Villalobos Osorio Darly Coromoto

1) Actividad biológica y farmacológica de diterpenos del labdano : 2) Aislamiento, caracterización

estructural y actividad biológica de diterpenos del labdano del oxylobus glanduliferus parte 1

Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Química Aplicada. 2008. p. 165

Venezuela

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Universidad de Los Andes Facultad de Ciencias. Departamento de Química. Postgrado Interdisciplinario en Química Aplicada

1. Actividad Biológica y Farmacológica de Diterpenos del Labdano

2. Aislamiento, Caracterización Estructural y Actividad Biológica de Diterpenos del

Labdano del Oxylobus glanduliferus

Trabajo de Grado de Maestría en Química Aplicada (Opción Orgánica)

Farm. Darly C. Villalobos Osorio

SERBIULA Donación

Mérida-Venezuela Mayo, 2008

DIGITALIZADO http://tesis. u la. ve

AGRADECIMIENTOS

• A DIOS todopoderoso, por estar presente en cada uno de mis pasos.

• A mi esposo Jairo y mi hijo "Carlitas" quienes me brindaron apoyo, paciencia y amor.

• A mis maravillosos padres quienes me infundieron la ética y el rigor que guían mi transitar por la vida.

• A mis hermanos, mi cuñada Karina y mi sobrino "Dubito" por confiar en mí y siempre contar con ustedes en los momentos difíciles.

• A !rama Ramírez amiga incondicional, por su valiosa ayuda.

• A mi tutor de Tesis, profesor Juan· Manuel Amaro Luis por sus enseñanzas, confianza y calidez.

• A los profesores Paulina Delgado y Ali Bahsas por el asesoramiento científico y estímulo para seguir creciendo intelectualmente.

• Al grupo de Productos Naturales por abrirme sus puertas y acogerme en sus espacios.

• A la profesora María del Carmen Araque por la realización de los ensayos microbiológicos.

• Al FONACIT (Fondo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación) por el financiamiento otorgado a través del Programa Agenda Petróleo para la realización de esté Trabajo de Grado.

¡¡

2

CONTENIDO

Página

1. Acta ......................................................................... :............. i

2. Agradecimientos..................................................................... ii

3. Contenido .......................................................................... . 2

4. Resumen............................................................................... 4

5. CAPÍTULO 1: Actividad Biológica y Farmacológica de Diterpenos del Labdano.......................................................................... 5

5.1 Introducción.................................................................. 6

5.2 Actividad Bactericida.................................................... 7

5.3 Actividad Fungicida............................................................... 14

5.4 Actividad Antiviral...................................................... 16

5.5 Actividad Leishmanicida y Antimalárica........... ... . .. . .. . .. ... 17

5.6 Actividad Anti-Inflamatoria........................... .. ... . . .. .. . .. .. 18

5.7 Actividad Antiespasmódica........................................... 19

5.8 Actividad Cardiotónica.... ... .. ............. .... .. .... ......... ......... 20

5.9 Actividad Antihipertensiva............................................ 20

5.10 Actividad Antihipercolesterolémica................................ 21

5.11 Actividad Inmunosupresora........................................... 21

5.12 Acción Inhibidora de la Agregación Plaquetaria............. .... 22

5.13 Actividad Gastroprotectora............................................ 24

5.14 Actividad Antinociceptiva............................................. 25

5.15 Actividad Antimutagénica............................................. 25

5.16 Actividad Cito tóxica y Antitumoral.............................. ... 26

5.17 Actividad Inhibidora Sobre Varias Enzimas....................... 31

5.18 Actividad Anti-Algal.................................................... 32

5.19 Edulcorantes............................................................... 33

5.20 AndrographoEdo..... ............. .... . ... . .. ... .. . . . . ........ .. .. ........ 34

5.í. 1 Forskolina........................................................... ........ 36

6. Referencias Bibliográficas......................................................... 38

7. CAPíTULO 2: Aislamiento, Caracterización Estructural y Actividad Biológica de Diterpenos del Labdano del Oxylobus glanduliferus ... .................................................................................... . 51

7.1 Introducción.................................................................. 52

7.2 Objetivos..................................................................... 54

7.3 Resultados y Discusión.................................................. 55

7.3.1 Labdan-8a,15-diol [1] ....................................... 57

7.3.2 Labdan-8a-ol-15-al [2]....................................... 75

7.3.3 Ácido Labdanólico [3]..... ......... ... . .. ......... ...... .... 83

7.3.4 Labdan-8a-ol-15-oato de metilo [4]........ .......... ... 95

7.3.5 13-epi-Labdan-8a,15-diol [5] ............................. 104

7.3.6 Oxylobusol [6] ....... :......................................... 113

7.3.7 13-epi-Oxylobusol [7]....................................... 130

7.4 Preparación de Algunos Ésteres del Labdan 8a,15-diol [1]...... 139

7.4.1 15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol [8]..................... 140

