CHAPTER 9

DEFINEN MEDIOS Y SUPLEMENTOS

9.1 DESARROLLO DE MEDIOS DE COMUNICACIÓN

Intentos iniciales de células en cultivo se realizaron en natural medios de comunicación basados en extractos de tejidos y fluidos del cuerpo, tales como chica. Extracto de embrión, suero, linfa, etc.. Con la propagación del líneas celulares, la demanda de grandes cantidades de un medio de calidad más consistente que condujo a la introducción de químicamente definido los medios de comunicación basados en análisis de cuerpo fluids y bioquímica nutricional. Medio Basal del águila [águila, 1955] y, posteriormente, un medio esencial mínimo del águila (MEM) [Águila, 1959] llegó a ser ampliamente adoptado, vario suplementado con proteína becerro, humanos o suero de caballo, hidrolizados y Extracto de embrión. Como célula más continua las líneas se convirtieron disponibles (elución de L929 células, HeLa, etc.), era evidente que estos medios eran perfectamente adecuados para la mayoría de esas líneas y la mayoría de los desarrollos posteriores fueron encaminadas a la sustitución del suero (véase sección 10.2), optimizando los medios para diferentes tipos de células (por ejemplo, RPMI 1640 para linfoblastoides líneas celulares), o la modificación de las condiciones específicas (por ejemplo, Leibovitz L15 para eliminar la necesidad de adición de CO2 y NaHCO3) [Leibovitz, 1963].Aislamiento y propagación de las células de un linaje específicas puede requieren un medio libre de suero selectivo (ver sección 10.2.1), mientras que las células cultivadas para la formación de productos, como anfitriones para propagación viral, o para los estudios moleculares no-celular-específicas dependen principalmente del águila de MEM [águila, 1959], Dulbecco s modificación del medio del águila, DMEM [Dulbecco & Freeman, 1959], o, cada vez más, RPMI 1640 [Moore et al., 1967], suplementado con suero. Sin embargo, muchos técnicas de producción a escala industrial ahora usan libre de suero medios de comunicación, para facilitar el procesamiento descendente y reducir el riesgo de agentes infecciosos adventicios (véase la sección 10.1). A compromiso popular para muchos laboratorios es una mezcla de un medio complejo, como el F12 de jamón [jamón, 1965], con una con mayor aminoácido y las concentraciones de vitaminas, tales como DMEM. Esta alternativa horroriza a los puristas, pero lo hace generar un medio útil, multiuso para cultivo primario como así como la propagación de la línea celular. En este capítulo se concentra en los principios generales de composición media, usando el serumsupplemented ampliamente utilizado los medios de comunicación como ejemplos y capítulo 10 se centrarán en el diseño y uso de los medios sin suero.

9.2 PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE

9.2.1 pH

La mayoría de las líneas celulares crecen bien a pH 7,4. Aunque el óptimo pH para el crecimiento celular varía relativamente poco entre diferentes cepas celulares, algunas líneas de fibroblastos normales realizan mejor a pH 7.4–7.7 y las células transformadas pueden hacerlo mejor en pH 7.0–7.4 [Águila, 1973]. Se informó que podrían ser células epidérmicas mantenido a pH 5.5 [Eisinger et al., 1979], pero este nivel tiene No han adoptado universalmente. En casos especiales puede resultar ventajoso hacer un crecimiento breve experimento (ver protocolos 21,7 y 21,8), ensayo de eficacia de chapado (véase sección 21,10), o análisis de función especial (por ejemplo, véase sección 17,7) para determinar el pH óptimo. Rojo de fenol se utiliza comúnmente como un indicador. Es de color rojo en pH 7,4 y se convierte en naranja a pH 7,0, amarillo a pH 6.5, limón

amarillo debajo de pH 6,5, más rosa en pH 7.6 y púrpura a pH 7.8 (ver placa 22b). Porque es la evaluación del color altamente subjetivo, es útil componer un conjunto de normas con rojo de fenol en una solución salina equilibrada estéril (BSS) la concentración correcta, en el mismo tipo de botella, con la mismo espacio para el aire, que normalmente utilizas para preparar un medio. El siguiente ejemplo se utilizará la cultura 25-cm2 frascos como los receptáculos del finales y puede ser utilizado en conjunción con ejercicio 8.

PROTOCOLO 9.1. PREPARACIÓN de pH

ESTÁNDARES

MaterialesEstéril:Una solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) o del águilaMEM, concentrado × 10, sin bicarbonato o glucosa, con 20 mM HEPES............... . 10 mLAgua ultrapura (UPW)............... 90 mL 1 N NaOH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 mLEnvases universales, 30 mL........... 7Frascos de cultivo, 25 cm2................. 7Puntas de pipeta, 100 μLNo estéril: medidor de pHPipeta, 10 μLProtocolo1. haga la HBSS o medio a pH 6,5 o inferior, y distribuir 10 mL en cada uno de siete años con la etiqueta envases universales.2. deje que se equilibren con aire durante 30 minutos.3. ajustar el pH en los envases separados a 6.5,6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6 y 7.8 con 1 N NaOH, usando un medidor de pH.4. filtro esterilizar 5 mL cada HBSS en separado frascos etiquetados (véase protocolo 11.11), utilizando la primera5 ml para purgar el filtro, antes de recoger la segundo 5 mL en el matraz.5. Tape los frascos firmemente.

9.2.2 CO2 y bicarbonato

Dióxido de carbono en la fase gaseosa se disuelve en el medio,vestablece equilibrio con HCO3Los iones − y disminuye el pH.

Porque disuelto CO2, HCO3− y el pH son todos interrelacionados, es difícil determinar el principal efecto directo del CO2. La tensión de CO2 atmosférica regulará la concentración de disuelto CO2 directamente, en función de la temperatura. El presente Reglamento, a su vez produce H2CO3, que disocia según la reacción.

