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© TERCERA EDICIÓN MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD JR. Cápac Yupanqui 1400, Jesús maría Telf. 471-3254 / Fax: 471-7443 Lima, Perú, 1997 Diseño e impresión: Art. Lautree S.R.Ltda.

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MANUAL DE LABORATORIO COLERA

COMITÉ RESPONSABLE: Dr. Carlos Carrillo Parodio Blgo. Nora Bravo Cruz Dr. José Aguilar Olano Dr. Alfredo Guillen Oneeglio Dr. Augusto Yi Chu (tJ

COMITÉ EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta Martínez- Vargas Dr. César Cabezas Sánchez Dr. Jaime Chang Neyra

MINISTERIO DE SALUD ALTA DIRECCIÓN Dr. Marino Costa Bauer Ministro Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco Viceministro INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodio Jefe.

CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD

Dr. César Cabezas Sánchez Directpr General

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PERFIL DE LOS AUTORES Dr. Carlos Carrillo Parad; Médico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología. Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud Blga. Nora Bravo Cruz Bióloga, Estudios en Maestría Microbiología. Ex Miembro del Laboratorio de Enteropatógenos, División de Bacteriología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Profesor Auxiliar, Facultad de Tecnología Médica, Universidad Federico Vil/arreal. Dr. José Aguilar Olano Médico Cirujano, Master en Medicing., Especialista en Inmunologia y Reumatología. Médico Asistente, Hospital Nacional L.ayetano Heredia. Profesor Asociado, Departamento de Medicina, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Alfredo Guillén Oneeglio Médico Cirujano Laboratorio de Bacteriología Especial, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Profesor Auxiliar Facultad de Tecnología Médica, Universidad Federico Villarreal Dr. Augusto Yi Chu(t) Médico Microbiólogo ExJefe del Laboratorio Central, Hospital Nacional Cayetano Heredia. Profesor Principal, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. PERFIL DE LOS EDITORES Dr. Alfonso Zavaleta Martínez- Vargas Médico Cirujano, Doctor en Farmacología Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA Profesor Principal, Sección Farmacología, Departamento Académico de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia Miembro, Instituto de Medicina Tropical "Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. César Cabezas Sánchez Médico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, MlNSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos y Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Jaime Chang Neyra Médico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries Director Ejecutivo de Certificación y Garantía de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA, Investigador, Instituto de Medicina Tropical "Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia.

La edición de este Manual se efectuó en el marco del Convenio de Cooperación suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia.

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CONTENIDO

Pág. 1. INTRODUCCION 8 2. ALCANCE 9 3. TOMA Y ENVIO DE LA MUESTRA 9

3.1. OBTENCION DE LA MUESTRA 3.2. ENVIO DE LA MUESTRA 4. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA 10 5. REMISION DE LA CEPA A INVESTIGAR 16 6. NORMAS DE BIOSEGURIDAD 17 7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 19 8. FLUXOGRAMA DE AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 20 9. ANEXOS 21 9.1. MATERIAL Y EQUIPOS 9.2. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO 9.3. FICHA CLINICO-EPIDEMIOLOGICA DE ENVIO DE MUESTRAS

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PRESENTACION

Este documento tiene como finalidad explicar el conjunto de

procedimientos simplificados para el tratamiento de las muestras humanas en la búsqueda e identificación del Vibrio cholerae 01.

La epidemia de cólera que afecta al país, ha puesto en evidencia los

graves problemas de salud pública y el estado de deterioro de las estructuras sanitarias y de control ambiental, representando uno de los principales desafíos de la salud pública en el Perú.

Debe mencionarse que este documento no aborda todas las metodologías

para el estudio bacteriológico del V. cholerae dedicándose a aquellos procedimientos de fácil acceso y de bajo costo, que pueden realizarse en el momento actual en la mayoría de los laboratorios a nivel nacional.

Es nuestra esperanza que este esfuerzo del Instituto Nacional de Salud

conlleve a un consenso sobre la necesidad de iniciar una etapa de publicaciones a manera de Notas Técnicas que contribuyan a la diseminación de la información científica en el país.