7.4.2 15-0-Propanoato de Labdan-8a,15-diol [9]............ 147

7.4.3 15-0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol [10]............ 154

7.4.4 15-0-Isobutanoato de Labdan-8a,15-diol [11]......... 161

7.5 Evaluación de la Actividad Antibacteriana Mediante la Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima, de los Labdanos Naturales [1] y [5), y de los Derivados [3], (8), (9], [10] y [11), Obtenidos a partir de (1]..... ...... .... .. ... . .. ... . .. 165

7.6 Estudio de las Interacciones de los Labdanos [1] y [5] con Modelos de Membranas Fosfolipídicas, a través de Análisis por Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC).................. 168

7.7 Parte Experimental....................................................... 172

7.8 Referencias Bibliográficas.............................................. 184

8. CONCLUSIONES ....................................................................... . 193

9. ÍNDICES ................................................................................ . 195

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RESUMEN

Este Trabajo de Grado de Maestría incluye los siguientes capítulos:

Capítulo 1: Una revision bibliográfica en la cual se describen algunos aspectos sobre las actividades biológicas y farmacológicas de los diterpenos dellabdano.

Capítulo 2: Un estudio fitoquírnico de la especie Oxylobus glanduliferus A. Gray (Compositae). Como resultado de este estudio se aislaron de las partes aéreas del O. glanduliferus los nuevos diterpenos del labdano Oxylobusol (6] y 13-epi-Oxylobusol (7] junto con los conocidos Labdan-8a.,15-diol [1] y 13-epi-Labdan-8a.,15-diol (5] Estos compuestos naturales y también algunos derivados sintéticos obtenidos a partir del Labdan-8a,15-diol fueron caracterizados sobre la base de estudios espectroscópicos, incluyendo experimentos uni- y bidimensionales de RMN. Un estudio sobre la actividad antibacteriana de estos diterpenos naturales y semisintéticos fue llevado a cabo. Por último, la técnica de calorimetría de barrido diferencial (DSC) fue aplicada para estudiar los efectos térmicos de [1] y [5] sobre un modelo artificial de bicapas de dipalmitoilfosfoftalidilcolina (DPPC).

SUMMARY

This MSc Degree Work includes the following chapters:

Chapter 1: A bibliographic review, in which sorne aspects on the biological and pharmacological activities of labdane diterpenes are described.

Chapter 2: A phytochemical study of the species Oxylobus glanduliferus A. Gray (Compositae). As result of this study the new labdane diterpenes Oxylobusol [6] y 13-epi-Oxylobusol [7], together with the known ones Labdane-8a,15-diol (1] and 13-epi-Labdane-8a., 15-diol (5], were isolated from aerial parts of O. glanduliferus. These natural compounds, as well as sorne synthetic derivatives obtained from Labdane-8a, 15-diol were characterized on the basis of spectroscopic studies, induding uni- and two-dimesional NMR experirnents. A study on antibacterial activity of these natural and semisynthetic diterperms was carried out. Finally, differential scanning calorimetry (I"JSC) technique, was applied to study the thermal effects of [1] and (5] on an artificial model of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) bilayers.

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Capítulo 1

Actividad Biológica y Farmacológica de Diterpenos del Labdano

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6

INTRODUCCIÓN

Los labdanos conforman un grupo de productos naturales incluidos entre los diterpenos bicíclicos, cuyo esqueleto contiene como unidad básica un sistema "trans"-decalínico-4,4,8,9, 10-pentasustituido. El sustituyente en C-9 es una cadena isoprénica de seis carbonos [1] (Conolly & Hill, 1991).

12 14

2

3

18 19

[1]

La biosíntesis de los labdanos, al igual que la de la mayoría de los diterpenos, se origina a partir del Ácido Mevalónico, el cual evoluciona al Pirofosfato de Geranil-Geranilo (CGGP); esté actúa como el precursor específico de todos los diterpenos cíclicos. La delación del CGGP es catalizada por enzimas y probablemente iniciada por un protón (Esquema A) (Luckner, 1972).

OPP

GGPP Labdano

Esquema A: Ciclación del GGPP para Originar el Esqueleto del Labdano

Paralelamente al aislamiento y determinación estructural de este tipo de diterpenos, productos del metaboli~mo secundario de las plantas, se han desarrollado numerosas investigacioi.es orientadas a determinar la actividad biológica y/o farmacológica que dichos productos pudieran exhibir. En el presente capítulo se pretenden recopilar aspectos sobre los estudios llevados a cabo e:p. este campo.

