taller del laboratorio clÍnico
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CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A DISTANCIA
TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO
EL SÍNDROME X FRÁGIL
CURSO 2007 - 2008 Nº 5
I.S.S.N.- 1988-7469 Título: Taller del Laboratorio Clínico Editor: Asociación Española de Biopatología Médica Maquetación: AEBM Fecha de Distribución: Marzo 2008
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SÍNDROME X FRÁGIL
Natalia Casasola Luna. -Química interna residente R4. Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Universitario De La Princesa. Madrid.
Concepción Alonso Cerezo.- Facultativo Especialista de Área. Unidad de Genética. Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Universitario De La Princesa. Madrid
1. EL SÍNDROME X FRÁGIL
El síndrome del cromosoma X frágil (SXF) [OMIM 300624] explica aproximadamente
la mitad de casos de retraso mental ligado al cromosoma X, siendo la segunda causa
de retraso mental tras la trisomía 21 o síndrome de Down. Su prevalencia se estima
en uno de cada 4000 varones y una de cada 8000 mujeres. En el caso de mujeres
portadoras, se realizó un estudio en Canadá que establecía la prevalencia en una de
cada 259 mujeres. Estudios posteriores fijaron que en el caso de hombres portadores
la prevalencia era de 1/760. (1,2,3)
Se transmite de forma dominante ligado al cromosoma X, con penetrancia
incompleta (80% de los varones presentan retraso mental y sólo el 30% de las
mujeres) y expresividad variable (diferente expresión clínica). (4)
Se caracteriza por retraso mental, macroorquidia postpuberal y características
faciales típicas como cara alargada, orejas grandes y mandíbula inferior prominente.
Se describe por primera vez en 1943 por Martin y Bell como una alteración mental
ligada al sexo (5). La correlación con una alteración citogenética fue descrita en 1969
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por Lubs, que identificó un cromosoma X marcador en diversos varones afectados,
cuyas células había cultivado en un medio pobre en ácido fólico (6). En aquel
momento, el marcador se definió como un pequeño satélite separado del final del
brazo largo del cromosoma X por una constricción del material genético. En 1977,
Sutherland publica que la manifestación del lugar frágil en el cariotipo depende del
medio de cultivo. (7)
En 1991, varios grupos identificaron el gen responsable. El síndrome X frágil está
causado en más del 99% de los casos por expansiones de una secuencia repetida
CGG (citosina-guanina-guanina) localizada en la zona no traducida de la región
promotora (exón 1) del gen FMR1 (Fragile X Mental Retardation) y que es variable en
la población. (8,9)
El gen FMR1 codifica la proteína FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein), que se
encuentra muy disminuida o ausente en los individuos afectos. La FMRP es una
proteína ubicuitaria, intracitoplasmática, que se expresa en diferentes tejidos, pero
que es más abundante en las neuronas. Su función es el transporte del ARN y de
otras proteínas desde el núcleo de la célula al citoplasma. Su ausencia pueda afectar
al funcionamiento de diversas proteínas, lo que se traduce en la variabilidad de las
manifestaciones fenotípicas. (10)
2. BASES GENÉTICAS
El gen FMR1 está situado en el locus Xq27.3, en la región FRAXA. Ocupa 38 Kb del
DNA genómico y está formado por 17 exones y 16 intrones, con una secuencia
repetitiva CGG en el extremo 5’ del primer exón. (11)
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La secuencia genética relacionada con el síndrome X frágil puede presentarse de
cuatro formas o estados principales: normal, “zona gris” o intermedia, premutación y
mutación completa, dependiendo del número de repeticiones CGG que contenga.
(Tabla 1)
ESTADO Nº REPETICIONES
NORMAL 5 - 40
INTERMEDIA o “ZONA GRIS” 41 - 58
PREMUTACION 59 - 200
MUTACION COMPLETA >200
Tabla 1. Categorías de los alelos dependiendo del nº de repeticiones (11,31)
La zona de repeticiones de tripletes CGG es polimórfica en la población,
distribuyéndose según una curva de Gauss con extremos entre 5 y 40 tripletes,
siendo los alelos de 29 y 30 repeticiones los más frecuentes.
