UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANAUNlOAD IZTAPALAPA

Casa abierta al tiempo

Division de Ciencias Baslcas e IngenierfaLicenciatura en Qufmica

Proyecto:"Sfntesis de LiFeP04 a traves de reacciones de biomineralizaci6n usando

peptidos especfficos expresados en la superficie del fago M13 comobioplantilla"

AsesoraDra. ~~s Vera Robles

Departamento de QufmicaArea de BiofisicoqufmicaProfesor Asociado "0"

AlumnaJhoana Lizeth Gonzalez Cansino

~Nurnero de matrfcula

210308834

RESUMEN

La biomineralización es la formación de minerales ocurrida naturalmente en organismos

vivos. Este proceso es biológicamente inducido y controlado. En los organismos vivos los

péptidos juegan papeles importantes en el control de la biomineralización de

nanoestructuras inorgánicas, ya que estos poseen una gran diversidad química de grupos

funcionales (-COO-, -SH, -OH, -NH2), aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos, diferentes

estructuras secundarias (cadenas aleatorias, alfa hélice, hojas beta) y patrones de

bioreconocimiento, lo que permite una gran versatilidad en el uso de péptidos para la

síntesis de nuevos materiales [1].

Recientemente, aprovechando las propiedades de los péptidos, éstos han sido empleados

como plataforma para biomineralizar compuestos inorgánicos. Estos péptidos se han

encontrado por técnicas combinatorias, tales como biopanning que utiliza bibliotecas de

péptidos desplegados sobre el virus M13, lo que permite tener en cada fago secuencias

aleatorias de cadenas polipeptídicas que sirven como puente físico para enlazarse a otro

material. Para seleccionar los péptidos desplegados en el virus que presentan afinidad a

un material, a partir de las secuencias aleatorias se realiza un barrido (biopanning) donde

la biblioteca de fagos se pone en contacto con el material de interés y posteriormente se

realizan lavados para eliminar los fagos que no se unen de manera específica. Por último

los fagos que se enlazaron específicamente al material (química o estructural) son

amplificados para su posterior secuenciación y ya teniendo las secuencias consenso se

llevan a cabo las reacciones de biomineralización en condiciones normales de

temperatura, presión, pH neutro.

Así, empleando la técnica de biopanning es posible biomineralizar, en principio cualquier

material inorgánico. Por otro lado, debido a la necesidad de reducir la dependencia de los

combustibles fósiles y la emisión de gases de efecto invernadero, nos obliga a almacenar

energía tanto en pequeñas cantidades como en grandes cantidades, para su uso

estacionario, o para uso móvil. Una consolidada solución al problema del almacenamiento

de la energía eléctrica es el empleo de baterías recargables. Las baterías recargables de

i

litio tienen claras ventajas sobre otras baterías por este motivo decidimos usar el LiFePO4

para realizar los experimentos de biopanning y poder observar si el material

biomineralizado presenta mejores propiedades. Esta técnica también busca ser un

método más “verde” para la síntesis de LiFePO4.

ii

AGRADECIMIENTOS

Agradezco todo el apoyo brindado por mi asesora:

Dra. Liliana Irais Vera Robles

Laboratorio de Docencia de CBI por permitirme el uso de sus instalaciones y

equipos.

Al laboratorio de Biología Molecular de CBS por permitirme el acceso al

Nanodrop. En especial quiero agradecer a la Dra. Alejandra Serratos por las

reacciones de secuenciación de ADN.

A mi familia: Silvia, Juan Carlos, Jennifer, Mario.

A mi tía Maru y a mi abuelita

iii

ABREVIATURAS ADN acido desoxirribonucleico

BSA albúmina de suero bovino

CN control negativo

CP control positivo

HCl cloruro de hidrogeno

IPTG isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido

IR región Infrarrojo del espectro electromagnético

LB medio de cultivo Luria Broth

mg/mL miligramos por mililitro

µg/mL microgramos por mililitro

PEG polietilenglicol PM ~8000 g/mol

pfu unidades que forman una placa

Ph. D. phage display (péptidos expresados en el fago)

rpm revoluciones por minuto

rt temperatura ambiente

TBS amortiguador de Tris-HCl

TEM microscopio electrónico de transmisión

Tet tetraciclina

Tris tris(hidroximetil)aminometano

% V/V concentración porcentual en volumen

X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido

iv

ÍNDICE Página

RESUMEN………………………………………………………………………………………….………….... i

AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………………………………..…….. iii

ABREVIATURAS………………………………………………………………………………………………… iv

1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………… 1

1.1. Bacteriófago M13……………………………………………………………………....... 3

1.2. Biopanning……………………………………….…………………………………….…..... 5

1.3. Celdas electroquímicas………………………………………………………….………. 6

1.4. Batería recargable ion litio……………….……………………………...……………. 8

2. OBJETIVO GENERAL….…………………………………………………………………….…….….. 10

3. PARTE EXPERIMENTAL.……………………………………………………………………..……... 11

3.1. Material….…………………………………………………………………………………..… 11

3.2. Biopanning……………………………………………………………………………………. 11

3.3. Reacciones de biomineralización……………………………………………………. 14

3.4. Caracterización……………………………………………………………………………… 15

3.5. Microscopía de transmisión electrónica……..…………………………………. 15

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………………………… 16

4.1. Interacción bacteriófago M13- LiFePO4…………………………….……………. 16

4.2. Reacciones de biomineralización……….….………………………………………. 17

5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………. 22

6. PERSPECTIVAS………………………………………………………..…………………………………. 22

7. REFERENCIAS……………………………………………………………………………………………. 23

8. ANEXO.……………………………………………………………………………………………........... 26

v

1. INTRODUCCIÓN

La biomineralización es la formación de minerales inducida por organismos vivos, tanto