CARLOS CARRILLO PARODI

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1. INTRODUCCION

El cólera es una infección intestinal aguda causada por el Vibrio cholerae, el que posee una enterotoxina termolábil que produce diarreas acuosas profusas (como agua de arroz), sin moco, ni sangre, acompañada de vómitos y calambres, pudiendo ocasionar una deshidratación severa, hipotensión, muchas veces shock y a veces la muerte. Los casos epidémicos son causados por el Vibrio cholerae serogrupo 01, biovar El toro El cólera existe en forma endémica en algunos países de Asia y África con condiciones de salubridad muy deprimidas, y desde Enero de 1991 se viene presentando un brote epidémico en el Perú dentro de la séptima pandemia. En el diagnóstico de laboratorio del cólera se deben considerar los siguientes aspectos: a. El envío de muestras desde cualquier establecimiento de salud que no tenga servicio de laboratorio de microbiología. b. El cultivo para el aislamiento del Vibrio cholerae en los laboratorios locales (Centro de Salud, Hospitales, Clínicas, Institutos especializados), yel envío de los cultivos sospechosos al Instituto Nacional de Salud (Laboratorio Nacional de Referencia de Enteropatógenos) para la confirmación y serotipificación. c. La confinnación, serotipia y pruebas especiales para la identificación final en el Laboratorio Nacional de Referencia de Enteropatógenos (LANARE), Instituto Nacional de Salud, Lima.

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2. ALCANCE Esta norma describe el equipamiento, material de laboratorio, medios de cultivo y procedimientos necesarios para que los laboratorios de Microbiología de los Centros de Salud, Hospitales, Institutos especializados u otras Instituciones del Sector Salud puedan realizar el aislamiento y la identificación de V. cholerae.

3. TOMA Y ENVIO DE LA MUESTRA 3.1. Obtención de la muestra: La muestra de heces de un paciente sospechoso de cólera debe recolectarse antes de la administración de cualquier antibiótico. La muestra se obtiene con un hisopo de algodón previamente esterilizado, el cual se desenvuelve de su protección de papel, se lubrica previamente introduciéndolo en el espesor del medio de transporte y luego se introduce en el recto unos 3 cms. imprimiendo movimientos de rotación, tratando de obtener una pequeña cantidad de muestra. Una vez obtenida ésta, se introduce el hisopo hasta el fondo del tubo que contiene el medio de transporte que puede ser el de Cary y Blair o el de Amies. En estas condiciones el microorganismo patógeno permanece viable hasta por 4 semanas a temperatura ambiente. Cuando las deposiciones son evacuadas en un recipiente la muestra se puede obtener directamente con el hisopo. NO SE DEBE REFRIGERAR LA MUESTRA. En la etiqueta de cada tubo se debe poner el nombre del paciente o código que identifique la muestra y debe ir acompañada de una ficha clínico-epidemiológica (Anexo 2) con los datos del paciente. Se debe escribir el mismo código tanto en el tubo de medio de transporte como en la ficha que lo acompaña.

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Fig. Nº1 toma de muestra mediante hisopado rectal

Si el procesamiento de la muestra va a realizarse en el mismo día, se puede enviar una muestra de heces (1 a 3 mI o media cucharadita) en un frasco limpio o tomar la muestra y ponerla directamente en un medio de enriquecimiento como es el caldo peptonado. En estos casos tampoco debe refrigerarse la muestra. 3.2. Envío de las muestras: Las muestras deben ser enviadas al hospital más cercano que cuente con servicio de Microbiología, el mismo que debe encargarse de proporcionar los medios de transporte a sus centros periféricos. 4. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA La técnica para el diagnóstico bacteriológico del cólera no se diferencia mucho de la que se emplea para el aislamiento de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y se utilizan los mismos medios de cultivo y el Agar TCBS. En el caso de pacientes con cuadro de diarrea aguda se puede sembrar la muestra de heces, hisopado rectal o vómito directamente en agar TCBS. Otra alternativa para pacientes convalescientes o en la búsqueda de portadores es

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sembrarla en un medio de enriquecimiento como es el caldo peptonado.

El enriquecimiento de la muestra se realiza al inocular 0.5 ml ó 1 g de

muestra en un tubo que contenga aproximadamente 10 ml de caldo peptonado alcalino. Incubar el medio de seis a ocho horas a 37°C.