No existe consenso sobre los límites de la llamada “zona gris”. Históricamente, el
límite superior se fijaba en 54, considerando el intervalo 55-58 como potenciales
premutaciones. Al no existir ningún caso publicado de expansión de tripletes por
debajo de 58, parece que podría incluirse este intervalo en la zona intermedia.
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Una expansión del triplete entre 59 y 200 repeticiones implica un estado de
premutación. Estos alelos contienen repeticiones relativamente largas que en general
se transmiten de forma inestable de padres a hijos. Los individuos con premutación
pueden presentar algunos rasgos clínicos.
Finalmente, por encima de 200 repeticiones nos encontramos ante una mutación
completa. Los individuos con mutación completa presentan la clínica del síndrome X
frágil, y suelen tener de varios cientos a varios miles de repeticiones CGG. El tamaño
de la expansión no está asociado con la severidad de la clínica. (13)
Cuando existe alguna alteración, la secuencia repetitiva CGG es muy inestable y
tiende a expandirse de una generación a la siguiente según el fenómeno de
anticipación, lo que implica que un individuo con una premutación (portador) puede
tener descendencia con la mutación completa.
La tendencia de la expansión a aumentar depende de la estabilidad o inestabilidad
que presente el fragmento CGG en la segregación de padres a hijos. Así, un
fragmento estable será aquel que no aumenta su tamaño al pasar a la generación
filial. Por la misma razón, un fragmento inestable será el que varía su número de
repeticiones CGG en la transmisión de padres a hijos.
La presencia de interrupciones AGG dentro de la secuencia repetida CGG confiere
estabilidad al alelo normal. Así, los alelos más estables serán aquellos que presenten
interrupciones AGG cada 9-10 repeticiones CGG.
Las expansiones del fragmento CGG por encima de las 200 repeticiones producen
una metilación de la isla CpG adyacente, con un silenciamiento en la expresión del
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gen y en consecuencia una alteración en el nivel de codificación de la proteína, cuya
ausencia se traduce en el fenotipo X frágil. La función de esta proteína no se conoce
con exactitud, pero se sabe que tiene dominios muy conservados de unión a RNA y
que se expresa en casi todos los tejidos, aunque más abundantemente en el cerebro.
La metilación es un factor clave en este síndrome. En las premutaciones, la isla CpG
del promotor no se encuentra metilada.
No se conoce el mecanismo de la metilación de novo del promotor como
consecuencia de la expansión de los tripletes por encima de unos 200, pero se
propone que las estructuras en horquilla que forman las secuencias largas de CGG
constituyen buenos sustratos para la metilación. También se especula con un
mecanismo defensivo para mantener en silencio el DNA repetitivo. (14,15)
Menos del 1% de los individuos con síndrome X frágil presentan otras alteraciones
del gen FMR1 diferentes a la expansión, que incluyen deleciones y mutaciones
puntuales. La existencia de individuos afectos con deleciones del gen FMR1 ha
confirmado que la causa del síndrome es la falta de expresión del gen FMR1, y por
tanto la ausencia de proteína FMRP.
Es importante realizar el diagnóstico diferencial con un segundo locus frágil
denominado FRAXE en la región Xq28, en el que existe una expansión de un triplete
CGG en el gen FMR2, que da lugar a un retraso mental menos grave que el de la
región FRAXA. (16)
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3. CLÍNICA
3.1. Varones con mutación completa
El hallazgo fundamental de síndrome de X frágil es el retraso mental, que en los
varones afectados es de grado moderado. Las manifestaciones neurológicas son
múltiples, incluyendo trastornos del desarrollo, de conducta, en la integración
sensorial o del sueño y epilepsia.
Los hallazgos clínicos en los varones con mutación completa varían en relación a la
edad y al estadio puberal. En los primeros años de la vida se manifiesta por
hiperactividad y retraso en la adquisición de las funciones psicomotoras,
especialmente el lenguaje, que posteriormente es repetitivo. En edad preescolar
pueden no ser evidentes los rasgos físicos que se manifiestan en edades posteriores,
como la cara alargada, frente prominente, pabellones auriculares grandes y
macrognatia. Los varones prepuberales suelen tener un crecimiento normal, excepto
su perímetro cefálico, que está por encima del percentil 50. En varones puberales es
característico el macroorquidismo.