H2O + CO2 ⇔ H2CO3 ⇔ H+ + HCO3− (1)HCO3−tiene una constante de disociación bastante baja con la mayoría de los cationes disponibles así que tiende a reasociar, dejando el medio ácido. El resultado neto de aumento de CO2 atmosférico

es a deprimir el pH, así que es el efecto de la elevada tensión de CO2 neutralizado por el aumento de la concentración de bicarbonato:

NaHCO3 ⇔ Na+ + HCO3− (2)

El aumento de HCO3- concentración configuración la ecuación (1) a la izquierda hasta el equilibrio se alcanza un pH de 7,4. Si otro álcali (por ejemplo, NaOH) se utiliza en lugar de ello, el resultado neto es el mismo:

NaOH + H2CO3 ⇔ NaHCO3 + H2O ⇔ Na+ +HCO3− + H2O (3)

Las concentraciones de NaHCO3 equivalentes usadas con CO2 diferentes tensiones aparecen en las tablas 9.1, 9.2, y 9.3. Valores intermedios de CO2 y HCO3− puede utilizar, siempre que la concentración de ambos es muy variada proporcionalmente. Porque muchos medios de comunicación se componen de ácido solución y puede incorporar un buffer, es difícil predecir ¿Cuánto bicarbonato para utilizar cuando otro álcali puede también terminan como bicarbonato, al igual que en la ecuación (3). Cuando prepare un nuevo medio por primera vez, añadir la cantidad especificada de bicarbonato y luego suficiente 1 N NaOH tal que el medio equilibra el pH deseado después de la incubación en una placa de Petri a C 37◦, en la correcta concentración de CO2, durante la noche. Al tratarse de un medio que ya está en trabajando la fuerza, variar la cantidad de HCO3− para adaptarse a la fase gaseosa (ver tabla 9.1) y dejar el medio de la noche para equilibrar a 37◦C. Cada medio tiene un recomendado concentración de bicarbonato y la tensión de CO2 para el logro de la correcta pH y la osmolalidad, pero las variaciones menores se producirán en diferentes métodos de preparación.

Con la introducción de los búferes del bien (por ejemplo, HEPES, Tricina) [bien et al., 1966] en cultivo de tejidos, había

algunas especulaciones que, como CO2 ya no era necesario estabilizar el pH, puede ser omitido. Esto probó ser falso [Itagaki & Kimura, 1974], al menos para un gran número tipos de células, particularmente en las concentraciones de bajos de células. Aunque 20 mM HEPES puede controlar pH dentro de los fisiológicos gama, la ausencia de CO2 atmosférico permite la ecuación (1) para mover a la izquierda, eliminando finalmente disuelto CO2, y en última instancia, HCO3−, del medio. Esta cadena de eventos aparece limitar el crecimiento de la célula, aunque si el las células requieren el CO2 disuelto o el HCO3− (o ambos) No está claro. HCO3 recomendada −, CO2 y HEPES las concentraciones se dan en la tabla 9.1.

Permite la inclusión de piruvato en el medio células para aumentar su producción endógena de CO2, haciéndolos independientes de CO2 exógeno, así como HCO3−. Leibovitz L15 medio [Leibovitz, 1963] contiene una mayor concentración de piruvato sódico (550 mg/L) pero carece de NaHCO3 y no requiere de CO2 en la fase gaseosa. Almacenamiento en búfer se obtiene mediante la relativamente alta concentraciones de aminoácidos. Porque no requiere CO2, L15 a veces se recomienda para el transporte de las muestras de tejido. Β-glicerofosfato de sodio puede también

utilizarse para amortiguar autoclavable medios carecen de CO2 y HCO3− [Waymouth, 1979] y Invitrogen comercializa un CO2- medio independiente. Si la eliminación de CO2 es importante para ahorrar costos, conveniencia o por otras razones, puede serVale la pena considerar una de estas formulaciones, pero sólo después de realizar una prueba apropiada.

En suma, las culturas en abran vasos necesitas ser incubadas en una atmósfera de CO2, la concentración de los cuales está en equilibrio con el bicarbonato de sodio en el medio (ver tablas 9.1, 9.2 y 9.3). Las células en moderadamente alta concentraciones (≥1 × 105 células/mL) y crecido en sellado frascos no necesitan CO2 añadida a la fase gaseosa, proporcionado que la concentración de bicarbonato se mantiene baja (∼4 mM), especialmente si las células son productores de ácido altos. En baja de la célula concentraciones, sin embargo (por ejemplo, durante la clonación) y con algunos cultivos primarios, es necesario añadir CO2 al gas fase de frascos sellados. Cuando sea necesaria, para permitir la ventilación el equilibrado de CO2 o su escape en alto ácido los productores, es necesario dejar la holgura del casquillo o usar un Tapa permeable al CO2 (ver Fig. 8.8).

9.2.3 Almacenamiento en búfer

Medios de cultivo debe ser protegido bajo dos conjuntos de condiciones: (1) Abra platos, en donde la evolución de CO2 provoca la pH a subir (consulte Sección 9.2.2) y (2) sobreproducción de CO2 y ácido láctico en líneas celulares transformadas en células alta concentraciones, cuando el pH se caerá. Puede ser un búfer incorporado en el medio para estabilizar el pH, pero en (1) exógeno CO2 todavía puede ser requerido por algunas líneas celulares, particularmente en las concentraciones de baja de la célula, para evitar la pérdida total de CO2 disuelto y bicarbonato del medio. A pesar de su escasa capacidad de almacenamiento en búfer en bicarbonato pH fisiológico tampón todavía se utiliza con más frecuencia que cualquier otro buffer debido a su baja toxicidad, bajo costo y beneficio nutricional a la cultura. HEPES es un buffer mucho más fuerte en el rango de pH 7.2–7.6 y se utiliza en 10-20 mM. Ha sido encontró que, cuando se usa HEPES con CO2 exógenos, la HEPES concentración debe ser más del doble de la bicarbonato para el adecuado almacenamiento en búfer (véase tabla 9.1). Una variación de F12 de jamón con 20 mM HEPES, bicarbonato de 10 mM, y 2% CO2 se ha utilizado con éxito en laboratorio del autor para el cultivo de un número de diferentes líneas celulares. Permite el manejo de titulación y otras placas de pocillos fuera de la incubadora sin un aumento excesivo en el pH y minimiza la necesidad de HEPES, que es tóxico y caro.

