teorico radicales libres 11-11-13 (1)
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FISICOQUIMICA TEORICO 11-11-13
RADICALES LIBRES E� SISTEMAS BIOLOGICOS
Material de estudio
• Radicales libres y Resonancia de espín
electrónico (EPR).
Material de enseñanza complementaria para
el curso de Fisicoquímica.
• Información de las clases teóricas.
¿Qué es un radical libre?
Indique las características de los radicales libres y mencione al menos tres ejemplos de radicales libres generados en sistemas biológicos.
¿Con qué criterio se clasifican?
¿Qué es un radical libre?
� Especie química (átomo ó molécula) con un número impar de electrones de valencia (octeto incompleto). Es decir, un electrón en un orbital.
� Especie química de existencia independiente, con uno o más electrones no apareados en su capa externa
Electrones apareados
(con espines opuestos)
2 electrones apareados
en un orbital
Características de un radical libre
� Paramagnético: Especie atraída por un campo magnético
�Alta reactividad: Tendencia a adquirir un segundo
electrón adquirir e-
deslocalización del e-
X e- + X•+
Y + e- Y•-
�Las especies radicales pueden estar cargadas positivamente, negativamente o neutras
Características de un radical libre
�
�Dan reacciones en cadena:
(1) iniciación
(2) propagación
(3) terminación
� Inespecificidad
Homólisis unimolecular (unión débil)
Fotólisis
Transf. de 1 e- a partir de un metal
Reacción en cadena
PROPAGACIO�
TERMI�ACIÓ�
→+•2BrH
•+ BrH2
→+•2HBr •+ HHBr
•+ BrHBr
→+• HBrH
→+ •• BrBr 2Br
•→ BrBr 22I�ICIACIO�
H2 (g) + Br2 (g) → 2 HBr (g)
hν
→+ •• BrH HBr
Radicales libres: clasificación
Clasificación Ejemplos Símbolo t 1/2 (s)
Centrados en H Atomo de H H• 10-8
Centrados en C Triclorometilo •CCl3 10-4
Ubisemiquinona Q10H• 10-2-1
Melanina - 104
Centrados en S Tiílo /Pertiílo RS•/RSS• 10-5
Centrados en N Oxido nítrico •NO 1
Dióxido de nitrógeno •NO2 1
Centrados en O
Inorgánicos Anión superóxido O2•- 10-4
Hidroxilo HO• 10-9
Orgánicos Alcohoxilos RO• 10-6
Peroxilos RO2• 10-1
Metales de transición Cobre Cu+/Cu2+ 10-8-10-4
Hierro Fe2+/Fe3+ 10-2-10-4
Pryor, 1976
Describa la secuencia de reducción univalente del oxígeno.
Especifique cuáles de dichos productos son radicales libres.
Para el oxígeno en su estado fundamental, el anión superóxido y el ión peróxido, justifique esquematizando la configuración electrónica (últimos orbitales).
Formas en que existe el oxígeno
1. Ozono (O3): principalmente en altitud
2. Oxígeno monoatómico (O): forma transiente reconocida
en química atmosférica
3. Dioxígeno (O2)
Perdiendo e- O2 e- + O2+
dioxigenilo radical
Ganando e- O2- ; H2O2 ; .OH ; H2O
Oxígeno
� Elemento más abundante en la naturaleza (54%)
� Constituye el 21% del aire atmosférico
� Configuración electrónica del O: 1s2 2s2 2px2 2py
1 2pz1
O O
� O2: Birradical (2 electrones no apareados, 1 electrón no
apareado sobre cada átomo de O)
� Estado fundamental: triplete (los 2 electrones tienen igual
número de espín (+1/2), espín paralelos)
� Químicamente estable
O
Estados del oxígeno
El O2 tiene la particularidad de que el estado basal es un triplete, con 2 electrones no apareados y que el estado excitado, altamente reactivo, es un singulete con los electrones apareados
Estado del O2
2o estado excitado
1er estado excitado
Estado basal
Orbital
1O2
Singulete
Triplete
Michaelis, 1946
La reducción parcial, univalente y sucesiva, del oxígeno produce tres
intermediarios, dos de ellos radicales libres.
O2 O2 • - H2O2
•OH H2O
e- e- e- e-
Aniónsuperóxido
Peróxidode hidrógeno
Radicalhidroxilo
Oxígeno Agua
Reducción univalente del oxígeno
σ* 2p
π * 2p
π 2p
σ2p
σ* 2s
σ 2s
σ* 1s
σ 1s
Ground-state O2
(3Σg -O2)
Singlet O2
(1∆g O2)
Estado basal O2 singulete Radicalsuperóxido
Iónperóxido
(O2: 3ΣgO2) (1∆gO2) (O2
-) (O 22-)
Configuración electrónica de las especies del oxígeno
σ2p
*
π2p*
π2p
σ2p
σ2s*
σ2s
σ1s*
σ1s
O2 O2 • - H2O2
• OH H2O
e- e- e- e-
Aniónsuperóxido
Peróxidode hidrógeno
Radicalhidroxilo
Radicales libres
Especie estable no radical
Habilidad para difundir a través de membranas biológicas
¿Qué causa los efectos tóxicos del oxígeno?
