Pasantía en RosarioDiciembre 2007-Febrero 2008

Presentación del ModeloTrypanosoma cruzi y sus particularidades

Enferemdad de ChagasVarios millones de

personas afectadasAgente causante: T. cruzi

Expresión génicagen A gen B gen C gen D gen E gen D

ADN

Estabilidad del Mensaje - Movilización

AAAAA AAAAA…

Transcription

AAAAA

Modificaciones

Trans-splicing Poli adenilación

ARN policistronico

ARNm individual

AAAAA

Traducción

Importancia de la regulación post-transcripcionalEstabilidadTraducción

Cambios rápidos en la expresión génicaProteínas de unión al ARN (UTR’s)Familia Pumilio

DrosophilaEstabilidad y traducciónDominio conservado de interacción Estudios en levadura

10 miembros en T. cruziTcPuf6

Antecedentes de la pasantía

TcPuf6No esencial para el crecimientoSobreexpresión en T. brucei reduce

infectividadExpresión constitutiva

Mensajeros asociados a TcPuf6

Interacción entre TcPUF-6 y TcDdh1

Objetivos

Demostrar la unión de la proteína homologa a Pop2 en T. cruzi a TcPuf6 por medio de ensayos de Y2H

Clonar (y expresar) dicha proteína para continuar con su caracterización

Procedimiento experimental

Doble híbrido en levadura

Resultados

Doble híbrido en levadurapEntr-pop2

Clonasa

pEntr-puf6

pGbk-pop2pGad-pop2pGbk-puf6pGad-puf6

Cotransfecciones relevantesPara ver interacción:

pGad-pop2/pGbk-puf6pGad-puf6/pGbk-pop2

Controles de auto-activación por pop2:pGbk-pop2/pGad-T7pGad-pop2/pGbk-T7

Controles de auto-activación por puf6:pGbk-puf62/pGad-T7pGad-puf6/pGbk-T7

Control negativopGad-T7/pGbk-T7

Cotransfección de ambas fusiones

Cotransfección con un vector vacío

Cotransfección con ambos vectores vacios

Master Plates (-LT)

Controles autoactivación pGBK-LT -ura -his 50mM 3AT

Placas –LT –H3AT

pGBK-Puf/pGAD-pop

Placas –LT –Ura pGBK-Puf/pGAD-pop

Método de las diluciones

Cont Gad

Cont -

Cont Gbk

Gbk-pop/Gad-puf

-LT –LT –Ura –LT –His 50mM3AT

Producción de proteína recombinante en E. coli

pEntr-pop2

Clonasa

pDest-pop2 pGex-pop2

Inducción con 1mM IPTG

Pop-gst??

S/ind His GstMW

ConcluisonesSe logro clonar TcPop2Existe una interacción entre TcPuf6 y TcPop2 en este

sistemaPodríamos tener un sistema de sobreexpresión de

TcPop2-Gst para continuar con la caracterización del sistema

Cosas pendientesControles…Purificar TcPop2Validar en un segundo sistema la interacción

encontrada (Anticuerpo)