una guía concisa de control de calidad sobre drogas ... · lugar seco. no toque la superficie de...

INSTITUTO DE MISIÓN MÉDICA

Volúmen IICromatografía de Capa Fina

del GPHF-Minilab®

Una Guía Concisa de Control de Calidad sobre Drogas Esenciales

Manual

en cooperación con el

Fundación Farmacéutica Alemana para la Salud

Una iniciativa de las compañías farmacéuticas alemanas basadas en la investigación

Una Guía Concisa de Control de Calidad de Drogas Esenciales · Volúmen II: Cromatografía de Capa Fina

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El cofre protector contiene una serie deartículos que quizás no sean familiarespara usted. Está confundido? No sepreocupe. Pronto tendrá una mejoridea de lo que deberá hacer o no ha-cer. Desempaque los materiales y reali-ce sus primeros pasos en el mundo delcontrol farmacéutico de calidad. Lasgeneraciones anteriores de técnicosfarmacéuticos han logrado dominarlo,por eso estamos seguros de que ustedtambién lo va a lograr. Buena suerte!

6 Procedimientos para el uso del Minilab

Un calibrador ha sido incluído para po-der realizar una descripción exacta deltamaño de la tableta o cápsula durantela inspección visual.El tamaño del blíster y de la caja deempaque se medirán usando una reglagraduada.

I. Inspección Visual


La preparación de las soluciones madrede la prueba y del estándar requiere deuna unidad entera de la forma farma-céutica sólida oral.

El Minilab provee de una colecciónapropiada de estándares secundariosauténticos con los que se puede reali-zar por lo menos 300 pruebascromatográficas con los productos sos-pechosos. Están empacados en un jue-go de quince tubos plásticos provistosde cierres herméticos contra violacio-nes. Cada tubo contiene 20-100 table-tas o cápsulas de referencia respectiva-mente. Se los puede pedir, como unjuego completo o individualmente, aTechnologie Transfer Marburg (TTM)en Alemania.

Nota: Luego de tomar una tableta ocápsula de referencia, cierre con cuida-do el envase, asegurándose de que lasotras muestras de referencia no se da-ñen antes de su tiempo de expiración.

III. CCF: 1. Preparación de la muestra

La prueba de disgregación de las table-tas y de las cápsulas se realiza usandouna botella de 100 ml con boca ancha,la cual está llena con agua a una tem-peratura de 37° C. La disgregacióndebera ser completa en el momentoque el reloj toque la alarma luego detreinta minutos.

II. Prueba de disgregación

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El sachet o sobre se vacía directamenteen un frasco de vidrio con la ayuda deun embudo, asegurándose de que elsólido residual sea enjuagado con unacantidad conocida de solvente.

Al igual que con los sobres, las cápsulasde gelatina dura se abren y se vacíandirectamente en el frasco de vidrio, latapa y el cuerpo de la cápsula se inclu-yen también en el frasco.

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Las cápsulas de gelatina blanda son cor-tadas en pedazos con un bisturí, cuchi-lla o tijera. Todas las partes son transferi-das completamente a un frasco de labo-ratorio y las tijeras o el bisturí son en-juagados con un volúmen conocido desolvente como está indicado en la mo-nografía individual.

Las tabletas se trituran con la mano demortero antes de la extracción. El pro-cedimiento exacto es el siguiente: en-vuelva una tableta en papel aluminio ytritúrela hasta obtener un povo fino.Transfiera todos los sólidos en un frascode laboratorio y enjuague el papel conel solvente de extracción, lo que asegu-ra que no se pierda nada de la tableta.

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Todos los sólidos se disuelven en unvolúmen conocido de solvente para ex-tracción, usando un juego de variaspipetas graduadas con una capacidadde volúmen de 0.01 a 25.0 ml. La solu-ción obtenida será la solución madredel estándar o la solución madre de lamuestra, las cuales necesitan serdiluídas hasta su concentración final osea la solución de trabajo de la muestray el estándar.