procariotas como eucariotas, incluso este proceso se realiza en seres humanos [2]. Existen

dos modelos que describen los procesos de biomineralización, la mineralización inducida

biológicamente (BIM) [3] y la mineralización controlada biológicamente (BCM) [4]. Este

proceso ocurre, por un lado, como resultado de la actividad celular, provocando los

cambios fisicoquímicos necesarios para que se produzca la nucleación sobre la superficie

ya sea de la pared celular, membranas, polímeros extracelulares como los polisacáridos,

etc., hasta formar minerales con morfología, composición y propiedades específicas, que

le ofrecen diferentes funciones a los organismos, por ejemplo soporte

(esqueletos/exoesqueletos), fuente de nutrientes, sensores magnéticos, etc. [5]. Los

biominerales más abundantes son las conchas de los moluscos, las perlas, los corales, los

cocolitos, los magnetosomas de bacterias, entre otros [6]. Por ejemplo, se ha encontrado

magnetita en las bacterias magnetotácticas [7], en algunas especias de algas [8] y en los

dientes de los quitones [9], en la tortuga verde y en las palomas [10]. La magnetita es un

mineral de hierro constituido por Fe3O4 (FeO∙Fe2O3), se caracteriza por ser ferrimagnético,

es decir, presenta un momento dipolar magnético espontáneo en ausencia de un campo

magnético aplicado. Esto se debe a que los momentos magnéticos de los dos cationes de

hierro tienen diferente magnitud, dando como resultado un momento magnético

resultante, aún después de que los momentos magnéticos se orienten [11]. Todas las

bacterias magnetotácticas forman magnetosomas, que se definen como unas vesículas

formadas por una bicapa de fosfolípidos que envuelven un cristal de magnetita. La

biomineralización del magnetosoma es un proceso complejo que se da en varios pasos.

Estos incluyen la formación de la vesícula del magnetosoma, la acumulación de hierro por

la célula, el transporte de hierro a las vesículas del magnetosoma y la biomineralización

controlada del Fe3O4. Los magnetosomas están dispuestos en una o más cadenas paralelas

al eje mayor de la célula. Se han observado tres tipos de morfología de las partículas de

magnetita, ver Figura 1 [12].

1

Figura 1: Micrografías electrónicas de la morfología cristalina de los magnetosomas encontrados en varias bacterias

magnetotácticas. Partículas de magnetita con forma A) de cubo-octaédrica, B) hexagonal prismática alargada, C) punta de flecha. Adaptada de la referencia [12]

Estos cristales de magnetita actúan como una brújula orientando a las bacterias

magnetotácticas con el campo magnético de la Tierra, para buscar zonas con menor

concentración de oxígeno, debido a que estas bacterias son anaerobias o microaerofilas.

De los ejemplos ya mencionados se puede observar que en los organismos vivos las

secuencias de aminoácidos de los péptidos y proteínas juegan un papel importante en el

control de la biomineralización de nanoestructuras inorgánicas. En particular, los péptidos

poseen una gran versatilidad (química y estructural) por lo que pueden ser empleados

como plantillas en la síntesis de nuevos materiales. Además, los péptidos son fáciles de

sintetizar, relativamente baratos y pueden ser modificados fácilmente por técnicas de

bioconjugación (químicas) o por técnicas de ADN recombinante (biológicas).

Recientemente, se han reportado secuencias de péptidos que se unen selectivamente a

una superficie de un material, es decir presentan afinidad a compuestos específicos

[13,14] y se unen preferencialmente a estructuras con la misma composición, pero con

arreglos cristalinos diferentes. Por ejemplo el grafito, el diamante, los nanotubos y el

grafeno todos ellos están formados de átomos de carbono, pero su estructura cristalina es

diferente, de tal forma que pueden presentar afinidad a péptidos con diferente secuencia

[15,16]. De este modo, la unión selectiva juega un papel importante en la nucleación,

crecimiento y ensamble de nuevos materiales bioinorgánicos nanoestructurados con un

diseño y propiedades predecibles, bajo condiciones ambientales [17].

La biomimética es una técnica que utiliza una estructura biológica como plantilla, para

ensamblar en su superficie un material inorgánico. Con esta técnica se busca replicar las

características morfológicas e imitar la funcionalidad de las estructuras biológicas.

2

Por ejemplo Tanaca et al. reportaron que la proteína MMS6

(VGGTIWTGKGLGLGLGLGLGAWGPIILGVVGAGAVYAYMKSRDIESAQSDEEVELRDALA) regula

la biomineralización de la magnetita con forma de cubo-octaédrico en las bacterias

magnetotácticas. [18].

Cui et al. reportaron la identificación de dos péptido expresados sobre la superficie del

bacteriófago M13, con la secuencias EPLQLKM (GBP1) y FTAPRFPHY (GBP2) con afinidad a

la superficie de grafeno [16]. El grafeno está formado por átomos de carbono, tiene forma

de hojuela cuasiplana con pequeñas ondulaciones, con un grosor de un átomo de carbono

(0.1 nm) y presenta propiedades eléctricas, ópticas, mecánicas, térmicas muy

interesantes.

