técnica western blot

Soluciones Western Blot of 9

Técnicas

• Transferencia de las proteínas a la membrana.

• Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos.

• Lavado de la membrana.

• Anticuerpos primarios y secundarios.

• Marcaje de anticuerpos.

• Sustratos cromogénicos.

• Sustratos quimioluminiscentes.

• Captura de los datos.

• Marcadores de peso molecular.

• Lavado y redetección de una membrana.

• Técnicas relacionadas.

Detección en el propio gel.

Far-Western Blot Detection.

• Productos.

• Soporte.


Introducción.

El término “blotting” hace referencia a la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma. Este proceso es necesario ya que todas estas macromoléculas están embebidas dentro de la matriz que forma el gel, lo que imposibilita realizar su detección, mientras que en la membrana, se encuentran accesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma.

La técnica del Western Blot (también llamado “inmunoblotting” debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el antígeno o los antígenos específicos de interés) fue descrita por primera vez por Towbin et al. en 1979 y en la actualidad es una técnica de rutina en todos los laboratorios que realizan análisis de proteínas. La especificidad de la unión antígeno – anticuerpo permite la detección de una única proteína dentro de una mezcla compleja de otras proteínas. En la actualidad se utiliza como criterio de identificación positivo de una proteína especifica en una mezcla compleja y para obtener datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.

El primer paso de todo Western Blot es la separación de las macromoléculas mediante geles de electroforesis; después de la misma, las macromoléculas ya separadas en función de su diferente peso molecular se transfieren a una segunda matriz, generalmente una membrana de nitrocelulosa o PVDF. Posteriormente, se bloquea la membrana para evitar la unión inespecífica a su superficie de los anticuerpos que se van a utilizar para la detección de la proteína de interés. En el siguiente paso, se une a dicha proteína transferida un anticuerpo especifico marcado con una enzima y, finalmente, se añade un sustrato apropiado para dicha enzima con lo que se produce un producto detectable como, por ejemplo, un precipitado cromogénico o fluorogénico en la membrana. En la actualidad, los métodos más sensibles emplean sustratos quimioluminiscentes que cuando se combinan con la enzima correspondiente, producen luz como producto final, que puede detectarse mediante una película o una cámara CCD. En todos los casos y sea cual sea el sustrato que se utilice, la intensidad de la señal se correlaciona con la cantidad del antígeno en la superficie de la membrana.

Método directo de detección: el anticuerpo primario marcado se une al antígeno de la membrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable.

Método indirecto de detección: el anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato.

En el método directo de detección, el anticuerpo primario que se utiliza para detectar el antígeno sobre la superficie de la membrana, debe ir marcado con una enzima o sonda fluorescente; no obstante, este método no es muy utilizado por diversas razones como posteriormente se puede ver en la tabla I. En el método indirecto, se añade primero un anticuerpo primario sin marcar contra el antígeno de la superficie de la membrana; posteriormente se añade un anticuerpo secundario marcado contra el anticuerpo primario. Los tipos de marcaje son diversos y variados y entre ellos se encuentran la biotina, las sondas fluorescentes como la fluoresceína o la rodamina, y las conjugados con enzimas como la peroxidasa de rábano (HRP) o la fosfatasa alcalina.

Tabla I. Comparación de los métodos de detección directo e indirecto

Detección Directa

Ventajas • Mucho más rápido ya que sólo se utiliza un anticuerpo.

• Se elimina la posible reacción cruzada del anticuerpo secundario.

• Se pueden detectar diferentes antígenos utilizando diferentes marcajes en diferentes anticuerpos primarios.

Desventajas • La inmunoreactividad del anticuerpo primario puede verse disminuida debido al marcaje.

• El marcaje de los anticuerpos primarios es muy cara y difícil.

• No hay flexibilidad en el marcaje del anticuerpo primario de un experimento a otro.


• Poca amplificación de la señal.

Detección Indirecta

Ventajas • Se incrementa la sensibilidad ya que cada anticuerpo primario posee numerosos epítopos a los que puede unirse en anticuerpo secundario marcado, lo que permite la amplificación de la señal.

• Hay disponibles comercialmente una gran variedad de anticuerpos secundarios marcados.

