Universidad Pontifica Salesiana del Ecuador, Facultad de
Biotecnología.
50
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M1. Reporte de análisis ensayo 1
51
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M2. Reporte de análisis ensayo 2
52
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M3. Reporte de análisis ensayo 3
53
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M4. Reporte de análisis ensayo 4
54
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M5. Reporte de análisis ensayo 5
55
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M6. Reporte de análisis ensayo 6
56
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M7. Reporte de análisis ensayo 7
57
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M8. Reporte de análisis ensayo 8
58
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M9. Certificación del Laboratorio LASA
59
Anexo M. Reporte de análisis emitido por el Laboratorio LASA.
Figura M10. Alcance de la certificación del Laboratorio LASA