Luego de este tiempo se toma una asada de la superficie del medio de

enriquecimiento o se aplica la muestra directamente en el medio selectivo que es el agar TCBS, se distribuye la muestra haciendo estrías en la superficie del agar,(la superficie de la placa debe estar seca antes de colocar la muestra) y se incuba por 24 horas a 37°C.

Conjuntamente con la investigación de V. cholerae se debe buscar la

presencia de otros enteropatógenos bacterianos que producen cuadros similares que pueden ser E. coli enterotoxigénico, V. parahaemolyticus, Sal-monella entérica serovar Enteritidis.

En el agar TCBS las colonias de V. cholerae son de color amarillo,

redondas, cremosas, ligeramente convexas, de 2 a 4 mm de diámetro, mientras que las de V. parahaemolyticus son de color verde azuladas.

Si se observan colonias de color amarillo, éstas deben inocularse en

placas o tubos de TSA el inóculo debe ser abundante para obtener un crecimiento a las 6 u 8 horas y poder realizar pruebas presuntivas rápidas: oxidasa,

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Foto Nº1. Siembra primaria en TCBS. Colonias amarillas sospechosas de

Vidrio cholerae prueba del cordón (String test) y la serología con suero polivalente 01, para obtener un diagnóstico rápido. Al mismo tiempo las colonias sospechosas se deben inocular en TSI, LIA (con un papel filtro impregnado en re activo Kovac o de Gilles para la prueba de indol). Estos se incuban a 37°C por 18 a 24 horas.

De no contarse con suero polivalente se puede hacer la prueba de tolerancia a la sal para confirmar la presencia de V. cholerae.

• Prueba de Oxidasa: Sobre un pedazo de papel filtro en una placa de petri, se colocan 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa. Se extiende el cultivo sobre el papel húmedo utilizando un palillo de dientes (no se debe utilizar el asa de siembra que generalmente es de nicrón pues dan falsos positivos). La coloración violeta oscura que aparece en 30 segundos a 1 minuto indicará un resultado positivo característico de Vibrio. Como control negativo de la prueba se utiliza una cepa de Escherichi coli y como control positivo una cepa de Pseudomonas aeruginosa.

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Foto Nº2. Prueba de la oxidasa, el color violeta oscuro (derecha)

indica la prueba positiva.

• Prueba del Cordón (String test o de la cuerda): Sobre un portaobjetos se coloca una gota de desoxicolato de so dio al 0.5% y se hace una suspensión con el cultivo en evaluación. La prueba será positiva si la suspensión se vuelve viscosa y se aprecia la formación del cordón al levantar suavemente el asa de siembra. Si sólo se observa turbidez que persiste más de un minuto la prueba es negativa.

Foto Nº 3. Prueba del cordón positiva.

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· Serología con antisuero polivalente 01: En una lámina portaobjetos se hace una suspensión del cultivo con una gota de suero fisiológico, frente a ésta se coloca una gota de antisuero polivalente 01 de Vibrio cholerae, se mezcla con el asa de siembra e inmediatamente se mueve la lámina en vaivén unas 15 veces para obtener una mezcla óptima; la lectura debe realizarse antes de un minuto y si se observa la presencia de grumos de aglutinación ésta se considera como prueba positiva. Foto Nº 5. Serología con antisuero polivalente: Reacción positiva (derecha).

Lectura e interpretación del TSI. LIA: El Cultivo de V.

cholerae, produce en:

- En el TSI: K/A--, se observa el fondo del tubo de color amarillo indicando acidez en el medio (ataque a la glucosa) y la punta del plano inclinado de color rojo, no hay formación de gas a partir de glucosa ni de hidrógeno sulfurado; muchas veces se observa que el plano inclinado es de color amarillo durante las primeras horas de cultivo A/A-- y se va tornando alcalino rápidamente para dar la lectura de K/ A --.

- En el LIA: K/K, se observa la decarboxilación de la lisina (fondo y plano inclinado de color morado intenso), indicando la alcalinidad de todo el medio.