• No se afecta la inmunoreactividad del anticuerpo primario por el marcaje.

• Se pueden utilizar diferentes marcadores con el mismo anticuerpo primario.

Desventajas • Puede producirse reacción cruzada con el anticuerpo secundario, con lo que se obtienen marcajes inespecíficos.

• Es más lento ya que se necesita un paso extra de incubación.

Transferencia de las proteínas a la membrana.

Después de la separación electroforética de las proteínas por su peso molecular, éstas deben transferirse desde el gel de electroforesis a la membrana. En la literatura hay descritos una gran variedad de métodos para este proceso, como la difusión, la capilaridad, por vacío o por electroelución (o transferencia electroforética), aunque éste ultimo es el más ampliamente utilizado en la mayoría de las ocasiones por su rapidez y alta eficacia de transferencia.

Este método se basa en la movilidad electroforética de las proteínas para transferirlas desde el gel hasta la membrana e implica poner en contacto directo el gel de poliacrilamida con las proteínas con la membrana de nitrocelulosa o de cualquier otro material adecuado para la unión de las mismas, formando un sándwich entre dos electrodos sumergidos en una solución conductora.

Cuando se aplica un campo eléctrico, las proteínas migran fuera del gel de poliacrilamida hacia la superficie de la membrana donde quedan fuertemente adheridas, por lo que la membrana resultante es una copia exacta del patrón de proteínas que se tenia en el gel de poliacrilamida. La eficacia de la transferencia puede variar enormemente entre las diferentes proteínas


dependiendo de la capacidad de la proteína de migrar fuera del gel, su tendencia a unirse a la membrana, la composición del gel y si éste esta en completo contacto con la membrana o no, presencia de detergentes, etc., por lo que las condiciones óptimas de tiempo y voltaje de dicha transferencia deben calcularse empíricamente. No obstante, generalmente estas condiciones optimas se consiguen con tampones de baja fuerza iónica y bajos voltajes de corriente.

Después de la transferencia y antes de realizar el Western Blot propiamente dicho, es aconsejable teñir la membrana reversiblemente para comprobar la eficacia de la transferencia; aunque se podría teñir el gel para comprobar que no quedan proteínas en el mismo, esto no aseguraría que se ha producido la unión de las proteínas a la membrana. El rojo Ponceau es el reactivo más utilizado para la tinción reversible de las proteínas en una membrana, aunque tiene el inconveniente de que su sensibilidad es limitada.

Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos.

Es muy importante en un Western Blot bloquear los sitios de unión de la membrana sin reaccionar con el antígeno, para reducir la unión inespecífica de las proteínas durante los siguientes pasos del ensayo. En la actualidad se utilizan una amplia variedad de tampones de bloqueo (desde la simple leche o suero normal y corriente hasta proteínas altamente purificadas) para bloquear los sitios sin reaccionar de la membrana. Estos tampones de bloqueo, lo que hacen es incrementar la sensibilidad del ensayo reduciendo la interferencia por el ruido de fondo (background). Un problema adicional es que no todos los tampones de bloqueo son compatibles con todos los sistemas, por lo que están disponibles comercialmente una gran variedad de bloqueantes tanto en tampón TBS como PBS, dependiendo la elección del bloqueante más adecuado del propio antígeno así como de la enzima que se vaya a utilizar; por ejemplo, aquellos Western Blot en los que se vaya a utilizar fosfatasa alcalina como enzima de conjugación, se deben utilizar tampones bloqueantes en TBS ya que el PBS interfiere con la fosfatasa alcalina.

El tampón de bloqueo ideal se va a unir a todos los potenciales sitios de unión inespecífica de la membrana, eliminando todo el ruido de fondo sin alterar o bloquear los epítopos para la unión del anticuerpo primario. El parámetro fundamental a la hora de elegir un tampón de bloqueo es la llamada “relación señal:ruido“ que se mide como la señal obtenida con una muestra que contiene el analito diana en comparación con la obtenida con una muestra sin el analito en cuestión. Si se utiliza poca cantidad de tampón de bloqueo, obtendremos un ruido de fondo excesivo, con lo que se verá disminuida dicha relación señal:ruido, mientras que si se utiliza una cantidad excesiva, el tampón puede enmascarar las interacciones antígeno-anticuerpo o inhibir la enzima, con lo que se vuelve a observar una disminución de la relación señal:ruido. No hay reglas preestablecidas ni un tampón de bloqueo universal para todos los Western Blot, ya que cada pareja antígeno-anticuerpo tiene unas características y la verdadera optimización del paso de bloqueo para un Western Blot concreto se debe realizar empíricamente, probando diferentes tampones de bloqueo y a diferentes concentraciones hasta quedarnos con el que se obtenga mayor relación señal:ruido.