� Presiones elevadas de O2 (hiperoxia) son tóxicas para los animales
� Los radicales libres de oxígeno son el mecanismo molecular común para la toxicidad del oxígeno y la radiación ionizante
� Un aumento en la presión de oxígeno o una disminución de la defensa antioxidante conducen a un daño celular
� Es un fenómeno continuo Science 119: 623-626 (1954)
La teoría de Gerschman(1954)
Indique (en el caso en que las haya) que enzima metaboliza cada especie reactiva del oxígeno en los sistemas biológicos.
Mecanismos de defensa antioxidante
1. Previniendo la formaciónCitocromo oxidasa
Proteínas quelantes de Fe y Cu (ferritina, transferrina, ceruloplasmina)
Glutatión transferasa
2. Desactivando las especies (Antioxidantes)
Enzimáticos (SOD, catalasa, GPx/GR)
No enzimáticos - hidrosolubles (GSH, vit C)
- liposolubles (vit E, carotenoides, ubiquinoles)
3. Reparando el daño producido
Enzimas reparadoras del ADN
Enzimas lipolíticas
Enzimas proteolíticas
Hidrosolubles
Liposolubles
Glutatión (GSH)
Acido ascórbico
Vitamina E
Coenzima Q10
Carotenoides
Antioxidantes no enzimáticos
• Moléculas que pueden atrapar especies radicales ya
formadas (•OH, ROO•, etc) y/o estados excitados (1O2,
RO*)
• Presentes en concentraciones µM o mM
• Fácilmente oxidables
O2 O2 •••• - H2O2 HO•••• H2O
e- e- e- e-
SOD
Catalasa
GSH GSSG
GPx
GR
Enzimas antioxidantes
Glutatión
Indique los sitios celulares de producción de anión superóxido y de peróxido de hidrógeno.
Anión superóxido (O2••••-)
UQH• + O2 → UQ + H+ + O2•••• -
k = 8 x 103 M-1 s-1
FMNH• + O2 → FMN + H+ + O2•••• -
Complejo I: NADH -ubiquinona reductasa
Complejo III: ubiquinol-citocromo c reductasa
�Auto-oxidación de componentes de cadenas de transporte de electrones
�Auto-oxidación de compuestos de bajo peso molecular
�Reacciones enzimáticas
Peróxido de hidrógeno (H2O2)
2 O2•- + 2 H+ → H2O2 + O2
� Dismutación no enzimática o enzimática de O2• -
� Reacciones catalizadas por enzimas peroxisomales (2 e-)
O2 + 2 H+
Sustrato
reducidoSustrato
oxidado
H2O2
Ej. Glicolato oxidasa, Urato oxidasa, Acil-CoA oxidasa
Reacciones que generan especies activas del oxígeno
I. O2- Autooxidación de moléculas de bajo peso molecular
Reacciones enzimáticas
Transporte mitocondrial de electrones
II. H2O2 Dismutación de O2-
Doble reducción directa de oxígeno molecular
III. •OH Reacción de Haber Weiss
Reacción de Fenton
Sitios subcelulares de generación de especies activas del oxígeno
� Mitocondrias
� Membrana de retículo endotelial
� Membrana nuclear
� Membrana plasmática
� Peroxisomas
� Enzimas citosólicas
Se estima que el 1-3% del O2 consumido, se metaboliza a especies
activas del oxígeno en condiciones fisiológicas
Otras especies activas
• Peróxido de hidrógeno– alta constante de permeabilidad en membranas
biológicas
• Oxígeno singulete, carbonilos excitados– emiten energía al volver al estado fundamental
• complejos ferrilos y perferrilos– pueden intervenir en la iniciación de cadenas de
oxidación lipídica
¿Es el óxido nítrico un radical libre?
¿Cuáles son sus principales características?
Indique vías de formación y degradación en sistemas biológicos.
�itrógeno y óxido nítrico (••••�O)
� N2 constituye el 79% del aire atmosférico
� Configuración electrónica del N: 1s2 2s2 2px1 2py
1 2pz1
(3 electrones no apareados)
� Cuando un átomo de N (3 electrones no apareados) se
combina con un átomo de O (2 electrones no apareados)
forma el óxido nítrico (•NO) con un electrón desapareado
�
O �
Oxido nítrico
�itrosonio (�O+)
�itrosaciónEfectos directos
Anión nitrosilo (�O-)
Efectos indirectos
deaminación
�itrosilación(nitrosotioles)
�itración(nitrotirosinas)
Lipid oxidaciónLipid nitración
D�A oxidaciónD�A nitración
PRODUCCIÓ� BIOLÓGICA DE ÓXIDO �ÍTRICO
En organismos fotosintéticos:
Vias reductivas: Actividad de la enzima nitrato reductasa (NR)
2 NO2- + NAD(P)H + 3 H3O
+ 2 NO + NAD(P)+ + 5 H2O
Producción de �O asociada a membrana plasmática o mitocondrial (sistema NR:NiNOR)
Vías oxidativas: Actividad de la enzima óxido nítrico sintasa-like
(utiliza L-Arginina, poliaminas o hidroxilamina)
Vías no enzimáticas: A partir de nitritos en medio ácido.
