optimizaciÓn de la regeneraciÓn y terapias de trasplante de...
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OPTIMIZACIÓN DE LA REGENERACIÓN Y TERAPIAS DE
TRASPLANTE DE CÉLULAS MADRE PARA DISTROFIAS
MUSCULARES DEGENERATIVAS
Pura Muñoz Cánoves
ICREA Universitat Pompeu Fabra
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1. Resumen
La distrofia muscular de Duchenne (DMD), causada por un defecto en el gen de la
distrofina, continúa siendo incurable, lo que enfatiza la necesidad de un mejor
conocimiento de esta enfermedad degenerativa compleja. Identificar tipos celulares y
factores que contribuyen a esta patología es, por lo tanto, crucial para el desarrollo de
estrategias de tratamiento. Las terapias con células madre musculares (células
satélite) han fallado debido a la proliferación y supervivencia limitadas de las células
trasplantadas. Sin embargo, el trasplante de mesoangioblastos (células madre de
origen vascular) ha tenido resultados prometedores en ratones y en modelos
preclínicos de DMD. Se ha reconocido ampliamente que la eficacia de los ensayos
clínicos depende de la continua optimización, basada en un conocimiento profundo de
la biología de las células madre usadas y de la patología del tejido diana. Este proyecto
aborda de manera coordinada estas optimizaciones que incluyen desde el uso de
modelos de ratones inmunodeficientes para la distrofia muscular (ratones mdx), hasta
la biología celular de las células madre y el uso dirigido de herramientas farmacológicas
para reducir la fibrosis (acumulación de colágeno) del músculo diana para mejorar la
integración de las células madre. A pesar de que la fibrosis es una seña de identidad de
la DMD, los mecanismos controladores del desarrollo de la fibrosis continúan siendo en
gran parte desconocidos. Nosotros recientemente encontramos que: i) la inflamación
promueve la fibrosis en ratones distróficos, con el factor hemostático fibrinógeno como
mediador clave; ii) los macrófagos alternativamente activados (aa) profibróticos
dirigidos por Th2 se ven aumentados en el músculo distrófico; iii) el micro-RNA-21
(miR-21) está implicado en la fibrogénesis muscular, y iv) un regulador crítico de las
funciones de las células madre musculares es la vía de señalización de las MAP
quinasas de p38.
1.1. Hipótesis
i) La fibrosis del tejido muscular distrófico diana afecta negativamente las funciones de
las células madre e impide el éxito de la regeneración terapéutica.
ii) Las moléculas que pueden ser usadas para revertir terapéuticamente la fibrosis
llevarán a aproximaciones más efectivas para la medicina regenerativa del músculo y a
curas nuevas para enfermedades degenerativas, incluyendo no solo miopatías, sino
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también arteroesclerosis, daño vascular en diabetes y en enfermedad de isquemia
periférica vascular.
iii) Modificaciones de la actividad de la quinasa p38a puede influenciar la regeneración
del músculo distrófico.
1.2. Objetivos principales
Objetivo 1: mejora del injerto de las células madre y recuperación muscular
mediante la inhibición de la inflamación y fibrosis en distrofias musculares
Fundamento. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad
degenerativa devastadora que aparece como consecuencia de la pérdida de la gran
proteína citoesquelética distrofina. La inflamación del músculo, la necrosis y la fibrosis
aparecen como consecuencias directas o indirectas de la deficiencia en distrofina, por
lo que pacientes con DMD sufren una pérdida de masa y función muscular grave y
progresiva. Por el momento no hay terapias correctoras del principal defecto en DMD
(ausencia de distrofina) que estén disponibles clínicamente, aunque avances recientes
en terapia celular han demostrado que los mesoangioblastos, células madre de origen
vascular, si se administran en el músculo distrófico, consiguen una mejora funcional
del fenotipo distrófico. La corrección de la enfermedad por trasplante de células madre
musculares, llamadas células satélite, o de origen vascular/mesodermal, llamadas
mesoangioblastos, depende de un conjunto de factores cruciales, que incluyen la
supervivencia e integración en el tejido diana, una capacidad de autorrenovación
residual suficiente de las células del donante para mantener la homeostasis del tejido
por un periodo largo, el control de la inflación y la fibrosis, y la inhibición de la posible