- lndol: En el tubo de LIA se observa que el extremo del papel de filtro

impregnado con re activo de Kovac o de Gilles (para la prueba de lndol) toma

¡

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un color rosado o fucsia indicando un resultado positivo

Foto Nº 4. Vidrio cholerae: Reacciones en TSI – LIA – INDOL. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS · Prueba de tolerancia a la sal Se prepara soluciones de caldo peptonado o caldo nutritivo con diferentes

concentraciones de Cloruro de Sodio: 0%, 7% Y 10%, se siembra el cultivo a investigarse y se deja 24 horas en la incubadora a 37°C. La lectura se efectúa observando el crecimiento del germen, de acuerdo con el siguiente cuadro: -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Concentración de CINa BACTERIA 0% 7% 10% ------------------------------------------------------------------------------------------------------ Vibrio cholerae + - - Vibrio alginolyticus - + + ------------------------------------------------------------------------------------------------------

· Determinación de Serotipo Se pone una gota de cada uno de los antisueros Inaba y Ogawa en una

lámina de vidrio, se añade una pequeña cantidad de cultivo al suero con ayuda de una asa de siembra y se mezcla inmediatamente para obtener una suspensión uniforme. Mientras se va rotando la lámina se observa la presencia

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de aglutinación que debe aparecer antes de los 60 segundos. Sólo una aglutinación franca debe considerarse como positiva. Se debe probar si es que ocurre aglutinación espontánea de la bacteria usando una gota de solución salina fisiológica en lugar del antisuero.

----------------------------------------------------------------------------------------------

Antisuero Inaba Ogawa --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Serovar Inaba + - Serovar Ogawa - + Serovar Hikojima + + --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

5. REMISION DE LA CEPA A INVESTIGAR Los Laboratorios que realizan cultivos de V. cholerae deben remitir al Instituto Nacional de Salud (LANARE), todos los cultivos en agar nutritivo o en TSA en tubos con tapa con rosca o de jebe, o en su defecto en cualquier frasco pequeño de vidrio con tapón sellados con parafina (el cierre debe ser hermético). Debe rotularse el frasco de tal manera que no se borre o pierda la identificación, así como transportarse y conservarse a temperatura ambiente, acompañados de su respectiva ficha. Estos tubos deben transportarse dentro de un reci¬piente seguro para evitar accidentes, se puede utilizar latas como las de café instantáneo, con las paredes y el fondo acolchado con algodón o papel para que los tubos no se rompan. Estas latas deben estar cerradas hermética¬mente utilizando para esto tiras de cinta adhesiva alrede¬dor de la tapa. Las mismas deben ir correctamente iden¬tificadas por fuera indicando la dirección a donde van a ser enviadas y señalándose que contiene material biológico, como se indica a continuació

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6. NORMAS DE BIOSEGURIDAD

El error humano y las prácticas impropias de laboratorio pueden

comprometer las mejores medidas de protección, por ello es indispensable que cada laboratorio adopte un código de prácticas apropiadas a su trabajo y que todo el personal lo observe estrictamente

El personal de laboratorio está expuesto a riesgos profesionales como

cualquier otro trabajador. La mayoría de las infecciones adquiridas en el laboratorio pueden atribuirse a uno o varios de los siguientes procedimientos peligrosos comunes a todo el personal de laboratorio:

- Procedimientos que entrañan riesgos de inhalación por ejemplo al

sembrar placas de agar, emplear pipetas, centrifugar, homogenizar, flamear asas, abrir cultivos.

- Procedimientos que engendran riesgos de ingestión, por ejemplo el

pipear con la boca, manipulación de muestras, hacer frotis y cultivos. - Procedimientos relacionados a la eliminación de material

infeccioso.

Son raros los reportes sobre casos de enteritis por Vibrio cholerae como consecuencia de una infección en el laboratorio. A pesar que todos los vibrios patógenos pueden encontrarse en las heces, la ingestión de V. cholerae constituye el principal peligro.

La dosis oral infectante de V. cholerae en individuos sanos no aclorhídricos está en el orden de 108 gérmenes. La importancia de la exposición por aerosoles no es conocida. El riesgo de infección seguida de

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una exposición oral puede incrementarse en individuos aclorhídricos. Aunque las vacunas han provisto una protección parcial de duración corta (3 a 6 meses) para individuos no inmunes en áreas altamente endémicas, su uso rutinario en el personal de laboratorio no se recomienda.

Todos los procedimientos para el diagnóstico de cólera con cultivos o

materiales clínicos infectados potencialmente, deben ser realizados según el Nivel 2 de Bioseguridad. Esto implica las siguientes medidas:

1. El personal de laboratorio debe tener un entrenamiento específico en el manejo de esta bacteria.

2. N o se debe pipetear material infeccioso con la boca (suero

sanguíneo, muestras, cultivos).