� Las óxido nítrico sintetasas (�OS) producen �O a partir de Arginina, �ADPH2 y O2.
� Hay cuatro �OS: I, nNOS (neuronal)
II, iNOS (macrófagos)
III, eNOS (endotelio)
IV, mtNOS (mitocondria)
Arg + �ADPH2 + O2 => Cit + H20 + �O
�ADPHFADFM�CaM
AlternativeSplicing
En organismos no fotosintéticos:
k = 1.9 x 1010 M -1 s -1
(Peroxinitrito)
O2 ••••- ••••�O
O�OO-
Reacción entre el O2 ••••- y el ••••�O
� Reacción de terminación entre 2 especies radicales:
se forma el anión (no radical) peroxinitrito
� Reacción muy rápida, controlada por difusión
Potente oxidante
Utilizando un diagrama relacione la generación de especies activas del oxígeno y del nitrógeno.
Defina el concepto de estrés oxidativo
Reacciones
fotoquímicasPolimorfonucleares
Intracelular
Concentraciones celulares en estado estacionario
����ón superóxido 10-11 M
�Peróxido de hidrógeno 10-7-10-9 M
�Radical hidroxilo 10-18 M
�Oxido �ítrico 10-7 M
�Peroxinitrito 10-9 M
� Estrés oxidativo como un desbalance.Un aumento de oxidantes o una disminución
de antioxidantes llevan igualmente al estrés oxidativo.
ESTRÉS OXIDATIVO
• Estrés oxidativo como un aumento de las concentraciones en estado estacionario de las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno. La concentración intracelular aumentada, de por lo menos una, de las especies reactivas del oxígeno o del nitrógeno es la base química del estrés oxidativo.
[O2- ]ss [H2O2 ]ss [HO·]ss
[ROO·]ss [1O2 ]ss
[�O ]ss [O�OO -]ss
Daño causado por radicales libres y otras especies activas
D�A
Oxidación/Nitración
Proteínas
Modificaciones
conformacionales
Lipídos
PeroxidaciónMutaciones
¿Cuál es la importancia de ciertos metales de transición (por ejemplo, Fe) en la bioquímica de los radicales libres?
Fe2+ + H2O2 → •••• OH + HO- + Fe3+
� Reacción del H2O2 con Fe2+ (o Cu+ )
Reacción de Fenton
Reacción de Haber-Weiss
Fe3+ + O2•- → Fe2+ + O2
Fe2+ + H2O2 → •••• OH + HO- + Fe3+
H2O2 + O2•- → •••• OH + HO- + O2
Muy reactivo
Distribución celular del Fe no hemínico
- Pool de Fe lábil: Fe unido a compuestos de bajo
peso molecular (citrato, ATP, pirofosfato, ácido
ascórbico).
- Ferritina: Es la proteína intracelular más
importante en el almacenamiento de Fe.
- Hemosiderina
Peroxidación lipídica
Definición:
Deterioro oxidativo de lípidos poliinsaturados
¿Cuáles son los indicadores más empleados para evaluar daño por radicales libres a lípidos, proteínas y AD�.
Metodología
Utilizada en el estudio de la bioquímica de especies
activas del oxígeno y nitrógeno
Métodos indicadores de estrés oxidativo in vivo
Detección de especies activas del oxígeno y del
nitrógeno
Detección de antioxidantes
Detección de daño a macromoléculas/estructuras
celulares
�Relación GSSG/GSH (espectrofotometría y HPLC)
�Relación ascorbilo/ascorbato (EPR)
�Quimioluminiscencia in vivo
Métodos indicadores de estrés oxidativo in vivo
�Velocidad de producción (espectroscopía y espectrofluorometría)
�Cálculo de estados estacionarios
Detección de especies activas específicas
�Actividad de enzimas antioxidantes (espectrofotometría)
�Antioxidantes (HPLC)
Detección de antioxidantes específicos
�Lípidos
�Proteínas
�DNA
Carbonilos (espectrofotometría y Western Blot)
Nitrotirosina (Western Blot y HPLC)
8-hidroxi-2´-deoxiguanosina (Western Blot y HPLC)
Hidroperóxidos lipídicos (espectroscopía y
espectrofluorometría)
Lípidos nitrados (Espectrometría de masa)
Detección de daño a macromoléculas/estructuras celulares