reacción inmune contra las células del donante (por trasplante heterólogo). Los ratones
mdx (el modelo de DMD más ampliamente usado) se han cruzado con ratones SCID,
se han usado para el trasplante en humano/ratón y están disponibles en nuestro
centro. Usaremos estos ratones para testar la eficacia del trasplante de células satélite
y de los mesoangioblastos. Basándonos en resultados recientes de nuestro grupo,
esperamos que la modificación del ambiente del tejido receptor distrófico mediante la
modulación de la interacción fibrinógeno/macrófago y/o las transiciones de fenotipos
de macrófagos, o mediante la interferencia con la señal intracelular de fibroblastos, nos
permita reducir la inflamación y fibrosis, lo que favorecerá la implantación y el injerto
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de células satélite y mesoangioblastos. Estos estudios proporcionarán dianas noveles
para la intervención que esperamos que mejoren el resultado de la terapia con células
madre y limite el avance de la enfermedad. Es importante señalar que los reactivos
propuestos en este proyecto para estas acciones (fármacos, péptidos e inhibidores de
micro-RNA) están disponibles para la mayoría de las moléculas consideradas en esta
propuesta, por lo que el traslado a la clínica sería factible y relativamente rápido.
Objetivos específicos: identificación de la eficacia de agentes moduladores de
la inflamación y fibrosis en terapia celular en ratones distróficos
Objetivo 2: entender la biología de células satélite en la mejora de la
regeneración del músculo distrófico
Fundamento. Las células satélite son las principales células madre que sustentan la
regeneración en músculo esquelético. Nos proponemos definir mejor cómo esas células
son controladas por vías de señalización intracelular de manera que se mantengan
quiescentes bajo la lámina basal de la fibra muscular o se activen en respuesta a lesión
o enfermedad. Una vez activadas, la cuestión crítica es cómo se regula su proliferación,
diferenciación y supervivencia, y cómo se orquestra la elección entre diferenciación y
retorno al estado quiescente, combinado con la optimización de las condiciones de
cultivo. Nos proponemos también mejorar nuestro conocimiento sobre los mecanismos
reguladores de las funciones de los mesoangioblastos para poder optimizar su cultivo,
trasplante e integración in vivo.
Objetivo específico: investigar factores que influyan en la quiescencia de
células satélite, su activación, autorrenovación y capacidad regenerativa en
músculo dañado y distrófico
2. Resultados
Relacionado con el objetivo 1: mejora de la integración de las células madre y
de la recuperación de músculo por la inhibición de la inflamación y fibrosis en
distrofias musculares
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Hemos analizado el papel del fibrinógeno en la degeneración del músculo distrófico,
comparamos ratones Fib+/+mdx y Fib−/−mdx a diferentes edades (antes de la
aparición de síntomas y en el pico de la enfermedad), y asociamos la acumulación de
esta proteína de matriz provisional específicamente con distrofinopatías en ratón mdx.
Hemos demostrado que el tratamiento in vivo con péptico Fibγ377-395 atenúa la
gravedad de la distrofia muscular mediante la interferencia selectiva con la activación
de macrófagos en músculo necrótico sin el indeseado efecto deletéreo hemorrágico.
Hemos analizado el tratamiento farmacológico con ancrod para la defibrinogenación en
músculo mdx. La eliminación farmacológica de un regulador de la regeneración tisular
e inflamación, el fibrinógeno, ha revelado un modificador poderoso de la enfermedad
muscular degenerativa y protegió a ratones mdx del deterioro funcional del músculo.
Hemos analizado los depósitos de fibrinógeno y los infiltrados de células inflamatorias
en biopsias musculares humanas. Hemos establecido un rasgo común de ambos, ratón
mdx y humano DMD, que evolucionó a una deposición vigorosa y recurrente de
fibrinógeno, y se registraron cambios secundarios de inflamación que producían la
progresión de la enfermedad muscular.
Hemos demostrado la recuperación de la fuerza muscular en el músculo distrófico por
angiotensina-1-7 a través de la inhibición de señalización de TGFb, en colaboración con
el grupo de E. Branda (Universidad Católica de Chile, Santiago de Chile, Chile.