Pipeteo: Sostenga la pipeta en posi-ción vertical para observar que el sol-vente alcance la mancha de gradua-ción deseada (A). La parte inferior delmenisco formado por el solvente debe-rá estar en la línea de la marca de gra-duación.

La punta de la pipeta (B) se la colocaen contacto con la pared del frasco.

Una pera de goma se incluye comoayuda para pipetear, así se evita el peli-gro de pipetear con la boca.

Advertencia! Todos los solventes or-gánicos se inflaman fácilmente. Notrabaje frente a la llama ni fumemientras trabaje con ellos! Todos lossolventes son tóxicos. Evite pipetearcon la boca. Utilice la pera de goma.No arriesgue su salud!


Use el juego de pipetas graduadasincluídas para diluír las soluciones ma-dre a su concentración final de trabajo.

Un juego de viales de 10 ml (frascospequeños de vidrio) servirá para enva-sar las soluciones de trabajo.

Un juego de placas cromatográficas.Son placas de aluminio, recubiertascon un adsorbente de gel de sílice 60F254. Estas vienen en empaques decincuenta con el tamaño preciso paraque calce en la cámara de desarrollo(5 x 10 cm).

Nota: Abra el empaque poco antes desu uso. Saque sólo una placa. Coloquede nuevo el empaque en el cofre deprotección. En lo posible evite contac-to con la humedad. Almacénelo en unlugar seco. No toque la superficie de laplaca.

III. CCF: 2 Aplicación de la muestra

Una cinta adhesiva y un marcador per-manente se utilizarán para la identifica-ción de las soluciones madre y de tra-bajo. La cinta adhesiva sirve tanto paramateriales de vidrio como de plástico.El marcador es resistente al agua.

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Se ha incluído un lápiz y una regla paramarcar la línea de inicio y del frente asícomo también el tamaño de la man-cha luego de ser visualizada con el de-tector de luz ultravioleta.

Microcapilares de vidrio desechableson incluídos para la aplicación de lamuestra. Ellos administran una canti-dad de volúmen de 2 microlitros (µl), sise los llena completamente de extremoa extremo.

Coloque la muestra en la línea de iniciode la placa cromatográfica con ayudadel microcapilar, el cual está lleno conla solución de trabajo apropiada. En-juague tres veces el microcapilar con elsolvente de extracción (llene el capilarcon el solvente y elimine el solvente so-bre un pedazo de papel filtro o papeltissú) antes de aplicar la siguientemuestra sobre la placa. Deseche elmicrocapilar una vez que la placa estéllena, evitando el peligro de una conta-minación entre las muestras de los di-ferentes productos.

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Compruebe la uniformidad de las man-chas usando una luz u.v. de 254nm.Las manchas se tornan visibles y mu-chas de ellas presentarán una formacircular y estarán colocadas a distanciasiguales sobre la línea de inicio. Repitaeste procedimiento si no se obtienenmanchas homogéneas.

Nota: La aplicación de la muestra esun trabajo de precisión y se necesitaráde mucho entrenamiento para obtenerperfección. Es muy importante no ra-yar la superficie de la capa absorbentepara evitar que la fase móvil córra deforma desigual y las manchas salgandistorcionadas.

Un recipiente con tapa servirá comocámara de desarrollo. Todos los ladosdel recipiente se cubren con papel fil-tro, lo que asegura la saturación de laatmósfera con los vapores del solventeantes de introducir la placa para el de-sarrollo. Corte el papel filtro de maneraque sea fácil introducirlo en el recipien-te. Use las tijeras incluídas.

Use el juego de pipetas graduadas parala preparación de la fase móvil, que esel vehículo que transporta la muestra através de la placa cromatográfica.Pipetée todos los solventes en el reci-piente tal como se indica en la mono-grafía individual y mézclelos. Cierre elrecipiente y espere aprox. 15 minutospara asegurar una saturación de la cá-mara con los vapores del solvente. Fi-nalmente, coloque la placa que contie-ne las muestras en el recipiente y espe-re hasta que el solvente haya subido lastres cuartas partes de la placa.

