separación de biomoléculas - unr
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Cromatografía. Aspectos generales, técnicas involucradas. FPLC, HPLC. Electroforesis. Conceptos generales y aplicaciones. Geles de poliacrilamida y agarosa. Isoelectroenfoque.
Separación de biomoléculas
Voet • Voet • PrattFundamentos de Bioquímica La vida a nivel molecular 2ª edición Ed. Panamericana
Lubert Stryer • Jeremy M. Berg • John L. TymoczkoBioquimica (5. ed) Ed. Reverte
Cox, M.M. • Nelson, D.L. • Lehinger A.Principios De Bioquímica 4ta o 5ta EdiciónEditorial Omega
Bibliografía
Apuntes del transparente virtual.CromatografíaElectroforesis
Métodos de ruptura celular(lisis)
Métodos físico – químicosShock osmóticoDetergentesSolventesEnzimas (lisozima, celulasas)
Métodos físicosMolinoFrench PressVibraciones ultrasónicas
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generador de ultrasonido
punta
suspensióncelular
Sonicador
bolitas
células
collar
Molino
Licuadora
French Press
Polytron
Mortero y pilón
Homogeneizadores potter para eppendorf
Métodos de ruptura celular
Medioisotónico
Medio hipotónico
Shock osmótico
Estrategias de purificación(se basan en propiedades diferenciales)
Solubilidad Fraccionamiento con sulfato de amonioFraccionamiento con solventesFraccionamiento con polietilenglicolPrecipitación isoeléctrica
Tamaño Molecular Diálisis Electroforesis en gelCromatografía de filtración por gelesUltracentrifugación
Carga Iónica Cromatografía de Intercambio IónicoElectroforesisIsoelectroenfoque
Polaridad Cromatografía de adsorciónCromatografía en papelCromatografía de interacción hidrofóbica
Especificidad de unión Cromatografía de afinidad
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Cromatografía
Los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (FASE ESTACIONARIA ) mientras que la otra (FASE MÓVIL) se mueve en una dirección definida.
La mezcla de sustancias a separar se disuelven en la FASE MÓVIL
La solución resultante atraviesa una matriz sólida porosa, la FASE ESTACIONARIA
La fase móvil puede ser líquida CROMATOGRAFÍA LÍQUIDAo gaseosa CROMATOGRAFÍA GASEOSA
La fase estacionaria puede estar dispuestos CROMATOGRAFÍA PLANAen forma plana CROMATOGRAFÍA en COLUMNA
Cromatografía en columna
Cromatograma
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1 La muestra es depositada sobre el lecho cromatográfico2 La muestra penetra en el lecho3 Se añade fase móvil4 Comienza la separación de los componentes de la muestra5 Eluye el primer componente6 Eluye el segundo componente
Cromatografía en columna
SoportesSon muy variados, sobre ellos se da la interacción que resulta en la separación ( grupos unidos - su misma estructura)
Celulosa : fácilmente hidratable, es compresible (no permite flujos elevados, es incompatible con algunos solventes (álcalis)
Derivados de polisacáridos: Microesferas porosas que se presentan con distinto tamaño y poroSephadex : dextranos entrecruzados, sensible a pHs extremosSepharosa : agarosa
Sephacryl : resistentes a la compresión y a pH extremos
Cromatografía en columna
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Detección
Los componentes de la muestra separados se detectan en el eluyentemediante su análisis continuo o mediante el análisis de las fracciones una vez recogidas
Métodosmidiendo absorbancia a 280 nm (para proteínas)midiendo absorbancia a 260 nm (para ácidos nucleicos)midiendo radioactividadensayo enzimático (específicos)ensayo biológicoreacciones coloreadas (Bradford, Lowry)reacciones fluorescentesreacciones inmunoquímicas (western, ELISA, RIA)Etc, etc…..
Cromatografía en columna
Cromatografía plana
ascendentedescendente
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La migración es proporcional a su densidad de cargafricción tamaño
forma
Electroforesis
Técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico.