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1. ACTIVIDAD BACTERICIDA

La búsqueda de nuevos principios que sean potencialmente activos frente a microorganismos patógenos, ha sido uno de los principales objetivos planteados en el campo de los productos naturales. Esta búsqueda encuentra su justificación en el hecho de que los extractos de ciertas plantas medicinales se han usado durante siglos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas (Recio & Ríos, 1989). Entre los diterpenos dellabdano con actividad bactericida se pueden citar los aislados del extracto metanólico de las hojas del Viburnum suspensum Lindl. (Caprifoliaceae). Estos labdanos diglicosidados llamados Gomojosidos A·J difieren sólo en la sustitución del anillo central; un ejemplo de ellos es el Gomojosido G [1]. Estos diterpenos exhibieron una potente actividad bactericida frente a Escherichia coli y Bacillus subtilis (Iwagawa et al., 1992).

En un estudio posterior, la investigación fitoquímica de una fracción menos polar del V. suspensum arrojó el aislamiento de nuevos labdanos monoglicosidados, los cuales fueron llamados Gomojosidos K-Q. Todos ellos exhibieron potente actividad antibacterial contra Aeromonas salmonishida a una concentración de 100 ppm y también resultaron activos contra B. subtilis (Iwagawa et al., 1993). Entre estos diterpenos destacan algunos derivados con un anillo lactónico entre C-19 y C-6, como es el caso del Gomojosido Q [2].

Gomojosido G [1] Gomojosido Q (2]

El Cistus incanus ssp. creticus L. (Cistaceae) es utilizado en la medicina tradicional para el tratamiento de varias enfermedades. Las hojas de todas las especies de Cistus se encuentran recubiertas con glánduléi s secretoras de resinas y aceites esenciales. Esta resina, comúnmente llamada "1EJano" en la Farmacopea Europea, consta principalmente de terpenoides, siendo particularmente abundantes . en la misma los diterpenos de la serie dellabdano.

8

De las hojas de C. incanus ssp. creticus fueron aislados varios diterpenos del labdano, entre los que se encuentran algunos derivados sencillos del grupo del ent-Óxido de Manoilo. El estudio comparativo de una serie de extractos de diferentes partes de esta planta (frutos y hojas) y del aceite esencial, mostró variaciones en la composición porcentual de los epímeros (3] y (4], y esto tiene implicación en la actividad biológica. Así pues, mezclas conteniendo diferentes porcentajes de ambos epímeros, y también una muestra. pura de [3] fueron ensayados contra Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. hominis y Escherichia coli. Al incrementarse el porcentaje de (3], la actividad frente a Staphyloccoccus aumenta y por ello se asume que (3] es más activo que [4] (Demetzos et al., 2002).

~ ~ r···· . o

(3] [4]

En otro estudio similar de esta misma especie se aislaron siete labdanos, estructuralmente relacionados con el 13-epi-Sclareol (5], los cuales resultaron ser también activos. El ensayo antibacterial de estos compuestos fue llevado a cabo a una concentración de 100 JlglmL; las bacterias empleadas fueron: Escherichia coli, Enterobacter cloacea, K. pneumoniae, Pseudomona aeruginosa, S. epidermidis y S aureus. Todos los compuestos excepto uno de ellos, mostraron ser más activos que la ampicilina frente a K. pneunmoniae y a S. aureus. Es importante destacar, que químicamente la única diferencia estructural del compuesto que resultó inactivo, radica en la presencia de un doble enlace C-7 /C-8, el cual no se encuentra en los compuestos activos (Chinou et al., 1994). 13-epi-Sclareol (5]

Recientemente se efectuó una investigación más detallada sobre la actividad antibacterial del 13-epi-Sclareol, aislado en este caso, del exudado resinoso de nos especies de Asteraceae: Pseudognaphalium heterotrichium (Phil.) Andf,rb. y P. cheiranthifolium (Lam.) Hilliard & B.L. Burtt. En este estudio se ensayó su actividad frente a cuatro bacterias Gram-( +) y tres Gram-(-), usando .tres métodos diferentes: Medio sólido, medio líquido y un micro-método en medio líquido.

9

Se encontró que el 13-epi-Sclareol es ligeramente más activo contra B. cereus, B. subtilis y B. coagulans que contra S. aureus en medios sólido y líquido. Estos resultados concuerdan con el hecho de que B. cereus, B. subtilis y B. coagulans forman cadenas largas y separadas, con lo cual, este arreglo espacial habría de facilitar su interacción con el diterpeno. Al contrario, S. aureus forma asociaciones globulares que sólo permiten la interacción del compuesto con la superficie externa de las células bacterianas. Por otro lado, la alta selectividad del 13-epi-Sclareol contra bacterias Gram-( +),puede sugerir que la pared de las células de las bacterias Gram-(-) actúa como una barrera que impide el acercamiento del compuesto a la membrana citoplasmática. Esta pared celular está constituida por una capa delgada de peptidoglicanos y una membrana exterior, una estructura que no está presente en las bacterias Gram-( + ). La carga negativa de la membrana exterior y la hidrofobicidad de [5] podría ser la causa por la cual éste diterpeno no penetra la pared de las bacterias Gram+) (Mendoza et al., 2002).

