técnicas in vitro para la valoración espermatica en bovinos
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Técnicas in vitro para la valoración espermática en bovinos
Estudiante
Diego Fernando González Clavijo
Asesor
Dunia Yisela Trujillo Piso
MVZ, MSc, Phd©
SEMINARIO DE PROFUNDIZACIÓN EN REPRODUCCIÓN BOVINA VII COHORTE
UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IBAGUÉ – TOLIMA
2018
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Técnicas in vitro para la valoración espermática en bovinos
1 Diego Fernando González Clavijo
1. Estudiante De Medicina Veterinaria Y Zootecnia, Universidad Cooperativa De Colombia, Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia, Sede Ibagué – Espinal.
Resumen
La implementación de técnicas in vitro para la valoración espermática es
fundamental en la implementación de programas reproductivos con el fin de generar
el uso eficiente del semen bovino. Logra mejorar la probabilidad de generar
animales de alta calidad genética y tener proyección a un sexo determinado,
haciendo el uso de técnicas como Citometría de Flujo, Computer Assisted Semen
Análisis (CASA), Reacción Acrosómica in vitro con Heparina, y test de host, siendo
estos los de mayor transcendencia laboratorial y comercial, por su fácil manejo y
acceso rápido, igualmente por el alto porcentaje en efectividad de evaluación
espermática. El presente trabajo busca, a través de un análisis comparativo de
varias técnicas in vitro, establecer cuáles son las ventajas y desventajas en la
valoración espermática del semen bovino.
Palabras clave: Citometría, Semen, Reproducción, Andrologia.
Abstract
The implementation of in vitro techniques for sperm assessment is fundamental
in the implementation of reproductive programs in order to generate the efficient use
of bovine semen. It manages to improve the probability of generating animals of high
genetic quality and have projection to a specific sex, making use of techniques such
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as Flow Cytometry, Computer Assisted Semen Analysis (CASA), Acrosome
Reaction in vitro with Heparin, and host test, being These are of greater laboratory
and commercial importance, because of their easy handling and rapid access, also
due to the high percentage of sperm evaluation effectiveness. The present work
seeks, through a comparative analysis of several in vitro techniques, to establish
which are the advantages and disadvantages in the sperm valuation of bovine
semen.
Key words: Cytometry, Semen, Reproduction, Andrology.
INTRODUCCIÓN
Para poder garantizar que el semen bovino a emplear en una técnica como
fertilización in vitro o inseminación artificial sea de óptima calidad y los
espermatozoides cumplan las características requeridas es necesario realizar un
examen completo del potencial reproductivo del macho a colectar, este análisis
consiste en efectuar una exploración física, sanitaria y una evaluación básica
macroscópica y microscópica del eyaculado (In vitro) (Moron, 2015).
En la valoración espermática la calidad del semen va a depender de que
contenga un número suficiente de espermatozoides viables, morfológicamente
normales y funcionalmente competentes (Garcia, 2015) esto se determina por
técnicas In vivo (Inseminaciones) o In vitro (Técnicas en laboratorio)
Las características básicas que se valoran macroscópicamente son el
volumen, color y aspecto del eyaculado. El volumen se expresa en mililitros (ml) y
normalmente un toro joven puede eyacular aproximadamente 2 ml de semen, y en
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adultos puede ser ≥ a 4 ml pudiendo llegar hasta 12 ml. El color y aspecto seminal
optimo debe ser cremoso, puede variar en aspecto lechoso hasta completamente
claro siendo estos últimos indeseables, con esta característica se pueden identificar
anormalidades como semen de color rojizos o amarillentos, indicando muestras
contaminadas (Brito, 2017)
Las características básicas que se valoran microscópicamente son la Motilidad
masal e individual, indica la capacidad de movimiento de los espermatozoides, La
Morfología que es muy importante para que el espermatozoide desempeñe su
función biológica, cumpliendo su estructura típica de cabeza, cuello, parte
intermedia y cola (Nuñez, 2015). En las técnicas de valoración espermática in vitro
se pueden encontrar el sistema CASA, La citometría de flujo, la reacción acrosómica
con heparina, y el test de host; (Veloz, 2017) las cuales son automatizadas, fiables,
de fácil ejecución y elevada repetibilidad (Fernandez, 2005) que permiten al
veterinario, técnico y propietario conocer si el semen de su reproductor es apto o
no, además existe la posibilidad de predecir el sexo, siendo esta técnica de gran
importancia en el sector lechero demostrando un avance significativo (Larocca,
2017)
En el sector productivo los avances que se llevan a cabo en la reproducción
animal son muy relevantes, logrando determinar aspectos importantes como la
clasificación de los gametos que darán como resultado un sexo específico en las
especies de producción (Agûero, 2012), con el fin de dar un uso adecuado a los
diferentes sistemas, para el caso específico de las lecherías, va en pro de generar
hembras y en ganaderías de carne generar machos y algunas hembras para el
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reemplazo (Jiménez, 2011), De esta manera se da cumplimiento a muchas
exigencias por parte de los ganaderos que van en pro del uso de nuevas tecnologías
y realizan aportes de desarrollo productivo al gremio (Alfonso, 2011).