Las matrices más comunes son:agarosapoliacrilamida
µ = =qf
VE
µ= Movilidad electroforéticaV= velocidad E= campo eléctricoq = cargaf= coeficiente de frición
Estrategias de purificación(se basan en propiedades diferenciales)
Solubilidad Fraccionamiento con sulfato de amonioFraccionamiento con solventesFraccionamiento con polietilenglicolPrecipitación isoeléctrica
Tamaño Molecular Diálisis Electroforesis en gelCromatografía de filtración por gelesUltracentrifugación
Carga Iónica Cromatografía de Intercambio IónicoElectroforesisIsoelectroenfoque
Polaridad Cromatografía de adsorciónCromatografía en papelCromatografía de interacción hidrofóbica
Especificidad de unión Cromatografía de afinidad
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La solubilidad de las proteínas depende de la concentración de sales disueltas, la polaridad del solvente, el pH y la temperatura
Métodos de separación que se basan en diferencias de solubilidad
Fraccionamiento con sulfato de amonio
Fraccionamiento con solventes
Fraccionamiento con polietilenglicol
Precipitación isoeléctrica
Solubilidad
Salting in – Salting out
Solubilidad
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sulfato deamonio +
sulfato deamonio
+
sulfato deamonio
0 al 40%
40 al 70% 70 al 100%
Fracción0 al 40%
Fracción 40% al 70%
Fracción 70% al 100%
Fraccionamiento con sulfato de amonio
Solubilidad
Fraccionamiento con sulfato de amonio
Calculador on linehttp://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm Solubilidad
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p
pH mayor que PI
pH menor que PI
pH = pI
Precipitación isoeléctrica
Solubilidad
Diálisis
Cromatografía de filtración por geles
Electroforesis en gel
Ultracentrifugación
Métodos de separación basados en el Tamaño Molecular
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Diálisis
Tamaño Molecular
Cromatografía de exclusión molecularFiltración Molecular
La separación se basa en diferencia de tamaño
Matriz porosa – distintos tamaños de poros
No hay interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria.
Columnas esbeltas, volumen de siembra 10 % del volumen de columna
Proteínas, ácidos nucleícos, hidratos de carbono
Tamaño Molecular
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Cromatografía de exclusión molecular
Tamaño Molecular
Tamaño Molecular
Cromatografía de exclusión molecular
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Kav = Ve – Vo
Vt - Vo
Ve volumen de eluciónVt volumen totalVo volumen vacío
Se puede usar como método de determinación de PM
Cromatograma
Cromatografía de exclusión molecular
Kav
Tamaño Molecular
Electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)
SDS-PAGETamaño Molecular
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Dodecil sulfato de sodio (SDS)
Na H-(CH2)12-SO4−+ Na+
SDS-PAGETamaño Molecular
BME o DTT
SDS-PAGE Reducción de puentes disulfuro
SDS-PAGETamaño Molecular
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SDS-PAGE
Gel desiembra
Gel deseparación
Geldiscontinuo
Cuba de electroforesis
Tamaño Molecular
Las moléculas más pequeñas son las más rápidas
SDS-PAGETamaño Molecular
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Tinción conCoomassie Blue
SDS-PAGETamaño Molecular
Tinción con Plata
Variando la concentración de poliacrilamida se puede obtener distinto grado de separación
SDS-PAGETamaño Molecular
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X
Xf
R=X
Xf
Relación de frente o migración relativa
SDS-PAGE se puede usar para determinar PM
SDS-PAGETamaño Molecular
SDS-PAGE – Curva de Calibración
SDS-PAGETamaño Molecular
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Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa
Se emplea para ácidos nucleicos
Tamaño Molecular
Electroforesis en geles de agarosa
Unidad de agarosa
Tamaño Molecular
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ADN, ARNTinción: Bromuro etidio (UV)
SYBR green
Cuba de electroforesis - Electroforesis en geles de agarosa
Tamaño Molecular
Se emplea para separar partículas o macromoléculas: CélulasComponentes sub-celulares ProteínasÁcidos nucleicos
Bases de separaciónTamaño FormaDensidad
Metodología: Empleo de gradientes de densidad (viscocidad del medio)
Velocidad del rotor (centrifugación – ultracentrifugación)
Centrifugación
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Centrifugación Diferencial
El tubo se llena con muestraTécnica poco resolutivaLa velocidad de sedimentación depende principalmente del tamaño y formaNo emplea gradiente de densidadSe obtienen dos fracciones: sobrenadante y sedimento (pellet)
Centrifugación Zonal Centrifugación Isopícnica
Gradiente de sacarosa preformadoLa δ máx. no supera a las partículas
Se siembra la muestra en la parte sup.