Publicado en Acuña et al., Hum Molec Genet, 2013).
Hemos analizado el papel de miR-21 en el modo de acción de Ang-(1-7): Hemos
descubierto que la reducción del micro-RNA profibrótico miR-21 por tratamiento con
Ang-(1-7) reduce la población de fibroblastos y la producción de matriz extracelular.
También hemos diseñado una estrategia para la separación celular (FACS) que nos
permite segregar correctamente tres poblaciones de macrófagos. Siguiendo este
proceso, hemos sido capaces de detectar la misma población de macrófagos tanto en
el músculo WT lesionado como en el músculo de ratones mdx distróficos. Sin embargo,
mientras que con el daño agudo inducido en el músculo WT la población Ly6Calto es
progresivamente reemplazada por las dos poblaciones de macrófagos Ly6Cbajo, estas
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tres poblaciones coexisten continuamente en el músculo distrófico de ratones mdx. Es
interesante señalar que hemos observado que no hay cambio en las diferentes
poblaciones infiltradas en el músculo de ratones WT o IL4R KO en este punto. También
hemos analizado la extensión de la fibrosis en ratones mdx y ratones mdx sin
señalización IL-13, y es destacable que en el diafragma de 6 y 18 meses en ratones
mdx la fibrosis se había reducido de manera significativa en la ausencia de IL-13, lo
que confirma que IL-13 es una citoquina profibrótica en el modelo mdx.
Hemos generado ratones distróficos con inflamación y fibrosis alteradas mediante el
cruce de ratones mdx con ratones IL-4R−/− e IL-13Ra−/−. Hemos caracterizado
nuevos tipos celulares que pueden contribuir a la progresión de la fibrosis en músculo
distrófico como células endoteliales, células satélite o progenitores fibroadipogénicos,
que se ha visto que son el principal tipo celular involucrado en la fibrosis de músculo
distrófico (Uezumi et al., 2011).
También hemos generado ratones reporteros para la identificación de las células
productoras de fibrosis en músculo distrófico: ratones knock-in para Pax7-Cre/YFP
(células miogénicas), VE-Cadherin-Cre/YFP y Tie2-Cre/YFP (células endoteliales), e
intercruces de estos ratones con ratones mdx.
Dado que nuestro grupo y otros han encontrado una función principal del factor de
crecimiento TGFb como promotor de la fibrosis en ratones mdx, hemos realizado un
microarray de análisis de genes de expresión de células satélite tratadas (o no) con
TGFb para investigar si este factor de crecimiento podría tener un papel en la
conversión celular de distintos tipos celulares a células fibrogénicas. También se
realizaron estudios similares con células endoteliales tratadas o no con este factor de
crecimiento. Estos llevaron a la identificación de nuevas funciones fibrogénicas de
funciones de TGFb en células satélite y endoteliales, a expensas de sus funciones
regenerativas (o angiogénicas).
Relacionado con el objetivo 2: entender la biología de las células satélite para
mejorar la regeneración del músculo distrófico
Hemos generado las líneas de ratón inducible y condicional Cre para superar la
dependencia del desarrollo embriónico miogénico en p38a, generando líneas de ratón
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para eliminar la señalización de p38a en células satélite, para precisamente identificar
y cuantificar las células satélite deficientes en p38a con el objetivo de marcar de
manera irreversible las células Pax7 positivas in vivo, y sus variantes inducibles.
Hemos analizado el papel de p38a en la función de las células satélite durante el
desarrollo postnatal, usando una nueva línea generada de ratón condicional mutante que
carece de p38a en células satélite y miofibras del compartimento del músculo esquelético
mediante la disrupción del gen de p38a en la progenia de Pax7 usando el sistema
Cre/loxP.
Hemos encontrado que la pérdida de p38a resulta en la pérdida de masa muscular y un
retraso de la regeneración muscular in vivo. Además, nuestros resultados indican que
p38a tiene un papel en la mediación de la activación de las células satélite in vivo.
Podríamos postular que un defecto en la activación de las células satélite por la
depleción de p38a resulta en un retraso de la regeneración muscular. Nuestros datos
revelan que el mecanismo de acción de p38a difiere entre progenitores del músculo
embriónico y células satélite adultas. Además, nuestros descubrimientos indican que
p38a es una de las moléculas importantes para definir el comportamiento asociado a la
edad de las células satélite, y esto incrementa nuestro conocimiento actual de la
biología de las células satélite.
