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Técnicas de Biología
Molecular: PCR
Ricardo Molina Gasset
Hospital Virgen de los Lirios
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P.C.RP.C.R..""PolymerasePolymerase ChainChain ReactionReaction""
"Reacción en Cadena de la
Polimerasa"
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Organización General IndividuoOrganización General Individuo
NúcleoCromosomas (DNA)
CitoplasmaDiferentes orgánulos
Células
Individuo
Órganos
Tejido
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Código GenéticoCódigo Genético
DNA RNAProteína
(enzimas, hormonas,
HLA y otros)
A G C T TA G AT A A
A1
A2
A3
Proteína
A1-A2-A3-.......
BasesAminoácidos
Severo Ochoa
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Extensión DNA genómico(3.000.000.000 bases)
Extensión DNA genómico(3.000.000.000 bases)
7.500 vol/ 200 páginas
CCATACCCCTAGGTAC
ATGGACCCCTAGGTACATACCCCTAGGTAC
ATACTCCCTAGGTAC
ATACCGGTCCTAGGTAC
CCATACCCCTAGGTAC
ATGGACCCCTAGGTAC
ATACGCCCTAGGTAC
AGTACCCCTAGGTAC
ATTTACCCCTAGGTAC
ATTTACCCCTAGGTAC
ATTTACCCCTAGGTAC
ATTTACCCCTAGGTAC 2.000 caracteres/página
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Transmisión deTransmisión de la información genéticaTransmisión de la información genética
ADN
ARN
ARN mensajero
ARN mensajero
Proteína
Núcleo
Citoplasma
Transcripción
Procesamiento
Transporte
Traducción
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Síntesis de ADN complementarioSíntesis de ADN complementario
ADN
ARN mensajero
Transcripción Retrotranscripción
A G C T T A T G A T A AA G C T T A G CA T A A T G A
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Pares de bases
Adenosina-Timidina Guanosina-Citidina
Enlaces entre basesEnlaces entre bases
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Análisis genéticoAnálisis genético
Sangre Leucocitos
Técnica
PCR
DNA
DetecciDeteccióónn
del ADNdel ADN
SecueciacSecueciacííonon
RFLPRFLP
SouthernSouthern
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• Medicina·Virología, Bacteriología·Genética, Oncogenes·Tipaje HLA y Paternidad·Medicina Forense
• Farmacología, Biología, Veterinaria...
• Antropología, Arqueología...
• Análisis Medioambiental
Usos de la P.C.R.Usos de la P.C.R.
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• EspecificidadSólo se amplifica lo determinado por los "primers“
• SensibilidadDetecta 1 molécula amplificándola hasta obtener millones de copias
• RapidezObtención de Resultados en pocas horas
Ventajas de la P.C.R.Ventajas de la P.C.R.
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• Paso 1: Obtención del DNA• Paso 2: Desnaturalización del DNA• Paso 3: Amplificación DNA• Paso 4: Terminación ciclo• Paso 5: Detección
PCR
“Sistemática de trabajo con DNA“:PCR
“Sistemática de trabajo con DNA“:PCR
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• Procedencia
• Calidad
• Métodos
• Conservación del DNA
Extracción de DNAExtracción de DNA
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Sangre entera (EDTA)
Plasma (EDTA) o suero generalmente en virología
Células aisladas (Mononucleares, en cultivo)
Tejidos (Congelar en nítrógeno líquido lo más rápido posible para evitar la
degradación del RNA o DNA)
Líquidos biológicos
Orina o exudado cervical (C. trachomatis o N. gonorrhorae)
Líquido amniótico para diagnóstico prenatal
LCR
Líquido pleural – para el diagnóstico de metástasis cancerosas o
enfermedades linfoproliferativas
Tipos de muestrasTipos de muestras
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Muestras de la pared bucal – para obtener muestras de DNA
Médula ósea – para dg de enf. Linfoproliferativas o la detección
de metástasis cancerosas.
Esputo – para la detección de Mycobacterium tuberculosis
Pus – estudio de bacterias
Tejidos parafinados o fijados.