Lavado de la membrana.

Como otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una serie de pasos de incubación con diferentes reactivos (tampones de bloqueo, anticuerpos, etc.) separados por pasos de lavado. Estos lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no unidos y para reducir el ruido de fondo, ayudando a incrementar la relación señal:ruido. Un lavado insuficiente de la membrana ocasionara un elevado ruido de fondo, mientras que un exceso del mismo puede ocasionar una disminución de la sensibilidad debido al lavado del antígeno y/o anticuerpo de la membrana.

Para realizar estos lavados, se pueden utilizar una gran variedad de tampones: tampones fisiológicos como el TBS o el PBS sin más conservantes, aunque en la mayoría de las ocasiones se añade a los mismos un detergente como el Tween-20 (0,05%) para ayudar a eliminar el material unido inespecíficamente. Otra técnica muy utilizada es hacer los lavados con el propio tampón de bloqueo diluido al que se le ha añadido una cierta cantidad de detergente; esto suele ayudar a disminuir el ruido de fondo del ensayo.

Anticuerpos primarios y secundarios.

Lógicamente, la elección del anticuerpo primario para un Western Blot dependerá del antígeno que se desee detectar y de los anticuerpos disponibles para ese antígeno en concreto. En la actualidad hay una enorme cantidad de anticuerpos disponibles comercialmente que pueden encontrarse fácilmente mediante búsquedas a través de internet (www.antibody-resource.com, ó www.sciquest.com) o también se puede producir el anticuerpo específico para reconocer el antígeno de interés.

Se pueden utilizar tanto anticuerpos monoclonales como policlonales para realizar un Western Blot; los policlonales son bastante más baratos, se tardan menos en producir y normalmente tienen una elevada afinidad por su antígeno; los monoclonales son muy valorados por su gran especificidad, pureza y consistencia que originan un menor ruido de fondo. A veces se utilizan preparaciones crudas de anticuerpos como suero o fluido ascítico para realizar el Western Blot directamente, aunque tienen el problema de que las impurezas de la preparación incrementa el ruido de fondo. Para obtener anticuerpos con la mayor especificidad posible, pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando el propio antígeno inmovilizado.

De la misma manera, hay una gran variedad de anticuerpos secundarios marcados de diferentes maneras para la detección del Western Blot. Su elección depende de la especie en la que se haya obtenido el anticuerpo primario (la hospedadora); por ejemplo, si el anticuerpo primario es un anticuerpo monoclonal de ratón, entonces el secundario debe ser un anticuerpo anti-ratón obtenido en un hospedador diferente del ratón. Normalmente, la especie hospedadora del anticuerpo secundario no suele afectar al experimento aunque si el secundario origina un elevado ruido de fondo en un ensayo en particular, se debería elegir otra especie hospedadora de entre todas las disponibles.

Normalmente, para los Western Blot se suelen utilizar diluciones del anticuerpo secundario que varían desde 1:100 hasta 1:500.000, partiendo de una solución stock de 1 mg/mL. No obstante, de igual manera que ocurría con el tampón de lavado, la dilución optima de un anticuerpo dado para un determinado sistema de detección, debe determinarse


empíricamente ya que los sistema de detección más sensibles necesitan menores cantidades de anticuerpo, por lo que éstos se pueden utilizar a mayores diluciones, ahorrando así en los costes del anticuerpo que suele ser el de mayor importe de todos los reactivos necesarios para realizar un Western Blot; al mismo tiempo, además de ahorrar dinero, se reduce de manera muy importante el ruido de fondo ya que al utilizarse una cantidad menor de anticuerpo, se incrementa la sensibilidad por su diana con una elevada afinidad. Las diluciones se suelen realizar en el tampón de lavado con el agente de bloqueo y una pequeña cantidad de detergente, lo cual ayuda a disminuir el ruido de fondo.

