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IDENTIFICACIN DESalmonel laGallinarum y Salmonel laPullorum EN POLLO DEENGORDE DE LA LINEA ROSS 308

JOSE ANDERSSON PIEROS GORDILLOMANUEL ARTURO RODRIGUEZ VASQUEZ

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IDENTIFICACION DESalmonel laGallinarum y Salmonel laPullorum EN POLLO DEENGORDE DE LA LINEA ROSS 308

JOSE ANDERSSON PIEROS GORDILLOMANUEL ARTURO RODRIGUEZ VASQUEZ

Trabajo de grado presentado para optar el ttulo de Zootecnista

Di t

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DIRECTIVAS

HERMANO CARLOS GABRIEL GMEZ RESTREPO F.S.CRECTOR

HERMANO FABIO CORONADO PADILLA F.S.CVICERRECTOR ACADEMICO

HERMANO CARLOS ALBERTO PABN MENESES F.S.CVICERRECTOR DE PROMOCIN Y DESARROLLO HUMANO

HERMANO MANUEL CANCELADO JIMENEZ F.S.CVICERRECTOR DE INVESTIGACIN Y TRASFERENCIA

DOCTOR EDUARDO ANGEL REYESVICERRECTOR ADMINISTRATIVO

DOCTORA PATRICIA INES ORTIZ VALENCIA

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APROBACION

_______________________________________DOCTOR RAFAEL IGNACIO PAREJA MEJIADIRECTOR DEL PROGRAMA

______________________________________DOCTOR ALEJANDRO TOBON GONZALEZASISTENTE ACADEMICO

______________________________________DOCTOR JAVIER GMEZDIRECTOR DEL TRABAJO DE GRADO

______________________________________DOCTORA RUTH RODRIGUEZ ANDRADE

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AGRADECIMIENTOS

A Dios por permitirnos terminar nuestra carrera.

A nuestros padres por su apoyo, por su confianza y ayuda durante toda la carrera.

A nuestro director de tesis, Doctor Javier Eduardo Gmez, por sus conocimientos y laasesora brindada para el desarrollo de este proyecto.

A la Universidad de la Salle por el apoyo brindado para que este proyecto se realizara.

A Rosario Santos, por su ayuda y colaboracin incondicional durante las pruebas delaboratorio requeridas para este proyecto.

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DEDICATORIA

A Dios por su ayuda espiritual.

A nuestros padres por su paciencia confianza y ayuda brindada a lo largo de

nuestra vida.

A todos nuestros amigos que estuvieron con nosotros en toda nuestra carrera.

Jose Andersson Pieros Gordillo

Manuel Arturo Rodriguez Vasquez

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IDENTIFICACION DE Salmonella Gallinarum Y Salmonella Pullorum ENPOLLO DE ENGORDE DE LA LINEA ROSS 308

RESUMEN

La avicultura de nuestro pas ha venido sufriendo un problema de gran relevancia,

consistente en la aparicin de una enfermedad denominada cientficamente como

salmonelosis, la cual origina problemas patolgicos que ocasionan principalmente

alteraciones en los parmetros zootcnicos de las aves, situacin que constituyeperdidas enormes en las empresas avcolas.

En la dcada de los ochenta se produjo un aumento en los casos de salmonelosis

humana trasmitida por los alimentos. La principal fuente fueron los productos avcolas.

Esto creo una gran desconfianza para los consumidores, provocando que no

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resultados obtenidos se analizaron por medio de estadstica descriptiva mostrando la

presencia de Salmonella Spp en un 80,42 %, Proteus Spp 11,67%, Enterobacter

Cloacae 5.83%, Klebsiela Spp 2,08 % y la ausencia de Salmonella Gallinarum y

SalmonellaPullorum en estas aves.

PALABRAS CLAVES:Aislamiento, Identificacin, Salmonella, Pollos.

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ABSTRAC

The poultry industry of our country has been facing a problem of great importance,

namely the emergence of a disease known scientifically as salmonella, which causes

problems mainly caused pathological changes in the zootechnical parameters of birds,presenting huge losses in the poultry companies.

In the eighties there was an increase in human salmonellosis cases of foodborne. The

main source was poultry products. This created a great distrust for consumers, causing

them not to buy these products for prevention. It also generates difficulties for domestic

poultry farmers to compete in foreign markets. Because of all this poultry companies

decreased their profits. This is because there is no salmonella in farm research where

data are available or information necessary for the implementation of strategies, proper

regulation and control of avian salmonellosis on farms in Colombia.

Th i bj i f hi h h i l i id ifi i d i f

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TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN .................................................................................................................... 1

ABSTRAC ..................................................................................................................... 3

1. INTRODUCCIN ................................................................................................. 10

2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 12

2.1 OBJETIVO GENERAL ....................................................................................... 12

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................. 12

3. MARCO TERICO .............................................................................................. 13

3.1 GENERALIDADES DE LA AVICULTURA EN COLOMBIA................................ 133.2 POLLO DE ENGORDE LINEA ROSS 308........................................................ 14

3.2.1 Parmetros Zootcnicos ................................................................................. 15

3.3 ENFERMEDADES BACTERIANAS EN LA AVICULTURA................................ 15

3.4 GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS......................................................... 15

3.4.1 Clasificacin De Las Bacterias ....................................................................... 16

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3.7.4.2. Agar Bismuto Sulfito ................................................................................... 29

3.8 PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE SALMONELLA..... 29

3.8.1 Prueba De Indol ............................................................................................. 29

3.8.2 Prueba de catalasa......................................................................................... 30

3.8.3 Prueba oxidasa .............................................................................................. 30

3.8.4 Prueba De Movilidad ...................................................................................... 30

3.9 SISTEMA DE IDENTIFICACIN BBL CRYSTAL........................................... 31

3.10. SEROTIPIFICACIN...................................................................................... 32

3.10.1 Esquema De Kauffmann White..................................................................... 33

4. MATERIALES Y METODOS ................................................................................... 35

4.1 UBICACIN DEL PROYECTO .......................................................................... 354.2 UNIVERSO Y MUESTRA .................................................................................. 35