Con la edad también se hacen evidentes alteraciones oftalmológicas,
osteoarticulares, otorrinolaringológicas y cardiológicas, debidas a la displasia del
tejido conectivo.
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3.2. Mujeres con mutación completa
En cuanto a mujeres portadoras de mutación completa en heterocigosis, existen
casos de niñas con fenotipo semejante a los niños, pero son raros. Lo más frecuente
es que no haya ningún rasgo físico característico, y que se manifieste sólo un ligero
retraso mental, con trastornos de conducta (aislamiento, angustia social, timidez) y
con problemas sobre todo en el área del lenguaje y de las matemáticas. (10)
3.3. Hombres con premutación
La presencia de la premutación del gen FMR1 en hombres se relaciona con el
síndrome de ataxia/temblor asociado a X frágil (Fragile X-associated Tremor/Ataxia
Syndrome, FXTAS), que se caracteriza por su aparición tardía, ataxia cerebelar
progresiva y temblor. Otros hallazgos neurológicos son pérdidas de memoria a corto
plazo, déficit en la función motora, descenso cognitivo, Parkinson, neuropatía
periférica y debilidad muscular. (17)
La penetrancia está relacionada con la edad; los síntomas aparecen en el 17% de los
varones entre 50-59 años, en el 38% de varones entre 60-69 años, en el 47% entre
70-79 años y en el 75% a partir de los 80 años. (3)
3.4. Mujeres con premutación
En mujeres premutadas, la disfunción endocrina es el fallo ovárico prematuro (FOP),
con menopausia precoz, antes de los 40 años. (18)
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En la actualidad no existe consenso en la estimación del riesgo absoluto de FOP
cuando una mujer es portadora de una premutación. Una revisión del 2005 concluye
que el riesgo de FOP es del 21% (estudios previos daban valores entre 15 y 27%) en
las mujeres premutadas mientras que se establece un riesgo del 1% para la
población general. (1,3)
Sin embargo, cuando se estudia a mujeres portadoras de mutación completa, no se
observa la relación del FOP con el síndrome X frágil. Por el momento se desconoce
la razón de la asociación existente entre la premutación en el gen FMR1 y el fallo
ovárico precoz.
Se debe informar a toda mujer portadora de la premutación de que tiene una
probabilidad superior a la población general de tener menopausia antes de los 40
años, y por lo tanto su edad reproductiva podría finalizar prematuramente y debería
programar su descendencia antes de los 30-35 años. (19)
Por otro lado, algunas mujeres con premutación pueden también desarrollar ataxia y
temblor, similar a los hombres portadores de premutación.
4. DIAGNÓSTICO
El diagnóstico de este síndrome se realiza por la clínica y por métodos citogenéticos y
moleculares. (20)
El American College of Medical Genetics recomienda realizar un estudio genético del
síndrome X frágil en los siguientes casos: (1)
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a) Individuos de ambos sexos con retraso mental, retraso en el desarrollo o autismo,
especialmente si tienen (1) cualquier característica física o del comportamiento típica
del síndrome X frágil, (2) historia familiar de X frágil, o (3) familiares con retraso
mental no diagnosticado.
b) Individuos que acuden a consejo genético con una historia familiar de (1)
síndrome X frágil o (2) retraso mental no diagnosticado, y que desean tener
descendencia.
c) Fetos de madres portadoras conocidas.
d) Individuos afectos o sus familiares con un estudio citogenético previo con
resultado positivo.
4.1. CITOGENÉTICA
Consiste en la detección de la fragilidad del cromosoma X en la
banda q27.3, empleando cultivos de linfocitos en medios
deficientes en ácido fólico. La zona frágil se observa como una
zona separada del final del brazo largo del cromosoma X por
una constricción del material genético (Figura 1).
Figura 1. Presencia del sitio frágil en el cromosoma X.
No obstante, la fiabilidad del estudio citogenético se limita a los varones afectos, ya
que en el caso de las mujeres existen muchos falsos negativos.
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Actualmente no se acepta como método diagnóstico, si no va acompañado del
estudio molecular.