9.2.4 oxígeno

El otro importante constituyente principal de la fase gaseosa es oxígeno. Considerando que la mayoría de las células requiere oxígeno para la respiración las células cultivadas, en vivo a menudo se basan principalmente en la glucólisis, una alta proporción de los cuales, al igual que en las células transformadas, puede ser anaerobios. Aunque ha habido intentos de incorporar Portadores de O2, por analogía con la hemoglobina en la sangre, aún esta práctica no es de uso general, y las células dependen principalmente de disuelto O2, que pueden ser tóxicos debido a la elevación en el nivel de los radicales libres. Proporcionar la correcta tensión de O2 es, por lo tanto, siempre un compromiso entre el cumplimiento de la requisito respiratorio y evitar la toxicidad. Estrategias O2 reducida y elevadas que implican los niveles han sido empleado, como la incorporación de depuradores de radicales libres, como el glutatión, 2-Mercaptoetanol (β-

mercaptoetanol) o Ditiotreitol, en el medio. La mayoría de esas estrategias han han derivado empíricamente.

Las culturas varían en sus requerimientos de oxígeno, la mayor distinción entre órgano y cultivos celulares. Aunque las tensiones de oxígeno atmosférico o inferior [Cooper et al., 1958; Balin et al., 1976] son preferibles para la mayoría de las culturas de célula, algunos cultivos de órganos, particularmente de embriones en fase tardía, los recién nacidos, o adultos, requiere hasta un 95% O2 en la fase gaseosa [Trowell, 1959; De Ridder & Mareel, 1978]. Este requisito para un alto nivel de O2 puede ser un problema de difusión relacionadas con la geometría y la penetración gaseosa de cultivos de órganos (ver sección 25.2.1) pero también puede reflejar la diferencia entre las células diferenciadas y rápidamente proliferantes. Oxígeno difusión también puede ser limitante en poroso microcarriers [Preissmann et al., 1997] (véase también sección 26.2.4).

Más cultivos de células dispersas prefieren más bajas tensiones de oxígeno, y algunos sistemas (por ejemplo, células tumorales humanas en clonogenic ensayo [Courtenay et al., 1978] y pulmón embrionario humano los fibroblastos [Balin et al., 1976]) hacerloen mejor menos de la nivel normal de la tensión de oxígeno atmosférico. McKeehan et al [1976] sugirió que el requisito para el selenio en medio está relacionada a la toxicidad del oxígeno, como el selenio es un cofactor en la síntesis de glutatión. Tolerancia de oxígeno — y selenio como Bueno — pueden ser proporcionados por suero, así que el control de O2 la tensión es probable ser más crítica en los medios sin suero.

Porque puede influir en la profundidad del medio de cultivo la tasa de difusión de oxígeno a las células, es aconsejable Mantenga la profundidad del medio en el rango de 2 a 5 mm (0,5 mL/cm2) en cultura estática. Algunos tipos de células, por ejemplo, epitelio bronquial y keratinocytes, crecidos en filtro bien insertos, parecen distinguir mejor cuando coloca en el Air–Liquid interfaz (véase la sección 25.3.6).

9.2.5 Osmolalidad

Las células más cultivadas tienen una tolerancia bastante amplia para osmótica presión [Waymouth, 1970]. Como la osmolalidad del ser humano el plasma es de 290 mosmol/kg, es razonable suponer que que este nivel es el óptimo para las células humanas in vitro, Aunque puede ser diferente de otras especies (por ejemplo, alrededor de 310 mosmol/kg para los ratones [Waymouth, 1970]). En la práctica, osmolalidades suero entre 260 mosmol/kg y 320 mosmol/kg son bastante aceptables para la mayoría de las células pero, una vez seleccionado, debe se mantuvo consistente en ±10 mosmol/kg. Ligeramente hipotónica medio puede ser mejor para la placa de Petri o cultura abierta-placa compensar la evaporación durante la incubación.

Osmolalidad se mide generalmente por la depresión de la congelaciónpunto (Fig. 9.1) o elevación de la presión de vapor, de la medio. Un control útil es la medición de la osmolalidad.Si usted se ha puesto encima de la media, como un paso ayuda a proteger contra errores en el pesaje, dilución, etc.. Lo es particularmente importante para monitorear la osmolalidad si las alteraciones se realizan en la Constitución del medio. La adición de HEPES y drogas disuelven en

ácidos fuertes y bases y sus posteriores neutralizaciones todos marcadamente afectan la osmolalidad.

9.2.6 Temperatura

Depende de la temperatura óptima para el cultivo celular (1) la temperatura del cuerpo del animal de la cual las células se obtuvieron, (2) cualquier variación anatómica de la temperatura (por ejemplo, la temperatura de la piel y el testículo puede ser inferior que la del resto del cuerpo) y (3) la incorporación de un factor de seguridad para permitir errores menores en la regulación la incubadora. Por lo tanto la temperatura recomendada para la mayoría líneas celulares animales humanos y sangre caliente está 37◦C, cerca de calor del cuerpo, pero establece un poco menor para la seguridad, como sobrecalentamiento es un problema más grave que el calentamiento insuficiente.

Debido a la temperatura del cuerpo mayor en las aves, aviar Las células deben ser mantenidas a 38,5 ◦ C para el crecimiento máximo, pero van a crecer bastante satisfactoria, aunque más lentamente, a 37 ◦ C. Células de mamífero cultivadas tolerarán gotas considerables de la temperatura, puede sobrevivir varios días a 4 ◦ C, y puede ser congelada y se enfrió a -196 ◦ C (véase el Protocolo 20,1), pero no puede tolerar más de aproximadamente 2 ◦ C por encima de lo normal (39,5 ◦ C) durante más de unas pocas horas y va a morir muy rápidamente a 40 ◦ C y otra vez.