Flynn et al. reportaron la identificación de péptidos expresados sobre la superficie del

bacteriófago M13 aplicando la técnica de Biopanning, con reconocimiento específico y

nucleación de cristales de sulfuro de zinc (ZnS) y sulfuro de cadmio (CdS). Siendo estos

importantes nanomateriales semiconductores, con propiedades ópticas, eléctricas únicas

y con un gran potencial en aplicaciones tecnológicas. Encontraron que la secuencia

CNNPMHQNC (A7) podía inducir la nucleación de ZnS con estructura cristalina tipo

Wurtzita y la secuencia LRRSSEAHNSIV (Z8) con estructura cristalina tipo Blenda. Para la

nucleación de nanocristales de CdS encontraron las secuencias CTYSRLHLC (J182) y

SLTPLTTSHLRS (J140) [19].

En este trabajo se utilizó como plantilla el bacteriófago M13, a continuación se describen

brevemente sus características.

1.1. Bacteriófago M13

Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan bacterias de una especie específica, es

decir, son parásitos intracelulares que necesitan estar dentro de una bacteria para poder

replicarse, consisten fundamentalmente de material genético y proteínas. Su genoma

puede componerse de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleicos (ADN,) el

cual puede consistir en una cadena doble (ds) o en una cadena sencilla (ss). El material

genético está protegido por una cubierta de proteínas denominada cápside.

3

La forma en la que se arreglan las proteínas alrededor del material genético del virus,

define la forma del fago, de tal modo que existen fagos icosaédricos, helicoidales o

filamentosos, como se ilustra en la Figura 2 [20].

Figura 2: Estructura proteica que pueden componer a un bacteriófago. a) Bacteriófagos complejos T7, MS2 Y Qβ con

simetría icosaédrica, b) Bacteriófago con simetría filamentosa, TMV y M13, adaptado de la referencia [20].

El M13 es un bacteriófago filamentoso que tiene una morfología cilíndrica con un

diámetro de 6.5 nm de diámetro y una longitud de aproximadamente 800 nm [21], la

longitud depende del genoma de bacteriófago. Consiste de una cadena circular de ADN de

cadena sencilla (ADNss) con 6407 nucleótidos encapsulados en una cápside proteica que

se compone de cinco proteínas (ver Figura 3 Tabla b), la proteína P8 esta expresada

mayoritariamente en el cuerpo del fago, habiendo alrededor de 2700 copias por fago [22].

Por estudios de cristalografía y espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR), ha

sido posible deducir que la P8 tiene una estructura secundaria hélice alfa de 1.5 a 2.0 nm

de espesor que va desde el extremo carboxilo terminal (C-terminal) y llega a una prolina

en la posición 6 del extremo amino terminal (N-terminal), la hélice alfa tiene una

inclinación de 20° respecto al eje del virus y se enrolla en una vuelta helicoidal dextrógira

con un paso de 16.5 Å. Esta disposición geométrica del virus se repite a través de todo su

eje hasta la extremidad de la cápside [23]. La P8 está compuesta de tres dominios

específicos, donde los primeros 20 residuos del extremo N-terminal están expuestos en la

superficie del virus con carácter anfipáticos, los siguientes 19 residuos de aminoácidos son

hidrofóbicos, y el extremo C-terminal es básico con 11 residuos que interaccionan y

estabilizan el ADN del fago, ver Figura 3 [24].

4

Figura 3: a) Estructura del bacteriófago filamentoso M13, b) Tabla 1: Proteínas que componen la cápside del

bacteriófago filamentoso M13, c) Estructura y secuencia de aminoácidos de la proteína P8, donde los aminoácidos marcados en color morado san alifáticos y los de color azul son polares. Figuras a y c adaptados de la referencia [25].

En un extremo del fago se encuentran entre tres-cinco copias de las proteínas P7 y P9,

donde las regiones hidrofóbicas de éstas forman uniones con las regiones

correspondientes de la proteína P8. La región de la P9 que llega hasta el extremo N-

terminal de la P8 tiene la función de estabilizar ésta estructura desde el interior. En el

extremo opuesto se encuentran las proteínas P6 y P3, la P6 es estructuralmente homóloga

a dos monómeros de la P8 que en esta terminación exponen un mayor número de

residuos hidrofóbicos respecto al monómero de la posición interna. De esta forma la P6

interactúa por una parte con la P8 y por la otra con el extremo C-terminal de la P3, que

expone a la periferia el dominio globular de su extremo N-terminal [25].

1.2. Biopanning

Para la selección de péptido(s) a partir de una biblioteca de fagos desplegados (Ph. D.) se

aplicó la técnica de Biopanning. En esta técnica el material blanco (en nuestro caso el

LiFePO4) se pone en contacto con la Ph. D. (que consiste en una colección de variantes de

péptidos que se expresan en la proteína P3 del fago M13), de este modo el (los) péptido(s)

que no interaccionaron son lavados (eluidos) y aquellos que si interaccionaron son

colectados y amplificados produciendo una “nueva” biblioteca, este proceso se repite tres

veces con el objetivo de identificar aquellas secuencias que interaccionaron de manera

5

específica. Posteriormente, se aislaron los virus que poseen el péptido afín para amplificar

y purificar la doble cadena de ADN (ADNds) de cada uno. Finalmente se secuenció el

ADNds para conocer la secuencia de nucleótidos y de acuerdo con el código genético se

determinó la secuencia de aminoácidos de los péptidos encontrados (ver Figura 7).

Generalmente se utiliza el fago filamentoso M13, en el cual su genoma ha sido modificado

para que exprese diferentes variantes de péptidos en su superficie. Esto permite tener en

cada fago secuencias aleatorias de cadenas

polipeptídicas (con 20n residuos diferentes, n es el

número de residuos) que sirven como puente para

enlazarse al blanco.

