trabajo practico de laboratorio ndeg2 (reparado)

8/17/2019 Trabajo Practico de Laboratorio Ndeg2 (Reparado)

1/8

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA FACULTAD DECIENCIAS AGRARIAS

BIOQUÍMICA DE LOS ALIMENTOS

Trabajo Práctico de Laboratorio N°2:Extracción, purifcación y caracterización de proteínas de tejido

ania!

P"#$E"% P%"TE: Extracción, purifcación y cuantifcación de

proteínas

#NT"&'())#*N

Es conocido que hasta cerca de los años 80 ha sido excepcional la

extracción y purifcación de proteínas para uso alimentario a excepción de

aquellas moléculas que poseen actividades enzimáticas, hormonales o

armacoló!icas" #umerosos productos de uso com$n en la alimentación están

disponi%les en estado puro o casi puro &sacarosa, #a'l(, o %ien en mezclas de

compuestos de propiedades comunes &aceites, mar!arinas, etc"(" )in

em%ar!o, existe %astante reticencia a$n al consumo de preparaciones de

proteínas purifcadas"

*a purifcación de proteínas es realizada para+

Estudiar la estructura, las unciones y sus interrelaciones, en estos

casos una pequeña cantidad de proteínas es sufciente y su pureza

de%e ser la máxima posi%le"

so industrial y particularmente tecnolo!ía alimentaria" En este caso la

pureza no -ue!a un rol undamental sino la disponi%ilidad de las

uentes proteicas, los costos de producción y las necesidades"

.or lo tanto, los o%-etivos de la extracción de proteínas pueden

ser++unciona!es, nutriciona!es o econóicas"

*a elección de la uente de proteína a extraer y purifcar depende

entonces de estos fnes posteriores" .or e-emplo, para las proteínas de

/


2/8

actividad enzimática, las uentes ele!idas serán aquellas donde esa proteína

es más a%undante y esta%le"

En este caso es undamental el estado nativo para que la preparación

presente una actividad tecnoló!ica &propiedad uncional deseada( o una

actividad específca lo más elevada posi%le"

*a estructura nativa de una proteína de ori!en animal o ve!etal es

alterada !eneralmente durante el proceso de extracción por las condiciones

adoptadas &1, tratamientos mecánicos o químicos, etc"( y tam%ién por el

contacto con proteasas naturales presentes, que pueden ser li%eradas y

puestas en contacto con la proteína durante el tratamiento de extracción"

Esto puede ser me-orado disminuyendo la temperatura &12 a /01' reducen

la actividad de proteasas en !eneral( o utilizando inhi%idores de las mismas"

am%ién el control del p3 es necesario para evitar la desnaturalización"

.ara extraer las proteínas intracelulares es necesario romper por

métodos ísicos o químicos las mem%ranas y paredes celulares impermea%les

a esas macromoléculas"

*a extracta%ilidad de las proteínas depende de su localización y

solu%ilidad en el medio acuoso, sensi%ilidad a la desnaturalización, tamaño,

orma y polaridad, etc"

4entro de las uentes proteicas animales la más importante la

constituye la carne, tanto de especies terrestres como marinas" El m$sculo

está constituido por 50678 de a!ua, /96:: de proteínas, /6/9 de lípidos,

/6: de !l$cidos y / de sales" Estas ciras indican que las proteínas

representan entre el 906;0 de la materia or!ánica de la carne" Esta es la

razón por la cual la mayor parte de los estudios so%re la calidad de las

propiedades de la carne se realizan so%re las proteínas musculares &


3/8

:( Proteínas iofbri!ares &solu%les en alta uerza iónica, 0,960,5m >'l

o #a'l:(

?( Proteínas de! estroa o de! tejido conectio &insolu%les en las

condiciones anteriores(

En peces las proteínas miof%rilares son las más a%undantes,

constituyendo aprox" un 79 del te-ido muscular, siendo mínimo el contenido

de proteínas del estroma" *as proteínas miof%rilares además de constituir el

sistema contráctil @in vivoA son las responsa%les de las propiedades

uncionales de la carne tales como capacidad li!ante de a!ua, poder

emulsifcante, capacidad de !elación, etc"

&-.ET#/&: Extraer, purifcar y cuantifcar miof%rillas de pescado

P"&)E'#$#ENT&:

a( )e utilizarán e-emplares de merluza &Merlucciushubbsi(, los cuales

serán fleteados" Estos serán posteriormente picados para tomar unamuestra homo!énea de te-ido y lue!o se pesarán los !ramos indicados

en el esquema que se detalla a continuación &punto %("

%( Extracción y purifcación de miof%rillas de pescado"

Bateriales+

• .escado &merluza(• 'uchilla y ta%la de picar• Calanza• 3omo!enizador DB#B'l• .ro%etas• I!ua destilada ría• u%os de centriu!a de :90 ml de capacidad• 3ielo• 'entriu!a reri!erada

?