Se debe prestar atención a la consistencia de la temperatura (dentro de ± 0,5 ◦ C) para asegurar resultados reproducibles. Puertas de incubadoras o salas calientes no se debe dejar abierta más de elementos o volúmenes necesarios, y grandes de líquido, ubicados en el habitación caliente al calor, no se debe poner el aparato cerca de las culturas. la distribución espacial de la temperatura dentro de la incubadora o caliente habitación también debe ser uniforme (véanse las secciones 4.4 y 5.3); hay debe haber puntos fríos'''', y el aire debe circular libremente. Esto significa que un gran número de matraces no debe ser apilado junto al primer puesto en la incubadora o sala caliente; espacio se debe permitir entre ellas para que circule el aire. Como el gas fase dentro de matraces se expande a 37 ◦ matraces de C, en particular cuando apilada, debe ser ventilado aflojando brevemente la tapa 30 min a 1 h después de la colocación de los matraces en la incubadora.

Poikilotermos (animales de sangre fría que no regulan el calor de la sangre dentro de límites estrechos) tolera una temperatura amplia rango, entre 15 ◦ C y 26 ◦ C. Simulación en vivo condiciones (por ejemplo, para los peces de agua fría) pueden requerir una incubadora con refrigeración y calefacción, para mantener la incubadora temperatura inferior a la ambiente. Si es necesario, los animales poikilothermic las células se pueden mantener a temperatura ambiente, pero el la variabilidad de la temperatura ambiente en laboratorios hace este indeseable, y una incubadora enfriada es preferible.

Un número de líneas de células mutantes termosensibles (ts) se han desarrollado que permiten la expresión de específicas genes debajo de una temperatura de ajuste, pero no sobre ella [Su et

al.,1991; Foster & Martin, 1992; Wyllie et al., 1992]. Estos los mutantes facilitan estudios sobre la regulación de la célula, pero también enfatizan la gama estrecha dentro de los cuales uno puede funcionar, como los dos discriminar las temperaturas son generalmente solamente sobre 2–3◦C Apart. El uso de mutantes ts generalmente requiere una incubadora con refrigeración y calefacción, para compensar un cálido la temperatura ambiente.

Aparte de su efecto directo sobre el crecimiento celular, la temperatura también influirá el pH debido a la mayor solubilidad del CO2 a temperaturas más bajas y, posiblemente, debido a cambios en ionización y el pKa de la memoria intermedia. El pH debe ser ajustado a la baja en la temperatura que en 0,2 unidades 37◦C. en la preparación de un medio por primera vez, es mejor para hacer subir el medio completo e incubar una muestra noche en 37◦C bajo la tensión correcta del gas, a fin de Compruebe el pH (ver sección 9.2.2 y placa 22b).

9.2.7 viscosidad

La viscosidad del medio de cultivo está influenciada principalmente por el suero de contenido y en la mayoría de los casos tendrá poco efecto sobre la célula crecimiento. Viscosidad se vuelve importante, sin embargo, cuando una suspensión celular se agita (por ejemplo, cuando una cultura de suspensión se agita) o cuando las células son disociadas después tripsinización. Cualquier daño celular que se produce en estas condiciones puede reducirse por el aumento de la viscosidad del medio con carboximetilcelulosa (CMC) o polivinilpirrolidona (PVP) [Cherry & Papoutsakis, 1990; véase también el apéndice I]. Esto llega a ser particularmente importante en las concentraciones bajas de suero, en ausencia de suero y en las culturas bioreactor agitado (véase Sección 26.1), en el cual Pluronic F68 es de uso frecuente, aunque su efecto es probablemente multifactorial.

9.2.8 tensión de superficie y espuma

No se han definido claramente los efectos de la espuma, pero la puede aumentar la tasa de desnaturalización de la proteína, como el riesgo de contaminación si la espuma alcanza el cuello de la cultura nave. Espuma también limitarán difusión gaseosa si una película de una espuma o derrames entra en el espacio capilar entre el tapón y la botella, o entre la tapa y la base de un plato de Petri.

Espuma puede surgir en las culturas de la suspensión en los vasos agitador o Biorreactores al 5% de CO2 en el aire es burbujeado por medio con suero. La adición de un Antiespumante de silicona (Dow Chemical) o Pluronic F68 (Sigma), ayuda 0.01–0.1%, evitar la formación de espuma en esta situación reduciendo la tensión superficial y también puede proteger las células contra la tensión de esquileo de burbujas. No debe ser burbujas de CO2 a través del medio cuando un frasco de burbujeo ya que esto puede generar una espuma y también puede propagar aerosol del frasco

9.3 SOLUCIONES DE SAL EQUILIBRADAS

Una solución salina equilibrada (BSS) se compone de sales inorgánicas y puede incluir bicarbonato de sodio y, en algunos casos, glucosa. Las composiciones de sal común equilibrado las soluciones se dan en la tabla 9.2. Buffer HEPES (5-20 mM) pueden agregarse a estas soluciones si es necesario y el equivalente cantidad de NaCl se omite mantener la osmolalidad correcta. BSS constituye la

base de muchos medios de comunicación completas y comercial proveedores proporcionarán del águila MEM con las de madejas sales [Hanks & Wallace, 1949] o del águila MEM con Earle sales [Earle et al., 1943], indicando que formulación BSS se utilizó; Sales de Hanks implicaría el uso de frascos sellados con una fase de gas de aire, mientras que las sales de Earle implicaría un mayor concentración de bicarbonato compatible con el crecimiento en 5% de CO2.

BSS también se utiliza como diluyente para concentrados de aminoácidos los ácidos y las vitaminas para hacer los medios completos, como una isotónica lavado o disección mediana y para incubaciones cortas para arriba a aproximadamente 4 h (generalmente con glucosa presente). Recetas de BSS a menudo modificado — por ejemplo, omitiendo la glucosa o fenol rojo de Hanks es BSS o dejando salir Ca2 + o Mg2 + iones de PBS de Dulbecco [Dulbecco & Vogt, 1954]. PBS sin Ca2 + y Mg2 + es conocido como solución de PBS A, y a lo largo de este libro se utilizará la Convención D-PBSA para indicar la ausencia de estos cationes divalentes. Uno debe Compruebe siempre que las modificaciones en la compra de BSS y debe citar las modificaciones a la fórmula Publicada en informes y publicaciones.