Por ejemplo, a partir de experimentos de Biopanning

Furst et al. reportaron la identificación de un nuevo

péptido con la secuencia ASTLPKA, que presenta

afinidad a “sólidos orgánicos”, tal como el Tiametoxam

(TMX) (ver Figura 4), el cual es un compuesto sintético

que sirve como insecticida [26].

1.3. Celdas electroquímicas

Una batería, es un dispositivo que consiste en una o más celdas electroquímicas que

pueden convertir la energía química almacenada en energía eléctrica. Este proceso ocurre

a través de una reacción óxido-reducción espontánea. Cada celda consta de un electrodo

positivo donde se produce la reducción (cátodo) y un electrodo negativo donde se

produce la oxidación, (ánodo) y electrolitos que permiten que los iones se muevan entre

los electrodos, facilitando que la corriente fluya fuera de la batería para llevar a cabo su

función. La función de una celda electroquímica es desacoplar esta reacción redox, para

aprovechar los electrones que genera la reacción en forma de corriente eléctrica. Esta

corriente es la que sirve como fuente de energía para que los dispositivos portátiles

funcionen [27]. Por ejemplo, en la celda de Volta las reacciones redox involucradas son las

siguientes:

Figura 4: Imagen de microscopía electrónica de transmisión del bacteriófago M13 con el péptido ASTLPKA interaccionando con la superficie del cristal de TMX [26].

6

Ánodo 𝑍𝑍𝑍𝑍(𝑠𝑠) ⇌ 𝑍𝑍𝑍𝑍(𝑎𝑎𝑎𝑎)2+ + 2�̅�𝑒

Cátodo 𝐶𝐶𝐶𝐶(𝑎𝑎𝑎𝑎)2+ + 2�̅�𝑒 ⇌ 𝐶𝐶𝐶𝐶(𝑠𝑠)

Reacción global 𝐶𝐶𝐶𝐶(𝑎𝑎𝑎𝑎)2+ + 𝑍𝑍𝑍𝑍(𝑠𝑠) ⇌ 𝑍𝑍𝑍𝑍(𝑎𝑎𝑎𝑎)

2+ + 𝐶𝐶𝐶𝐶(𝑠𝑠)

Hay dos tipos fundamentales de celdas y en ambas tiene lugar una reacción redox.

La celda electrolítica transforma una corriente eléctrica en una reacción química de

oxidación-reducción que no es espontánea. Por ejemplo, la electrolisis del agua cuando se

le hace pasar una corriente eléctrica ocurre la siguiente reacción:

Ánodo 20𝐻𝐻(𝑎𝑎𝑎𝑎)− ⇌ 1

2𝑂𝑂2(𝑔𝑔) + 𝐻𝐻2𝑂𝑂(𝑙𝑙) + 2�̅�𝑒

Cátodo 2𝐻𝐻2𝑂𝑂(𝑙𝑙) + 2�̅�𝑒 ⇌ 𝐻𝐻2(𝑔𝑔) + 20𝐻𝐻(𝑎𝑎𝑎𝑎)−

Reacción global 𝐻𝐻2𝑂𝑂(𝑙𝑙) ⇌ 𝐻𝐻2 (𝑔𝑔) + 12𝑂𝑂2 (𝑔𝑔)

La celda galvánica o celda voltaica transforma una reacción química espontánea en

corriente eléctrica. Consta de dos semiceldas conectadas eléctricamente mediante un

conductor metálico y un puente salino. Cada semicelda consta de un electrodo y un

electrolito. Las celdas galvánicas se clasifican en dos categorías.

Celdas primarias: transforman la energía química en energía eléctrica, de manera

irreversible. Cuando se agota el material activo presentes en la batería, este deja de

funcionar, ya que no pueden volver a su forma original. Por ejemplo la celda de zinc-

mercurio usada en cámaras fotográficas, relojes, etc.

Celdas secundarias: el proceso que ocurre en esta celda es reversible, es decir, después de

proporcionar energía, los materiales activos pueden reconstruirse imponiendo una

corriente desde una fuente energética externa en la dirección inversa. La reacción de la

celda se invierte y el dispositivo se recarga. Por ejemplo la batería de plomo utilizada en

los automóviles, las celdas recargables de níquel-cadmio o las de ión litio (LiFePO4) usadas

en calculadoras, linternas, etc. [28].

7

1.4. Batería recargable ión-litio

En las baterías recargables de ion litio, el material catódico es un componente clave para

el desempeño de la batería. Se han estudiado extensivamente muchos materiales

catódicos, como el LiCoO2, LiMnO2, LiNiO2, LiMn2O4, etc. El LiCoO2 se ha usado como

material catódico en las baterías de ion-litio comerciales [29]. Sin embargo, presenta

desventajas como su toxicidad y su alto costo asociado al cobalto, por lo que se deben

desarrollar nuevos materiales catódicos en relación no solo con el desempeño de la

batería sino también en relación a la seguridad y al costo.

Paghi et al. propusieron el LiMPO4 (M= Fe, Mn, y Co) con estructura cristalina tipo olivina

(ver Figura 5) consiste en un empacamiento hexagonal compacto, donde los átomos de

oxígeno con los cationes de Li+ y M2+ están localizados en la mitad de los sitios octaédricos

y el catión P5+ en 1/8 de los sitios tetraédricos y su celda unitaria es ortorrómbica.

Figura 5: Esquema representativo de la estructura cristalina del LiMPO4 (M= Fe, Mn, Co y Ni), adaptada de la referencia

[29].

