PCR Transcripcin reversa

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la clula de duplicar el ADN.Se trata de una tcnica usada para crear un gran nmero de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin, apareamiento con cebadores y extensin por una ADN polimerasa termoresistente.Hasta la dcada de 1980, el nico mtodo para obtener grandes cantidades de un fragmento de ADN era clonndolo en vectores adecuados e introducindolo y multiplicndolo en bacterias. En el ao 1985, un investigador norteamericano, Kary Mullis (acreedor del Premio Nobel en Qumica 1993 por este aporte), desarroll un mtodo que permite, a partir de una muestra muy pequea de ADN, obtener millones de copias de ADNin vitro, en unas pocas horas y sin necesidad de usar clulas vivas. Esta tcnica, llamada reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), requiere conocer la secuencia de nucletidos de los extremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para disear dos oligonucletidos sintticos de ADN complementarios a una porcin de cada una de las dos cadena de la doble hlice.1. La mezcla de reaccin contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucletidos sintticos (P1 y P2) que servirn como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato dATP, dGTP, dCTP

PCR a partir de ARN.El genoma de muchos virus de importancia clnica est compuesto de ARN en lugar de ADN, los ms sobresalientes son el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), el Virus de la Hepatitis C (HCV) y la familia de Enterovirus (EV).

Transcripcin Reversa- PCR (RT-PCR).Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR. La transcripcin reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es ADN complementario (cADN) el cual es estable al calor y puede resistir la metodologa PCR.Los pasos de la RT-PCR son:1. Transcripcin reversa: Unin del partidor a la secuencia de ARN objetivo.2. Transcripcin reversa: La polimerasa rTthcataliza la extensin del partidor mediante la incorporacin de nucletidos complementarios.3. Fin de transcripcin reversa, se obtiene la hebra del cADN complementario al ARN.4. PCR.1er paso: Retrotranscripcin a partir del ARN.2 paso: Amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc.3er paso: Se procede a relaizar PCR de cualquier otro tipo.Algunas aplicaciones de este tipo PCR son:La transcriptasa inversa se utiliza para crear bibliotecas de cDNA de ARNm, Diagnostico molecular, Evalucacion de terapias, Deteccin temprana de Citomegalovirus y otros patgenos en pacientes con transplante de rganos, entre otras muchas mas.