3. No se permitirá comer, beber, fumar, almacenar alimentos ni aplicarse productos de tocador en el sector de los trabajos de laboratorio.

4. El laboratorio siempre estará ordenado, limpio y libre de todo el

material que no sea pertinente a los trabajos. 5. Las mesas de trabajo serán descontaminadas por lo menos una

vez al día y después de que caiga" sobre ellas cualquier material contaminado.

6. Todas las personas deberán lavarse las manos después de

manipular material infeccioso y también al salir del laboratorio. 7. Todos los procedimientos se practicarán cuidadosamente a fin de

reducir al mínimo la formación de aerosoles. 8. Se descontaminarán todos los deshechos líquidos o sólidos

contaminados antes de su eliminación o de darles otro destino.

9. El personal de laboratorio deberá llevar mandiles u otro uniforme apropiado.

10. El jefe del laboratorio garantizará que solamente tengan acceso al laboratorio las personas a quienes se les han advertido los posibles peligros y reúnan los requisitos específicos para entrar en el local. 11. Mientras se llevan a cabo los trabajos, las puertas del laboratorio permanecerán cerradas

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12. No se permitirá la entrada en el laboratorio a las personas expuestas a un mayor riesgo de adquirir una infección o para quienes la infección puede resultar extraordinariamente peligrosa, entre estas personas figuran los niños y los individuos afectados por inmunodeficiencia o inmunosupresión. 13. Se utilizarán guantes para todos los procedimientos que obliguen al contacto directo con material infeccioso. 14. Cualquier derrame peligroso, accidente o exposición manifiesta o potencial a material infeccioso se notificará de inmediato al Jefe del laboratorio.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

CDC-Cholerae-Perú,1991.MMWR. 40: 108-110, 1991. Ewing WH. Edwars and Ewing's Identification of

Enterobacteriaceae. 4th edition. Elsevier Science Publishing Co., New York. 1986.

Farmer JJ III, Hickman-Brenner FW, Kelly MT. Vibrio. In: Lennete EH, Balows A, Hausler WJ Jr, et al, (eds). Manual ofClinical microbiology. 4th ed. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1985: 282301.

Grados O. Vibrio parahaemolyticus. Diagnóstico. 11: 73-62, 1983. Grados O. Guía para el aislamiento y vigilancia de Salmonella y

Shigella. Lima 1982, 55 pp.

Organización Mundial de la Salud. Cuadernos de Salud Pública NQ 40. Principios y prácticas de lucha contra el cólera. Ginebra 1970.149 pp.

Organización Mundial de la Salud. Manual de Investigaciones de Laboratorio de Infecciones Entéricas Agudas. Edición en Español. Reimpresión 1991.126 pp.

Richardson JH, Barkley WE, (eds). Biosafety in microbiologycal and

biomedicallaboratories 2 nd ed. 1988. Washington DC. U.S. Deparment ofHealth and Human Services. 139 pp.

West PA, Russek E, Brayton PR, Colwell RR. Statistical evaluation of a quality control method for isolation of pathogenic Vibrio species on selected

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Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose medium. J. Clin Microbiol. 16:1110-1116,1982.

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9. ANEXOS

Anexo N- 1

9.1. MATERIAL Y EQUIPO NECESARIOS

9.1.1. Equipo a. Estufa que pernúta mantener los cultivos a

37°C. b. Autoclave. c. Horno para esterilización. d. Refrigeradora. e. Balanza. 9.1.2. Material de vidrio a. Placas Petri 100 x 10 o similares. b. Tubos de borosilicato 13 x 100. c. Tubos de borosilicato 13 x 100 con tapa de rosca. d. Balones de 500 mI ó 1000 mI. e. Frascos de boca ancha. f. Frascos tipo penicilina de diferentes tamaños. g. Probetas graduadas de volúmenes diferentes. h. Pipetas de 1, 2, 5 Y 10 mI. i. Láminas portaobjetos. 9.1.3. Medios de cultivo a. Agar TCBS. (Tiosulfato, Citrato, Bilis, Sacarosa). b. Agar TSI. (Triple Sugar Iron). c. Agar LIA. (Lysine Iron Agar). d. Agar Tripticase soya (TSA)

e. Peptona. f. Medio de Transporte: Cary y Blair o Amies.