4.3 CARACTERIZACIN DE LAS GRANJAS ......................................................... 36

4.4. TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS PARA LA RECOLECCIN DELA INFORMACIN................................................................................................. 37

4.4.1 Mtodo para la recoleccin de muestras de Salmonella Gallinarum y

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TABLAS

1. Parmetros Zootcnicos Pollo De Engorde ..................................................... 152. Tipos de formas bacterianas ........................................................................... 163. Pruebas bioqumicas para la identificacin de S. Gallinarum y S. Pullorum .... 184. Resultados pruebas bioqumicas .50

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FIGURAS

1. Pollo Ross 308 ............................................................................................... 142. Pared celular Gram negativasGram positivas .............................................. 173. Salmonella Spp. .............................................................................................. 194. Estructura antgena Salmonella Spp. .............................................................. 205. Prueba BBL Crystal ..................................................................................... 326. Muestreo con hisopo cloacal ........................................................................... 377. Tubos identificados para el muestreo .............................................................. 388. Tubos muestreados e identificados ................................................................. 389. Caldo Tetrationato ........................................................................................... 3910.Siembra en caldo Tetrationato ........................................................................ 40

11.Muestras descartadas ..................................................................................... 4112.Colonias SalmonellaSpp. ............................................................................... 4113.Prueba catalasa y oxidasa .............................................................................. 4214.Medio SIM ....................................................................................................... 4315.Muestras con Produccin de H2S y movilidad +. ............................................. 4316.Siembra en Agar triptiasa soya........................................................................ 4417.Siembra en BBL Crystal. .............................................................................. 44

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GRAFICAS

1. Presencia / Ausencia de SalmonellaSpp. ....................................................... 482. Porcentaje de aislamiento de SalmonellaSpp y otras especies ...................... 513. Resultados muestras por lote. ......................................................................... 524. Resultados muestras semanales ..................................................................... 53

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ANEXOS

1. Principales enfermedades de control oficial en Colombia. .............................. 622. Esquema de kauffmann white ......................................................................... 633. Registro de seguimiento de muestra ............................................................... 644. Estadstica descriptiva presencia Salmonella Spp. por lotes y por semana..75

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1. INTRODUCCIN

En el mundo a travs del tiempo ha aumentado cada vez ms el inters por la

inocuidad de los alimentos en sus diferentes campos de produccin. En Latinoamrica

y en Colombia se han establecido documentos legislativos los cuales estn

encaminadas a la exigencia de la inocuidad de los alimentos en las diferentes etapas

de produccin encaminada siempre a la evolucin de la agroindustria. La carne, uno

de los productos ms consumidos y base de la canasta familiar Colombiana, es uno de

los productos ms importantes por sus caractersticas nutricionales y es uno de los

objetivos principales de control y vigilancia por estar considerado como de mayor

riesgo para la salud pblica, segn el Decreto 3075 de 1997. (MINISTERIO DE LA

PROTECCION SOCIAL, 1997)

En Colombia la avicultura constituye uno sectores ms dinmico dentro de las

actividades pecuarias encaminadas a la produccin de carne en las ltimas tres

dcadas seguido por la produccin de carne bovina y la porcicultura.

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Actualmente en la produccin avcola de nuestro pas, encontramos que hay

deficiencia de informacin actualizada sobre la incidencia de la salmonelosis en las

granjas de pollo de engorde que impiden facilitar las polticas de reglamentacin y

control de zoonosis en el pas.

El presente estudio busca aislar e identificar la presencia/ausencia de S.Gallinarum yS. Pullorum en pollo de engorde de la lnea ROSS 308, por medio de pruebas

bioqumicas y el sistema de identificacin BBL Cristal para entrico no fermentadores

con el fin de proporcionar informacin que ayude a facilitar las polticas de

reglamentacin y control de zoonosis en el pas.

Este estudio hace parte de un Macro proyecto que est realizando la Universidad deLa Salle y el Ministerio de Agricultura y desarrollo rural, lo cual hace que todos los

datos obtenidos no sean totalmente expuestos ya que algunos de estos datos son

catalogados como confidenciales para el proyecto.

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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Identificacin y serotipificacin de Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum en

pollo de engorde de la lnea Ross 308.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Implementar el manual para la toma de muestras de SalmonellaGallinarum y

SalmonellaPullorum en pollos de engorde

Aislar la SalmonellaGallinarum y SalmonellaPullorum en pollos de engorde de

la lnea Ross 308, por medio de muestras de Hisopos cloacales.

Identificar la presencia SalmonellaGallinarum y SalmonellaPullorum por medio

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3. MARCO TERICO

3.1 GENERALIDADES DE LA AVICULTURA EN COLOMBIA

En Colombia la avicultura se constituye en el sector ms dinmico dentro de lasactividades pecuarias en las tres ltimas dcadas. La produccin de carne bovina se

increment a una tasa anual del 1,4%. La porcicultura al 2,1% y la avicultura en 11,6

% para carne de pollo y 7,5% en produccin de huevo. (FENAVI, 2009)

La produccin de pollo de engorde en Colombia es una de las principales

producciones pecuarias ya que es de gran importancia para la alimentacin de loscolombianos. Segn FENAVI (Federacin Nacional de Avicultores de Colombia) el

consumo per capital en los ltimos aos ha aumentado significativamente pasando de

20.1 kg/ao en el 2006 a 23.7 kg/ao en el 2009. Con respecto las dems cadenas

pecuarias el pollo se ubica en el primer lugar de consumo frente a la carne de ganado

bovino con 18 kg/ao y la carne de cerdo con 4.4 kg/ao. (FENAVI, 2009)

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3.2 POLLO DE ENGORDE LINEA ROSS 308

El pollo Ross 308 es un pollo con caractersticas robustas especialmente en la

pechuga y patas, lo cual lo hace ver de forma redondeada. Se caracteriza por tener

una excelente velocidad de crecimiento, una magnifica conversin de peso y una

buena resistencia a enfermedades. (Figura 1) (GUTIERREZ, DISNEY, & JOSE, 2007)