4.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
A partir del descubrimiento del gen FMR1, se emplean métodos directos de
diagnóstico molecular como el Southern blotting y la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
4.2.1. Diagnóstico por la técnica de Southern
La técnica de Southern se basa en la digestión del DNA genómico con las enzimas de
restricción adecuadas, la separación de los fragmentos por electroforesis en el gel de
agarosa, la transferencia a una membrana de nylon y la hibridación con una sonda
marcada.
Después de hibridar con la sonda se obtiene en los individuos normales un fragmento
de 5,2 Kb. En el caso de afectados y portadores la banda tendrá un tamaño superior
a 5,2 Kb, pudiéndose determinar el tamaño de la amplificación.
Esta técnica es capaz de determinar alelos en todos los rangos de expansión, pero no
es posible realizar una medida exacta del tamaño, sino solamente una aproximación
del mismo.
Por otra parte, es importante conocer el estado de metilación de la isla CpG próxima
a FRAXA que va a determinar en gran medida la expresión del gen FMR1 y por lo
tanto la manifestación clínica del síndrome. Para conocer el estado de metilación de
la isla CpG se hace una doble digestión en la que una de las enzimas de restricción
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es sensible a la metilación. Los patrones obtenidos en cada caso se resumen en
laTabla 2.
Paciente Nº bandas Tamaño Observaciones
VARÓN NORMAL 1 2,8 Kb Cromosoma X normal
VARÓN PREMUTADO 1 >2,8 Kb El incremento está relacionado con el tamaño de la
premutación
VARON CON MUTACIÓN 1 >5,2 Kb Cromosoma X con mutación y metilado
2,8 Kb Cromosoma X activo (sin metilar)
MUJER NORMAL 2
5,2 Kb Cromosoma X inactivo (metilado)
MUJER PREMUTADA Variable El alelo premutado suele repartirse al azar entre el X activo y el
inactivo, por lo que suelen aparecer 4 bandas de intensidad variable
>5,2 Kb Cromosoma X con mutación y metilado
MUJER CON MUTACIÓN 2
2,8 ó 5,2 Kb Dependiendo si el cromosoma X normal está metilado o no
Tabla 2. Bandas obtenidas por Southern para cada tipo de paciente
Es importante a la hora de valorar los datos de laboratorio conocer la frecuencia
relativamente alta de patrones mosaicos en este síndrome, pudiendo aparecer en un
mismo sujeto bandas de diferentes tamaños y estados de metilación.
A pesar de ser el método de referencia, el Southern presenta dificultades técnicas
que lo hacen muy largo y laborioso, y sus dificultades de interpretación requieren de
profesionales expertos en el diagnóstico del síndrome X frágil.
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4.2.2. Diagnóstico por reacción de cadena de la polimerasa (PCR) (21)
Utilizando cebadores específicos, la técnica de la PCR permite amplificar la zona de
los CGG y conocer con exactitud el número de tripletes, hasta un límite de unas 100
repeticiones.
La determinación exacta del tamaño del fragmento amplificado debe realizarse con
una electroforesis en gel de poliacrilamida y corriendo en paralelo con un marcador
de tamaños o bien una muestra con un número conocido de CGG.
Las condiciones de la PCR, la temperatura de cebamiento y el número de ciclos
dependen de los cebadores y de la enzima que se vayan a utilizar.
La principal limitación de la técnica de la PCR es que los alelos con un elevado
número de repeticiones CGG son muy difíciles de amplificar y no lo consigue en
aquellos alelos que están por encima de unas 100 o más repeticiones. De este modo,
los alelos con la mutación completa podrían aparecer como falsos negativos, por lo
que es necesario combinar el estudio de PCR con el análisis de Southern. Por esta
razón, se recomienda la combinación de ambas técnicas para un correcto
diagnóstico.
En el caso de fetos femeninos en los que tanto por Southern como por PCR del
triplete CGG presenten una sola banda, es necesario utilizar las técnicas de PCR de
microsatélites cercanos. Es una técnica sencilla, sin problemas de amplificación y su
visualización es muy clara. Puede diferenciar perfectamente aquellas mujeres
heterocigotas cuyos alelos difieren en una sola repetición. Sin embargo, como
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pueden existir recombinaciones, debe considerarse únicamente como una ayuda, y
no como una técnica diagnóstica en sí misma.