Ha atraído una amplia atención debido a una alta capacidad específica teórica (~170

mAhg-1) [30], tiene una alta estabilidad química y térmica, bajo costo y una alta

compatibilidad con el medio ambiente [31]. Sin embargo, es difícil alcanzar su capacidad

total porque su conductividad electrónica y iónica son muy bajas. [32].

8

Se han propuesto algunas soluciones para este problema

i) Cubrir las partículas de LiFePO4 con una capa de material conductor

ii) Sustitución iónica para mejorar las propiedades iónicas

iii) Sintetizar partículas con una morfología bien definida, [33].

Una característica de los materiales activos, en este tipo de batería, es que son materiales

laminares, generalmente se utiliza grafito dopado con iones Li+ como material anódico y

como materia catódico el LiFePO4. Cuando se descarga la batería lo que ocurre es que los

iones Li+ que se encuentran intercalados en la estructura del grafito espontáneamente se

salen de la estructura y se dirigen al cátodo, esto provoca que el grafito se oxide y el

hierro se reduzca, estos electrones son colectados por un conductor electrónico. Esta

corriente de electrones es la que va a suministrar energía para que nuestros dispositivos

electrónicos funcionen. Cuando la batería se descarga totalmente, lo que se tiene que

hacer es aplicar una corriente eléctrica externa para que ocurra el proceso inverso. Ya que

para liberar los iones Li+ de la estructura del LiFePO4 se necesita suministrar energía,

cuando los iones Li+ salen de la estructura, provoca que el hierro se oxide y el grafito se

reduzca (ver Figura 6) [34].

Figura 6: Esquema de la descarga de una batería de ion Li+.

9

Hasta la fecha, se han propuesto una gran cantidad de síntesis de LiFePO4, por métodos

hidrotérmicos, empleando plantillas de óxidos mesoporosos, etc. Si bien, por estos

métodos se ha logrado obtener LiFePO4, presenta la desventaja de ser métodos que

requieren grandes cantidades de energía (en forma de calor), lo que los convierte en

métodos costosos y poco amigables con el ambiente. Así, alrededor del mundo varios

grupos de investigación se han dado a la tarea de sintetizar LiFePO4 a bajas temperaturas

y en condiciones suaves de reacción empleando técnicas de biomineralización.

Lee et al. reportaron el uso del bacteriófago M13 modificado genéticamente para que en

el extremo de la proteína P8 expresara cuatro glutamatos en la superficie, y de esta forma

actuar como centro de nucleación y biomineralización del LiFePO4. En esta ruta la

interacción entre los glutamatos y los precursores de hierro y fosfato es principalmente

por interacciones electrostáticas [35].

Recientemente este grupo de investigación reportó la síntesis de FePO4 dopado con

nanopartículas de plata, utilizando el mismo bacteriófago M13 como plantilla. Con el

objetivo de aumentar la conductividad electrónica del material [36].

En los trabajos ya reportados la síntesis del LiFePO4 se debe a la interacción electrostática

de los precursores con el fago. En este trabajo se busca biosintetizar el material tomando

ventaja del reconocimiento molecular que presentan los péptidos por esta razón, se busca

un péptido que presente afinidad específica al LiFePO4.

2. OBJETIVO GENERAL

En este proyecto, se desea buscar las condiciones para llevar a cabo las reacciones de

biomineralización del LiFePO4 usando como plantilla el fago M13 con diferentes péptidos

expresados en su superficie. Debido a que la biomineralización se realiza en condiciones

suaves de temperatura y presión, además de usar agua como solvente. De este modo, se

busca, también, proponer una síntesis amigable con el ambiente.

10

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Material

Fe2(SO4)2 (Baker Analyzed), NaH2PO4 (Sigma Aldrich), Na2HPO4 (Sigma Aldrich), LiFePO4

(MTI Corporation), OsO4 (Electron Microscopy Sciences) rejillas tipo FORMVAR de cobre

con una película de carbón con 200-mesh (Electron Microscopy Sciences), QIAprep Spin

Miniprep Kit (QIAGEN).

3.2. Biopanning

La solución inicial de la biblioteca se preparó añadiendo 10 µL de la biblioteca (≈1x1013

pfu/mL) y 990 µL de buffer TBST al 0.1% de Tween 20 (V/V) para obtener una

concentración final de 1x1011 pfu/mL (biblioteca diluida). El LiFePO4 fue lavado

previamente con etanol y agua, después se lavó 10 veces y se resuspendió en TBS en un

volumen adecuado para que la solución tuviera una concentración final de 1000 µg/mL.

Posteriormente, se tomó una alícuota de 150 µL y se centrifugó para separar el

sobrenadante del sólido (LiFePO4), se retiró el sobrenadante para limpiar la superficie del

LiFePO4 con la solución de blocking, donde la BSA interaccionó con cualquier molécula que

pudiera interferir con la biblioteca. Después se lavó varias veces con el buffer TBST al 0.1%

[V/V] de Tween20 para eliminar el BSA que se haya adsorbido a la superficie del LiFePO4 y

cualquier otra impureza. Una vez limpia la superficie del LiFePO4 se agregó 100µL de la

biblioteca diluida y se dejó incubando durante 1hora a 100 rpm a temperatura ambiente.

La muestra se lavó varias veces con el buffer TBST al 0.1% [V/V] de Tween20 para retirar

todos los fagos que no tuvieron ninguna interacción con el material; para colectar los

fagos que si interaccionaron con el material se añadieron 100 µL de la solución Glicina-

BSA, donde el BSA desplazó a los fagos que se hayan adsorbido a la superficie del LiFePO4.