FIGURA 1. Pollo Ross 308

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3.2.1 Parmetros Zootcnicos

Segn los objetivos de rendimiento del manual Ross 308 se presentan los siguientes

parmetros teniendo en cuenta una produccin normal de pollo Broiler a una edad de

35 en un lote de aves mixtos.(Tabla 1) (AVIAGEN CORPOREITED, 2007):

TABLA 1. Parmetros Zootcnicos Pollo De Engorde

EDAD (DAS) 35PESO CORPORAL (GR) 2021GANANCIA DIARIA (GR) 89

CONSUMO DIARIO (GR) 183

CONSUMO ACUMULADO (GR) 3248CONVERSIN 1.6PESO INICIAL (GR) 42

FUENTE: (AVIAGEN CORPOREITED, 2007)

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deben de haberse originados por mecanismos evolutivos, a saber, por seleccin y

estabilizacin adaptiva frente a las distintas presiones ambientales presentes en

diferentes nichos ecolgicos. (AVIAGEN, 2009)

TABLA 2.Tipos de formas bacterianas

Forma Aspecto

Cocos Clulas ms o menos esfricas

Bacilos En forma de bastn, alargados, que a su vez pueden tener

varios aspectos:

Cilndricos

Fusiformes

En forma de masa, etc.

Espirilos Atendiendo a los tipos de extremos, estos pueden ser:

Redondeados (lo ms frecuente)

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FIGURA 2. Pared celular Gram negativas Gram positivas

FUENTE:(BIOLOGYCORNER, 2009)

G S S O

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amplio rango de temperatura de crecimiento destacando que la mejor temperatura de

crecimiento es de 37C y pueden desarrollarse en un pH entre 4 y 9.Son ubicuas en la

naturaleza, son sensibles a la pasteurizacin, se inactivan a 64C por un minuto (la S.

Gallinarum es inactivada a 60C por 10 minutos). (CALNEK B. W., 2000) La gran

mayora de estas bacterias se encuentran en el intestino animal lo cual nos indica que

se diseminan fcilmente en el ambiente.

Estas bacterias son incapaces de fermentar lactosa o sacarosa pero si fermentan

glucosa con produccin de acido y gas. Segn su metabolismo estas bacterias para

ser identificadas deben tener los siguientes resultados bioqumicamente. Cabe

mencionar que la S. Gallinarum y S. Pullorum son inmviles y no producen H 2S(Tabla

3.)

TABLA 3. Pruebas bioqumicas para la identificacin deS. Gallinarum y S. Pullorum

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FIGURA 3. Salmonel laSpp.

FUENTE:(MENDEZ, 2007)

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FIGURA 4. Estructura antgena Salmonel la Spp.

Existen otros antgenos como el K y el VI que estn presente en algunas especies esto

debido a algunos genes especficos.

Para identificar el antgeno O se hace con nmeros arbigos y dada la participacin

ANTIGENO H

ANTIGENO

ANTIGENO VI

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3.5.2Salmonella Gallinarum

Es un bacilo corto y grueso sin flagelos no forma esporas ni cpsulas, se tie con

colorantes ordinarios es Gram negativo, puede aislarse fcilmente de la sangre e

hgado. Es aerobio y anaerobio facultativo y su temperatura ptima para el crecimiento

es los 37 grados centgrados. Posee antgenos O1,9 y 12 similar al grupo D de la

clasificacin de las Salmonelas.(SENASICA, 2008)

Los signos incluyen mortalidad repentina o espordica, apata, diarrea verde o amarilla

(acompaada de la adhesin de las plumas cercanas al ano), prdida de apetito,

incremento de sed y una apariencia plida de la cresta y carncula(INSPECCION DE

SALUD ANIMALY VEGETAL DE USDA DE TEXAS, 2003).

3.5.3Salmonella Pullorum

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3.6 SALMONELOSIS

Es una enfermedad de gran importancia econmica, ya que produce grandes prdidas

por mortalidad, prdida de peso y una disminucin en la produccin. Es producida por

bacterias denominadas Salmonelas. Las cuales pertenecen a la familia de las

enterobacterias las cuales son Gram negativas. Se han identificado ms de 2300

serotipos. En las cuales se encuentran como nicas inmviles las S. Gallinarum y S.

Pullorum. Estas bacterias son sensibles a la a pasterizacin y se inactivan a 64c por

un minuto a excepcin de la S. Gallinarum, es inactivada a 60c por 10 minutos.

(CALNEK B. , 2000)

Algunos tipos de Salmonela son altamente especficos las especies como lo es el caso

de S. Thyphy en donde el hombre es el nico que se considera como hospedador de

este serotipo. En el caso de S. Gallinarum y S. Pullorum, las aves y los pjaros son los

mayores hospedadores para estos dos serotipos. (SHIVAPRASAD, 2000)

Las enfermedades causadas por la S. Gallinarum y S. Pullorum son denominadas

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3.6.1 Resistencia A Antibiticos

Durante varios aos las cepas de Salmonela han desarrollado resistencia a varios

antibiticos. Los cual dificulta su control. Por otra parte el manejo indebido de

antibiticos ha generado que estas bacterias sean resistentes a los antibiticos.

Segn la Organizacin Mundial de la Salud OMS (1997) el uso indebido de antibiticos

en la produccin animal intensiva incide para que la resistencia bacteriana se haya

incrementado a un ritmo alarmante y es factible para que continu aumentando a

proporciones mayores si no se realiza un debido control de antibiticos o agentes

antimicrobianos.