Hemos identificado la MAP quinasa de p38a como un regulador principal de la pérdida
de funciones de las células satélite. La pérdida de p38a es capaz de prevenir la
inducción de inhibidores del ciclo asociados a senescencia en células satélite de ratones
muy viejos. Por eso, la deficiencia genética de p38a rejuvenece células satélite viejas.
Hemos encontrado que defectos similares de las células satélite de músculo envejecido
son compartidas por células satélite de músculo distrófico, lo que sugiere que la
reducción de actividad de p38a MAP quinasa de p38a puede ser una ventaja para las
funciones de las células satélite (en músculo endógeno como tras trasplante) en
ratones distróficos.
Para investigar el programa de transcripción génica global regulado por p38a durante
la diferenciación de las células satélite y para estudiar específicamente si ocurre la
regulación a través de acción directa de p38a en promotores de genes, hemos
realizado una combinación de análisis de microarray de expresión génica y puntos de
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unión en todo el genoma. Estos resultados evidencian la asociación y la función de
p38a en relación con la cromatina en nuevas clases de genes diana durante la
diferenciación de músculo esquelético.
3. Relevancia e implicaciones
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es la enfermedad hereditaria más común y
letal de la niñez, y afecta a 1 de cada 3.500 niños nacidos en todo el mundo. Esta
enfermedad, demasiado habitual, es la consecuencia de mutaciones en el gen de la
distrofina. La pérdida de distrofina de la membrana celular del músculo deriva en la
debilitación mecánica de la membrana, que es más fácilmente dañada durante la
contracción muscular. La inflamación muscular, necrosis, fibrosis y anormalidades
musculares ocurren como consecuencia directa o indirecta de la deficiencia de
distrofina, de manera que los pacientes con DMD sufren una pérdida grave y
progresiva de masa muscular y de función. Los pacientes con DMD se ven limitados a
una silla de ruedas a la edad de 9-12 años, y mueren al final de la adolescencia o al
llegar a los veinte años, a menudo debido a complicaciones que son secundarias a la
debilidad de los músculos respiratorios. Hasta la fecha, la DMD sigue siendo incurable.
A pesar de la gravedad de la enfermedad, es importante señalar la dependencia física
de los pacientes con DMD, lo que resulta en un alto coste económico para la sociedad.
Se ha hecho un progreso extraordinario en el conocimiento de las múltiples
características clave de las células madre en los últimos diez años, incluyendo la
definición del nicho, la identificación de señales reguladoras de la movilización, y
también se ha logrado un entendimiento parcial de los mecanismos controladores de la
autorrenovación, compromiso y diferenciación. Este progreso ha producido
herramientas valiosas para el desarrollo de protocolos de terapia celular que han
obtenido resultados positivos en modelos preclínicos de enfermedades musculares
genéticas. Seguramente nuevos tratamientos farmacológicos que trabajen en sinergia
con la terapia de células madre cosecharán éxitos en el tratamiento de la enfermedad
con modelos animales. Es evidente que queda mucho trabajo por hacer para mejorar
nuestro conocimiento de los mecanismos reguladores del desarrollo, homeostasis y
regeneración tisular, y así poder proporcionar nuevas herramientas para implementar
la eficacia de pruebas de terapia celular. Basándonos en estas consideraciones, hemos
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intentado descubrir el proceso inflamatorio que puede promover degeneración y
fibrosis en músculo distrófico, y hemos descifrado nuevos agentes celulares implicados
en la progresión fibrótica en DMD. A partir de estos resultados, proponemos que
mediante la atenuación de la fibrosis producida por la inflamación, y la protección de la
masa y función muscular, no solo seremos capaces de mejorar la calidad de vida de los
pacientes distróficos, sino también de mejorar la eficacia de las terapias basadas en
células madre.