4/8

E01(E$% 'E ET"%))#*N 3 P("#+#)%)#*N 'E $#&+#-"#LL%0:

=

4 5r de 6scu!o desenuzado y

3omo!eneizar en /00ml de %uGer estándar &ris6maleato :0mB a p3 7H 0,/B >'l(durante ?min" &? pulsos de 90se! con intervalos de /0 se!( en un 3omo!eneizador

+i!trar por

)entri7u5ar a 489 x 5 durante 8

0&-"EN%'%NTE

&descartar(

P"E)#P#T%'&

Fesuspender en 90 ml de %uGer std y repetir dos veces

0&-"EN%'%NTE

&descartar(

P"E)#P#T%'&

Fesuspender en 90 ml de

$#&+#-"#LL%0

P("#+#)%'%0


5/8

Nota: Todos los procedimientos deben realizarse a 2-4°C

a( )uantifcación de !as proteínas: la cuantifcación de las proteínas

se realizará utilizando el método de *oJry y col" &/;9/(, utilizando

al%$mina de suero %ovino como estándar"

%( 'on la concentración de proteína calculada se procederá a determinar

el rendimiento &!ramos de miof%rillas por /00 !ramos de te-ido( y

tomar alícuotas para la caracterización de las mismas &Parte 2("

0E;(N'% P%"TE: )aracterización de iofbri!!as de pescado

#NT"&'())#*N

*as miof%rillas pueden ser caracterizadas a través de medidas de sus

propiedades %ioquímicas y fsicoquímicas" 4entro de los indicadores

%ioquímicos se determinan las actividades B!:K y B!:K &ELI(6I. asas que

están relacionadas con la interacción actina6miosina del comple-o

actomiosina en presencia yMo ausencia de calcio endó!eno" 4urante esta

interacción la ca%eza ener!izada de miosina conteniendo I4. y osatoinor!ánico, hace contacto con actina por activación de la troponina por el

calcio" Bientras la determinación de la enzima 'a:K6I.asa indica la

uncionalidad de la miosina en el comple-o actomiosina" .or otra parte la

electrooresis en !eles de )4)6poliacrilamida, permite monitorear la

existencia de las %andas polipeptídicas que constituyen el comple-o proteico

y determinar el porcenta-e relativo de cada componente a través del análisis

densitométrico de los mismos"

&-.ET#/&0:

• 'aracterización de miof%rillas de merluza a través de la

determinación de la actividadB!:K 'a:K6 I.asay B!:K &ELI(6

I.asa y electrooresis en !eles )4)6.ILE"

9


6/8

$%TE"#%LE0 3 $ET&'&0

$uestras:


7/8

Tab!a : )ondiciones específcas para !as enzias $52? )a2?< %TPasa

y $52? @E;T%> )uantifcación de 7ós7oro:

"eactio de co!or:

6: vol$menes de a!ua destilada

6/ volumen de ácido sul$rico 5#

6/ volumen de moli%dato de amonio :,9

6/ volumen de ácido ascór%ico /0

6)olución estándar de osato monopotásico de : N!Mml

Protoco!o:

T&'" E%#*a+ * ,-%,"+" Ag&a *%ila*a M&%+a Ra.i" * ."l"+

Bla#.

"--- 2,0 ml --- 2 ml

0 0,5 ml (1μg Pi) 1,5 ml --- 2 ml

7


8/8

2 1,0 ml (2μg Pi) 1,0 ml --- 2 ml

1 1,5 ml (3μg Pi) 0,5 ml --- 2 ml

2,0 ml (4μg Pi) --- --- 2 ml

3 --- 1,7 ml 0,3 ml 2 ml

)e a!ita vi!orosamente al a!re!ar el reactivo de color" )e de-a en %año a

?71' por /h ?0 min", se enría y se lee en espectrootómetro a 8:0nm" 3acer

la curva de cali%ración con el estándar y calcular los micro!ramos de ósoro

li%erado en cada muestra"

c> E!ectro7oresis en 5e!es 0'0 Po!iacri!aida @0'0

I cada tiempo serán tomadas alícuotas de las suspensiones para

electrooresis en !eles )4)6 poliacrilamida /0" *as mismas serán

desnaturalizadas por calentamiento a /001' durante 9minutos en %uGer

desnaturalizante &ris63'l / B p3 5,8, )4) /0, !licerol, %eta6

mercaptoetanol, a!ua destilada(" )e usará una relación /+/ muestra+ %uGer

desnaturalizante"*a electrooresis se llevará a ca%o en !eles /0 de acuerdo

al procedimiento de *aemmli &/;70( usando un equipo microsla% &)LBI( o

CDFI4 en el ran!o de 5900 a :09000 4a"

8

trabajo practico de laboratorio ndeg2 (reparado)

Documents