tratamiento de la osteonecrosis de cabeza femoral...
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TRATAMIENTO DE LA OSTEONECROSIS DE CABEZA
FEMORAL CON TERAPIA CELULAR AVANZADA Y
BIOMATERIALES EN UN MODELO EXPERIMENTAL OVINO
Màrius Aguirre Canyadell
Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d'Hebron
Maria Pau Ginebra Molins
Escola Tècnica Superior d'Enginyeria Industrial de Barcelona UPC
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1. Resumen del proyecto
La osteonecrosis de cabeza femoral (ONCF) es una enfermedad adquirida que se
caracteriza por un proceso isquémico y su progresión hacia una deformidad e
incongruencia articular de la cadera, que en su estadio más avanzado presenta
cambios degenerativos articulares (artrosis), dolor e incapacidad funcional.
Típicamente afecta a pacientes jóvenes y activos, y se estima que cada año se
diagnostican 30.000 nuevos casos de osteonecrosis en Estados Unidos.
Aproximadamente el 10% de todas las artroplastias de cadera se realizan a causa de
su diagnóstico.
Actualmente no se dispone de ningún tratamiento eficaz para evitar la progresión de
los estadios más iniciales de la ONCF, y en las fases más avanzadas las opciones se
limitan a técnicas quirúrgicas de reconstrucción articular como las artroplastias
(prótesis) de cadera. Las modalidades de tratamiento para las fases más tempranas
incluyen tratamientos no quirúrgicos (farmacológicos, biofísicos) y quirúrgicos que
intentan preservar la cabeza femoral. Las técnicas quirúrgicas en las fases más iniciales
incluyen la descompresión central, la descompresión central con el aporte de un injerto
no vascularizado o vascularizado y las osteotomías rotacionales. Estas técnicas
quirúrgicas solo han demostrado una utilidad relativa en lesiones de pequeñas a
moderadas.
Recientemente se han propuesto nuevos tratamientos para los estadios iniciales de la
ONCF con el uso combinado de proteínas morfogénicas (BMP), concentrados de médula
ósea o células madre mesenquimales (MSC), y se ha demostrado un retraso en la
progresión radiológica de la lesión.
La investigación de nuevos tratamientos para la ONCF requiere estudios prospectivos,
aleatorizados y en un ambiente experimental controlado. No se ha progresado
especialmente en este campo debido a la falta de modelos animales experimentales de
ONCF que repliquen todos los estadios de la enfermedad humana. Los tratamientos se
deberían enfocar hacia modalidades biológicas coadyuvantes con soporte estructural,
que permitan la regeneración ósea y eviten el colapso de la cabeza femoral, por lo que
se propone utilizar células madre mesenquimales derivadas de médula ósea que tienen
la propiedad de renovarse y diferenciarse en varios tejidos, como el tejido óseo,
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adiposo, cartilaginoso y muscular. Por estas razones, la obtención y manipulación de
células madre mesenquimales pueden constituir una herramienta útil para el estudio
del desarrollo y regeneración de órganos y tejidos mediante la ingeniería tisular.
El uso de adyuvantes con los implantes de biomateriales en combinación con la
descompresión central presenta el potencial de proporcionar ventajas estructurales de
los injertos óseos sin el riesgo asociado de su obtención autóloga. Los implantes
pueden ser de diferentes materiales biocompatibles, como las espumas de fosfato de
calcio que se obtienen de la hidrólisis de α-TCP hacia hidroxiapatita, que tiene lugar en
condiciones fisiológicas no exotérmicas, resultando en la formación de unas espumas
de hidroxiapatita sólidas con una arquitectura 3D que potencian la colonización tisular.
Las proteínas óseas morfogénicas, como la BMP-2 (bone morphogenic protein 2), son
potentes inductores osteogénicos y se pueden combinar con este material.
El objetivo general de este estudio es evaluar la eficacia de la descompresión ósea
central asociando la bioingeniería tisular y la terapia celular avanzada para el
tratamiento de la ONCF en un modelo ovino.
Los objetivos específicos son:
1. Verificar la capacidad de estimular la regeneración ósea por medio de la
implantación de una espuma de fosfato de calcio cargada con BMP-2.