Se transfirió el sobrenadante, el cual contenía a los fagos desplazados, a un tubo limpio, e

inmediatamente se neutralizó la solución añadiendo 15 µL de Tris-HCl. Los fagos

colectados se amplificaron en 20 mL de LB / Tet (20 µg/mL) inoculado previamente con un

cultivo de E. coli ER2738 (1:100); ya que el fago no se puede replicar por sí solo, necesita

usar la maquinaria celular de E .coli para poder replicarse. A este cultivo se le permitió

11

crecer a 37 °C por 5 horas. Posteriormente, los fagos se purificaron por precipitación

utilizando PEG. Así, esta nueva biblioteca reducida se utilizó para el siguiente ciclo.

Este proceso de screening se repitió tres veces usando los fagos amplificados de cada

etapa (biblioteca reducida). De esta manera, se esperaba que hubieran suficientes

“individuos”. Así, todas las mutantes tuvieron la misma probabilidad de interaccionar con

la superficie del material blanco. También, se incrementó la concentración de Tween-20

de manera creciente en los ciclos sucesivos a 0.3 y 0.5% [V/V] respectivamente, con el fin

de incrementar la astringencia sobre la superficie del LiFePO4 y así asegurar que los fagos

colectados fueran los que realmente tuvieron interacciones fuertes (reconocimiento

molecular) con el material, ver Figura 7.

Para verificar que no había contaminación de fagos M13 silvestres, en cada etapa se

realizaron los experimentos de titulación, que consiste en hacer diluciones de la solución

con los fagos amplificados y posteriormente se plantaron sobre una carpeta de E. coli en

platos de LB-agar, suplementados con Tet (20 µg/mL), IPTG (0.05 mg/mL), y X-gal (0.04

mg/mL), los cuales se incubaron durante 16 horas a 37 °C. Al día siguiente se obtuvieron

placas, donde las placas azules corresponden a los fagos de la biblioteca ya que el genoma

del fago M13 ha sido modificado genéticamente con el marcador genético lacZ para que

se lleve a cabo el proceso de α-complementación, de tal suerte que en presencia de X-gal

se forme un compuesto azul. De este modo, las placas que no presenten color

corresponden a los fagos silvestres ya que estos no tienen dicha modificación genética.

Los fagos colectados del ciclo 3 no se amplificaron para hacer el experimento de

titulación, pero se hizo bajo las condiciones ya mencionadas. Al día siguiente, se

seleccionaron 20 placas azules bien aisladas para hacer los stocks de cada mutante, se

amplificaron los fagos en 1 mL de medio LB inoculado previamente con un cultivo de E.

coli ER2738 (1:100), se permitió crecer durante 4.5 horas a 37 °C y se purificaron por

precipitación con PEG. Cada placa corresponde a un solo fago (una sola mutante), después

de amplificar y purificar cada uno, se aisló la cadena de ADNds de acuerdo al protocolo del

kit de Qiagen. Finalmente, se secuenciaron los 20 clones seleccionados para identificar la

12

secuencia de aminoácidos del péptido expresado en la proteína p3 que se unió de manera

específica al LiFePO4.

Figura 7: Esquema del proceso de biopanning usado para la selección de péptidos específicos al LiFePO4. a) Biblioteca

de péptidos desplegados sobre el fago M13, donde cada color representa un clon diferente, b) Interacción de la biblioteca con los cristales de LiFePO4, c) Eliminación de los fagos que no interaccionaron, d) elución de los fagos que si

interaccionaron con el material. Los fagos colectados del paso d) se amplificaron, purificaron para repetir el ciclo dos veces más desde el paso b). e) En el último ciclo los fagos colectados del paso d) ya no se amplifican, se plantaron en platos con medio adecuado, se seleccionaron 20 placas para purificar el ADNds y se secuenciar, de esta manera se

conoció la identidad de los péptidos con afinidad a LiFePO4.

13

3.3. Reacciones de biomineralización

En este trabajo, se buscaron las condiciones para sintetizar FePO4.

De los clones que se encontraron en el trabajo ya reportado [37], ver Tabla 2. Se eligieron

los péptidos LPVRLDW (M1) y HGGVRLY (M2), ya que fueron los que presentaron mayor

frecuencia.

Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de los péptidos con afinidad al LiFePO4.

Mutante Secuencia de aminoácidos pI Abundancia

1 L P V R L D W 6.25 3 2 H G G V R L Y 9.06 2 3 Y A T S D F L 3.81 1 4 S I T L N T P 5.5 1 5 W S L S E L H 5.5 1 6 S Y T D L L R 6.25 1 7 T S T G A I A 5.5 1 8 D T A L H S L 5.5 1 9 D R L S H T R 10 1

10 Q L Y R E F N 6.25 1 11 H L K H S L L 9.06 1 12 N S V L P F H 7.19 1 13 V S R D T P Q 6.25 1 14 Y H T T Q Y T 7.19 1

Figura 8: Carga de los péptidos reportados en la Tabla 2 a diferentes pH.

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Carg

a

pH

M1 y M13M2M3M4 y M7M5 y M8M6 y M10M9M11M12M14

14

Para la reacción de biomineralización se tomó una alícuota de 600 µL del virus en agua a

una concentración de 0.9424 mg/mL y se incubó con 1.2 µL de la solución de sulfato de

hierro 1.665 mM (Fe2(SO4)3) durante 24 horas a temperatura ambiente y otra muestra

igual se incubo a 4 °C. Después se le añadieron 600 µL de la solución de fosfato 3.33 mM a

pH= 7.5 (NaH2PO4/Na2HPO4) y se incubó durante 24 horas a temperatura ambiente (rt) y

otra muestra igual se incubó a 4 °C. El producto obtenido se centrifugó durante 15

minutos a 5000 rpm, se retiró el sobrenadante y se lavó tres veces con agua estéril para

eliminar los precursores que no reaccionaron. El polvo colectado se secó 24 horas a 45 °C

en una estufa. Este procedimiento se hizo para el clon M1, el clon M2, el bacteriófago

silvestre (M13KE) como control positivo (CN) y un control negativo (CN) sin bacteriófago.