La elección de BSS depende tanto la tensión de CO2 (consulte Sección 9.2.2 y tablas 9.1 y 9.2) y la intención uso de la solución para la disgregación del tejido o monocapa dispersión; en estos casos se omiten generalmente Ca2 + y Mg2 +, al igual que en solución salina libre de calcio y magnesio [1952] de Moscona (CMF) o D-PBSA (véase la tabla 9.2). También está la opción de BSS onwhether dependiente del solutionwill ser utilizado para la suspensión cultivo de células adherentes. S-MEM, basado en la ruleta del águila solución de sal, es esencial una variante del mínimo [1959] del águila medio que es deficiente en Ca2 + para reducir de la célula agregación y accesorio (véase tabla 9.2). HBSS, EBSS y PBS dependen de la relativamente débil tampón de fosfato, que no está en su más eficaz a pH fisiológico. Paul [1975] construye un tampón Tris BSS que es más eficaz, pero que a veces las células requieren un período de adaptación. HEPES (10-20 mM) es Actualmente el buffer más eficaz en el rango de pH 7.2–7.8, y la gama de tricino en el 7.4–8.0 de pH, aunque ambos tienden a ser caro si se utiliza en grandes cantidades.

9.4 MEDIOS COMPLETO

El medio de término completo implica un medio que ha tenido todos sus componentes y suplementos añadidos y es suficientes para el uso especificado. Generalmente se compone de un definido componente medio, algunos de los componentes de los cuales, como la glutamina, puede añadirse justo antes del uso y varios suplementos, tales como suero, factores de crecimiento u hormonas. Gama de medios definidos en complejidad, desde la relativamente simple MEM [águila, 1959], que contiene aminoácidos esenciales del águila ácidos, vitaminas y sales, a medios complejos como medio 199 (M199) [Morgan et al, 1950], CMRL 1066 [Parker et al., 1957], 752/1 [Waymouth, 1959], RPMI 1640 MB [Moore et al., 1967] y F12 [jamón, 1965] (tabla 9.3) y una amplia gama de formulaciones sin suero (ver tablas 10.1 y 10.2). Los medios complejos contienen un número más grande de diferentes aminoácidos, incluyendo los aminoácidos los ácidos y las vitaminas adicionales y son a menudo complementada con metabolitos adicionales (por ejemplo, nucleósidos, ácido tricarboxílico ciclo de intermedios y lípidos) y minerales. Nutrientes las concentraciones son, en general, bajo en F12 (que era optimizado por clonación) y alta en modificación de Dulbecco del águila MEM (DMEM) [Dulbecco & Freeman, 1959; Morton, 1970], optimizado con densidades superiores de la célula para viral propagación. Barnes y Sato [1980]

utilizan una mezcla 1:1 de DMEM y F12 como base para sus formulaciones libre de suero para combinar la riqueza de F12 y el mayor nutriente concentración de DMEM. Aunque no siempre del todo racional, esta combinación ha proporcionado una fórmula empírica es adecuado como un medio básico para la suplementación con aditivos especiales para muchos diferentes tipos de células.

9.4.1 aminoácidos

Los aminoácidos esenciales (es decir, aquellos que no son sintetizados en el cuerpo) son requeridos por las células cultivadas, además de cistina o cisteína, arginina, glutamina y tirosina, aunque necesidades individuales de aminoácidos varían de uno tipo de la célula a otra. Otros aminoácidos no esenciales son a menudo se agregan, para compensar tanto para una celda determinada incapacidad del tipo para hacerlos o porque están hechas, Pero perdió por fugas en el medio. La concentración de los aminoácidos generalmente limita la concentración máxima de la célula alcanzable, y el equilibrio puede influir en la supervivencia celular y tasa de crecimiento. Glutamina es requerido por la mayoría de las células, aunque algunas líneas celulares utilizará glutamato; la evidencia sugiereglutamina también es utilizado por las células cultivadas como fuente de energía y carbono [Butler Christie &, 1994; véase también la sección 3.6]. GlutaMAX (Invitrogen) es un dipéptido alanil-glutamina que es más estable que la glutamina.

9.4.2 vitaminas

Del águila MEM contiene sólo las vitaminas solubles en agua (las Grupo B, además de colina, ácido fólico, inositol y nicotinamida, pero excluyendo biotina; ver tabla 9.3); otros requisitos presumiblemente se derivan del suero. La biotina está presente en la mayoría de los medios de comunicación más complejas, incluyendo la serumfree recetas y ácido p-aminobenzoico (PABA) está presente en M199, CMRL 1066 (que deriva de M199), y RPMI 1640. Todas las vitaminas liposolubles (A, D, E y K) Sólo están presentes en M199, considerando que la vitamina A está presente en LHC-9 y la vitamina E en MCDB 110 (véase tabla 10.1). Algunas vitaminas (por ej., colina y Nicotinamida) han aumentado concentraciones en medios sin suero. Limitación de vitamina — para ejemplo, por la precipitación de folato de caldo concentrado soluciones — se expresa generalmente en términos de reducción celular las tasas de supervivencia y crecimiento en lugar de la densidad máxima de la célula. Como las de los aminoácidos, vitamina requisitos tienen sido derivados empíricamente y a menudo se refieren a la célula línea originalmente utilizada en su desarrollo; por ejemplo, Fischer medio tiene una concentración alta de folato debido al folato dependencia de L5178Y, que fue utilizado en el desarrollo del medio [Fischer & Sartorelli, 1964].