Nuestro trabajo ha revelado que la patología distrófica (en particular, la degeneración y
la fibrosis) puede ser atenuada y se puede preservar la función muscular mediante
intervenciones al nivel del fibrinógeno asociado a la matriz que no supone ninguna
alteración o riesgo hemostático. Específicamente, la simple eliminación del motivo de
unión de αMβ2 en la cadena g del fibrinógeno que dirige las funciones inflamatorias,
pero que es irrelevante para la formación de polímeros de fibrina, se ha probado
suficiente para aliviar la gravedad de la enfermedad en el músculo distrófico mdx. Por
tanto, la alteración de interacciones fibrinógeno-αMβ2 con péptidos comerciales de
interferencia podría ser de uso potencial para atenuar la progresión de la distrofia en
pacientes. La relevancia de esos potenciales resultados para enfermedades humanas
queda subrayada por el hallazgo de la acumulación de fibrinógeno positivamente
asociada con la inflamación en músculos degenerantes de paciente DMD (nuestros
resultados previos). Por tanto, si se seleccionan de manera selectiva las funciones
inflamatorias de los fibrinógenos, se podría conseguir una estrategia terapéutica
prometedora para pacientes con DMD, que mayoritariamente solo cuentan con
tratamientos de apoyo. De manera similar, tratamientos con amilorida (que se usa en
clínica para patologías del riñón, conocido como Midamor), o con antagomiRs de miR-
21, o tratamientos consistentes en alterar el eje de señalización de IL-4/IL-13, o de la
señalización de TGFb, pueden ser también de rápida transferencia y desvelar nuevas
formas de reducir la fibrosis y mejorar la integración de células madre para
aplicaciones humanas en DMD. De hecho, nuestros resultados, junto con los de
Cosgrove et al. y Bernet et al. (Nature Medicine), sugieren que la reducción de la
actividad de la MAP quinasa p38a puede mejorar no solo la regeneración endógena del
músculo sino también la capacidad de integración de las células satélite, con
implicaciones biomédicas de terapias celulares para DMD.
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4. Publicaciones
Sousa-Victor P, Muñoz-Cánoves P.
Regenerative decline of stem cells in sarcopenia.
Mol Aspects Med. 2016, 50:109-17.
García-Prat L, Martínez-Vicente M, Muñoz-Cánoves P.
Autophagy: a decisive process for stemness.
Oncotarget (Autophagy and Cell Death section). 2016, 7:12286-8.
García-Prat L, Muñoz-Cánoves P*, Martínez-Vicente M*. (*Autores para
correspondencia).
Dysfunctional autophagy is a driver of muscle stem cell functional decline with aging.
Autophagy. 2016, 12:612-3.
García-Prat L, Martínez-Vicente M, Perdiguero E , Ortet L, Garcia-Ubreva J, Rebollo E,
Ruiz-Bonilla V, Gutarra S, Ballestar E, Serrano AL, Sandri M, Muñoz-Cánoves P.
Autophagy maintains stemness by preventing senescence.
Nature. 2016: 529: 37-42.
Brack AS, Muñoz-Cánoves P.
The ins and outs of muscle stem cell.
Skel Muscle. 2016.
Segalés J, Islam AB, Kumar R, Liu QC, Sousa-Victor P, Dilworth FJ, Ballestar E,
Perdiguero E, Muñoz-Cánoves P.
Chromatin-wide and transcriptome profiling integration uncovers p38α MAPK as a
global regulator of skeletal muscle differentiation.
Skelet Muscle. 2016.
Muñoz-Cánoves P, Di Croce L.
Special issue on Epigenetics.
FEBS J. 2015, 282:1569-70.
Pessina P, Kharraz Y, Jardí M, Fukada SI. Serrano AL, Perdiguero E, Muñoz-Cánoves
P.
11
Fibrogenic cell plasticity blunts tissue regeneration and aggravates muscular dystrophy.
Stem Cell Reports. 2015, 4:1046-60.
Artandi SE, Blau HM, de Haan G, Geiger H, Goodell MA, Jones L, Levine RL, Muñoz-
Cánoves P, Rodewald HR, Wagers A, Wang ZQ, Yamashita Y.
Stem Cells and Aging: What’s Next?
Cell Stem Cell. 2015, 16: 578-81.
Segalés J, Perdiguero E, Muñoz-Cánoves P.
Epigenetic control of adult skeletal muscle stem cell functions.
FEBS J. 2015, 282: 1571-1588.