En otros estudios también se ha evaluado la actividad antibacterial frente a B. subtilis de varios diterpenos del labdano. Así tenemos que el Sclareol (6] y dos labdanos relacionados [7] y [8] aislados del Astragalus brachystachys D.C. (Leguminosae) fueron ensayados contra esta bacteria, observándose que la acción bactericida de los mismos se encuentra en el siguiente orden: (6] > [7] > [8], el cual es consistente con el aumento de polaridad de los compuestos. Por otro lado, se dedujo que la epoxidación del doble enlace del Sclareol o la hidroxilación en C-6 resulta en un descenso de la actividad antibacterial Uassbi et al., 2002). Vale la pena destacar que este diterpeno es usado comercialmente en la manufactura de perfumes tipo ambergris, y además es un potente inhibidor del crecimiento de hongos rojizos (Bailey et al., 1975). Este diterpeno se encuentra en cantidades razonables sólo en el follaje de una Solanaceae, la Nicotiana glutinosa L. y en las flores de Salvia sclarea L. (Lamiaceae); por esta razón ha surgido un gran interés en el desarrollo de líneas celulares, con el fin de incrementar la producción de Sclareol, así como también en la purificación del sistema enzimático responsable de su biosíntesis (Banthorpe et al., 1990).

H

Sclareol (6] 14R-Epoxisclareo1 (7] 6(3-Hidroxisclareol [8]

10

La Premna oligotricha Baker. (Verbenaceae) es un arbusto cuyas ramas son usadas para masticar, mientras que el humo que se forma al quemar la planta es utilizado en la esterilización de envases contenedores de lácteos, dando lugar a una leche que permanece fresca por prolongados periodos. Estos usos sugieren la probable presencia de compuestos antibacteriales, y en efecto, el extracto etanólico crudo de P. oligotricha mostró actividad antibacterial contra algunas bacterias Gram-( + ). Esta actividad incrementó a lo largo de varias etapas de purificación y finalmente se llegó al aislamiento de dos compuestos [9] y [10] que mostraron actividad contra bacterias Gram-( + ). La actividad de [9] fue baja, pero la de [10] fue bastante buena, casi equiparable con la de la Estreptomicina que se usó como patrón de comparación (Habtemarian et al., 1992).

COOH

[9] [10]

Algunas bacterias Gram-( + ), particularmente especies de Streptococcus están implicadas en la caries dental y en desórdenes relacionados. Se supone que el uso de P. oligotricha en forma masticada, puede por consiguiente, proporcionar alguna defensa química contra la acumulación nociva de bacterias Gram-( + ).

De la semilla del Aframomum aulacocarpos Pellegr. (Zingiberaceae) se aislaron tres diterpenos de la serie del labdano: Aulacocarpinolido [11), Aulacocarpin A [12] y Aulacocarpin B (13]; tales compuestos inhibieron moderadamente el crecimiento de bacterias patógenas como B. subtilis, con una concentración mínima inhibitoria de 25 lJ.g/mL (Ayafor et al., 1994).

~o HO''

Aulococarpinolido [ 11]

R

R=H AulacocarpinA (12) R=OH Aulacocarpin B (13)

11

El Potamogeton nodosus Poir. (Potamogetonaceae) es una hierba acuática, que en el sistema Ayurvédico es utilizada por ser eficaz en el tratamiento de cáncer, tuberculosis, acné y tos. Del extracto etanólico de P. nodosus se aisló, un nuevo diterpeno labdano furanoide [14] y el mismo mostró moderada actividad antibacterial contra B. cereus, B. subtilis, Shigella boydii, S. shiga, S. sonnei, Staphylococcus aureus y Streptococcus faecalis (Qais et al., 1998). De otra especie de este género, concretamente del Potamogeton malaianus Miq., se aislaron dos labdanos, Potamogetonido [15] y Potamogetonol [16], los cuales exhibieron actividad frente a Mycobacterium tuberculosis (Kittakoop et al., 2001).

(14]

9 CH20COCH3

R=CHO Potamogetonido (15] R= CH20H Potamogetonol [16]

De la oleoresina de la planta peruana Copaifera paupera (Herzog) Dwyer. (Cesalpinaceae) se lograron aislar varios diterpenos del labdano con actividad antibacterial, como por ejemplo el Ácido (-)-Copálico [17], el cual resultó activo frente a B. subtillis, S. aureus y S. epidermidis. Se pudo deducir que la presencia del grupo carboxilo afecta fuertemente la actividad antimicrobial, ya que al transformarlo, la actividad desaparece (Tincusi et al., 2002).

Del extracto clorofórmico de la Salvia leriaefolia Benth. (Lamiaceae) se aisló un diterpeno de la serie del labdano: 8(17),12E,14-Labdatrien-6,19-olido [18], el cual mostró actividad frente a S. aureus. Este diterpeno presenta, como grupo funcional más característico, un anillo lactónico (Habibi et al., 2000).