Marcaje de anticuerpos.

La elección del anticuerpo secundario también depende del tipo de marcaje que se desee. Hace algunos años se utilizaban mayoritariamente los radioisótopos, pero eran muy caros, con una vida media muy corta, requieren una manipulación especial y no ofrecen ninguna mejora de la relación señal:ruido. Como marcajes alternativos, en los últimos años se han desarrollado los marcajes con biotina, fluoróforos o enzimas:

• El uso de fluoróforos requiere de menos pasos durante el proceso pero necesita de equipamiento especial para visualizar la fluorescencia, sobre todo si se desea tener un registro permanente de los resultados.

• El marcaje con enzimas se utiliza más ampliamente y, aunque necesita algunos pasos extra, suelen ser bastante sensibles. Las dos enzimas que más se utilizan son la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa de rábano (HRP) y hay una amplia variedad de sustratos cromogénicos, fluorogénicos y quimioluminiscentes disponibles comercialmente para cada enzima.

La fosfatasa alcalina es una enzima de 140.000 Da de tamaño que normalmente se aísla de intestino de carnero y que cataliza la hidrólisis de los grupos fosfato de la molécula de sustrato originando un producto coloreado, fluorescente o la liberación de luz como producto, tal y como se muestra en la figura; su actividad optima es a un pH básico (ph 8 – 10) y puede inhibirse con cianidas, arsenatos, fosfato inorgánico y quelantes de cationes divalentes como, por ejemplo, el EDTA. Su principal ventaja es que su tasa de reacción permanece lineal por lo que se puede incrementar la sensibilidad de la detección simplemente dejando la reacción durante más tiempo.

La peroxidasa de rábano es una proteína bastante más pequeña (40.000 Da de tamaño) que cataliza la oxidación de los sustratos por el peróxido de hidrógeno, originando un producto coloreado, fluorescente o la liberación de luz como producto. Su actividad óptima es a pH neutro y se inhibe por cianidas, sulfitas y azidas. Su gran estabilidad, bajo coste y gran disponibilidad de sustratos hacen que sea la enzima de elección para la mayoría de las aplicaciones.

Tabla II. Comparación de las enzimas HRP y AP

Peroxidasa de rábano (HRP) Fosfatasa alcalina (AP)

Tamaño: 40 kDa 140 kDa

Precio: Relativamente barata Relativamente cara

Estabilidad: Estable a <0°C Inestable a <0°C

Sustratos disponibles: Muchos Pocos

Cinética: Rápida Lenta

pH óptimo: 5 – 7 8 – 10

Sustratos cromogénicos.

Al igual que ocurre con el resto de componentes de un Western Blot, hay un gran número de sustratos disponibles comercialmente y su elección depende, entre otros factores, de la enzima utilizada (AP o HRP), la sensibilidad deseada y el método de detección o tipo de señal que se busque (colorimetría, fluorescencia, quimioluminiscencia, etc.).

Los sustratos cromogénicos son los más ampliamente utilizados y proporcionan el método de detección más barato y sencillo; cuando estos sustratos entran en contacto con la enzima correspondiente, se transforman en productos insolubles coloreados que precipitan sobre la membrana, por lo que no necesitan ninguna instrumentación especial para realizar la visualización de los resultados. Para la HRP los sustratos más utilizados son el TMB (3,3’,5,5’-tetrametil-benzidina), el 4-CN (4-cloro-1-naftol) y el DAB (tetrahidrocloruro de 3,3’-diaminobenzidina).


Para la AP, los más utilizados son el NBT (cloruro de tetrazolio nitro-azul), el BCIP (sal p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3’-indolilfosfato) y el Fast Red (fosfato de naftol AS-MX + sal Fast Red TR).

En la tabla III se comparan las propiedades de diferentes sustratos para Western Blot. Hay que destacar también que el comportamiento de un determinado sustrato puede variar drásticamente dependiente del fabricante del mismo ya que, éste se ve afectado por la concentración y pureza y por los aditivos y componentes del tampón que formen parte de la formulación del mismo.