En los aos 90 se identifico una cepa S.Typhimurium la cual es resistente a un amplio

rango de antibiticos en donde se encuentra la ampicilina, estreptomicina, tetraciclina

dando origen a la nomenclatura S. Typhimurium R-type ACSSUT esta cepa se ha

encontrado en muestras de trabajadores de granjas, algunos mamferos, aves y

mascotas domesticas.(OMS, 1997)

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3.6.2 Transmisin en el Hombre

La principal ruta de infeccin en el hombre es por la ingestin de alimentos y agua

contaminada, en los alimentos principalmente de origen animal como carne de res,

cerdo, aves, huevos y leche, sin dejar atrs las frutas y vegetales.(OMS, 1997)

Esta contaminacin en los alimentos se puede dar por la manipulacin indebida de los

procesos de produccin, distribucin y preparacin. Adems otros orgenes de

infeccin por SalmonellaSpp, es la transmisin de persona a persona y el contacto

con animales o mascotas.

3.6.3 Programas De Control

El control de salmonelosis es muy complejo, para esto se debe reducir el riesgo de

contaminacin en los procesos de produccin, transporte y preparacin partiendo de

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tiempo simple, rpido y econmico. Actualmente no existe ningn mtodo que cumpla

con todos los criterios y ninguno es ptimo para todas las condiciones, dado que

pueden presentarse alteraciones en los medios de cultivo y algunas pruebas

bioqumicas; por lo tanto es aconsejable apoyarse tambin en los nuevos mtodos de

diagnstico que estn innovando para el aislamiento de Salmonella Spp. Mediante el

uso de pruebas serolgicas y moleculares como ELISA y PCR respectivamente; estaltima tiene la capacidad de detectar un pequeo nmero de organismos del gnero

Salmonella (102 a 104). Estos mtodos arrojan resultados favorables y confiables en

menos tiempo, pero tienen la desventaja de ser costosos. (TERRAGNO, CAFFER, &

BRUNA, 2003)

Ante la sospecha de salmonelosis, el material que debe remitirse al laboratorio debeser variado. Se enviar en caso de infeccin intestinal, muestra de heces. En

enfermedad sistmica, se recoge una muestra de sangre para realizar un cultivo

estndar. (STANCHI, 2007)

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muestra se encuentren en un estado semi latente y tiene como finalidad la

revitalizacin de los microorganismos afectados por las diferentes condiciones de

tratamientos industriales o de almacenamiento, permitiendo que las clulas

bacterianas comiencen el proceso de multiplicacin normal sin estar expuestas a

sustancias inhibidoras o selectivas que puedan llegar a ser txicas para estas

bacterias (debilitadas), sustancias que si estn presentes en los medios selectivos deenriquecimiento. Se realiza en caldo peptonado bufferado al 0,1%, para incrementar la

recuperacin de especies de Salmonelas deterioradas por tcnicas de elaboracin,

preservacin, preservantes, presin osmtica alta, cambios bruscos de pH. (LUNA,

1991.)

3.7.2 Medios de enriquecimiento selectivo

Se realiza en caldos de enriquecimiento, los cuales estimulan el crecimiento de formas

compatibles con Salmonella Spp, e inhiben el desarrollo de bacterias intestinales y

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Salmonella Spp. La base de Caldo Tetrationato est especificada en los Mtodos

Estndar para las pruebas de SalmonellaSpp.(LABORATORIOS MCD, 2008)

3.7.3 Medios de cultivo selectivos

Son aquellos que permiten seleccionar ciertos microorganismos deteniendo el

desarrollo de otros; esto se logra con el agregado de sustancias inhibidoras como

antibiticos, ciertos colorantes y sales biliares. Entre la gran variedad de medios

selectivos encontramos el Agar MaCconkey el cual permite detectar con rapidez los

microorganismos no fermentadores de lactosa como SalmonellaSpp y Shigella Spp elagente inhibidor de este medio son las sales biliares.(STANCHI, 2007)

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo,

aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan, lactosa

en muestras clnicas, de agua y alimentos. Las peptonas, aportan los nutrientes

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caractersticas y propias de la bacteria (STANCHI, 2007). Los medios ms reconocidos

para el aislamiento de SalmonellaSpp. Son:

3.7.4.1 Agar Xilosa Lis ina Desox icol ato (XLD)

El Agar XLD (por sus siglas Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es utilizado para el

aislamiento y diferenciacin de bacilos entricos Gram negativos, especialmente del

gnero Shigella y Providencia.(LABORATORIOS MCD, 2009)

El efecto inhibidor de este medio de cultivo es dbil. El desoxicolato genera la

inhibicin de bacterias coliformes y permite la dispersin de cepas de Proteus que

puede llegar a confundirse con las colonias producidas por Salmonela.

Adicionalmente, la diferenciacin entre SalmonellaSpp. y ShigellaSpp. Se da porque

la primera produce fermentacin de Xilosa, descarboxilacin de Lisina y genera cido

sulfhdrico.(HURTADO, 2001.)

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3.7.4.2. Agar Bismuto Su lf ito

Es un medio diferencial y selectivo, usado para el aislamiento e identificacin de

Salmonela entrica Serovar Typhi y otras bacterias entricas. El medio contiene

peptona y tejidos animales, extracto de carne, glucosa, sulfato frrico y sulfito bismuto

que acta como inhibidor de la mayora de organismos comensales. Las colonias

tpicas de Salmonella Spp. Pueden ser caf, gris o negras con o sin brillo metlico,

generalmente el medio circundante (halo) es caf que posteriormente se torna negro;

algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro.(MURRAY &

SHEA., 2004)

3.8 PRUEBAS B IOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE

SALMONELLA

En la identificacin bioqumica para diagnostico de Salmonella Spp. Se utilizan

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3.8.2 Prueba de catalasa

Esta prueba consiste en la identificacin de la enzima catalasa en los

microorganismos, las cuales desdoblan el perxido de hidrogeno en oxigeno y agua.

Generalmente todos los microorganismos poseen esta enzima.

2H2O2 2H2O+O2

Para la identificacin en laboratorio se deposita una muestra del microorganismo a

analizar en un portaobjetos y se agrega una gota de perxido de hidrogeno. A los

pocos segundos se observa la reaccin de con lapresencia de gran cantidad de

burbujas por un determinado tiempo.(WHEELIS, STANIE, & INGRAHAM, 1996)

3.8.3 Prueba oxidasa

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distribucin aleatoria de los microorganismos. Por el contrario las bacterias inmviles

permanecern en la misma picadura donde se sembraron(MacFADDIN, 2000).