La implementación de nuevas tecnologías en la reproducción bovina es
importante para la salud, el mantenimiento y la calidad del producto que se estará
generando, la compra de pajillas o la adquisición de machos reproductores
(Cabrera, 2014) en un hato puede garantizar ejemplares de buenas características
genotípicas y fenotípicas para las producciones, y el gremio ganadero bovino,
dejando un material genético competitivo (Jiménez, 2011)
MARCO TEÓRICO
La evaluación de las técnicas para la valoración espermática puede llegar a
determinar la calidad seminal para eliminar aquellos eyaculados que puedan
presentar características no apropiadas para lograr pajillas de calidad (Aquino,
2017).
Los métodos in vitro están siendo utilizados frecuentemente por su economía
y su rapidez en comparación con los métodos in vivo. La calidad seminal con estos
métodos puede ser identificada pero no la fertilidad real. Estas pruebas deben ser
objetivas, precisas, rápidas, sencillas y de bajo costo. Con estas características se
desarrollaron las siguientes técnicas. el sistema CASA, La citometría de flujo, la
reacción acrosómica con heparina, y el test de host (Veloz, 2017).
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La valoración espermática es un método que día a día a estado tomando
fuerza, debido a su importancia en la producción de pajillas de mejor calidad, la
realización de semen sexado, la disminución de espermatozoides alterados (Trujillo,
2017), y otros beneficios en la reproducción bovina (Muiño, 2008)
CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo es una técnica que se basa en el recuento o
caracterización de células por medio de un citómetro, fue desarrollada en los años
50 cuando su fin era contar y caracterizar células sanguíneas, actualmente está
técnica representa un método rápido, objetivo y cuantitativo de análisis de células,
núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión (Izquierdo et
al, 2016)
La citometría de flujo es la principal herramienta en el sexaje de semen bovino,
por medio de la cual se hace la diferenciación de los espermatozoides con
cromosoma X y los que tienen el Y (Echeverry , 2015) logrando también determinar
algunas características morfológicas y fisiológicas de los mismos, y clasificando los
de mejor desempeño, y obteniendo cantidades de semen de óptima calidad y con
una probabilidad superior al 85% en producto final de la preñez con el sexo escogido
sea macho o hembra (Oliveira, 2009).
Los espermatozoides son sometidos a un colorante específico
(bisbenzimidazol, Hoechst 33342) que se fija de manera selectiva al ADN (Schenk
et all, 1999) que genera fluorescencia cuando es sometido a luz ultravioleta emitida
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por un láser de onda corta; la fluorescencia que emite el espermatozoide X es un 4
% mayor comparado con la emitida por el espermatozoide Y (Seidel, 2007).
Para detectar la diferencia de fluorescencia y separar los espermatozoides
deseados, se utiliza un citómetro de flujo. Consiste en un circuito cerrado de alta
velocidad de flujo de líquidos que permite alinear y “leer” los espermatozoides
individualmente en microgotas. La fluorescencia que produce cada espermatozoide
teñido es procesada por un software que permite al operador seleccionar la
población espermática con mínima o máxima luminosidad, según el sexo. Los
espermatozoides elegidos son cargados eléctricamente, desviados del flujo original
en un campo magnético y finalmente recolectados para su posterior congelación
(Teruel, 2009)
Esta técnica posiblemente sea la de mayor uso y desempeño en la
programación de sistemas de reproducción aplicados a diferentes ganaderías,
elevando sus índices de natalidad tanto de hembras para las lecherías, como de
machos para las de propósito cárnico (Ramirez et al, 2016), así se garantiza que los
tiempos de reemplazo y el crecimiento adecuado de los rebaños sea el indicado
para la región donde se establecerá y sus resultados sean favorables para el
productor (Franchini, 2016).
Igualmente es una de las técnicas con mayor antigüedad en la innovación
reproductiva, y que presenta en la actualidad el más alto índice de resultados
acertados con su finalidad (Magali, 2012), logrando que quienes han usado la
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técnica incrementen sus rebaños, también productivamente eleven sus tasas y
económicamente han sido favorecidos positivamente (Urruego, 2008).