4.2.3. Secuenciación
Es necesario secuenciar el gen FMR1 en los individuos con síndrome X frágil en los
que no se observa una expansión del triplete CGG, para la detección de posibles
deleciones o mutaciones puntuales. Estos pacientes suponen menos de 1% del total.
4.3. ANÁLISIS DE LA PROTEÍNA FMRP (Fragile X Mental Retardation
Protein)
En 1995 se publicó la técnica para determinar la expresión de la proteína FMRP,
mediante el análisis inmunohistoquímico en los linfocitos de la sangre periférica. A
partir de este trabajo quedan abiertas nuevas vías de diagnóstico, valorando la
expresión de la FMRP no sólo en sangre, sino en otros tejidos, y ayudando a un
mejor conocimiento de la fisiopatología del síndrome.(22,23)
La medida de la expresión de la proteína FMRP puede ser útil en el cribado de
pacientes con retraso mental y en la caracterización de la producción celular de
FMRP en individuos con fenotipo atípico. Se ha propuesto la utilización de la
expresión de la proteína FMRP como potencial factor pronóstico de severidad de la
enfermedad debido a la correlación observada entre esta magnitud y el fenotipo X
frágil. (3,24)
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5. DIAGNÓSTICO PRENATAL (25,26)
El diagnóstico prenatal se realiza en células del líquido amniótico alrededor de la
semana 15 de gestación o en las células de las vellosidades coriónicas entre las
semanas 10 y 12 del embarazo.
Las técnicas moleculares presentan algunas dificultades técnicas en el diagnóstico
prenatal, como por ejemplo la frecuente ausencia de metilación en los tejidos
extraembrionales, como son las vellosidades coriales. En caso de obtener un
resultado ambiguo, habría que recurrir a la realización de la amniocentesis.
La determinación previa del tamaño de los alelos de los padres es fundamental para
la interpretación de los resultados:
• En el análisis con PCR de un feto varón, si se observa el alelo materno se
predice un sujeto normal para ese locus.
• En el caso de un feto femenino, si los alelos de los padres tienen diferentes
tamaños en los alelos, y ambos se encuentran en la muestra fetal, se
corresponderá también con un sujeto normal. Si se observa sólo el
cromosoma normal del padre el feto ha heredado el cromosoma X frágil, ya
que el alelo materno no aparecería porque tiene un tamaño demasiado grande
para ser observado por PCR.
Cuando los padres comparten el tamaño del alelo normal, y sólo se observa
una banda, ésta puede ser la del padre, y estaríamos ante un feto afecto, o
puede deberse a un estado de homocigosis, y que la banda correspondiera
tanto al alelo del padre como al de la madre, por lo que no estaría afectado.
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Para analizar la existencia del posible alelo mutado habría que realizar el
estudio por Southern.
En el análisis molecular prenatal pueden darse dos situaciones comprometidas:
cuando en un feto varón se detecta un número de repeticiones correspondientes a
un estado de premutación, o en un feto femenino portador de una mutación
completa, ya que en estos casos no se puede predecir si presentará o no retraso
mental.
En la actualidad es posible efectuar el diagnóstico preimplantacional. La técnica se
basa en el estudio genético de embriones fecundados in vitro y la elección y
transferencia al útero de aquellos que no estén afectados por la mutación ni la
premutación. Otra opción es el diagnóstico preconcepcional, técnica diagnóstica
basada en el estudio genético del óvulo antes de la fertilización y la posterior
fecundación in vitro de los óvulos sanos. (19)
6. CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO
La correlación entre el genotipo y el fenotipo se resume en la tabla 3.
TIPO DE MUTACIONES DEL GEN FMR1
Tipo de mutación PREMUTACION MUTACION
COMPLETA MOSAICISMO MOSAICISMO METILADO
MUTACION COMPLETA
NO METILADA
Nº de (CGG)n 59-200 >200 Variable >200 >200
Estado de metilación
de gen FMR1
No metilado Completamente metilado Parcial Parcial No metilado
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Fenotipo varones
Usualmente no afectados. Riesgo de
FXTAS
100% afectados
100% afectados pero con
síntomas más leves que mutación completa
100% afectados pero con
síntomas más leves que mutación completa
Alto % de afectados
Fenotipo mujeres
Generalmente no afectadas. Riesgo de FOP
y FXTAS
50% afectadas, 50% no
afectadas Muy variable Muy variable Muy variable
Tabla 3. Correlación entre genotipo y fenotipo (11,24,31)
El término mosaicismo se aplica a la coexistencia de la premutación y la mutación
completa en un mismo individuo. Se estima que la frecuencia de estos mosaicismos
es del 15-20% de los individuos con mutaciones en FMR1.