~

Ácido (-)-Copálico [ 17] [18]

12

Corno parte de un programa relacionado con la búsqueda de nuevos agentes antirnicrobiales de origen natural, un total de diez compuestos semi-sintéticos derivados del Ribenol [19] fueron preparados: tres carboxilatos [20], [21], [22], cinco carbarnatos (23], (24], [25], (26] y (27], un rnetanosulfonato [28], y un glicósido [29] (Kalpoutzakis et al., 2001).

/'J = ~ r····-

QJ:· .~ , .. ·

HO , (19]

(RCOlzO, RCOC:Y RN=C=O CHJXl~'-.r

~· . = ,-

~0 ... ~··

RO' /'• ,,,

[20) R=COCH3 (21] R=COC~5 [22] R=COC6H4N02

[23) R=CONHC6H5

[24) R=CONHC6H40CH3 Cl (25] R=CONHCH2(CHzhoCH3 [26] R=CONH(CH2)zCH3

[27] R=CONHCH2CH2Cl

b

[29)

[28)

La actividad antirnicrobial de estos compuestos fue probada contra dos bacterias Gran1-(+): S. aureus y S. epidermidis, y cuatro bacterias Grarn-(-): E. coli, E. cloaceae, K. pneumoniae y P. aeruginosa. En cuanto a la relación estructura actividad, es interesante señalar que el Ribenol mostró buena actividad frente a S. aureus, S. epidermidis, K. pneumoniae y P. aeruginosa, así como los esteres de los ácidos carboxílicos (20), [22] y los carbarnatos (26) y [27]. El compuesto [.'!7] mostró un amplio espectro de actividad {Kalpoutzakis et al., 2001). En este es~t'Jio se llegó a la conclusión, en concordancia con resultados publicados previamente, que la actividad antimicrobial aumenta con el incremento de la lipofilicidad (Roth et al., 1988).

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Los océanos son una fuente rica de plantas marinas y animales. En años recientes se han aislado potenciales agente terapéuticos de la flora y fauna marina; así tenemos que de una esponja tailandesa del genero Mycale, fueron aislados los Micaperoxidos A (30] y B (31], los cuales son sesteterpenos que posee el grupo decalínico de los labdanos con la cadena lateral sobre C-9 aumentada en una unidad isoprénica. En razón a esta analogía estructural, se ha considerado interesante incluirlos en este estudio. Estos compuestos son potentes inhibidores del crecimiento de las bacterias B. subtilis y S. aureus (Tanaka et al., 1993).

Micaperoxido A (30] Micaperoxido B [31]

Entre la amplia variedad de metabolitos secundarios aislados de esponjas marinas, han sido descritos algunos sulfato-ésteres, entre los que destacan los de tipo esteroidal y fenólicos. En la búsqueda de nuevos metabolitos biológicamente activos, de una esponja marina de la familia Halichondriidae conocida en California con el nombre común de "castaña oscura", se aisló un sesteterpeno hidroquinona sulfatado (32), el cual inhibe el crecimiento de S. aureus a una concentración de 5 Jlg/disco y de B. subtilis a una concentración de 50 Jlg/disco (Kernan et al., 1988).

OH

14

2. ACTMDAD FUNGICIDA

Una gran variedad de compuestos naturales inhiben el crecimiento de hongos patógenos y garantizan un tratamiento efectivo en la mayoría de las micosis superficiales. En el caso concreto de los diterpenos de la serie dellabdano, se han descrito algunos ejemplos de compuestos con actividad fungicida, como por ejemplo el Aframodial (33), presente en las semillas de una especie de la familia Zingiberaceae, el Aframomum daniellii K. Shum. (Kimbu et al., 1987).

También del extracto metanólico de las semillas secas de otra Zingiberaceae, la Alpinia galanga Willd., se obtuvieron cinco diterpenos labdánicos, los cuales mostraron potente actividad antifúngica contra cinco especies del género Gandida (Morita et al., 1988). Un ejemplo representativo de estos diterpenos es la Galanolactona (34].

CHO

Aframodial [33] Galanolactona [34]

Otra especie de la familia Zingiberaceae, la Renealmia alpinia (Rottb.) Maas, la cual es usada como febrífuga en Surinam, biosintetiza diterpenos dd labdano como por ejemplo los aldehídos [35) y [36), los cuales inhibieron el crecimiento de la cepa Sc-7 de la levadura Saccharomyces cerevisiae (Zhou et al., 1997).

COOH

[35] (36j

15

Cabe así mismo destacar que varios de los diterpenos anteriormente descritos, poseen también actividad antifúngica, como es el caso del carboxilato (20], el carbamato (27] y el glicósido [29] (pág. 12), todos ellos derivados semi-sintéticos obtenidos a partir del Ribenol [19], los cuales exhibieron una buena actividad fungicida contra tres especies del género Gandida (Kalpoutzakis et al., 2001). También entre los labdanos con actividad antibacteriana aislados del Cistus incanus destacan algunos que poseen actividad antifúngica contra C. albicans, como por ejemplo el compuesto [37] (Chinou et al., 1994).