2. Verificar la capacidad de estimular la regeneración ósea por medio de la
implantación de un constructo de matriz ósea colonizado con MSC autólogas
expandidas ex vivo.
3. Verificar la capacidad de estimular la regeneración ósea por medio de la
implantación de un constructo de matriz ósea colonizado con MSC alogénicas
expandidas ex vivo.
4. Verificar el origen celular, la multiplicación y la diferenciación in vivo de las MSC
implantadas en lesiones osteonecróticas que previamente han estado expandidas ex
vivo y marcadas con proteína de fluorescencia verde (GFP).
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5. Determinar cuáles de los diferentes productos de ingeniería tisular ensayados,
basándose en matrices óseas combinadas con MSC autólogas o alogénicas o con un
concentrado de médula ósea, tienen mayor capacidad de regeneración ósea.
6. Determinar cuál de las diferentes concentraciones de MSC autólogas o
alogénicas es la más adecuada para estimular la regeneración ósea.
El modelo experimental consistió en inducir experimentalmente una lesión de ONCF en
la extremidad derecha de 38 ovejas adultas mediante la introducción hasta el centro de
la cabeza femoral de una sonda semipercutánea de crioterapia con control de
temperatura regulada con los gases helio y argón. Al cabo de seis semanas de la
inducción de la lesión, las ovejas se dividieron en seis grupos terapéuticos, donde la
descompresión central se asoció a uno de los tratamientos establecidos, excepto el
grupo control, al cual no se le aplicó ningún tratamiento añadido.
Grupo A. Tratamiento con células mesenquimales obtenidas de concentrado de
médula ósea y espuma de fosfato de calcio.
Grupo B. Tratamiento con espuma de fosfato de calcio cargada con BMP-2.
Grupo C. Tratamiento con un constructo de matriz ósea combinada con MSC
expandidas ex vivo obtenidas de médula ósea autóloga a dosis alta.
Grupo D. Tratamiento con un constructo de matriz ósea combinada con MSC
expandidas ex vivo obtenidas de médula ósea autóloga a dosis baja.
Grupo E. Tratamiento con un constructo de matriz ósea combinada con MSC
expandidas ex vivo obtenidas de médula ósea alogénica a dosis alta.
Grupo F. Tratamiento con un constructo de matriz ósea combinada con MSC
expandidas ex vivo obtenidas de médula ósea alogénica a dosis baja.
Grupo G. Tratamiento de descompresión ósea central.
Después de un seguimiento total de 12 semanas, donde se hizo un seguimiento clínico
y analítico de los animales, la ONCF se evaluó por radiología, microtomografía
computada (micro-TC), ensayos biomecánicos, análisis histológico y análisis
inmunohistoquímico con la finalidad de evaluar el potencial de regeneración ósea de
cada tratamiento.
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2. Resultados
En todos los grupos experimentales, seis semanas después de la inducción de la lesión
de ONCF mediante crioterapia, se volvió a realizar una segunda intervención quirúrgica
para implantar todos los tratamientos experimentales correspondientes a cada grupo
de estudio.
Los tratamientos se realizaron siguiendo un procedimiento similar al que se realiza en
la práctica clínica, donde a través de un trocar se implantaron los tratamientos
experimentales hasta el centro de la cabeza femoral. En todos los casos se siguió una
evaluación clínica y analítica postoperatoria de los animales hasta el final del periodo
de estudio de los tratamientos experimentales de seis semanas.
Evaluaciones clínicas y analíticas
En las horas postoperatorias posteriores a las cirugías de inducción de la lesión de
ONCF y de los tratamientos experimentales, los animales presentaron signos de cojera
en la extremidad intervenida. No se observaron complicaciones quirúrgicas durante las
intervenciones realizadas.
Se estudió la evolución de la media de peso así como los porcentajes de variaciones de
peso durante el periodo de tratamiento (6 semanas) y experimental global (12
semanas) entre los diferentes grupos de tratamiento. No se observaron diferencias
estadísticamente significativas en los cambios de peso entre los grupos
experimentales.
En las analíticas sanguíneas realizadas con muestras de sangre basal (antes de
cualquier tipo de intervención), antes del tratamiento seis semanas después de la
inducción de la lesión de ONCF y al final del periodo de estudio después de las seis
semanas de tratamiento, se valoraron los diferentes parámetros para estudiar la
presencia de algún tipo de reacción de nivel sistémico.