Nota: Prepare diariamente la fase mó-vil. No regrese el solvente ya usado alos recipientes de almacenamiento.

Advertencia! Todos los solventes sontóxicos. Evite pipetear con la boca.Utilice la pera de goma. No arries-gue su salud!

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III. CCF: 3. Desarrollo de la placa cromatográfica


Una vez que la placa cromatográfica hasido desarrollada, sáquela del recipien-te y deje evaporar el exceso de solven-te. Para acortar el tiempo de secado sepodría usar la hornilla eléctrica. Este úl-timo procedimiento se realiza si la fasemóvil consiste en solventes de bajavolatilidad, como por ejemplo acetatode etilo, tolueno o agua.

En nuestro trabajo se utilizará unaplancha marca Philips colocada al re-vés como hornilla. La plancha puedeser usada con cualquier circuito eléc-trico y está provista de un selector devoltaje (110-240V). En caso necesa-rio, un adaptador para el enchufeeléctrico, está incluído en el Minilab.

Advertencia! Evite el contacto directocon la plancha caliente. Desconecte laplancha despúes de usarla.

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Se ha incluído una segunda lámparaultravioleta a baterías, capaz de emitiruna radiación de onda larga de 366nm, para la detección de manchas invi-sibles. Lleve la placa a una habitaciónoscura (debajo de la mesa, en un com-partimento, caja o cabina) y expóngalaa la luz ultravioleta. Las manchas sensi-bles a la luz se volverán visibles. Mar-que con un lápiz las manchas para pos-teriores evaluaciones.

Se ha incluído una lámpara ultravioletaa baterías con una radiación de ondacortas de 254 nm para la detección demanchas invisibles en la placa croma-tográfica. Lleve la placa a una habita-ción oscura (debajo de la mesa, enun compartimento, caja o cabina) yexpóngala a la luz ultravioleta. Lasmanchas sensibles a la luz se volveránvisibles. Marque con un lápiz las man-chas para posteriores evaluaciones.

Advertencia! No mire directamente ala fuente de luz ultravioleta para evitardaños en los ojos.

Se ha incluído un segundo recipiente parala coloración con yodo de manchas invisi-bles, que no han podido ser detectadascon la luz ultravioleta. Añada algunoscristales de yodo en el recipiente, cierreloy caliéntelo por 30 segundos. Otra alterna-tiva es exponer el recipiente directamentea la luz solar por cinco minutos. El yodoempieza a sublimarse y la atmósfera delrecipiente empieza a saturarse con los va-pores de yodo indicado por una nieblavioleta.

Coloque la placa cromatográfica en el re-cipiente y la mayoría de las manchas invi-sibles van cambiando gradualmente a uncolor café-amarillo. El tiempo de desarro-llo termina luego de un minuto.

III.CCF: 4. Detección de la Muestra

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Luego de limpiar y secar todos los ma-teriales, retorne éstos al cofre de pro-tección. Colóquelos como está indica-do en la fotografía. El cofre tiene unaprotección hermética apropiada contraagua y aire para asegurar la proteccióncontra la humedad.

V. Restitución del Minilab a su estado original

Lave minuciosamente todas las pipetasgraduadas, los materiales de vidrio ydemás equipos de laboratorio luego deser usados. Las substancias usadas en laprueba serán descartadas y los frascosvacíos serán enjuagados usando sufi-ciente detergente. Si es necesario seusará un cepillo para tubos. Finalmentesi es posible se enjuagarán los materia-les de vidrio con agua desionizada paraevitar formación de espuma o de man-chas. Luego de ésto se colocarán laspipetas graduadas y los demás mate-riales de vidrio boca abajo en el estantepara fácilitar el secado.

Las pipetas graduadas que se encuen-tran muy sucias o tapadas se las lavarácon un solvente apropiado, como unasolución de detergente caliente, ácidoacético al 50 % o peróxido de hidróge-no al 10 %, antes del lavado final.