La mayora de las Salmonelas son mviles a excepcin deS. pullorum y S. gallinarum,

huspedes especficas de aves, responsables adems de las enfermedades

Pulorosis y Tifoidea aviar respectivamente (HERRERA, INFANTE, LEN, & DE

NOGUERA, 1991) .

3.9 SISTEMA DE IDENTIFICACIN BB L CRYSTAL

El sistema de identificacin BBL Crystal (ID) de bacterias entricas no fermentadoras

(E/NF) sirve para la identificacin de bacterias aerobias Gram-negativas que

pertenecen a la familia Enterobacteriaceae as como tambin de los bacilos Gram-

negativos fermentadores y no fermentadores de glucosa aislados con ms frecuencia.

El sistema BBL Crystal es un mtodo miniaturizado de identificacin. Muchos de los

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convierte en nmero de perfil de 10 dgitos que se utilizan como base para la

identificacin. Los patrones de la reaccin bioqumica y enzimtica de los 30 sustratos

BBL Crystal E/NF con una amplia variedad de microorganismos son almacenados en

la base de datos de BBL Crysta E/NF ID. (Anexo 3) La identificacin se deriva de un

anlisis comparativo del patrn de redaccin del aislado del anlisis con aquellos que

existen en la base de datos.(Figura 5)

FIGURA 5. Prueba BBL Crystal

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La Salmonella Spp. Est serotipificada de acuerdo a sus antgenos somticos de

superficie (LPS, antgenos O), antgenos flagelares (protenas, antgenos H) y

antgeno capsular (Vi) (TERRAGNO & CAFFER, 2003). Los antgenos se identifican con

anticuerpos monovalentes y polivalentes disponibles comercialmente, mediante

pruebas de aglutinacin en lmina. Para identificar los antgenos O, se hace unaprueba con antisueros contra los grupos del O1 (A) al O67, luego se prueba el

antisuero Vi para antgeno capsular, y por ltimo se incluyen los antisueros contra los

antgenos flagelares H(CUBILLOS, 2009).

En el gnero existe un solo tipo capsular, el tipo Vi (de virulencia), aunque la mayorade las Salmonelas no producen cpsula (CUBILLOS, 2009).La constitucin antignica

de la fraccin polisacardica del lipopolisacarido (LPS) define en gran parte la especie;

as mismo, la clase y el nmero de azcares junto con los enlaces existentes entre los

mismos, definen los determinantes antignicos que contienen los antgenos O de un

determinado aislamiento; dichos antgenos O, junto con los determinantes antignicos

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Primera columna: Indica el nombre de la serovariedad, si la misma pertenece a S.

entrica sub especie. Entrica (I) las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V, S. VI;

indicando que la serovariedad considerada pertenece a la subespecie II III a, etc.

Segunda columna:Antgenos somticos (O). Los nmeros indican el los factores

del antgeno O y se escriben, separados por una coma. Las serovariedades son

agrupadas en grupos somticos, cada uno de ellos caracterizado por un factor O

mayor. As se determnalos grupos A, B, C, etc. Por ej. el grupo O:2 (A) est integrado

por S. Paratyphi A (1,2,12:a:-) entre otras, el grupo O:4 (B) por S. Typhimurium

(1,4,5,12:i:1,2); S.Agona (1,4,12:f,g,s:- ); S. Saintpaul (1,4,5,12:e,h:1,2), entre otras. El

Esquema de Kauffmann-White presenta 67 grupos O, desde el grupo A hasta el Z y

luego contina con nmeros, desde el O: 51 hasta el O: 67

Tercera y cuarta columna:Antgenos flagelares (H). Se indican los factores de las

fases 1 y 2, del antgeno H, respectivamente. Para la fase 1 los factores se denominan

con letras minsculas, seguidas algunas veces por un nmero que figura como

subndice y para la fase 2 se emplean en general nmeros arbigos, aunque tambin

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4. MATERIALES Y METODOS

4.1 UBICACIN DEL PROYECTO

El trabajo de investigacin se desarroll en una granja correspondiente a una empresa

del sector avcola especializada en la produccin, levante y engorde de pollo de la

lnea Ross 308. La cual se encuentra localizada en el municipio de San Francisco de

Sales (Cundinamarca) con una altitud 1520 m.s.n.m. y una temperatura promedio de

20C.

En cuanto el anlisis de muestras se realiz en el laboratorio de control de calidad de

la Universidad de La Sall, sede Norte, ubicado en la ciudad de Bogot en donde se

realizaron todos los procesos de aislamiento e identificacin de SalmonellaSpp.

4.2 UNIVERSO Y MUESTRA

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4.3 CARACTERIZACIN DE LAS GRANJAS

Las granjas visitadas en donde se realiz el muestreo cumplan con todas la normas

de bioseguridad que estableci la resolucin 3283 del instituto Colombiano

Agropecuario (ICA), las cuales presentan:

Cuenta con un cerco perimetral en buen estado que restringe el libre acceso de

personas, vehculos y animales.

Dispone de una zona limpia para desinfeccin de todo personal que ingrese a

la granja y objetos ajenos que ingresen.

La granja posee arco de desinfeccin para vehculos.

Disponen de registros de todo personal o vehculos que ingresen o salgan de la

granja.

Manipulan registros indicando cada protocolo que recomienda el ICA para la

desinfeccin de los galpones.

Cuentan con registros para manejo de mortalidad de las aves.