Tabla III. Características de los sustratos para Western Blot.

Sustrato Medida ó color Dilución del Ac

(Sol. stock 1mg/mL) Sensibilidad Enzima

SuperSignal West Pico 425nm/quimioluminiscencia 1º: 1:1000 – 1:5000

2º: 1:20000 – 1:100000

1 pg HRP

SuperSignal West Dura 425nm/quimioluminiscencia 1º: 1:1000 – 1:5000

2º: 1:50000 – 1:250000

250 fg HRP

SuperSignal West Femto 425nm/quimioluminiscencia 1º: 1:5000

2º: 1:100000 – 1:500000

60 fg HRP

1-Step TMB Blotting Precipitado azul oscuro 1º: 1:500

2º: 1:2000 – 1:20000

1 ng HRP

1-Step 4-CN Precipitado azul púrpura 1º: 1:500

2º: 1:2000 – 1:20000

1 ng HRP

CN/DAB Precipitado negro 1º: 1:500

2º: 1:2000 – 1:20000

1 ng HRP

DAB Precipitado marrón 1º: 1:500 1 ng HRP


2º: 1:2000 – 1:20000

Metal enhanced DAB Precipitado marrón negruzco

1º: 1:500

2º: 1:2000 – 1:20000

20 pg HRP

1-Step NBT/BCIP Precipitado negro púrpura 1º: 1:500

2º: 1:2500

30 pg AP

1-Step NBT/BCIP + Supresor

Precipitado negro púrpura 1º: 1:500

2º: 1:2500

30 pg AP

NBT Precipitado azul púrpura 1º: 1:250

2º: 1:2500

100 pg AP

BCIP Precipitado azul púrpura 1º: 1:250

2º: 1:2500

100 pg AP

Fast Red Precipitado rojo 1º: 1:250

2º: 1:2500

320 pg AP

Lumi – Phos 440nm/quimioluminiscente 1º: 1:5000

2º: 1:25000

15 pg AP

El TMB, con un peso molecular de 240,4 Da se utiliza más frecuentemente para los ELISAs; sin embrago, en presencia de HRP y peróxido, se obtiene un producto soluble de color azul que puede precipitarse sobre una membrana; es adecuado para aplicaciones en las que se requiere una elevada relación señal:ruido. El 4-CN tiene un peso molecular de 178,6 Da y no es tan sensible ni estable como el TMB o el DAB pero su claro color azul púrpura diferente del resto de sustratos lo hace ideal para trabajar con él en aplicaciones de doble marcaje. El DAB tiene un peso molecular de 214,1 Da y da un precipitado insoluble de color marrón en presencia de peróxido y HRP; este color marrón puede intensificarse añadiendo metales como el níquel, cobre, plata y cobalto, con lo que se incrementa su sensibilidad. Las ventajas individuales del 4-CN y el DAB se suelen combinar en un solo sustrato mixto (sustrato CN/DAB) que tiene una sensibilidad excelente y da un precipitado negro oscuro muy fácilmente visualizable.

Para la detección colorimétrica con HRP debe añadirse al sustrato peróxido y debido a su extremadamente corta vida útil a la concentración que se utiliza, tradicionalmente se añade peróxido de hidrógeno al tampón, junto con el sustrato, inmediatamente antes de su uso; como consecuencia de esto, los sustratos sólo suelen tener una vida media de unas pocas horas.

El NBT tiene un peso molecular de 817,6 Da y pertenece al grupo de las sales de tetrazolio; después de su reducción, da un precipitado de color azul púrpura insoluble en agua que tiene la gran ventaja de ser lineal y estable con la concentración a lo largo de un enorme rango dinámico. El BCIP tiene un peso molecular de 433,6 Da y su hidrólisis por la AP origina un precipitado de color azul púrpura que se deposita en las membranas de nylon o nitrocelulosa. Otra combinación ideal para el Western Blot es la formada por el NBT y el BCIP ya que juntos originan un precipitado negro púrpura muy intenso con mucha mayor sensibilidad que cualquiera de ambos sustratos por separado; otra ventaja de esta combinación de los dos sustratos es que proporcionan bandas mucho más definidas y con mucho menos ruido de fondo. El Fast Red TR/AS-MX es un sustrato muy sensible que proporciona un precipitado rojo intenso, por lo que es ideal en aplicaciones de doble marcaje (en estos casos, es conveniente añadir la solución de Fast Red antes del sustrato de HRP para evitar la formación de excesivo ruido de fondo); el precipitado suele desaparecer cuando la membrana se seca, pero reaparece cuando ésta se rehidrata con agua.