Nota: Para descartar los reactivos y lassoluciones de prueba usadas utilice unrecipiente preferiblemente hecho depolipropileno. Las substancias se des-cartarán de acuerdo a las leyes y los re-quisitos locales.

IV. Limpieza

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El montaje final del Minilab.

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7.7 Cotrimoxazol

Identificación primaria por medio de la inspección visual y la prueba de disgregación

I. PRINCIPIO

II. EQUIPOS Y REACTIVOS

El sulfametoxazol y la trimetoprima son extraídos de las tabletas con metanol y sondeterminados con la CCF usando como referencia un estándar secundario autén-tico.

II. PRUEBA DE DISGREGACIÓN

Todas las tabletas y cápsulas decotrimoxazol de liberación rápida de-ben pasar la prueba de disgregación talcomo está descrita en los capítulosanteriores sobre métodos y operacio-nes. Ellas deberán disgregarse en aguaa 37° C en menos de 30 minutos.Si el producto no pasa esta prueba,esto constituye un signo de deficiencia.

III. RESULTADOS Y MEDIDAS A TOMAR

Los productos medicinales provenien-tes de una fuente dudosa o en los cua-les los documentos acompañantes fal-tan o no son los correctos, así como losproductos medicinales con defectos ensu forma farmacéutica, defectos en elempaque o con etiquetas incompletas,dañadas o que faltan; o con las etique-tas escritas en otros idiomas deberánser sometidos a una prueba de identi-dad.

I. INSPECCIÓN VISUAL

Busque las deficiencias en el etiqueta-do, en el empaque y en las formas far-macéuticas como se describe en loscapítulos anteriores de métodos y ope-raciones generales. Use el formulariode reporte como una guía para anotarcualquier particularidad del producto.Cada tableta contiene usualmente480 mgr. de cotrimoxazol (400 mgr.sulfametoxazol + 80 mgr. trimetopri-ma). Las tabletas que contienen sólo120 mgr. de cotrimoxazol (100 mgr.sulfametoxazol + 20 mgr. trimetopri-ma) son para uso pediátrico.

1) Mano de mortero2) Papel aluminio3) Frasco de laboratorio de vidrio con una capacidad de 25 a 100 ml4) Un juego de pipetas graduadas (de 1 a 25 ml)5) Viales de 10 ml6) Cinta adhesiva7) Marcador8) Lápiz9) Placa cromatográfica recubierta con gel de sílice 60 F 254 de Merck,

tamaño 5 x 10 cm10) Microcapilares de vidrio de 2 µl de capacidad11) Hornilla eléctrica ( Plancha marca Philips)12) Cámara de desarrollo para cromatografía de capa fina (frasco)13) Papel filtro14) Tijeras15) Luz ultravioleta de 254 nm16) Cámara para el yodo17) Pinzas18) Metanol19) Acetato de etilo20) Tabletas de referencia de cotrimoxazol de 120 mg

Verificación de la identidad a través de la cromatografía de capa fina

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IV. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓNESTÁNDAR DE TRABAJO AL 100 %.(LÍMITE SUPERIOR DE TRABAJO)

Pipetée 2 ml de la solución madre clara del estándar en un vial de 10 ml y añada2 ml de metanol. Cierre el vial y agítelo. Esta solución debe contener 6 mgr. de ladroga total/ml y se la identificará como solución estándar de trabajo de cotrimoxazol al100 %.La solución estándar de trabajo representa un producto de buena calidad conte-niendo 100% de cotrimoxazol.

V. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓNESTÁNDAR DE TRABAJO AL 80 %(LÍMITE INFERIOR DE TRABAJO)

Pipetée 2 ml de la solución madre clara del estándar en un vial de 10 ml y añada3 ml de metanol. Cierre el vial y agítelo. Esta solución debe contener 4.8 mgr.de la droga total/ml y se la identificará como solución estándar de trabajo de co-trimoxazol al 80%.La solución estándar de trabajo de baja concentración representa un producto depoca calidad conteniendo 80% de cotrimoxazol. Para nuestro trabajo este nivel dela droga representa el límite inferior aceptable para un determinado producto.