2.5 Microscopia electrnica de transmisin:A diferencia de los anteriores microscopios, este no explora superficies , por el contrario el haz de electrones incidente atraviesa la muestra o espcimen observado y la sombra de detalles finos o ultra-estructura es capturada en una pantalla fosforescente con propiedades de emisin de luz, ubicada en la parte inferior de la columna. El tener una adecuada preparacin de la muestra da lugar a una excelente definicin de imagen. Son mltiples las facetas el las que interviene este tipo de microscopio. As, en control de calidad sealamientos morfolgicos, conformacin de agregados, tcnicas forenses, determinacin de estratos en restauracin y diferenciacin histolgica entre otros.En la construccin de microscopios electrnicos (1), se han usado con resultados satisfactorios ambos tipos de lentes: electrostticas y magnticas. Con todo, la mayor parte de los microscopios electrnicos hoy da en uso son magnticos; Un esquema clsico de estos aparatos esta representado en la figura 2. Algunos instrumentos no poseen lente condensadora, otros en cambio tienen dos, mientras otro grupo de aparatos posee solamente una lente proyectora. Aunque los detalles de construccin varen de un tipo a otro, se puede obtener una visin cualitativa de conjunto de sistema ptico. La fuente de electrones (2)esta constituida por un hilo de volframio en forma de horquilla, rodeado por una pantalla cilndrica polarizada negativamente respecto al filamento( figura 3). Despus de atravesar el nodo conectado a tierra, la mayor parte de los electrones del haz se pierden en las paredes y aberturas excepto un estrecho cono que atraviesa el diafragma del condensador. La lente condensadora se usa tanto para controlar la intensidad luminosa, como para variar la abertura de iluminacin relativa en el objeto. Los dimetros de los diafragmas del condensador varan segn el tipo de instrumento, pero suelen estar comprendidos entre 0,1 y 0,5 mm. Despus de atravesar el objeto, donde muchos electrones se esparcen, el haz penetra en el campo de la lente objetivo que produce una imagen aumentada del objeto. En el objetivo se suele colocar un diafragma de 10 a 100 de dimetro para interceptar los electrones esparcidos , pero generalmente esta precaucin se omite en el estudio de muestras muy delgadas en las que el esparcimiento no es excesivo. Puesto que para las distancias usuales entre lente e imagen, el aumento obtenido con la lente objetivo es del orden de X100 a X300, sera necesario el uso de una o mas lentes protectoras que vuelvan a aumentar la imagen primaria.Algunos instrumentos llevan incorporada una pantalla intermedia para facilitar la alineacin, pero no poseen en cambio este accesorio aquellos aparatos dotados de dos lentes proyectoras. La imagen final se observa en una pantalla fluorescente , y separando esta pantalla del camino del haz, se impresiona una placa fotogrfica con dicha imagen. Las dimensiones mas usuales para un microscopio de transmisin pueden ser: Del filamento a la lente condensadora 15 cm, y otro tanto de esta ltima al objeto, mientras que del objetivo a la pantalla que recoge la imagen final pueden haber unos 100 cm, el sistema completo deber ser rgido y capaz de alcanzar un vaco de 0.0001 mmHg con ayudas de bombas de difusin rpidas en serie con bombas rotatorias. Otras partes importantes importantes del aparato que no han sido representadas en los diagramas son la fuente de alimentacin para crear un potencial del haz, fuentes de alimentacin para las lentes magnticas , medidores de vaco, tornillos de alineacin, vlvulas de vaco , controles de aumento y enfoque, etc. De momento, nuestro inters mas inmediato se centra en la tcnica de preparacin de muestras.Comparacin entre microscopia electrnica de transmisin (MET) y microscopia electrnica de barrido (MEB).Preparacin de las muestras El proceso comienza con el tejido altamente hidratado y termina con el tejido virtualmente libre de agua y preservado en una matriz de resina. Existen muchos caminos para la preparacin de tejidos para Microcopia electrnica de transmisin, pero los mtodos siguen bsicamente ocho pasos:1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se realiza con glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su accin se centra en las protenas as:(COOH-protena-NH2)2+ CHO- CH2-CH2-CH2-CHOEntonces:COOH-protena-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH +H2O La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en una hora por el glutaraldehido.2. Lavado: Normalmente se hace con un buffer.Buffer: es necesario su uso debido a que el pH de los tejidos se baja drsticamente durante el proceso de fijacin. El uso de buffer mantiene el pH fisiolgico (7,2 a 7,4) los sistemas de buffer ms comunes son: fosfato, s-collidine, tris-maleato y cacodylate.3. Fijacin secundaria:es llevada a cabo por la accin del tetrxido de osmio, el cual reacciona principalmente con los lpidos. El tetrxido de osmio generalmente no penetra mas de 0,5 mm en una hora.4. Deshidratacin: La filosofa de la deshidratacin es el reemplazo del agua usando etanol en series 70% 85% 95% y etanol absoluto.5. Infiltracin con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay transmisin de fluidos gradualmente reemplazado por soluciones intermediarias altamente miscibles con los agentes deshidratantes, la mayora de los protocolos emplean un solvente transicional entre el deshidratante y la resina.6. Infiltracin con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando dentro de los tejidos despus de la deshidratacin. La concentracin del solvente es minimizada gradualmente incrementando las concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura.7. Inclusin: sumergir el tejido en la resina pura.8. Polimerizacin de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerizacin aumentando la temperatura.

Recipientes de uso comn para la inclusin de las muestras en MET. Normalmente las muestras se marcan con un trozo de papel indicando algn tipo de convencin que ilustre posteriormente su contenido.

Los tejidos debidamente incluidos son cortados con el ultramicrotomo, dependiendo del tipo de microtomo utiliza cuchillas de diamante o vidrio (la ms comn). Procesador automtico de tejidos.