3.4. Caracterización

Microscopio electrónico de transmisión (Marca Jeol, Modelo 2100F, 200 kV),

Espectrofotómetro de transformada de Fourier e Infrarrojo (Perkin Elmer GX), MIRacle

ATC (PIKE Technologies), Hiraoka Staining Kit (Electron Microscopy Sciences), Nanodrop

1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific), centrífuga (SOLBAT).

3.5. Microscopía de transmisión electrónica

Para el clon M1 se centrifugaron 56.2 µL de una solución de LiFePO4 con una

concentración de 1000 µg/mL en agua estéril durante 5 minutos a 8000 rpm, se retiró

todo el sobrenadante y se incubó con 100 µL de una solución del clon M1 en agua con

una concentración de 0.0423 mg/mL durante 30 minutos a 100 rpm a temperatura

ambiente. Para preparar la rejilla, se tomó una alícuota de 5 µL de la solución anterior y 5

µL de agua estéril, se mezcló perfectamente la solución, después se tomaron 5 µL de esta

última solución y se puso sobre la rejilla, hasta que se secó la rejilla, se tiñó el fago con 5

µL de una solución de ácido Tungstofosfórico (H3PO4∙12WO3∙H2O). Al teñir se incubó 40

segundos y se lavó la rejilla con unas gotas de agua estéril.

15

Para el clon M2, la rejilla se preparó de igual forma que la rejilla del clon M1. Con la

diferencia, que se centrifugaron 75 µL de una solución de LiFePO4 y la concentración de la

solución del clon M2 fue de 0.1692 mg/mL.

Para el fago silvestre, la rejilla se preparó de igual forma que la rejilla del clon M1. Con la

diferencia, que se incubó con 100 µL de una solución del fago silvestre en agua con una

concentración de 3.13x10-6 mg/mL. La rejilla previamente preparada con el fago y los

cristales, se tiño con dos gotas de OsO4 y se incubó durante 24 horas utilizando el kit

hiraoka staining.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Interacción bacteriófago M13-LiFePO4

Para caracterizar el complejo LiFePO4-bacteriófago, se utilizó un microscopio electrónico

de transmisión (TEM) aplicando la técnica de campo bajo. Debido a que el fago no se

contrasta lo suficiente para poder observarlo en el microscopio, se tiñó con el ácido

tungstofosfórico, el tungsteno oxida los dobles enlaces de las proteínas del fago y se

reduce sobre la superficie del fago. De esta forma el W depositado en la superficie del

fago contrasta y permite su visualización en el microscopio.

Figura 9: Imágenes obtenidas de TEM, a la izquierda se muestra el clon M1 y a la derecha se muestra el clon M2 con cristales de LiFePO4.

16

Figura 10: Imagen obtenida de TEM, del fago silvestre con cristales de LiFePO4.

En las Figuras 9 y 10 se muestran las imágenes de microscopía preparadas como se

describió en el punto 4.4, con el clon M1, el clon M2 y un CP, respectivamente. Este

experimento tiene la finalidad de poder observar si los péptidos que se eligieron para

hacer las reacciones de biomineralización si presentaban afinidad con el material.

Claramente, se puede observar que los fagos en cuya superficie de la proteína P3 se

encuentran insertados los péptidos del clon M1 y del clon M2 respectivamente, están

unidos a la superficie del LiFePO4 a través de esta proteína. Esto es claramente visible ya

que como se explicó la proteína P3 se encuentra en un extremo y en las imágenes de TEM

vemos que sólo un extremo se encuentra unido a los cristales de LiFePO4. Por otro lado,

cuando se compara con la imagen obtenida con el fago silvestre (P3 sin inserto) no se

observa que este unido a la superficie. Es evidente que los péptidos encontrados por la

técnica de biopanning presentan efectivamente afinidad a la superficie de este material.

4.2. Reacciones de biomineralización

Para establecer la formación de “nuevos” enlaces y/o la interacción entre los grupos

funcionales de la proteína P3 y el LiFePO4 las muestras se caracterizaron por

espectroscopía infrarroja (IR) empleando el accesorio de reflexión atenuada (ATR). Para

analizar las reacciones de biomineralización, también se caracterizó una película del

bacteriófago silvestre y los cristales de LiFePO4 que se utilizaron para hacer los

experimentos de biopanning. A continuación se muestran los espectros de IR.

17

3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 50070

80

90

100

Tran

smita

ncia

(T %

)

No. de Onda (cm-1)

M13

Figura 11: Espectro de infrarrojo de una película del fago silvestre.

3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

50

60

70

80

90

100

Tran

smita

ncia

(T %

)

No. de Onda (cm-1)

LiFePO4

Figura 12: Espectro de infrarrojo de los cristales de los cristales de LiFePO4

18

3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 50070

80

90

100

Tran

smita

ncia

(T %

)

No. de Onda (cm-1)

M1, 4 °C CP, 4 °C CN, 4 °C M1, rt CP, rt CN, rt M13

Figura 13: Espectros de infrarrojo de las reacciones de biomineralización con el clon M1 a 4 °C y a rt, comparados con un CP y CN.