9.4.3 sales

Las sales son principalmente los de Na +, K +, Mg2 +, Ca2 +, Cl−, SO42−, PO43− y HCO3− y son los principales componentes contribuyendo a la osmolaridad del medio. Mayoría de los medios deriva sus concentraciones de sal originaria de Earle (alto bicarbonato; fase gaseosa, 5% de CO2) orHanks (bicarbonato baja; fase de gas, aire) BSS. Cationes divalentes, particularmente Ca2 +, son requeridos por algunas moléculas de adhesión celular, tales como las caderinas [Yamada & Geiger, 1997]. Ca2 + también actúa como intermediario en la transducción de la señal [Alberts et al., 2002] y la concentración de Ca2 + en el medio puede influir en las células se proliferan o distinguir (ver

las secciones 17.2.2, 23.2.1.) Na +, K + y Cl− regular membrana potencial, mientras que SO42−, PO43− y HCO3− tienen funciones como aniones requeridos por la matriz y nutricionales precursores de macromoléculas, así como los reguladores de carga intracelular. Calcio se reduce en las culturas de suspensión con el fin de minimizar la agregación celular y accesorio (véase la sección 9.3). La concentración de bicarbonato de sodio es determinada por el concentración de CO2 en la fase gaseosa (ver sección 9.2.2) y tiene un importante papel nutricional además de su capacidad de almacenamiento en búfer.

9.4.4 glucosa

Glucosa está incluida en la mayoría de los medios como fuente de energía. Es se metaboliza principalmente por glucólisis a piruvato forma, que se puede convertir en lactato o acetoacetato y pueden entrar en el ciclo del ácido cítrico y se oxida para formar CO2 y agua. La acumulación de ácido láctico en el medio, particularmente evidente en las células embrionarias y transformadas, implica que el ciclo del ácido cítrico puede no funcionar enteramente como lo hace en vivo, y los datos recientes han demostrado que gran parte de su carbón se deriva de glutamina en lugar de glucosa. Este hallazgo podría explicar El excepcionalmente alto requisito de algunas células cultivadas para glutamina o glutamato.

9.4.5 suplementos orgánicos

Una variedad de otros compuestos, incluyendo proteínas, péptidos, nucleósidos, intermedios del ciclo de ácido cítrico, piruvato, y los lípidos, aparecen en medios complejos. Otra vez, estos componentes se han encontrado para ser necesario cuando el suero concentración se reduce, y pueden ayudar en la clonación y en el mantenimiento de ciertas células especializadas, incluso en la presencia del suero.

9.4.6 hormonas y factores de crecimiento

Las hormonas y factores de crecimiento no se especifican en las fórmulas de los medios más habituales, aunque con frecuencia se agregan a medio libre de suero (véanse las secciones 9.5.2, 9.5.3 10.4.2, 10.4.3).

9.4.7 antibióticos

Los antibióticos fueron introducidos originalmente en medios de cultivo a reducir la frecuencia de la contaminación. Sin embargo, el uso de campanas de flujo laminar, junto con una técnica aséptica estricta, los antibióticos hace innecesario. De hecho, los antibióticos tienen un número de desventajas significativas:

(1) estimulan el desarrollo de algunos organismos.(2) esconden la presencia de bajo nivel, críptico los contaminantes que pueden llegar a ser plenamente operativos si el los antibióticos son borrados, cambian las condiciones de cultivo, o desarrollan cepas resistentes.(3) se pueden ocultar infecciones por micoplasma.(4) tienen efectos antinutritivos que pueden reacción cruzada con células mamíferas.(5) animan a pobres en condiciones asépticas.

Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que la rutina cultura ser realizada en ausencia de antibióticos y que su uso restringirse al cultivo primario o a gran escala requiere mucho trabajo experimentos con un elevado coste de los consumibles. Si las condiciones exigir el uso de antibióticos, entonces ellos deben eliminarse tan pronto como sea posible, o, si se utilizan en el largo plazo, culturas paralelas deben mantenerse libres de antibióticos (véase Sección 13.7.7).Es una serie de antibióticos usados en cultivo de tejidos moderadamente eficaz en el control de las infecciones bacterianas(Tabla 9.4). Sin embargo, un número significativo de cepas bacterianas son resistentes a los antibióticos, ya sea natural o por la selección, Así que el control que ofrecen nunca es absoluto. Fungicida y contaminaciones de levadura son particularmente difíciles de controlar con antibióticos; ellos podrán realizarse en jaque, pero rara vez son eliminados (véase sección 19,4).

9.5 SUERO

Suero contiene factores de crecimiento, que promueven la célula actividad antitripsina y factores de adhesión y proliferación, que promuevan el apego de la célula. El suero es también una fuente de minerales, lípidos y hormonas, muchos de los cuales pueden ser unida a proteína (tabla 9.5). Los sueros más utilizados en el tejido cultura son humanos, fetal bovino, caballo adulto y cría bovina suero. Ternero (CS) y suero fetal bovino (SFB) son las más ampliamente utilizado, el último particularmente para los más exigentes de la célula las líneas y para la clonación. A veces se utiliza en suero humano junto con algunas líneas de células humanas, pero tiene que ser prueba de detección de virus, como el VIH y la hepatitis B. caballo el suero es preferible a suero de ternera por algunos trabajadores, como puede obtenerse de una manada de donantes cerrado y es a menudo más consistente de lote a lote. También puede ser de suero equino menos probabilidades de metabolizar las poliaminas, debido a bajos niveles de oxidasa poliamina; las poliaminas son mitógenos para algunas células [Hyvonen et al., 1988; Kaminska et al., 1990].

9.5.1 proteína

Aunque las proteínas son un componente importante del suero, la las funciones de muchas proteínas in vitro permanecen oscuras; puede ser que relativamente pocas proteínas se requieren más que como portadores para minerales, ácidos grasos y las hormonas. Esas proteínas para ¿Qué requisitos se han encontrado son albúmina [Iscove & Melchers, 1978; Barnes & Sato, 1980], que puede ser importante como portador de los lípidos, minerales y globulinas [Tozer & Pirt, 1964]; fibronectina (globulina insoluble en frío), que promueve el apego de la célula [Yamada & Geiger, 1997; Hynes, 1992], aunque probablemente no tan eficazmente como derivados de la célula fibronectina; y α2-macroglobulina, que inhibe la tripsina [de Vonne & Mouray, 1978]. Fetuin en el suero fetal aumenta la célula accesorio [Fisher et al., 1958] y transferrina [Guilbert & Iscove, 1976] une a hierro, por lo que es menos tóxico y biodisponible. Otras proteínas, como todavía no caracterizados, pueden ser esenciales para accesorio de celular y el crecimiento. La proteína también aumenta la viscosidad del medio,reducir la tensión de esquileo durante el pipeteo y agitación y mayo Añadir a la capacidad del soporte almacenamiento en búfer.