Sustratos quimioluminiscentes.

El proceso de la quimioluminiscencia se define como la emisión de energía en forma de luz a partir de una sustancia, como consecuencia de una reacción química. El luminol es uno de los sustratos más ampliamente utilizados y su oxidación en presencia de peróxido, origina la formación de un producto en estado excitado llamado 3-aminoftalato, que al pasar a un estado de energía menor, emite fotones de luz.

Los sustratos quimioluminiscentes han ganado en popularidad durante la última década ya que ofrecen numerosas ventajas sobre los métodos tradicionales de detección, por lo que se han convertido en el método de detección de elección para la mayoría de los laboratorios:


• con la quimioluminiscencia se pueden hacer múltiples exposiciones de la membrana hasta conseguir la mejor imagen

• se puede lavar la membrana, eliminando por completo todos los reactivos para, posteriormente, volver a incubarlo para visualizar otra proteína u optimizar la detección de la primera

• también poseen una mayor rango lineal, lo que permite la detección cualitativa y cuantitativa en un mayor rango de concentraciones

• los sustratos quimioluminiscentes proporcionan la mayor sensibilidad de todos los métodos de detección existentes

Los sustratos quimioluminiscentes difieren de otros sustratos en que la luz detectada es un producto de transición de la reacción y no el producto final de la misma, por lo que éste esta solo presente mientras la reacción esta teniendo lugar. En una reacción quimioluminiscente, el sustrato es el reactivo limitante de la reacción y en cuanto que éste se acaba, termina la emisión de luz por ello es critico la optimización de la aplicación utilizando las concentraciones más adecuadas de anticuerpos primario y secundario; si hay mucho anticuerpo presente, el sustrato es utilizado muy rápidamente, por lo que la señal durara muy poco tiempo y además obtendremos mucho ruido de fondo y una baja sensibilidad del ensayo.

Captura de los datos.

Hay numerosos métodos para realizar la captura de los datos generados en un Western Blot con sustratos quimioluminiscentes; entre ellos, los más utilizados son las películas de autoradiografía o las cámaras CCD refrigeradas, que tienen la ventaja de permitir la manipulación en tiempo real de las imágenes, eliminar la necesidad de tener una cámara oscura y el equipamiento necesario para el procesamiento de las películas de autoradiografía, poseer una mayor sensibilidad y resolución y, sobre todo, tener un mayor rango dinámico que las películas de autoradiografía; no obstante, tienen la desventaja de que necesitan la utilización de sustratos quimioluminiscentes que produzcan una señal intensa y de duración suficiente para ser capturada por la cámara.

No obstante, aunque en los últimos años estos sistemas de captura de imágenes digitales van creciendo en popularidad al mismo tiempo que su tecnología mejora y sus precios bajan, la mayoría de los datos de los Western Blot con sustratos quimioluminiscentes se siguen obteniendo con las películas de autoradiografía. La mayoría de las veces es necesario exponer varias películas a diferentes tiempo de exposición para obtener la adecuada relación señal:ruido que permita ver correctamente los resultados; esto se debe a que el proceso no se puede ver a simple vista y, por lo tanto, solo se puede tener una aproximación inicial de cuál va a ser el mejor tiempo de exposición para un determinado Western Blot: si la película no se expone lo suficiente, la señal no será visible, pero si se expone demasiado tiempo, la señal puede verse diluida por el ruido de fondo y no observarse o bandas separadas pueden verse conjuntamente como una sola banda.

Marcadores de peso molecular.

Para la detección en cualquier Western Blot, es muy aconsejable la utilización de marcadores de peso molecular preteñidos, que se transfieren a la membrana conjuntamente con las proteínas de la muestra y permiten estimar del peso molecular de las bandas de las proteínas que se detecten al final del Western Blot.