OH

[37]

En otro estudio sobre los diterpenos presentes en el Plectranthus ornatus Codd. (Labiatae), se logró aislar la Plectrornatina C [38], un labdano que mostró moderada actividad fungicida (con una MIC= 62,5 ¡...Lg/mL) frente a Gandida albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei y C. tropicalis (Rijo et al., 2002).

El aceite esencial de las hojas del Solidago chilensis Cabrera. (Asteraceae), mostró ser un agente eficaz contra algunos dermatofitos: Microsporum gypseum y Trichophyton mentagrophytes, mientras que resultó ser inactivo frente a otros hongos filamentosos como Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum var. pinaster y Penicillium purpurogenum. El Pumiloxido [39], un raro diterpeno dellabdano, fue encontrado como el componente mayoritario del aceite (Vila et al., 2002).

······~Ha O Hb

OAc

Plectromatina C [38] Pumiloxido (39]

16

3. ACTIVIDAD ANTIVIRAL

Los tratamientos que existen contra las infecciones virales no suelen ser del todo satisfactorios, ya que la mayoría de las drogas que destruyen los virus también afectan a las células en las que se reproducen, de allí la importancia de la búsqueda, de nuevos agentes antivirales de origen natural que superen esta deficiencia. En el caso concreto de los diterpenos dellabdano tenemos algunos ejemplos, como los ya citados Micaperoxidos A (30] y B [31] (pág. 13) los cuales resultaron activos frente al virus de la estomatitis vesicular y al herpes simple tipo 1 (Tanaka et aL, 1993). También el Potamogetonido [15] y el Potamogetonol [16] mencionados anteriormente, (pág. 11) mostraron ser potentes antivirales contra HSV-1 (virus del herpes oral) (Kittakoop et al., 2001).

Del extracto clorofórmico de la corteza de la Thuja standishii Carr. (Cupressaceae) se aislaron siete diterpenos dellabdano y todos ellos expresaron un fuerte efecto inhibitorio del antígeno temprano del virus de Epstein-Barr (EBV-EA), cuya activación es inducida por el 3-Acetil-12-0-tetradecanoil-phorbol (TPA). Uno de ellos, el Ácido 15,16-bisnor-13-0xolabda-8(17),11E-dien-19-óico (40] presentó el mayor efecto inhibitorio en la activación de EBV-EA, siendo este efecto más fuerte que el del ~-caroteno el cual ha sido intensamente estudiado en la prevención del cáncer usando modelos animales. También se determinó que [40] muestra una excelente actividad antitumoral en dos etapas de carcinogénesis inducida por 7,12-dimetilbenz[a]antraceno y TPA, por lo que se está estudiando la posibilidad de ser usado como agente quimiopreventivo de uso clínico (Tanaka et al., 2000).

Más adelante, se reportó otro estudio exhaustivo de extractos de esta misma especie (Thuja standishii Carr.), el cual condujo al aislamiento de nuevos diterpenos entre los cuales el Ácido 125-Hidroxi-labda-8(17),13(16),14-trien-19-óico [41], mostró un moderado efecto inhibitorio en la inducción por TPA del EBV-EA (lwamoto et al., 2001).

º"

COOH COOH

(40] [41]

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4. ACTIVIDAD LEISHMANICIDA Y ANTIMALÁRICA

Durante muchas décadas, la primera opción para el tratamiento de la leishmaniasis, han sido drogas derivadas del antimonio pentavalente. Estos medicamentos requieren administración parenteral y aparte de ser de elevado costo, su eficacia es variable y producen algunos efectos secundarios tóxicos; por otro lado, también se ha reportado que los parásitos han desarrollado cierta resistencia a estos medicamentos, por lo que existe una necesidad urgente de nuevas drogas leishmanicidas, y entre las alternativas exploradas destacan algunos compuestos de origen natural (Chan-Bacab et al., 2001).

En la búsqueda de nuevos diterpenos leishmanicidas, del extracto neutro de la corteza de Polyalthia macropoda King. (Annonaceae), se logró aislar un nuevo labdano, el (4S,9R,10R)-Metil-18-carboxilabda-8,13(E)-dien-15-oato [42), el cual resultó ser biológicamente activo contra promastigotes de Leishmania donovani. (Richomme et al., 1991).

También el diterpeno [9], anteriormente referido (pág. 10), aislado de dos especies etíopes del género Premna: P. schimperi y P. oligotricha, presentó actividad leismanicida frente a promastigotes de Leishmania aethiopica, el agente causal de la leishmaniasis cutánea en Etiopía (Habtemariam, 2003).