VI. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓNMADRE DE LA MUESTRA, CUYOPRODUCTO DECLARA UNACONCENTRACIÓN DE 120 MGR.DE COTRIMOXAZOL POR UNIDAD

Para la preparación de la solución madre de la muestra se requiere una tableta en-tera o de una cápsula del producto apropiado que se encuentre en el mercado. Elprocedimiento de extracción es el mismo que para la tableta de referencia decotrimoxazol: envuelva una tableta en papel aluminio y tritúrela con la mano delmortero hasta obtener un polvo fino. Transfiera cuantitativamente el polvo a unfrasco de laboratorio de 25 ml. Añada 10 ml de metanol, cierre el frasco y se agíte-lo por tres minutos hasta que se haya disuelto el sólido. Deje que repose la solu-ción por 5 minutos hasta que los residuos insolubles se sedimenten debajo del lí-quido sobrenadante claro. El frasco se lo identifica como solución madre de la mues-tra de cotrimoxazol. Esta solución debe contener 12 mgr. del total de la droga/ml.Prepare una solución nueva para cada prueba.

III. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN MADRE DEL ESTÁNDAR

Para la preparación de la solución madre del estándar se requiere una tableta dereferencia de 120 mgr. de cotrimoxazol. El procedimiento de extracción es el si-guiente: envuelva una tableta en papel aluminio y tritúrela con la mano del morte-ro hasta obtener un polvo fino. Transfiera todos los sólidos en un frasco de labora-torio de 25 ml y enjuague los residuos de sólido con 10 ml metanol. Cierre el fras-co y agítelo por tres minutos hasta que se haya disuelto el sólido. Deje que reposela solución por 5 minutos hasta que los residuos insolubles se sedimenten debajodel líquido sobrenadante. La solución debe contener 12 mgr. del total de la droga/ml y se lo identifica como solución madre del estándar de cotrimoxazol. Prepare unanueva solución para cada prueba.

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VIII. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO DE LA MUESTRA

Pipetée 2 ml de la solución madre clara de la muestra en un vial de 10 ml y añada2 ml de metanol. Cierre el vial, agítelo e identifíquelo como solución de trabajo dela muestra de cotrimoxazol.La concentración esperada de trimetroprima en la solución de trabajo es de1.0 mg/ml y la de sulfametoxazol es 5.0 mg/ml. Ambas concentraciones equiva-len a la concentración del estándar de concentración alta de trimetoprima ysulfametoxazol.

Marque una línea paralela (línea de inicio) a una distancia de 1.5cm del extremoinferior de la placa cromatográfica y aplique con las pipetas microcapilares 2 micro-litros (µl) de la solución de la prueba y del estándar como se demuestra en la foto-grafía de la página siguiente.

Hasta cinco aplicaciones se pueden hacer en la placa cromatográfica. Compruebela uniformidad de las manchas usando una luz UV de 254 nm. Todas las manchasdeben ser circulares y estar localizadas a distancias iguales sobre la línea de inicio.La intensidad de ellas puede diferir pero sus diámetros no deben ser diferente.La diferencia en la intensidad se debe a la diferente cantidad de los residuos de lastabletas o de las cápsulas, o a la diferente concentración de la droga en la soluciónde muestra. Una diferencia en el tamaño de la mancha es evidencia de una malaaplicación. Repita de nuevo el procedimiento si no se logra una aplicación homogénea.

IX. APLICACIÓN DE LA PRUEBA

A. Para la preparación de la solución madre de la muestra se requiere de una table-ta del producto apropiado, el procedimiento de extracción se realiza de la siguien-te manera: se tritura la tableta hasta obtener un polvo fino y se transfiere todo elsólido obtenido en un frasco de laboratorio de 25 ml. Añada 20.0 ml de metanol,cierre el frasco y agítelo por tres minutos hasta que se haya disuelto el sólido. Dejeque repose la solución por 5 minutos hasta que los residuos insolubles se sedimen-ten debajo del líquido sobrenadante.