Baja velocidad
Velocidad de sedimentación(no se logra la sedimentación completa, se detiene)
Muestras: densidad semejante, distinto peso molecular
ácidos nucleicos y organelas
Gradiente de Cloruro de CesioLa δ máx. supera a las partículas
Muestra disuelta en ClCs
Alta velocidad
Equilibrio de sedimentación(se logra la sedimentación completa, tiempos largos)
Muestras: peso molecular semejante, distinta densidad
proteínas
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE
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CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE
Cromatografía de Intercambio Iónico
Electroforesis (nativa)
Isoelectroenfoque
Métodos de separación basados en laCarga Iónica
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Cromatografía de intercambio iónico
La separación ocurre en base de interacciones iónicas entre la superficie de la proteína y grupos de la fase estacionaria
Intercambio aniónico: La matriz cargada positivamente se une a proteínas cargadas negativamenteIntercambio catiónico: La matriz cargada negativamente se une a proteínas cargadas positivamente
Los grupos más comunes son:
Elución: con fuerza iónicaCarga Iónica
Cromatografía de intercambio iónico
Carga Iónica
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Carga Iónica
Cromatografía deintercambio iónico
Cromatograma
Carga Iónica
Cromatografía de intercambio iónico
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Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas
No se usan agentes desnaturalizantes (SDS, BME, DTT)
Las proteínas migran de acuerdo a su relación q/m
Las interacciones entre subunidades de las proteinasoligoméricas se conservan: se puede obtener informaciónacerca de al estructura cuaternaria
Se pueden hacer determinaciones de actividad en gel
Relación carga/masa
Isoelectroenfoque
Punto isoeléctrico
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Isoelectroenfoque
Punto isoeléctrico
Electroforesis bidimensional
Separación basada enPI y tamaño
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Electroforesis bidimensional
PI y tamaño
Cromatografía de interacción hidrofóbica
Cromatografía en papel y de capa fina (plana)
Cromatografía de adsorción
Métodos de separación basados en la polaridad
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Cromatografía de interacción hidrofóbica
Se basa en interacciones hidrofóbicas entre la fase estacionaria y las moléculas a separar.
La fase estacionaria consiste en un grupo no polar pequeño unido a una matriz
La muestra se siembra disuelta en un buffer que contiene alta concentración de una sal (sulfato de amonio, cloruro de sodio)
La elución se realiza bajando la concentración de la sal. Las proteínas eluyen en orden creciente de hidrofobicidad
Cromatografía de interacción hidrofóbica
SepharosaSephadex
Soporte
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Cromatografía de interacción hidrofóbica
Cromatografía de interacción hidrofóbica
Cromatograma
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1: aplicación de la muestra 2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil 3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación de los componentes 6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance
Cromatogafía en papel y silica-gel
Soporte : papel, silca gel (TLC)
1 2 3 4 5 6 7
Cromatogafía en silicagel - TLC
Usos: lípidos, aminoácidos, pigmentos, etc
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Cromatogafía de adsorción
La separación se basa en diferencias de adsorción a la superficie de la fase estacionaria
La fase estacionaria es polar
La fase móvil es apolar
Soporte: alúmina, sílica-gel
Cromatografía de afinidad
Se basa en la interacción reversible entre la proteína a purificar y un ligando inmovilizado sobre la matriz
Es muy específica
Ligandos: anticuerpos, inhibidores, sustratos, cofactores
La elución se realiza con el ligando o un análogo, cambio de fuerza iónica o pH
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Cromatografía de afinidad
Cromatografía de afinidad
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Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad se emplea parar purifi car proteínas recombinantes
Cromatografía de afinidad
HIS tag: Polihistidina ( 6 aa)Columna: IMAC (Inmobilized Metal Affinity Chromatography), generalmente con columnas de Ni2+Elución: Imidazol
GST tag Glutathione S-transferasa (26 kDa)Columna: resinas de glutathioneElución: Glutatión
Tags basados en estreptavidina/biotina: BCCP (péptido señal de biotinilación) (100aa)Las proteínas que incluyen el tag BCCP, pueden ser biotiniladas mediante la enzima biotin ligasa, una vez biotinilada, la purificación de proteínas recombinantes puede llevarse a cabo mediante cromatografía de afinidad con resina de estreptavidina.Elución: destiobotin - NaOH
TAGProteína
recombinante
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Cromatografia de líquidos de alta resolución (HPLC)
El material de las columnas está muy finamente dividido (2,5 a 5
micrones) lo que incrementa la posibilidad de interacción y el
poder resolutivo. Para obtener flujos adecuados es necesario
emplear presiones elevadas.
Posee alta resolución por lo que se emplea para
determinaciones cuantitativas exactas
Se emplea en la industria y en la ciencia para la determinación
de plaguicidas, hidrocarburos, aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos, azucares, drogas, terpenoides
UPLC (partícula menor de 2 micrones – mayor presión)
FPLC se emplea para biomoléculas de varios kDa. Se usan otras
matrices y menor presión
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HPLC
pH buffers
Temperatura lo más baja posible , 0 ºC
Enzimas degradativasProteasas, inhibidoresDNasas y Rnasas guantes
Desnaturalización por glicerol, ABSelevada actividad de agua
Almacenamiento por largos períodos (crecimiento de microorganismos y oxidación)
Cuando las biomoléculas no se hallan e su entorno natural se vuelven inestables y es necesario controlar:
bajas temperaturas (-80 ºC, -196 ºC)
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Pasos generales empleados para realizar una purificación
EXTRACTO CRUDO
PURIFICACIÓN DE LA MOLÉCULA DE INTERÉS
FUENTE NATURAL
FraccionamientoCromatografíasElectroforesis
PRODUCTO PURIFICADO
RendimiemtoPurificaciónActividad Biológica
Ruptura celularCentrifugación
Tabla de Purificación