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4.4. TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS PARA LA

RECOLECCIN DE LA INFORMACIN

4.4.1 Mtodo para la recoleccin de muestras de Salmonella Gallinarum ySalmonel laPullorum

Para la toma de muestras se implemento el manual de toma de muestras en las

explotaciones avcolas, para diagnstico de Salmonella Spp Procedimiento

Operacional Estandarizado (POE). (VENEGAS, SANCHEZ, GOMEZ, & SANTOS, 2009)

Se utilizaron hisopos cloacales estriles, (Figura 6.) los cuales despus de ser

utilizados en el muestreo de las aves, fueron inmediatamente a insertados en tuboscon agua peptonada, que fueron rotulados e identificados previamente. (Figura 7)En

seguida estos tubos fueron empacados en neveras de icopor y sellados con el fin de

mantenerlos refrigerados e identificados cada uno con el respectivo lote. (Figura 8)

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FIGURA 7. Tubos identificados para el muestreo

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4.4.2 Aislamiento e identificacin de Salmonel laGallinarum y SalmonellaPullorum.

Para el aislamiento e identificacin las muestras fueron trasladadas al laboratorio de

control de calidad de la Universidad de La Sall en un tiempo aproximado de 2 horas,

en donde se sometieron a incubacin a una temperatura de 37C por un tiempo de 12horas.

Pasadas las 12 horas se procedi a agitar los tubos y posteriormente a retirar los

hisopos. Inmediatamente se tomo 1ml de cada tubo y se sembr en tubos que

contenian, 9ml de caldo Tetrationato con solucin yodo yoduro. (Figura 9) estos

fueron incubados a una temperatura de 37C en un lapso de 12 a 24 horas . (Figura 10)

FIGURA 9. Caldo Tetrationato

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FIGURA 10. Siembra en caldo Tetrationato

Transcurridas las 12 a 24 horas se realiz la toma de muestra de cada unos de los

tubos anteriormente mencionados, con un asa estril para posteriormente ser

sembrados por la tcnica de agotamiento en cajas de petri en el medio de cultivo XLD,

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FIGURA 11. Muestras descartadas

FIGURA 12. Colonias Salmonel laSpp.

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De las colonias identificadas como posibles Salmonellas Spp. se tomaron muestras

con asas redondas para posteriormente ser puestas en lminas portaobjetos para

realizarse las pruebas de catalasa y oxidasa (Figura 13). Otras muestras para ser

sembradas en medios de cultivo Sim, que fueron incubados a una temperatura de

37C durante un tiempo de 12 horas. Con el fin de realizar respectivamente la prueba

de Indol, produccin H2S y movilidad las cuales son necesarias para la identificacinbioqumica S. Gallinarum y S. Pullorum.(Figura 14).

FIGURA 13. Prueba catalasa y oxidasa

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FIGURA 14. Medio SIM

Trascurrido el tiempo de incubacin se efectu la lectura a cada uno de los medios

sembrados con el fin de comparar estos resultados, con resultados de la literatura

consultada que muestran cmo deben ser para que sean confirmados como S.

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Realizadas esta pruebas bioqumicas necesarias para la identificacin S.Gallinarum y

S. Pullorum, Se sembraron las muestras en Agar tripticasa soya las cuales fueron

incubadas a 37C por un lapso de 12 a 24 horas.(Figura 16)

FIGURA 16. Siembra en Agar triptiasa soya

Pasadas las 24 horas, se realiz la identificacin bioqumica con el kit de diagnstico

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Finalmente se analizaron los datos obtenidos de los procedimientos anteriormente

mencionados para as poder determinar si era necesario realizar las pruebas de

serotipificacin en las muestras identificadas como SalmonellaSpp y as identificar su

serovariedad. (Figura 18)

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Figura 18. Esquema proceso de identificacin de Salmonel laSpp. Enlaboratorio

Toma de muestra

Siembra en medio XLD

Trans orte laboratorio

Incubacin muestras 12 horas,

37c

Retiro incubadora y Retiro del hisopo

Siembra en caldo Tetrationato

12 a 24 horas, 37c

Incubacin tubos

Retiro incubadora

Incubacin cajas

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4.5 DISEO EXPERIMENTAL

Para la toma de muestras se hizo una seleccin completamente al azar hasta

completar el nmero de aves totales por muestreo. El cual se le realizo a 4 lotes de

pollo de engorde de la lnea Ross 308, en donde se tomaron 20 muestras por lote.

(Cada muestra corresponde a un grupo de 20 aves), durante 3 semanas para un totalde muestras 240 correspondiente a ,4800 aves muestreadas. (4X20X3)

Para el anlisis de datos se utilizo estadstica descriptiva, los cuales se representaron

con tablas, grficos circulares entre otros.

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4. RESULTADOS Y DISCUSIN

Los siguientes resultados surgen de la implementacin del manual para toma de

muestras de S.Gallinarum y S.Pullorum en pollo de engorde y de la evaluacin de los

datos obtenidos en el Laboratorio de control de calidad de la Universidad de la Salle,

en donde se tuvo en cuenta como indicadores la presencia / ausencia de salmonellaSpp, anlisis de datos de las pruebas bioqumicas necesarias para la identificacin de

S. Gallinarum y S. Pullorum (catalasa, oxidasa, indol, produccin de H2S, movilidad) y

la presencia de salmonella Spp y de otras especies, por lotes y por semanas. El

proceso de toma de muestras y anlisis de laboratorio tuvo una duracin de 2 meses.

4.1 Resultados presencia / ausencia de Salmonella Spp

GRAFICA 1. Presencia / Ausencia de Salmonel laSpp.

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De las 240 muestras analizadas en 193 muestras fueron aisladas e identificadas como

colonias tpicas de Salmonella Spp (con pigmentacin rosa o roja, algunas veces

transparentes con o sin centro negro o completamente negras), Que representan el

80,42 %. El restante equivalente 19,58 % (47 muestras) fueron identificadas como

colonias no tpicas para SalmonellasSpp (Colonias de color blanco, diferentes formas,

con cambios en el aspecto del medio a color amarillo).

De el nmero total de muestras aisladas como sospechosas para SalmonellaSpp. la

totalidad fueron identificadas por medio del kit de diagnostico rpido BBL Crystal para

entricos no fermentadores como SalmonellaSpp con un nivel de confianza promedio

de 0.9879. Estudios realizados por (RUANO, 1996),mostraron un aislamiento total de

30 cepas de SalmonellaSpp. en pollitos de 8 das de nacidos en granjas avcolas, demuestras de materia fecal, saco vitelino, hgado y ciego. Lo cual evidencia la presencia

de SalmonellaSpp en pollos de engorde en granja, adems de la poca informacin de

aislamiento de Salmonela por medio de hisopados cloacales.