Muestras de sangre en papel Guthrie
Tipos de muestrasTipos de muestras
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Sangre entera
Tejidos – procesar rápidamente , si no se puede lo mejor es sumergirlo 15-
20s seg en nitrógeno líquido y después conservar a –70ºC hasta la
extracción de DNA. Si no tengo –70, lo corto en pedacitos pequeños para
asegurarme una rápida congelación
Plasma o suero – congelar a –70 o –20 en alícuotas
Orina – estable para C. trachomatis y N. gonorreae por 4 días a 4ºC y 60
días si se congela
Exudado cervical - en medio de transporte se conserva igual que orina.
Conservación de las muestrasConservación de las muestras
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Bucal . En general estable a Tª ambiente, pero es conveniente realizar la
extracción lo antes posible por las bacterias contaminantes
Líquido amniótico. Se procesa enseguida. Si no es posible,congelar el
pellet celular .
Médula ósea y líquido pleural. No debe congelarse (x hemo) se puede
refrigerar a 4ºC por menos de 72 horas pero lo ideal es procesarla
enseguida
Esputo – guardar a 2-8 ºC hasta ser procesada pero debe hacerse
dentro de las 24 horas de la recolección (decontaminación y
concentración) .
Pus, se puede refrigerar o congelar si no tiene hematies.
Tejido fijado . Especímen de último recurso.
Conservación de las muestrasConservación de las muestras
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Es Importante Diferenciar dos Conceptos
• Extracción: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra:
– Lisis de las células que contienen a los AN
– Inactivación de nucleasas
– Clarificación: separación de los AN de los restos celulares (debris).
• Purificación: Separación de AN:– De proteínas solubles
– De otros AN no deseados
– De Lípidos, carbohidratos
– De sales y otros compuestos orgánicos
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EL PROBLEMA
Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de ADN
es necesario disponer de éstos en estado puro.
• Por qué purificar?
Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los ácidos
nucléicos.
Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en
ingeniería genética.
El desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde una
mezcla compleja, manteniendo la integridad de los mismos
Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del
medio, iones, etc.
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Disgregación o fragmentación del tejido
Lisis celular
Clarificación
Purificación
AnálisisCualitativo:
electroforesis
Cuantitativo:
espectrofotometría
UV
Etapas bEtapas báásicas de un procedimiento general para sicas de un procedimiento general para
ExtracciExtraccióón y Purificacin y Purificacióón de ANn de AN
Estas etapas
deben ir
acompañadas de
medidas o
agentes que
inactiven
nucleasas
celulares
Durante todo el
procedimiento se
debe usar
soluciones y
material estéril, ademas
de guantes
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1. M1. Méétodos de fragmentacitodos de fragmentacióón y lisis celular n y lisis celular para la extraccipara la extraccióón de ADNn de ADNEl procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria pEl procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para ara
romper el material de inicio (cromper el material de inicio (céélulas o tejido) y la delicadeza requerida lulas o tejido) y la delicadeza requerida
para preservar las molpara preservar las molééculas de interculas de interéés (ADN o ARN). s (ADN o ARN).
• Métodos físicos– Homogenización mecánica,
– Homogenización en solución
– Molienda manual en mortero
– Bolitas de vidrio
– Sonicación
• Métodos químicos- Detergentes
• Métodos enzimáticos– Lysozima: rompe enlaces β-1.4- entre N-acetil murámico y N-acetil glucosamina de peptidoglicánde la pared celular de bacterias
– Lyticasa: rompe enlaces β-1.3 de glucano de levaduras
– Proteasas: rompe enlaces peptídicos de prot. de pared y membrana plasmática e interacciones célula-célula.
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Ruptura de células por medios físicosTable 1. Techniques used for the physical disruption of cells.
Lysis Method Description Apparatus
Mechanical Waring Blender Polytron
Rotating blades grind and disperse cells and tissues
Liquid Homogenization
Dounce Homogenizer Potter-Elvehjem Homogenizer French Press
Cell or tissue suspensions are sheared by forcing them through a narrow space
Sonication Sonicator High frequency sound waves shear cells
Freeze/Thaw Freezer or dry ice/ethanol
Repeated cycles of freezing and thawing disrupt cells through ice crystal formation
Manual grinding Mortar and pestle Grinding plant tissue, frozen in liquid nitrogen
Homogenizador
Dounce
Homogenizador
mecánico - polytron
Sonicador
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MMéétodos para todos para lisarlisar ccéélulaslulas
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Otros componentes de una soluciOtros componentes de una solucióón de lisisn de lisis
Debe Incluir
•Etilen diamino tetracetico (EDTA).