Como ya se ha mencionado anteriormente, cuando se utilizan sustratos quimioluminiscentes en un Western Blot, las bandas de las proteínas se detectan en una película de autoradiografía o con equipos de imagen digitales, por lo que surge el inconveniente de que los marcadores de peso molecular no se pueden observar ya que no producen emisión de luz. Para solucionar este punto, en los últimos años se han desarrollado marcadores de peso molecular que poseen dominios de unión de la proteína A o G, los cuales capturan los anticuerpos utilizados como reactivos de detección en la posición de cada banda del marcador, por lo que permiten ser visualizados junto con los datos experimentales a la hora de hacer el revelado fotográfico.

Lavado y redetección de una membrana.

Una de las principales ventajas de la detección quimioluminiscente es la posibilidad de eliminar los reactivos (“stripping”) y volver a detectar (“reprobe”) la misma membrana; esto se debe a que el producto detectado es la luz y no un compuesto coloreado precipitado en la membrana. Una membrana puede ser lavada y vuelta a detectar muchas veces para visualizar otras proteínas o para optimizar la detección de la misma proteína variando las concentraciones de los anticuerpos primario y secundario sin necesidad de correr numerosos geles y realizar múltiples transferencias. La clave de este procedimiento es utilizar condiciones que provoquen la ruptura de la unión entre los anticuerpos y los antígenos sin que esto ocasiones una significativa liberación de dichos antígenos (proteínas de la muestra) de la membrana.

Se han descrito en la literatura diversos protocolos con este propósito y casi todos incluyen alguna combinación de detergentes, agentes reductores, calor y/o bajo pH, aunque debido a que cada unión antígeno–anticuerpo posee unas características únicas, no hay un método general ni que garantice la eliminación de todo el anticuerpo de la membrana al mismo tiempo que deja intacto todo el antígeno en la misma.

Después del proceso de lavado de la membrana, se debería comprobar que todos los reactivos de detección han sido eliminados; para ello, debe lavarse varias veces la membrana con agente bloqueante e incubada solamente con el anticuerpo secundario y el sustrato quimioluminiscente. Si el anticuerpo primario ha sido efectivamente eliminado de la membrana por el proceso de lavado, el anticuerpo secundario no debería unirse a la membrana por lo que no debería observarse señal alguna; si todavía se observan bandas en la membrana, debe repetirse el proceso de lavado en condiciones más intensas. Normalmente basta con incrementar el tiempo de la reacción de lavado o la temperatura, aunque a veces es necesario cambiar la composición del tampón de lavado o cambiar el protocolo completamente.

Técnicas relacionadas.

• Detección en el propio gel (“UnBlot® In-Gel Detection”). La principal razón para transferir y adsorber las proteínas a una membrana para su posterior detección con un anticuerpo es que las proteínas en la membrana se encuentran en la superficie y, por lo tanto, más accesibles a los anticuerpos que si estuvieran imbuidas en un gel de


poliacrilamida. No obstante, en los últimos años se ha desarrollado la posibilidad de realizar la detección de las proteínas dentro del propio gel sin perdida de sensibilidad; esta técnica conocida como “UnBlot® In-Gel Detection” elimina la necesidad de realizar los pasos de transferencia y bloqueo y, además, permite la detección de proteínas que no se transfieren con eficiencia desde el gel a la membrana y evita las perdidas de proteínas durante el propio paso de transferencia.

• Far-Western Blot Detection. Una modificación de la técnica de Western Blot es su utilización para la búsqueda de interacciones entre proteínas. La técnica “Far-Western Blot” utiliza una proteína marcada en lugar de un anticuerpo como sonda en la membrana, la cual reconoce y se une a las proteínas de la membrana a través de interacciones proteína–proteína, por lo que si se genera señal en la membrana, indica la presencia de una proteína que interacciona con la proteína-sonda y, además, que dicha proteína posee el peso molecular correspondiente a la banda donde se observa la señal. Este método se suele utilizar para buscar interacciones desconocidas entre proteínas o para confirmar posibles interacciones.

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