9.5.2 factores de crecimiento

Suero del coágulo natural estimula la proliferación celular más suero de la cual las células han eliminado físicamente (por ejemplo, mediante centrifugación). Esta estimulación creciente parece debido a la liberación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) de las plaquetas durante la coagulación. PDGF [Antoniades et al., 1979; Es uno de una familia de polipéptidos en et al., 1979] con actividad mitogénica y es probablemente el mayor crecimiento un factor en el suero. PDGF estimula el crecimiento de fibroblastos y glia, pero otros factores, derivado de las plaquetas, como TGF-β, puede inhiben el crecimiento o promover la diferenciación en células epiteliales [Lechner et al., 1981]. Otros factores de crecimiento (ver tabla 10.3), como el fibroblasto factores de crecimiento (FGFs) [Gospodarowicz, 1974], epidérmicos factor de crecimiento (EGF) [Cohen, 1962; Carpintero & Cohen, 1977; Gospodarowicz et al., 1978a], crecimiento de la célula endotelial factores tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y angiogenina [Hu et al., 1997; Folkman & ' d ' amore, 1996; Zhukov et al., 1997; Folkman et al., 1979; Maciag et al., 1979], y factores de crecimiento similares a la insulina IGF-I e IGF-II [le Roith & Raizada, 1989], que han sido aislados de todo tejido o liberados en el medio de las células en cultivo, tienen diferentes grados de especificidad [Hollenberg & Cuatrecasas, 1973] y son Probablemente presentes en suero en pequeñas cantidades [Gospodarowicz & Moran, 1974]. Muchos de estos factores de crecimiento están disponibles comercialmente (véase Apéndice II) como proteínas recombinantes, algunos de los cuales también están disponibles en formato largo análogos (Sigma) con mayor estabilidad y actividad mitogénica.

9.5.3 hormonas

La insulina promueve la absorción de la glucosa y los aminoácidos [Kelley et al., 1978; Stryer, 1995] y podría deberle su mitogénica efecto a esta propiedad o a la actividad a través de la IGF-I receptor. IGF-I y sino también se unen a los receptores de insulina, IGF-II tienen sus propios receptores específicos, puede obligar a que la insulina con menor afinidad. IGF-II también estimula la absorción de glucosa [Sinha et al., 1990]. La hormona de crecimiento puede estar presente en suero, suero fetal particularmente — y, en conjunto con las somatomedinas (IGF), puede tener un efecto mitogénico. También está presente en el suero hidrocortisona — particularmente fetal suero bovino — en diferentes cantidades y puede promover la célula accesorio [Ballard & Tomkins, 1969; Fredin et al., 1979] y celulares proliferación [Guner et al., 1977; McLean et al.,1986; Véase también las secciones 23.1.1, 23.1.3, 23.1.4], pero bajo ciertas condiciones (por ejemplo, en alta densidad celular) pueden ser de citostáticos [Freshney et al., 1980a, b] y puede inducir la diferenciación celular [Moscona & Piddington, 1966; Ballard, 1979; McLean et al., 1986; Speirs et al., 1991; McCormick et al., 1995, 2000].

9.5.4 nutrientes y metabolitos

Suero también puede contener aminoácidos, glucosa, oxo (ceto) ácidos, nucleósidos y un número de otros nutrientes y intermediarymetabolites. Estos pueden ser importantes en los medios de comunicación simple Pero tanto en medios complejos, particularmente aquellos con mayor las concentraciones de aminoácidos y otros definen suplementos.

9.5.5 lípidos

El ácido linoleico, ácido oleico, etanolamina y Fosfoetanolamina están presentes en suero en pequeñas cantidades, generalmente obligado a proteínas como la albúmina.

9.5.6 minerales

Reemplazo de suero experimentos [jamón & McKeehan, 1978] también han sugerido que los oligoelementos y el hierro, cobre, y cinc puede obligarse a la proteína de suero.McKeehan et al [1976] demostró un requisito para el selenio, que probablemente ayuda a desintoxicar los radicales libres como cofactor de sintetasa GSH.

9.5.7 inhibidores

Suero puede contener sustancias que inhiben la proliferación celular [Harrington & Godman, 1980; Liu et al., 1992; Varga Weisz & Barnes, 1993]. Algunos de éstos pueden ser artefactos de la preparación (por ejemplo, toxinas bacterianas de la contaminación antes de filtración, o anticuerpos, contenidos en el γ-fracción globulina, que epítopes con epitopos superficiales de las células cultivadas), pero otros pueden ser reguladores del crecimiento negativo fisiológicas, tales como TGF-β [Massague et al., 1992]. Inactivación de calor elimina complemento del suero y reduce la acción citotóxica de inmunoglobulinas sin dañar crecimiento polipéptido factores, sino que también puede eliminar a algunos constituyentes más lábiles y no siempre es tan satisfactorio como suero no tratado.