3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 50070

80

90

100

Tran

smita

ncia

(T %

)

No. de Onda (cm-1)

M2, 4 °C CP, 4 °C CN, 4 °C M2, rt CP, rt CN, rt M13

Figura 14: Espectros de infrarrojo de las reacciones de biomineralización con el clon M2 a 4 °C y a rt, comparados con

un CP y CN.

19

Tabla 3: Correlación de las señales de IR obtenidas de la película del bacteriófago silvestre

[38, 39].

Número de onda (cm-1)

Vibración del grupo Número de onda (cm-1)

Vibración del grupo

3284.9 -NH3 1240 NO2- 3000-2800 C-H 1100 C-O

1700 C=O 900-650 N-H 1650 OCNH 720-600 Ar-OH 1540 CHN 545-520 =C-C-C 1460 -CH3 450-375 C-OH

Tabla 4: Correlación de las señales de IR obtenidas de los cristales de LiFePO4 [40, 41].

Número de onda (cm-1)

Vibración del grupo Número de onda (cm-1)

Vibración del grupo

1062 P-O 637 O-P-O 960 O-P-O 351 Fe-O

En la Figura 11 y 12 podemos observar los espectros de infrarrojo de una película del

bacteriófago silvestre y de los cristales de LiFePO4 respectivamente, con estos dos

espectros podemos tener una referencia de los modos vibracionales (ver Tabla 3 y 4) que

podemos encontrar en los compuestos formados por las reacciones de biomineralización.

En la Figura 13 y 14 podemos observar que en los CN a 4 °C y a rt no se formó el

compuesto debido a que no se observan las vibraciones características del FePO4, que

normalmente aparecen a baja frecuencia. Mientras que en el caso del CP se observar una

banda a 1067 cm-1 vibración que corresponde al enlace P-O, pero no se pueden observar

las vibraciones características del bacteriófago por lo que se podría inferir que no

interaccionó con los precursores y cuando se lavó el compuesto obtenido se eluyó el

bacteriófago. En el caso de las reacciones con el clon M1 se pueden observar, tanto las

vibraciones características del bacteriófago como las del compuesto de FePO4. Cuando la

reacción se realizó, a rt las vibraciones son más intensas que a 4 °C. Para el clon M2 la

interacción con los precursores se favorece a rt debido a que se pueden observar las

vibraciones características tanto del fago como del FePO4, sin embargo cuando la reacción

se llevó a cabo a bajas temperaturas (4 °C) la intensidad de las vibraciones disminuyó.

20

Cabe mencionar que las reacciones de biomineralización se hicieron a un pH de 2.5 debido

a que la solución de hierro presenta este pH, estas condiciones son diferentes a las de los

experimentos de biopanning (pH=7.5) por lo tanto la carga de los péptidos van a hacer

diferente a la carga que tenían cuando se seleccionaron, en la Figura 5 se puede observar

que los clones elegidos tanto el clon M1 y M2 van estar cargado positivamente bajo las

condiciones del experimento.

21

5. CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados reportados es evidente que los péptidos M1 y M2 expresados

en la superficie de la proteína P3 del bacteriófago M13KE si están interactuando con los

precursores para formar el FePO4, debido a que en los espectros de infrarrojo si se

observaron las vibraciones correspondientes al fago y al FePO4 y con los CN y CP no se

observó el mismo comportamiento; y además, en las imágenes de microscopía se muestra

que el clon M1 y M2 si tiene afinidad el LiFePO4.

6. PERSPECTIVAS

Debido a que el péptido esta expresado solo en la proteína P3 que se encuentra en un

extremo del bacteriófago, la cantidad del compuesto que se obtuvo de las reacciones de

biomineralización es muy pequeña, por lo que no se pudo hacer otro tipo de

caracterización como difracción de Rayos-X, análisis termogravimétrico (TGA), etc. Por lo

tanto, se procederá a hacer una modificación genética sobre el genoma del fago para

insertar dentro del gen 8 la secuencia correspondiente a cada uno de las mutantes

encontradas (por separado), así cada uno de los péptidos se expresará en la proteína P8

que se encuentra a lo largo de todo el fago, de esta forma tendríamos mayor cantidad de

producto para poder caracterizarlo. Con estas condiciones encontradas para la

biomineralización de FePO4, se repetirán los experimentos y se diseñara otro experimento

para poder dopar el FePO4 con Li+ o con otro tipo de ion que pueda mejorar las

propiedades de este material catódico. Una vez encontradas las condiciones de síntesis se

procederá a ensamblar las baterías para analizar sus propiedades electroquímicas.

22

7. REFERENCIAS

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25

8. ANEXO 1

A continuación se muestra como se prepararon las soluciones que se utilizaron.

Tris Buffer Saline-Tween-20 (TBST)

50 mM de Tris-HCl a pH 7.5

150 mM de NaCl

0.1% V/V de Tween-20

Solución blocking

0.1 M de NaHCO3 a pH 8.6

5 mg/mL de BSA

0.02% de NaN3

Glicina-BSA

0.1 M de Glicina-HCl a pH 2.2

1 mg/mL BSA

Tris-HCl

1M de Tris-HCl a pH 9.1

Soluciones para las reacciones de biomineralización

La solución de fosfato que se utilizó como precursor para las reacciones de

biomineralización se preparó con dos sales de fosfatos (NaH2PO4/Na2HPO4) ambas con

una concentración de 3.33 mM, las dos soluciones se utilizaron para ajustar el pH a 7.5.

La solución de hierro (Fe2(SO4)3) se preparó con una concentración de 1.665 mM y se

calentó hasta que se disolvió completamente.

26