El Aframomum latifolium K. Schum (Zingiberaceae) es tradicionalmente usado contra los síntomas relacionados a la malaria. Del extracto de las frutas y hojas de otras especies de este género: A. latifolium y A. sceptrum K. Schum, se aislaron varios labdanos con actividad antimalárica; una muestra representativa de ellos es la Coronarina B [43), la cual mostró una moderada actividad contra cepas de Plasmodium falciparum sensibles a la cloroquina (Duker-Eshun et al., 2002).

CHO

OH

[42] (43]

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5. ACTMDAD ANTI-INFLAMATORIA

La inflamación es un complejo proceso fisiopatológico, caracterizado por enrojecimiento, calor, hinchazón y disminución de las funciones del órgano afectado. Este proceso se encuentra mediado por una variedad de moléculas intermediarias producidas por neutrófilos, monocitos/macrófagos, células cebadas, plaquetas y linfocitos, así como por la activación de la cascada del complemento, la cual provoca la formación del edema como resultado de la extravasación de fluidos, proteínas y leucocitos en el sitio de inflamación (Ley, 2001).

Entre los tipos de fármacos que inhiben los procesos inflamatorios, destacan los glucocorticoides y los anti-inflamatorios no esteroideos (AINES), los cuales, en su gran mayoría son de origen sintético. Recientemente ha habido un renovado interés en la búsqueda de productos anti-inflamatorios de origen natural, entre los cuales se han descrito algunos compuestos activos de origen isoprenoide (Almeida et al., 2002).

La fracción soluble en éter etílico, del extracto metanólico de las hojas de la Cryptomeria japonica D. Don. (Cupressaceae), mostró una acción anti-inflamatoria y un efecto inhibidor de la contracción de ileum de cobayo inducida por histamina. La actividad anti-inflarnatoria fue probada por el método CEP (edema podal inducido por carragenina). El componente activo fue aislado e identificado como Ácido cis-Commúnico (44], siendo éste el primer reporte de un compuesto con esqueleto dellabdano con actividad anti-inflamatoria (Shimizu et al., 1988).

El extracto hexánico de las partes aéreas de una especie de la familia Labiatae, la Sideritis javalambrensis Pau., exhibió actividad anti-inflamatoria, y del mismo se logró aislar el Óxido de ent-16-Hidroxi-13-epi-manoílo [45], el cual fue identificado como el principio activo responsable de esta actividad. El mecanismo de acción de este diterpeno parece ser independiente de la inhibición de la ciclo oxigenasa, ya que no disminuyó la actividad de la enzima en varios prueba realizadas "in vitro" (Alcaraz et al., 1989).

HOOC

[44] [45)

19

De esta misma especie del género Sideritis, se reportó el aislamiento de otros dos diterpenos, [46] y [47], los cuales mostraron actividad anti-inflamatoria, en rangos de concentraciones entre 10"7 M a 10-4 M; además se encontró que ambos compuestos inhiben la síntesis de prostaglandina E2• (De las Heras et al., 1994). De otra especie de este mismo género, la S. foetens Benth, se aisló el Andalusol [48], un labdano que mostró actividad anti-inflamatoria "in vivo" (Navarro et al., 1997).

OAc

H

[46] [47] [48]

6. ACTMDAD ANTIESPASMÓDICA

La Dodonaea viscosa Jack. (Sapindaceae), un arbusto que se encuentra ampliamente distribuido en México, es usado en la medicina tradicional en el tratamiento de dolores estomacales y en diversos desórdenes que involucran músculo liso. De las partes aéreas de esta especie se aisló un diterpeno de la serie del labdano, el ent-15,16-Epoxi-9aH-labda-13(16)14-dien-3P-8a-diol [49], el cual provoca una inhibición dosis-dependiente de la contracción espontánea y de la contracción inducida con electricidad del ileum de cobayo; así como también de la contracción de ileum de cobayo inducida por acetilcolina, histamina y cloruro de bario. En adición, este diterpeno es capaz de relajar la contracción de útero de rata inducida por Ca+2

, con lo cual cabe su poner que el mismo produce interferencia en el metabolismo del calcio en el músculo liso de las ratas. Estas observaciones proporcionan la base farmacológica que justifica el uso tradicional de esta planta como agente antiespamódico, en la medicina popular mexicana (Rojas et al., 1996). [49)

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7. ACTIVIDAD CARDIOTÓNICA

En la actualidad se dispone de muchos agentes cardiotónicos efectivos, tanto de origen sintético como de origen natural; entre estos últimos destacan los glicósidos cardiotónicos, los cuales exhiben mejor respuesta en comparación con las drogas sintéticas (Bohm, 2002).