Esta técnica es de las más seguras y que representa un gran porcentaje de
viabilidad del semen, ya que tiene una seguridad casi del 100% en tener
espermatozoides vivos y solo el 10% de estos podrían lograr ser el sexo no deseado
(Muiño, 2008), pero mayormente el resultado en los procesos reproductivos es
siempre el deseado, lo que infiere mucho en la productividad de los hatos y el
crecimiento favorable de los rebaños (Quintero, 2017), y se destaca en alta
proporción en la producción de animales genéticamente valiosos.
El citómetro de flujo evalúa la calidad, estructura, función y motilidad del
esperma luego de ciclos de congelación/descongelación; valorar daños en el
esperma y su calidad para la fertilización (Izquierdo et al, 2016) además el
porcentaje de daño espermático encontrado en los espermatozoides sexados
mediante citometría de flujo puede ser el doble o hasta el triple que los detectados
mediante microscopía de fluorescencia en los espermatozoides criopreservados de
la forma tradicional (Echeverry , 2015).
COMPUTER ASSISTED SEMEN ANÁLISIS (CASA)
El sistema de análisis computarizado asistido del semen se ha desarrollado
con el paso de tiempo y con relación a los diferentes métodos manuales que han
servido de ayuda como los son: videomicrografia, cinemicrografia, fotografía con
tiempo de exposición y fotografía con exposición múltiple, siendo el primero el más
acertado e implementado en el acoplamiento a sistemas computarizados dando
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como finalidad el CASA (Agûero, 2012), dando como resultado positivo el desarrollo
de un equipo que se encarga de medir características morfológicas y funcionales
del semen, que a su vez determina el porcentaje de viabilidad y efectividad fértil del
mismo (Urrego, 2005).
El sistema está conformado por una cámara de video conectada a un
microscopio de fases y a una computadora que digitaliza las imágenes del tamaño
y de los movimientos espermáticos. Las imágenes digitalizadas permiten analizar la
velocidad de las células, el movimiento rectilíneo, circular o lateral (Anchatuña,
2017)
Esta técnica de gran innovación a nivel laboratorial y tecnológico, ha logrado
garantizar a los diferentes productores e investigadores la herramienta con un
mayor porcentaje de efectividad y elección indicada en la estandarización del
manejo seminal de los animales (Almela, 2014), lo que es uno de los avances quizás
con mayor relevancia y el que cada vez cumple con mayores requerimientos
exigidos por el gremio reproductivo de bovinos, generando un incremento y
fortalecimiento del mismo (Farfán, 2015), al lograr producir pajillas, embriones y
fertilizaciones in vitro de calidad óptima y con garantías bastante prometedoras, que
se encargan cada vez mas de darle beneficios al sector pecuario, a nivel de
producción bovina (Medina, 2007).
Por medio de este proceso se busca determinar principalmente la motilidad de
los espermatozoides, lo cual es determinante para el tiempo de recorrido a la hora
de generar la fecundación y logra así, que las concepciones sean más probables
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(González, 2013), ya que este parámetro microscópico del semen se debe mantener
en el semen fresco y congelado, de tal forma que la calidad y la garantía que den
los productores de pajillas sea siempre la misma, sin importar el tiempo de
congelación que han tenido los espermatozoides (Bury, 2016).
Esta técnica se basa en la captura de imágenes para observar los
espermatozoides en movimiento, estas imágenes son digitalizadas identificando las
células espermáticas, luego se procede a observar los espermatozoides en
imágenes sucesivas para poder establecer las trayectorias definitivas de los mismos
(Barragán, 2017)
Las trayectorias se procesan matemáticamente, obteniendo así resultados
numéricos 22 precisos. Los parámetros determinados para cada espermatozoide
son la velocidad de movimiento sobre la base de varios descriptores, las trayectorias
que realiza la cabeza del espermatozoide y la frecuencia de los cambios de
dirección que efectúa (Hidalgo, 2005).
En el mercado existen variedad de sistemas CASA, desarrollando diferencias
en sus sistemas ópticos, técnicas de captura, reconocimiento espermático,
algoritmos para la construcción de trayectorias espermáticas, y manejo y análisis de
los datos obtenidos (Muiño, 2008) además Las desventajas del CASA están
relacionadas con el costo del equipo, la necesidad extrema de validación y la
normalización de las medidas realizadas (Hernandez, 2014)
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REACCIÓN ACROSÓMICA IN VITRO CON HEPARINA
Para llevar a cabo una evaluación espermática también se debe tener en
cuenta el índice de fertilidad de los espermatozoides, para eso la técnica de reacción
acrosómica con heparina es la más indicada (Cabrera, 2014). La heparina es una
sustancia que se encuentra a nivel oviductal y tiene como principal funcionalidad la
capacitación espermática y contribuir en la reacción acrosómica por medio de la
activación de las proteínas presentes en el acrosoma. (Fernández, 2014). De esta
forma, si se usa in vitro puede mejorar las tasas de fecundación en los bovinos
(Montes & et al, 2012)
Durante la capacitación se da la alteración de la membrana plasmática para
permitir al espermatozoide fusionarse a la membrana plasmática y membrana
acrosomal externa, denominada reacción acrosómica (In vivo), la capacitación
espermática es adquirida durante la migración de los espermatozoides a través del
tracto reproductivo de la hembra y la reacción acrosómica ocurre cuando los
espermatozoides se unen a la zona pelúcida. La técnica in vitro más utilizada
consiste en la exposición del semen a la heparina para que puede adquirir la
capacidad fertilizante (Salgado, 2005) se ha podido determinar que la concentración
de 10 µg/ml de heparina utilizada demuestra resultados óptimos para que los
espermatozoides sean activados (shamsuddin et al, 1996).