•Quelante de iones Mg2+, baja la concentación
efectiva de este ión.
•Por lo tanto, EDTA inhibe nucleasas y minimiza
la degradacion de AN durante la
extración/purificación.
• Amortiguador de pH (7-8).
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2. Clarificaci2. Clarificacióón. Eliminacin. Eliminacióón de restos n de restos celulares (celulares (debrisdebris))
– Centifugación
– Filtración
–Método mixto: enzimas + centrifugación
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3. Purificaci3. Purificacióónn• Desproteinización con fenol, que al desnaturalizar lasproteínas causa su precipitación.
• Precipitación de proteínas con sales (“salting out”)
• Cromatografía
– De intercambio iónico
– De adsorción a sílica
– De filtración
• Extracción de DNA desde un gel
de agarosa
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ExtracciExtraccióónn FenFenóólicalica de de proteproteíínasnas
fenol
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CromatografCromatografíía de intercambio ania de intercambio anióóniconico
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CromatografCromatografíía de intercambio ania de intercambio anióóniconico
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CromatografCromatografíía de intercambio ania de intercambio anióóniconico
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CromatografCromatografíía de adsorcia de adsorcióónn
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CromatografCromatografíía de a de adsorcionadsorcion
DNA eluye de
la sílica en
agua
DNA se une
a la sílica
en NaI
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MetodosMetodos magnmagnééticosticos
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DNA es insoluble en solución alcohólica
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Longitud de onda
•Razón Abs230/Abs260 debe ser menor de 0.5 (> sugiere
contaminación con fenol/CHCl o carbohidratos).
•Razón Abs260/Abs280 debe ser ~1.8 (< sugiere contaminación con
proteínas,
•Abs320 se debe a difracción de la luz por material particulado en la
muestra. Debería ser baja.
Análisis espectrofotométrico de ADNAnAnáálisislisis espectrofotomespectrofotoméétricotrico de ADNde ADN
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• Cantidad de material de partida
– Número de copias de las moléculas de AN
– Cantidad de tejido
• Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado)
• Contaminantes e interferentes en el material biológico
• Hay un compromiso entre rendimiento/calidad/pureza
Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificadosFactores que afectan el rendimiento, Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificadoscalidad y pureza de los AN purificados
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El DNA purificado es relativamente estable si se encuentra en
un buffer libre de DNAsas.
Se ha visto que es estable a 4ºC por 3 años.
Los ciclos de congelado-descongelado dañan el DNA por lo
cualse recomienda alicuotar las muestras.
Tips de punta estrecha pueden cortar hebras de DNA cuando se
trabaja en solución.
Conservación de las muestras de ADNConservación de las muestras de ADN
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• ADN polimerasa termoestable
• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)
• Desoxiribonucleótidos trifosfatados(dNTPs)
• Cationes divalentes
• Buffer (para mantener el pH)
• ADN molde (Templado)
Componentes de la PCRComponentes de la PCR
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• Llevan a cabo la síntesis de ADN
dependiente del templado.
• Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C,
Pwo >2 hr a 100°C
• Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta
• Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (0.5 unidades)
• La más comunmente usada = Taq ADN polimerasa
PolimerasasPolimerasas
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PolimerasasPolimerasas
> 50+-Maritima de
ThermotogaTma
400 +-Litoris de
ThermusTli
20 -+Themus
thermophilusrTth
--Thermas
flavusTfl
N/AN/AN/A+-Woesei de
PyrococcusPwo
1 en 1.3 x 10^6 60120 +-Furiosus de
PyrococcusPfu
1 en 10^3 7540 -+Thermus
AquaticusTaq
Error
Velocidad
extensión
(nucleosides/s)
período
95°C
(minuto)
3' -- 5 '
Exonuclease
Actividad
5' -- 3 '
Exonuclease
Actividad
Fuente
Biológica
Polimerasa
de la DNA
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• Se conoce su secuencia
• Factor más importante para la eficiencia y la especificidad del proceso
• Deben estar presentes en exceso
• Requieren de un cuidadoso diseño:(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas
(d) Valores de Tm de no más de 5°C uno del otro
OligonucleótidosOligonucleótidos
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• Puede ser cadena simple o doble
• ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal
• Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg of plasmídico
• Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas
ADN molde (templado)ADN molde (templado)
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