No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes
parámetros analíticos ni bioquímicos que indicaran una respuesta inmunitaria, ni daño
hepático ni cardiovascular en los animales de experimentación. Únicamente se observó
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un incremento en el recuento plaquetario del grupo control a diferencia del resto de
grupos con tratamientos experimentales.
Evaluaciones radiológicas y micro-TC
Se obtuvieron imágenes mediante radioscopia antes de la lesión de ONCF, a las seis
semanas de la inducción de la lesión y a las seis semanas del tratamiento
experimental. Observamos que este sistema es útil para determinar las proyecciones
necesarias en el momento de la cirugía, pero no proporciona suficiente resolución para
poder diferenciar cambios en el tejido óseo de la cabeza femoral.
Una vez obtenidas las muestras de las cabezas femorales, se escanearon y evaluaron
por micro-TC. Para la cuantificación ósea se definió un protocolo de cuantificación a
partir de las imágenes obtenidas donde se establecieron diferentes zonas de interés de
las cabezas femorales ovinas. Principalmente se compararon las zonas
correspondientes al canal de descompresión central, las zonas de tejido óseo trabecular
alejado de la lesión y la zona de tejido óseo trabecular adyacente al canal de
descompresión central donde se indujo la lesión de osteonecrosis y posteriormente se
aplicaron los tratamientos.
Se ha visto que en las zonas correspondientes al canal de descompresión central se
observa una gran variabilidad debido a la diferente disposición de los canales dentro de
la cabeza femoral y a la presencia o no de restos de material de los tratamientos
experimentales en diferentes grados de reabsorción. Las zonas de tejido trabecular
alejadas de la lesión presentan valores similares entre los grupos en relación con la
cantidad de hueso, pero valores variables en relación con la estructura de este, propia
de cada individuo. Finalmente, en la zona de tejido óseo adyacente al canal de
descompresión central en contacto con los tratamientos aplicados no se vieron
diferencias en los parámetros estudiados que indicaran una mayor capacidad
regenerativa de un tratamiento respecto a los otros.
Análisis biomecánico
El análisis biomecánico para determinar el módulo de compresión del tejido óseo de las
cabezas femorales se realizó en cuatro zonas previamente establecidas en todas las
muestras.
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Los valores de la media calculados para el test biomecánico realizados en la zona
inmediatamente adyacente a la aplicación del tratamiento son menores respecto a los
valores de la zona de tejido óseo alejado de la lesión, zona considerada como tejido
óseo control. Los resultados obtenidos del análisis biomecánico no muestran diferencias
estadísticamente significativas entre los módulos de compresión del tejido óseo entre
los diferentes tratamientos experimentales aplicados.
Análisis histológico e inmunohistoquímico
El análisis histológico de los grupos experimentales ha consistido en la evaluación del
marcaje vital óseo de la tetraciclina mediante microscopia de fluorescencia y, por otro
lado, en la evaluación de la tinción con azul de toluidina mediante microscopia óptica.
En la evaluación de los marcajes con tetraciclina se observó que todos los grupos
experimentales presentaban cúmulos de células con un mayor nivel de fluorescencia
correspondientes a los depósitos de tetraciclina sobre el calcio del tejido óseo formado
de novo. Esto indica que ha habido remodelación ósea y que esta es más evidente en
las trabéculas óseas más cercanas a la zona adyacente al tratamiento, donde el
marcaje es más intenso. No obstante, también aparecen otras zonas alejadas del canal
de descompresión central con marcaje vital por tetraciclina en las trabéculas. Esto es
debido al proceso autólogo de remodelación del tejido óseo, el cual ha continuado en
función del metabolismo de cada animal y de la nueva distribución de cargas en la
cabeza femoral que tiene que soportar. Por estos motivos se observa un
engrosamiento del hueso cortical a nivel femoral y una densificación trabecular en la
zona superior del canal de descompresión central.
En la evaluación de las tinciones por azul de toluidina de las muestras procesadas de
cada grupo experimental se puede observar que ha habido remodelación ósea sobre el
tejido adyacente al canal de descompresión central donde se han implantado los
tratamientos experimentales. Esta remodelación se puede observar cómo ha tenido
lugar sobre las trabéculas óseas preexistentes del hueso huésped afectadas por la
osteonecrosis inducida por la crioterapia.