B. Para diluciones posteriores, mezcle en un vial de vidrio de diez mililitros 2 ml dellíquido claro con 2 ml de metanol. Cierre el vial y agítelo. Identifíquelo como solu-ción madre de la muestra de cotrimoxazol. La solución debe contener 12 mgr. deltotal de la droga/ml. Prepare una solución nueva para cada prueba.

VII. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓNMADRE DE LA MUESTRA, CUYOPRODUCTO DECLARA UNACONCENTRACIÓN DE 480 MGR.DE COTRIMOXAZOL POR UNIDAD

X. DESARROLLO Pipetée 15 ml de acetato de etilo y 5 ml de metanol en el frasco utilizado comocámara de desarrollo para la CCF. Cierre el recipiente y mezcle cuidadosamente.Recubra las paredes del recipiente con papel filtro y espere 15 minutos para asegu-rar la saturación de la cámara con los vapores del solvente. Coloque con cuidado laplaca cargada en el frasco. Cierre el frasco y desarrolle la placa cromatográfica has-ta que el solvente haya alcanzado las tres cuartas partes de la longitud de la placa,siendo el tiempo de desarrollo de aproximadamente 20 minutos. Remueva la placacromatográfica de la cámara, marque el frente del solvente y deje que el resto delsolvente se evapore usando la hornilla eléctrica si fuese necesario.

XI. DETECCIÓN Seque los residuos de solvente y observe la placa cromatográfica con una luzultravioleta de 254 nm. Inspeccione la placa después de realizar la coloración conyodo.

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XV. RESULTADOS Y MEDIDASA TOMAR

XIV. OBSERVACIONES HECHAS DURANTE LA COLORACIÓN CON YODO

Dos manchas de color café se producirá en el mismo lugar indicado con la luz UVde 254 nm. La mancha que representa al sufametoxazol atrapa con facilidad elyodo y se torna de un color anaranjado-café mientras que la otra mancha repre-senta la trimetoprima y es relativamente débil con la coloración con yodo.

XIII. OBSERVACIONES HECHAS A 254 NM

La presencia de cotrimoxazol está indicada por dos manchas principales, unarepresenta al sufametoxazol con una distancia recorrida de 0.65 seguido de unasegunda mancha que representa la trimetoprima con una distancia recorrida decerca 0.24. Otras manchas fuertes producidas por la solución de prueba indican unavance en la degradación de la droga especialmente cuando es asociado con unamancha principal pequeña. Muchas manchas débiles podrían aparecer en laregión inferior del cromatograma causado normalmente por agentes auxiliaresincorporados en la formulación de las tabletas o de las cápsulas.

XII. PLACA CROMATOGRÁFICA OBSERVADA A 254 NM

La mancha principal obtenida en el cromatograma con la solución prueba debecorresponder tanto en color, forma, intensidad y distancia corrida con el delcromatograma obtenido con las soluciones estándares alta y baja. Este resultadodebe ser obtenído con todos los métodos de detección. Si no se logra esto, se de-berá repetir la corrida con una segunda muestra. Rechace el lote si el contenido dela droga no puede ser verificado luego de una tercera corrida. Para una segundaopinión envíe las muestras a un laboratorio completo de control de calidad de dro-gas. Retenga el lote y manténgalo en cuarentena hasta que se haya tomado unadecisión de rechazar o aceptar el producto.

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Mancha satélite detrimetoprima

Mancha principal desulfametoxazol

Corrida Nr. 1Límite superior para el cotrimoxazolrepresentando el 100 % del totalde la droga

Corrida Nr. 2Un producto de buena calidad

Corrida Nr. 3Un producto de baja calidad

Corrida Nr. 4Límite inferior para cotrimoxazolrepresentando el 80 % del totalde la droga

(Frente del solvente)

(Línea de inicio)

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