También hay mosaicos de metilación, en los que pacientes que presentan mutación
completa tienen diferentes líneas celulares en las cuales el gen FMR1 está
parcialmente metilado o incluso no metilado, y por tanto pueden tener algún grado
de expresión de la proteína FMRP. Se ha propuesto que la metilación variable en el
locus FRAXA es responsable de la diversidad fenotípica del síndrome.
7. CONSEJO GENÉTICO (3)
7.1. Padres de un paciente afecto
- La madre de un individuo con mutación completa del gen FMR1 es portadora de
una premutación o mutación completa.
- En caso de una mujer con premutación, o bien su padre o bien su madre son
portadores de premutación.
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- En caso de un varón con premutación, su madre es portadora de un premutación
7.2. Hermanos de un paciente afecto
El riesgo de los hermanos depende de su sexo, del sexo del progenitor portador y del
tamaño del alelo expandido en el padre portador.
7.3. Descendencia de un individuo con mutación completa
- Los varones con mutación completa tienen retraso mental y generalmente no se
reproducen.
- Las mujeres con mutación completa tienen aproximadamente un riesgo del 50% de
tener retraso mental, dependiendo de la inactivación del cromosoma X. Tanto si
presentan manifestaciones fenotípicas como si no, su descendencia tiene un riesgo
del 50% de heredar la mutación completa.
7.4. Descendencia de un individuo con premutación
- Los hombres portadores de premutación son considerados “hombres transmisores”.
Todas sus hijas heredan la premutación y ninguno de sus hijos. Cuando la
premutación es transmitida por el padre, se dan expansiones pequeñas en el número
de repeticiones de trinucleótidos y no suelen ser mutaciones completas.
- Las mujeres portadoras de premutación tienen un riesgo del 50% de transmitir un
alelo anormal (premutación o mutación completa) en cada embarazo. El riesgo de
que la premutación de la madre pase a mutación completa en su descendencia está
relacionado con el tamaño del número de repeticiones CGG en la premutación y con
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las interrupciones de la expansión de CGG por tripletes AGG ocasionales. Como la
presencia de repeticiones AGG no se examina en los laboratorios clínicos, el riesgo se
calcula únicamente en base al número de repeticiones CGG en la premutación de la
madre. El riesgo oscila desde el 5,3% con 60-69 repeticiones, el 31.1% con 70-79
repeticiones, a cercano al 100% a partir de 100 repeticiones.
7.5. Descendencia de un individuo con un alelo en la zona intermedia
La descendencia de un individuo de la “zona gris” puede tener una variación mínima
en la zona de repetición (como por ejemplo el cambio de 1 ó 2 tripletes), y tienen un
riesgo insignificante de estar afectados. Parece ser que los alelos con 50 a 58
repeticiones pueden ser de alguna forma más inestables que los de menos de 50
tripletes, por lo que teóricamente podrían convertirse en premutaciones en
generaciones sucesivas. Por esto se establece un riesgo bajo pero algo mayor que la
población general.
7.6. Otros familiares de un individuo afecto
Se debe realizar el estudio genético a todas las personas de la familia potencialmente
portadores.
8. TRATAMIENTO
En la actualidad, el tratamiento médico que puede ofrecerse es sintomático,
abordando los diferentes trastornos que presente cada caso.
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La posibilidad de reactivar el gen se intuye como una forma de terapia para este
síndrome, siempre que se encuentre el modo de hacerlo sin afectar otros genes
inactivos fisiológicamente por metilación. (28)
Las líneas de investigación actuales en el campo de la genética se centran en
encontrar las vías de reactivación más efectivas así como en el estudio de la acción
de la proteína FMRP, en vías de poder desarrollar una terapia génica.
88
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