La heparina se une al espermatozoide de bovino a través de proteínas de
unión situadas en la membrana celular produciendo un aumento en la fosforilación
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de proteínas y en el Ca2+ libre que conlleva a un incremento del pH intracelular
(Risopatron et al, 2005)
Hasta el momento se ha indicado como la técnica más revolucionaria que
genera un porcentaje de determinación de fertilidad en machos con resultados
exitosos hasta de un 75% y a su vez logra establecer la capacidad de incremento
en la motilidad de los mismos, siendo un dato relevante a la hora de parametrizar
las características del semen usado en las pruebas (Ruiz, 2010), generando la
herramienta indicada para los poseedores de toros de valor genético bueno y
fabricación de pajillas para su correcto y exitoso desarrollo en el mercado (Salgado,
2005).
La capacitación espermática en bovinos, dada por la heparina, depende de su
concentración en el medio de incubación con tasas de fecundación in vitro sobre el
70%, utilizando dosis entre 10 µg/ml a 20 µg/ml de heparina (Reyes, 1992).
Investigaciones actuales demuestran que concentraciones de heparina de 10 ug/ml
y de semen de 1x106 espermatozoides/ml han arrojado las mejores tasas de
penetración de oocitos bovinos de manera in vitro observados en una resolución 4x
en el microscopio (Salgado, 2005) .
Finalmente el lograr un incremento en la determinación de los mejores
espermatozoides y sus características morfológicas, fisiológicas y de fertilidad sería
la mayor tecnología aplicada en la biotecnología de reproducción (MINITUBE,
2017), siendo muy relevante en la investigación de nuevos procesos y la
determinación del más adecuado para el avance en producción y eficiencia
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económica del sector ganadero tanto del país como de Latinoamérica, siendo
países con deficiente desarrollo comparado con Europa y Estados Unidos (Bury,
2016)
TEST HIPOSMÓTICO (Test de Host)
Su función es evaluar la integridad funcional de la membrana plasmática de la
célula espermática, considerando que el espermatozoide sea móvil y que sea capaz
de realizar la fecundación (Mejía Gutiérrez, 2017)
Esta técnica se basa en la observación de las alteraciones morfológicas que
sufren los flagelos de los espermatozoides (incremento de tamaño y flagelos
flectados o curvos) al ser expuestos a un medio hiposmótico, el cual ocasiona un
desequilibrio osmótico entre el medio extracelular e intracelular, situación que el
espermatozoide trata de vencer difundiendo agua al compartimiento intracelular,
aumentando la célula su volumen, lo cual se evidencia al observar la torsión de sus
flagelos en diferentes grados (Quintero et al, 2013)
Se debe preparar una solución con 0.735 gr de citrato de sodio, 1.35 gr de
fructosa y se disuelve en 100 ml de agua destilada y filtrar, agregar en un vial 1000
micro litros de solución hipo-osmótica y llevar a baño maría a 37 grados centígrados
por 15 minutos, adicionar a esta solución 50 micro litros de semen y llevar a baño
maría por 30 minutos colocar una muestra en un portaobjetos y contar (Barragán,
2017)
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CONCLUSIÓN
La efectividad en la valoración espermática genera un impacto altamente
positivo en la reproducción bovina y sus diferentes programas, como inseminación
artificial, transferencia de embriones y la conservación de semen de animales de
alto valor genético, lo que revoluciona en la actividad económica y con mayor
espacio de tiempo iniciara un mayor impacto, logrando llevar a las producciones a
fortalecer sus ámbitos reproductivos y conjuntamente un acrecentamiento
productivo que difícilmente sea medible o sus resultados sean exitosos, llevando a
la producción de rebaños con grandes características de rusticidad y productividad,
gracias al uso de tecnologías de desarrollo pecuario y su importancia en las
ganaderías mundiales
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