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Gallinarum y Pullorum si no a otras serovariedades imposibilitando as la realizacin

de la serotipificacin.(Anexo 3) Segn investigaciones realizadas por (BERCHIERI &

asociados, 1999) determinaron que la presencia de S. Gallinarum y S. Pullorum

dependen de la susceptibilidad de la lnea de las aves, para este caso la lnea Ross

308 como lo mencionamos anteriormente es un animal que presenta una buena

resistencia a enfermedades lo cual es una de las principales caractersticas de la lnea.Por otra parte concluyeron que no es fcil identificar S. Gallinarum y S.Pullorum en

ausencia de signos clnicos caractersticos de las enfermedades causadas por estas

bacterias, en este caso las aves encontradas en la granja no presentaban ningn

signo clnico producido por estas dos bacterias lo cual comprueba lo mencionado

anteriormente.

Por otra parte en un estudio realizado(CUBILLOS, 2009)la S.Gallinarum y S. Pullorum

es una bacteria que no posee flagelos lo cual nos indica que es inmvil. Tambin estas

serovariedades no producen H2S gracias que en su metabolismo no reduce el hierro

presente en el medio. Por consiguiente no se realizo la prueba de serotipificacin.

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4.3 Presencia de Salmonel laSpp y otras especies

GRAFICA 2. Porcentaje de aislamiento de Salmonel laSpp y otras especies

80,42%,

11,67%

5,83% 2,08%

Sallmonella Proteus sp Enterobacter cloacae Klebsiella sp

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4.4 Resultado muestras por lote

GRAFICA 3. Resultados muestras por lote.

5046

52

45

5 4 6

13

2 1 1 139

1 10

10

20

30

40

50

60

LOTE 83 LOTE 84 LOTE 85 LOTE 86

Salmonella spp. Proteus spp

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4.5 Resultados semanales

GRAFICA 4 Resultados muestras semanales

65 6563

9 910

1 2 25 4 5

0

10

20

30

40

50

60

70

SEMANA 1 SEMANA 2 SEMANA 3

Salmonella spp. Proteus spp

Klebsiella spp Enterobacter cloacae.

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6. CONCLUSIONES

Las tcnicas sugeridas por el manual para la toma de muestras de S.Gallinarum y S.Pullorum en granja permiten la correcta ejecucin de muestreo

en campo.

Es difcil el aislamiento e identificacin de S. Gallinarum y S. Pullorum pormedio de hisopados cloacales en ausencia de signos clnicos caractersticos delas enfermedades causadas por estas bacterias.

Con este estudio se comprueba la baja prevalencia de Salmonelosis aviar

causadas por S. Gallinarum y S. Pullorum en pollos de engorde en la lnea

Ross 308.

Este estudio es el primer reporte mediante el cual se trata de aislar la S.

Gallinarum y S.Pullorum por medio de Hisopado cloacal en pollo de engorde

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7. RECOMENDACINES

Seguir implementando los manuales para la identificacin de agentes

patgenos que afecten la produccin avcola y las dems producciones

pecuarias, que conlleve a mejorar cada vez ms las cadenas productivas.

Identificar S. Gallinarum y S. Pullorum con Hisopado de arrastre de cama,

Hisopado en diferentes partes del galpn e Hisopados en los rganos de las

aves con el fin de obtener ms informacin sobre estas bacterias.

Realizar peridicamente chequeos rutinarios en todas las granjas avcolas con

el fin de controlar la trasmisin, diseminacin y obtener informacin

actualizada de estos agentes bacterianos.

La empresa evaluada implementa un buen manejo de bioseguridad en sus

granjas y en sus procesos que anteceden como son la reproduccin del pollito,

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Efectuar investigaciones complementarias sobre los tipos de salmonellas

aisladas en este trabajo

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REFERENCIAS

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STANCHI, O. (2007). Microbiologa Veterinaria.Republica Argentina.: Intermedica.

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ANEXOS

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ANEXO 4 Principales enfermedades de control oficial en Colombia.

ENFERMEDAD AGENTE TRASMISION SINTOMAS

INFLUENCIA AVIAR Virus de la familia OrthomyxoviridaeEl contacto con las heces y el airecontaminado son las vas decontagio.

-Aumento de la secrecin nasal con tos, estornudos, prdida del

apetito y hasta sinusitis.-Disminucin o suspensin de la produccin de huevos y como elvirus se reproduce en el tracto intestinal, diarrea y muerte.- Diarrea verdosa.-Cianosis.-Edema de la cabeza, cresta y barba.-Decoloracin de las patas

NEWCASTLE Virus RNA de la familia Paramyxoviridae

Contacto directo con lassecreciones de las aves infectadas,especialmente las heces-Comida, agua, instrumentos,locales, vestimentas humanascontaminados.

-Jadeo y tos .-Alas cadas, arrastran las patas, cabeza y cuellos torcidos,desplazamientos en crculos, depresin, inapetencia, parlisiscompleta.-Interrupcin parcial o completa de la produccin de huevos.-Huevos deformados, de cscara rugosa y fina y que contienenalbmina acuosa-Diarrea verde acuosa.

-Tejidos hinchados en torno a los ojos y el cuello.

SALMONELOSIS AVIAR

SalmonellaPollorum

El contacto con las heces y el airecontaminado son las vas decontagio.-Va madre e hijo.

Sienten fro, no comen, tienen aspecto somnoliento y muestranpastas fecales blanquesinas alrededor del ano.

SalmonellaGallinarum


Las aves, se presentan deshidratadas y en la necropsia presentanel hgado tumefacto y manchado de bilis, bazo y rionesagrandados.

Salmonella Typhimurium


Los animales presentan depresin, poco crecimiento, debilidad,diarrea y deshidratacin.