9.1.4. Reactivos y colorantes a. Cloruro de sodio. b. Desoxidación de sodio. c. reactivo de aoxidasa. d. reactivos de kovac.

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9.1.5. Material de laboratorio

a. Gradillas. b. Mechero Bunsen. c. Asas de cultivo. d. Espátula. e. Algodón. f. Lápices marcadores. g. Hisopos con punta de algodón. h. Papel filtro.

9.2. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

9.2.1. Medio de transporte de Amies

Tioglicolato de sodio 1.00g Cloruro de sodio 3.00g Cloruro de potasio 0.20g Cloruro de calcio 0.10g Cloruro de magnesio 0.10g Fosfato de potasio monobásico 0.20g Fosfato de sodio dibásico 1.15g Agar 4.00g pH7.3

Preparación: Pesar 10 g de medio deshidratado en un litro de agua

destilada, disolver con calor y distribuir en frasquitos o tubos, se auto clava a 121°C por 15 minutos

9.2.2. Medio de transporte de Cary y Blair Tioglicolato de sodio 1.50g Fosfato disódico 1.10g Cloruro de sodio 5.00g Agar 5.00g Agua destilada 991 ml pH 8.4

Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada en Baño

María calentando hasta que la solución se aclare (no se deje hervir). Una vez enfriada la preparación a 50°C, añadir 9 ml de solución de cloruro de calcio al 1 % recién preparada y ajustar el pH a 8.4 (con hidróxido de sodio ION). Distribuir cantidades de 5 mI en tubos limpios y esterilizados de 13x100 con tapa de rosca dejando un pequeño espacio de aire en la parte superior y con las tapas sin enroscar. Esterilizar a vapor fluente durante 15 minutos, dejar enfriar y ajustar las tapas. De no contar con tubos se puede emplear frasquitos tipo penicilina con tapa de jebe.

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9.2.3. Agar TCBS

Extracto de levadura 5.00 g Peptona 10.00g

Citrato de sodio 10.00g Tiosulfato de sodio 10.00g Bilis de buey 8.00g Sacarosa 20.00g Citrato férrico 1.00g Cloruro de sodio 10.00g Agar 15.00g Azul de bromotimol 0.04g Azul de timol 0.04g pH8.6

Preparación: Suspender 89 g de medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada, disolver los ingredientes en Baño María hirviendo durante algunos minutos, agitando frecuentemente. Enfriar a 45-50°C y distribuir en placas. El medio distribuido presenta una coloración azul verdosa. No se debe esterilizar el medio en autoclave. La fórmula del medio puede variar de acuerdo al fabricaI)te, seguir las instrucciones que figuran en el frasco que se use.

9.2.4. Agar TSI

Extracto de carne 3.00 g Extracto de levadura 3.00 g Peptona 15.00g Proteosa peptona 5.00 g Lactosa 10.00g Sacarosa 10.00g Glucosa 1.00 g Sulfato ferroso 0.20 g Cloruro de sodio 5.00 g Tiosulfato de sodio 0.30 g Agar . 12.00 g

Rojo de fenol 0.024g pH 7.4

Preparación: Pesar 65 gramos para 1 litro de agua destilada, calentar al

fuego hasta licuar completamente. Repartir 3 ml por tubo de 13 x 100. Autoclavar a 121°C por 15 minutos. Dejar solidificar dando una inclinación muy corta.

9.2.5. Agar LIA

Peptona 5.00 g Extracto de levadura 3.00 g

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Glucosa 1.00 g L-lisina 10.00 g Citrato férrico amoniacal 0.50 g Tiosulfato de sodio 0.04 g Púrpura de bromocresol 0.02 g Agar 15.00 g pH6.7 Citrato férrico amoniacal Tiosulfato de sodio Púrpura de bromocresol Agar pH6.7

Preparación: Pesar 34.5 gramos para 1 litro de agua destilada. Llevar al

fuego y licuar. Repartir 3 mI en cada tubo de 13 x 100. Autoclavar a 121°C por 15 minutos. Dar una inclinación muy corta.