9.6 SELECCIÓN DEL MEDIO Y DEL SUERO

Todos los 12 medios que se describe en la tabla 9.3 se desarrollaron a soporte líneas celulares particulares o condiciones. Muchos eran desarrollado con fibroblastos de ratón de elución de L929 o cervical HeLa las células del carcinoma y F12 de Ham fue diseñado para los chinos células de ovario (CHO) del hámster; Todos tienen ahora más general aplicaciones y se han convertido en formulaciones clásicas. Entre los datos de los proveedores indicaría que RPMI 1640, DMEM y MEM son los más populares, para sobre 75% de las ventas. Otras formulaciones rara vez representan más del 5% del total; la mayoría constituye 2 ó 3%, aunque mezclado Se aproxima DMEM/F12, con más del 4%. Medio esencial mínimo (MEM) del águila fue desarrollado de medio Basal del águila (BME) mediante el aumento de la gama y la concentración de los constituyentes. Durante muchos años, águila MEM tenía el uso más general de todos los medios. De Dulbecco modificación de BME (DMEM) fue desarrollado para el ratón fibroblastos para estudios de propagación de virus y transformación. Tiene dos veces las concentraciones del aminoácido de MEM, tiene cuatro veces las concentraciones de vitamina y utiliza dos veces el HCO3− y las concentraciones de CO2 para lograr mejor almacenamiento en búfer. ΑMEM [Stanners et al., 1971] tiene aminoácidos adicionales y vitaminas, así como nucleósidos y ácido lipoico; ha sido utilizado para una amplia gama de tipos celulares, incluyendo hematopoyético células. F12 de Ham fue desarrollado para clonar células CHO en soporte de suero baja; también se utiliza ampliamente, particularmente para análisis clonogenic (véase protocolo 22.3.2) y en cultivo primario (véase protocolo 12,7). Todos estaban CMRL 1066 y M199 de Waymouth medios desarrollado para cultivar células de elución de L929 libre de suero, pero se han utilizado solos o en combinación con otros medios, tales como DMEM o F12, para una variedad de condiciones más exigentes. RPMI 1640 y los

medios de comunicación de Fischer fueron desarrollados para las células linfoides — fischeri específicamente para el linfoma L5178Y, que tiene un requisito de folato alto. RPMI 1640 en particular ha uso muy generalizado, a menudo para las células adjuntas, a pesar de ser diseñado para la cultura de suspensión y calcio falta. L15 medio fue desarrollado específicamente para proporcionar almacenamiento en búfer en la ausencia de HCO3 − y CO2. A menudo se utiliza como una transporte y el medio de cultivo primario por este motivo, pero su valor fue disminuido por la introducción de HEPES y la demostración que HCO3− y CO2 son a menudo esencial para el crecimiento celular óptimo, independientemente de los requerimientos para el almacenamiento en búfer.

Información sobre la selección de la correspondiente medio para un determinado tipo de célula está generalmente disponible en el literatura en artículos sobre el origen de la línea celular o de la cultura de células similares. También puede obtenerse información de la origen de las células. Bancos de células, tales como ATCC y ECACC, proporcionar información sobre los medios utilizados para actualmente disponibles las líneas celulares y hojas de datos se pueden acceder desde sus sitios web (véase el Apéndice III; véase también tabla 9.6). Su defecto, la opción se realiza ya sea empírico o mediante pruebas comparativas de varios los medios de comunicación, en cuanto a selección de suero (ver sección 9.6.2).

Muchas líneas celulares continua (por ejemplo, HeLa, elución de L929, BHK21), cultivos primarios de humanos, roedores y aves fibroblastos, y líneas celulares derivadas de ellos pueden mantenerse en un relativamente simple media como la del águila MEM, complementado con suero de ternera. Los medios de comunicación más complejas pueden ser necesario cuando se se expresa una función especializada (véase la sección 17,7) o cuando las células son subcultivadas a baja densidad de siembra (< 1 × 103/mL), como en la clonación (véase la sección 14.2). Con frecuencia, las condiciones de cultivo más exigentes que requieren complejas los medios de comunicación también requieren suero bovino fetal en lugar de ternera o caballo del suero, a menos que la formulación permite específicamente para el omisión del suero. Algunas sugerencias para la elección del medio y varios se dan ejemplos de tipos de la célula y los medios utilizados para ellos en el cuadro 9.6 [véase también Mather, 1998]. Si la información no es disponible, un crecimiento de la célula simple experimento con comercialmente los medios disponibles y las placas pocillos (ver protocolos 21.7–21.9) puede llevarse a cabo dentro de dos semanas. Ensayo para clonal crecimiento (véase protocolo 21,10) y medir la expresión de funciones especializadas pueden estrecharse la elección más. Te sorprenderás al ver que tus mejores condiciones No coinciden con los mencionados en la literatura; reproducir las condiciones encontradas en otro laboratorio puede ser difícil, debido a las variaciones en la preparación o proveedor, las impurezas presentan en los reactivos y el agua, y diferencias entre lotes de suero. Es de esperar Así se reducen los requerimientos de suero y la pureza de los aumentos de los reactivos, la estandarización de los medios de comunicación serán mejorar. Por último, tendrá que comprometerse en su elección de medio o suero por coste. Son los medios de comunicación en el autoclave disponible de proveedores comerciales (véase el Apéndice II). Ellos son fácil de preparar, a partir del polvo y conveniente para muchos dos, dada la formación de ese producto o algunos otros especializados función es la misma. Si el suero bovino fetal parece esencial, intentar mezclándola con becerro suero. Esto puede permitir reducir la concentración de el suero fetal más caro. Si puedes, dejar de lado el suero en conjunto, o reducir la concentración y utilizar un suero-libre formulación (véase la sección 10.5).

9.6.1 lote reserva

Puede preverse una considerable variación entre lotes del suero. Dicha variación resultados de diferentes métodos de de preparación y esterilización, diferentes edades y almacenamiento las condiciones y las variaciones en las poblaciones animales de los cuales el suero fue derivado, incluyendo las disparidades y diferentes cepas en pasto, el clima y otras condiciones ambientales. Es importante para seleccionar un lote, usarlo tanto tiempo como sea posible, y eventualmente, reemplazarlo con uno similar a la como sea posible.Estandarización del suero es difícil, ya que varían en lotes considerablemente, y un lote durará sólo unos seis meses a un año, almacenado en −20◦C. Seleccione el tipo de suero que es más apropiado para sus propósitos y solicitar los lotes a prueba de un número de proveedores. Mayoría de los proveedores del suero será reservar un lote hasta que un cliente puede seleccionar los más adecuados uno (siempre y cuando esto no tomará más de tres semanas o algo así). Cuando se ha seleccionado un lote adecuado, el proveedor se solicita para mantener el volumen apropiado para hasta uno año, para expedirse sobre la demanda. Otros proveedores deben también estar informado, para que puedan volver los lotes rechazados a sus existencias.