FUENTE:www.oie.int,mundo pecuario, enfermedades de las aves, salmonelosis.
http://www.oie.int/http://www.oie.int/http://www.oie.int/http://www.oie.int/

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ANEXO 5. Esquema de kauffmann White

ORGANISMO G R U P OA N T G E N O ANTIGENO FLAGELAR

SOMTICO FASE 1 FASE 2

S. enteritidis

ser Berta D 9,12 f, g, t -

ser Enteritidis * D 1,9,12 g, m -

ser Dublin D 1,9,12 g, p -ser Panama D 1,9,12 l,v 1,5

ser Javiana D 1,9,12 l, z 1,5

bioser gallinarum D 9,12 - -

ser Anatum E 3,1 e, h 1,6

ser Meleagridis E 3,1 e, h l, w

ser Give E 3,1 l,v 1,7

ser Newington E 3,15 e, h 1,6

ser Illinois E (3), (15), 34 z10 1,5

ser Senftenberg E 1,3,19 g, s, t -

ser Simsbury E

1,3,19 z

-ser Rubislaw F 11 [d], r [d], e, n, x

ser Poona G[1], 13,22,

[36] z 1,6

ser Worthington G 1,13,23 z l, w

ser Cubana G 1,13,23 z -

ser Florida H 1,6,14,25 d 1,7

ser Madelia H 1,6,14,25 y 1,7

ser Nottingham * I 16 d e ,n, z

ser Cerro K 18 z, z [z]

ser Siegburg K 6,14,18 z, z [1,5]

ser Minnesota L 21 b e, n, xser Urbana N 30 b e, n, x

FUENTE:Laboratorios DIFCO

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ANEXO 3. Registro de seguimiento de muestra.

PROCESO PODUCTIVO POLLO DE ENGORDE SEMANA 1 FECHA 3 DE NOVIEMBRE 2009

CODIGO PEPTONA 37CTETATRIONATO

37CXLD 37C CATALASA OXIDASA SIM

Tripticasa Soya37C

Bioqumicas37C

H2S INDOL MOVILIDAD SI NO BBL Crystal

001 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X Salmonella Spp.002 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X Salmonella Spp.

003 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X Salmonella Spp.











015 Crecimiento Crecimiento Descartada





020 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X Salmonella Spp.Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.

FUENTE:(UNIVERSIDAD DE LA SALLE - MINISTIRERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL, 2009)

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CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO 37C XLD 37C CATALASA OXIDASA SIM

TripticasaSoya37C

Bioqumicas37C

H2S INDOL MOVILIDADD SI NO BBL Crystal



















040 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X Salmonella Spp.Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.


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CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO


Tripticasa Soya37C

Bioqumicas37C


041Crecimiento Crecimiento Crecimiento

+ - + - + XSalmonellaSpp.

042 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X SalmonellaSpp.








050 Crecimiento Crecimiento Descartada .


052 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X SalmonellaSpp.053 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X SalmonellaSpp.








Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.

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CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO

37C

XLD 37C CATALASA OXIDASA SIMTripticasa

Soya37C

Bioqumicas37C





















Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel.R.


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CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO


Tripticasa Soya37C

Bioqumicas37C
















015 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + x Salmonella Spp.






Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.


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CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO


TripticasaSoya37C

Bioqumicas37C













034 Crecimiento Crecimiento Descartada .







Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.


PROCESO PRODUCTIVO POLLO DE ENGORDE SEMANA 2 FECHA 9 DE NOVIEMBRE 2009

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CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO


TripticasaSoya37C

Bioqumicas37C





044 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + x SalmonellaSpp.








052 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X SalmonellaSpp.053 Crecimiento Crecimiento Descartada








Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.


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CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO


Tripticasa Soya37C

Bioqumicas37C

H2S INDOL MOVILIDAD SI NO BBL Cristal












074 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X Salmonella Spp.075 Crecimiento Crecimiento Descartada






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CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO


TripticasaSoya37C

Bioqumicas37C





004 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + x SalmonellaSpp.







011 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X SalmonellaSpp..012 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X SalmonellaSpp.

013 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X SalmonellaSpp..








Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.


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CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO


TripticasaSoya37C

Bioqumicas37C

H2S INDOL MOVILIDAD

SI NO BBL Crystal



















Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.


7/23/2019 T13.10 P658i

79/81

73


CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO


TripticasaSoya37C

Bioqumicas37C

H2S INDOL MOVILIDAD

SI NO BBL Crystal



















Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.


7/23/2019 T13.10 P658i

80/81

74


CODIGOPEPTONA

37CTETATRIONATO


TripticasaSoya37C

Bioqumicas37C

H2S INDOL MOVILIDADD SI NO BBL Crystal













073 Crecimiento Crecimiento Descartada074 Crecimiento Crecimiento Crecimiento + - + - + X SalmonellaSpp.







Jose A. Pineros

Rosario S.A.

Manuel. R.CONFIANZAPROMEDIO 0.9879


O 4 S

7/23/2019 T13.10 P658i

81/81

ANEXO 4. Estadstica descriptiva presencia Salmonella Spp. por lotes y por semana.

Muestras Salmonella Spp.Lotes

Muestras Salmonella Spp.Semanas

Media 48,25 Media 64,33333333Error tpico 1,652018967 Error tpico 0,666666667

Mediana 48 Mediana 65

Moda Moda 65

Desviacin estndar 3,304037934 Desviacin estndar 1,154700538

Varianza de la muestra 10,91666667 Varianza de la muestra 1,333333333

Curtosis -3,869005303 Curtosis

Coeficiente de asimetra 0,228727759 Coeficiente de asimetra -1,732050808

Rango 7 Rango 2

Mnimo 45 Mnimo 63

Mximo 52 Mximo 65

Suma 193 Suma 193

Cuenta 4 Cuenta 3

Mayor (1) 52 Mayor (1) 65

Menor(1) 45 Menor(1) 63

Nivel de confianza(95,0%) 5,257461656 Nivel de confianza(95,0%) 2,868435153

t13.10 p658i

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