9.2.6. Agar TSA

Tryptona 15.00 g Soytona 5.00 g Cloruro de sodio 5.00 g Agar 15.00 g pH7.3

Preparación: Pesar 40 gramos para 1 litro de agua destilada. Calentar hasta disolver por completo. Repartir en tubito s de 12 x75 ó10 x 75, aproximadamente 2.5 a2 mI por tubo o en tubos 15x125, aproximadamente 4 mI por tubo. Esterilizar a 12PC por 15 minutos, dejar enfriar. Los tubos destinados al cepario no necesitan inclinación.

9.2.7. Reactivo de Kovac (lndol)

Alcohol amílico o isoarm1ico Puro 75.0 ml Paradimetilamino benzaldehido 5.00 g Acido clorhídrico Q. P. 25.00 g

Preparación: Disolver el aldehído en el alcohol, luego agregar el ácido

lentamente. Guardar en frascos oscuros y en refrigeración.

Los papeles de filtro cortados en tiras delgadas de unos 5 cm. de longitud por 0.5 cm. de ancho se impregnan con el re activo de Kovac's. Se hacen secar en estufa y se almacenan en frascos oscuros. Los papeles así preparados tienen una duración de tres meses aproximadamente

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9.2.8. Reactivo de Gilles

Alcohol metílico (metanol) 50 ml Paradimetilamino benzaldehido. 5.00 g Acido ortofosfórico 10 ml

Preparación: Similar al re activo de Kovac. 9.2.9. Caldo peptonado

Peptona 10.00 g Cloruro de sodio 5.00 g Agua destilada 1000.0 ml pH8.6

Preparación: Disolver y ajustar el pH a 8.6; repartir 10 mI en tubos de

15x125, esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos. 9.2.10. Prueba de Oxidasa Preparar solución acuosa al 1% de N-N dimetil pa-

rafenilenodiaminaoxalato, distribuir en frascos de vidrio oscuro y refrigerar (no congelar), preparar sólo 2 mI cada vez.

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Anexo Nº 2

SECTOR SALUD

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD RED DE EMERGENCIA DE LABORATORIOS DE COLERA

FICHA CLINICO EPIDEMIOLOGICA DE ENVIO DE MUESTRAS

CODIGO INS ( ) FECHA: …/…….. /.......

1. ESTABLECIMIENTO DE PROCEDENCIA: ........................................................................................................................................... 2. DATOS DEL PACIENTE: CODIGO………..……... HISTORIA CLINICA………...;...........

NOMBRE y APELLIDO:............................................................................................... EDAD: ............SEXO: M ( ) F () OCUPACION............................................................

PROCEDENCIA: ............................... /....................... .../ ....................../........................................................ DEPARTAMENTO PROVINCIA DISTRITO LOCALIDAD RESIDENCIA PROVISIONAL: ………………………………..../…….………………………….……./............................ DEPARTAMENTO PROVINCIA DISTRITO HOSPITALIZADO ( ) AMBULATORIO ( ) FALLECIDO ( ) 3. MANIFESTACIONES CLINICAS: FECHA DE INICIO DE SINTOMAS:………...… /…………………/......................... DIA MES AÑO SINTOMAS: FIEBRE () DOLOR ABDOMINAL ( ) DIARREA () NAUSEAS () VOMITOS ( ) CALAMBRES ( ) CARACTERISTICAS DE LA DIARREA: . LIQUIDA () CON MOCO () CON SANGRE ( ) Nro. DE DEPOSICIONES POR DIA: .......................................................................... TRATAMIENTO CON ANTIBIOTICO SI ( ) NO ( ) TIPO: ... ... ... ... ... ... ... ... ........ ... ...... ... ………….............................................. 4. DATOS DEL LABORATORIO:

TIPO DE MUESTRA: HECES ( ) HISOPADO RECTAL ( ) OTRO............................ FECHA DE TOMA DE MUESTRA:................. / /............ DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO:…………………………………………….... FECHA DE AISLAMIENTO:……………..…. /………………..…/……………....... ..............................................

PERSONA RESPONSABLE

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Esta publicación se ténnino de imprimir en diciembre de 1997 en los

Talleres Gráficos de Art. Laulrec S.R.Ltda. Av. Paseo de la República 731 - Lima 13

Tel/Fax: 4237616