En los grupos A y B se observa, además, remodelación ósea en las trabéculas
periféricas al canal de descompresión central y restos de gránulos de fosfato de calcio
en diferentes grados de absorción por acción de células de apariencia osteoclástica.
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En los grupos de tratamiento celular —C, D, E y F—, también se observa remodelación
ósea en forma de aposición de hueso laminar sobre las trabéculas óseas cercanas al
canal de descompresión central, así como en la matriz ósea combinada con las MSC
autólogas y alogénicas. En todos los grupos experimentales se pueden observar las
líneas de cementación típicas del tejido óseo que marcan la acción de los osteoclastos
precedentes al depósito osteoblástico de la matriz extracelular que será seguido por la
mineralización del tejido óseo.
A continuación se pueden observar las imágenes representativas de cada grupo
experimental. Las imágenes de la izquierda corresponden a una imagen sagital
obtenida por micro-TC que se corresponde con el mismo plano que las imágenes de la
derecha, que son una composición de imágenes obtenidas por microscopia de
fluorescencia. Las flechas de las imágenes indican las zonas periféricas del canal de
descompresión central donde se ha observado la remodelación ósea.
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Conclusiones
Una vez obtenidos y analizados los resultados del proyecto y puestos en común
conjuntamente con todos los investigadores que han participado en el mismo, hemos
dado respuesta a los objetivos planteados que se describen a continuación.
Todos los tratamientos estudiados han estimulado la regeneración ósea en los animales
de experimentación. En mayor o menor medida, se observa formación de hueso nuevo
sobre las trabéculas preexistentes. Aun así, a partir de los datos experimentales no se
observan diferencias significativas entre los tratamientos aplicados, ni desde el punto
de vista biomecánico, ni a partir de los resultados de micro-TC o histología. Esto podría
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deberse a un periodo de tratamiento corto, ya que aunque sí que se observa una
estimulación de la formación ósea en todos los grupos experimentales, no se pueden
detectar diferencias estadísticamente significativas entre ellos.
En el caso de la verificación del origen celular y de la proliferación y diferenciación in
vivo de las MSC marcadas con GFP, estamos a la espera de poder valorar las muestras
experimentales de los grupos E y F. Para poder realizar los estudios
inmunohistoquímicos de detección de las células marcadas con GFP es necesaria la
descalcificación previa del tejido para poder manipularlo de forma adecuada, pero es
un procedimiento lento que puede tardar meses en completarse. Esperamos que a
medida que avancemos en el proceso de las muestras estos resultados puedan verse
reflejados en una futura publicación.
3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas
En el presente proyecto se ha realizado la reproducción lo más fiel posible de la
situación clínica real de la enfermedad de osteonecrosis de cabeza femoral en un
animal de experimentación. Los tratamientos obtenidos se han demostrado seguros
gracias a los análisis clínicos y analíticos obtenidos en los animales de
experimentación, ya que no se han observado alteraciones sistémicas ni analíticas que
sugieran un daño para el organismo. Todos los tratamientos aplicados estimulan la
regeneración ósea, en mayor o menor medida, ya que han inducido la formación de
hueso de novo sobre trabéculas preexistentes en la zona de la lesión.
Los resultados obtenidos en el estudio permiten el desarrollo de un ensayo clínico para
evaluar la eficacia y seguridad de la aplicación de un producto de bioingeniería tisular
compuesto por gránulos de trifosfato de calcio beta y BMP-2 o concentrado de médula
ósea autóloga en pacientes afectados por osteonecrosis de cabeza femoral o en otros
pacientes que requieran una estimulación de la regeneración ósea.
Los resultados obtenidos permiten considerar la realización de una segunda fase del
ensayo clínico en curso Terapia celular autóloga con células madre adultas en la
osteonecrosis de cabeza femoral, realizado en el HUVH, con una nueva perspectiva de
tratamiento con células madre mesenquimales adultas alogénicas.
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4. Bibliografía científica generada
Actualmente estamos en fase de preparación de publicaciones derivadas directamente
del proyecto financiado donde se describan los resultados obtenidos.