Aso E, Serrano AL, Muñoz-Cánoves P, Ferrer I.
Fibrinogen-Derived γ377-395 Peptide Improves Cognitive Performance and Reduces
Amyloid-β Deposition, without Altering Inflammation, in AβPP/PS1 Mice.
J Alzheimers Disease. 2015, 47: 403-12.
Sousa-Victor P, García-Prat L, Serrano AL, Perdiguero E, Muñoz-Cánoves P.
Muscle stem cell aging: regulation and rejuvenation.
Trends Endocrinol Metab. 2015, 26:287-96.
Muñoz-Cánoves P, Serrano AL.
Macrophages decide between regeneration and fibrosis in muscle.
Trends Endocrin and Metab. 2015, 26: 449-50.
Sousa-Victor P, García-Prat L, Muñoz-Cánoves P.
Dual mTORC1/C2 inhibitors: gerosuppressors with potential anti-aging effect.
Oncotarget. 2015, 6:23052-23054.
López-Arribillaga E, Rodilla V, Pellegrinet L, Guiu J, Iglesias M, Roman AC, Gutarra S,
González S, Muñoz-Cánoves P, Fernández-Salguero P, Radtke F, Bigas A, Espinosa
LL.
Bmi1 regulates murine intestinal stem cell proliferation and self-renewal downstream of
Notch.
Development. 2015, 142: 41-50.
12
Sousa-Victor P, Perdiguero E, Muñoz-Cánoves P.
Geroconversion of aged muscle stem cells under regenerative pressure.
Cell Cycle. 2014, 13:20.
Bouché M, Muñoz-Cánoves P, Rossi F, Coletti D.
Inflammation in muscle repair, aging, and myopathies.
Biomed Res Int. 2014.
Kharraz Y, Guerra J, Pessina P, Serrano AL, Muñoz-Cánoves P.
Understanding the process of fibrosis in Duchenne muscular dystrophy.
BioMed Res Int. 2014.
Pessina P, Cabrera D, Morales G, Riquelme C, J Gutiérrez C, Serrano AL, Brandan E,
Muñoz-Cánoves P.
Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne
Muscular Dystrophy.
Skelet Muscle. 2014, 25;4:7.
Sousa-Victor P, Gutarra S, García-Prat L, Rodriguez-Ubreva J, Ortet L, Ruiz-Bonilla V,
Jardí M, Ballestar E, González S, Serrano AL, Perdiguero E, Muñoz-Cánoves P.
Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence.
Nature. 2014, 506:316-21.
Acuña MJ, Pessina P, Olguin H, Cabrera D, Vio CP, Bader M, Muñoz-Cánoves P,
Santos RA, Cabello-Verrugio C, Brandan E.
Restoration of muscle strength in dystrophic muscle by angiotensin-1-7 through
inhibition of TGF-β signalling.
Human Mol Genet. 2014, 23:1237-49.
Muñoz-Cánoves P, Michele D.
Special issue: myogenesis: introduction.
FEBS J. 2013, 280: 3979.
Sandri M, Barberi L, Bijlsma AY, Blaauw B, Dyar KA, Milan G, Mammucari C, Meskers
CG, Pallafacchina G, Paoli A, Pion D, Roceri M, Romanello V, Serrano AL, Toniolo L,
13
Larsson L, Maier AB, Muñoz-Cánoves P, Musarò A, Pende M, Reggiani C, Rizzuto R,
Schiaffino S.
Signalling pathways regulating muscle mass in ageing skeletal muscle. The role of the
IGF1-Akt-mTOR-FoxO pathway.
Biogerontology. 2013, 14:303-23.
Muñoz-Cánoves P, Scheele C, Pedersen BK, Serrano AL.
IL-6 myokine signaling in skeletal muscle: a double-edged sword?
FEBS J. 2013.
Kharraz Y, Guerra J, Mann CJ, Serrano AL, Muñoz-Cánoves P.
Macrophage plasticity and the role of inflammation in skeletal muscle repair.
Mediators Inflam, 2013:491497.
García-Prat L, Sousa-Victor P, Muñoz-Cánoves P.
Functional dysregulation of stem cells during aging: a focus on skeletal muscle stem
cells.
FEBS J. 2013.