Recientemente, algunos diterpenos del labdano han llamado la atención como potenciales agentes cardiotónicos; así tenemos que en el estudio fitoquímico de la raíz del Melodinus monogynus Roxb. (Apocynaceae), se lograron aislar varias agliconas diterpénicas y sus correspondientes glicósidos, con este tipo de actividad. Una de estas agliconas, es el alcohol denominado Medigenina (50], el cual junto a su acetato [51] presentarán actividad cardiotónica en corazón aislado de rana y de

O conejo; el compuesto [50] incrementó el tono y la fuerza de contracción del corazón de rana,

0 mientras que la velocidad de contracción fue

R = H [50]

R = Ac [51)

...l~rtT'n~rt"''t"(TOrlrlA ~fortnc CÍTTll'lares como ' otr' • u.J..:>UJ..L.u.u._y v.o..o.uv. '-' ... ~._.,...,v vuu ~ ln OplCO

positivo y cronotrópico negativo se observaron en el corazón de conejo. El derivado acetilado (51] también mostró estas propiedades y resultó ser más potente que el alcohol (Sethi et al., 1988).

8. ACTIVIDAD .ANTIHIPERTENSIVA

El extracto acuoso de las partes aéreas del Marrubium trulgare L. (Lamiaceae), redujo significativamente la presión arterial sistólica en ratas con hipertensión espontánea (no inducida); esto se encuentra relacionado a un efecto vasodilatador "in vivo" e "in vitro", exhibido por el extracto de esta planta (El Bardai et al., 2001). En un estudio posterior, El Bardai et al., (2003), determinaron que los compuestos responsables de la acción vasorelajante atribuida a esta planta, son dos diterpenos del labdano, la butirolactona Marrubina [52] y el triol Marrubenol [53].

o

Marrubina [52)

o

' . .. •''

-HOH2C ~ OH

Marrubenol [53]

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9. ACTIVIDAD ANTIHIPERCOLESTEROLÉMICA

En el cuerpo humano los niveles de colesterol sérico se encuentran regulados básicamente por tres factores: Consumo de colesterol en los alimentos, biosíntesis de colesterol en el hígado y excreción del colesterol; sin embargo la biosíntesis de colesterol en el hígado es el principal factor que regula los niveles de colesterol sérico (Spady et al., 1983). En la búsqueda de nuevos agentes capaces de regular los niveles de colesterol, se ha recurrido también a los productos de origen natural.

El ya referido Aframodial (33) (pág. 14), aislado de los rizomas del jengibre, Zingiber officinale Rosco e (Zingiberaceae ), reveló un efecto inhibitorio de la biosíntesis del colesterol en ratas con hipercolesterolemia inducida. El efecto hipocolesterolémico resultó con igual potencial que el de la Atromida-S, la cual es un conocido agente terapéutico usado en casos de hipercolesterolemia. Se asume que el mecanismo de acción se debe a una inhibición de la enzima HMG-CoA reductasa, debido a que la estructura de [33] es análoga a la del "Compactic" (un conocido inhidor de la HMG-CoA reductasa); no obstante esto se encuentra aún en estudio (Tanabe et al., 1993).

10. ACTIVIDAD INMUNOSUPRESORA

Las células implicadas en la respuesta inmune involucran linfocitos y monocitos, y estos pueden ser modulados por varios tipos de agentes, incluyendo los de origen bacteriano, los provenientes de los hongos, de las plantas y productos sintéticos (Han et al., 1998b; Lin et al., 2000). El ya referido Andalusol [48] (pág.19) mostró actividad inmunosupresora, puesta de manifiesto a través de un efecto inhibitorio de la proliferación de linfocitos inducida por Concavanalina A y también por su actividad moduladora "in vitro" de la actividad hemolítica en la ruta clásica del sistema de complemento (Navarro et al., 2000).

Otro ejemplo significativo es el del Miriadenolido [54], un ent-labdano aislado de la Alomia myriadenia Baker. (Asteraceae), el cual inhibe completamente la proliferación de células mononucleares de la sangre periférica humana {PBMC); este compuesto no resultó tóxico a los linfocitos a la!i dosis ensayadas (Souza-F1gundes et al., 2002). Posteriormente se determinó que [54] induce la apoptosis en monocitos, hecho éste que explica su efecto inmunosupresor (Souza-Fagundes et al., 2003a). Miriadenolido (54]

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11. ACCIÓN INHIBIDORADE LAAGREGACIÓN PLAQUETARIA

La 1-0-Alquil-2-0-Acetil-sn-Glicero-3-Fosfocolina (conocido como PAF) es un mediador fosfolipídico y una de las más potentes sustancias de bajo peso molecular que activa la agregación plaquetaria. El P AF induce varias respuestas fisiológicas, las cuales incluyen incremento de la permeabilidad vascular (Wedmore et al., 1981), hipotensión (Tanaka et al., 1983a), broncoconstricción (Vargaftig et al., 1980) y exudación de proteínas del plasma (Sanchez-Crespo et al., 1982). Los antagonistas PAF podrían ser usados en el tratamiento de algunas enfermedades; sin embargo, aunque varios fármacos con esta actividad han sido desarrollados, ninguno cumple las características básicas de alta potencia, baja toxicidad y buena biodisponibilidad (Yasui et al., 1993; Yang et al., 1995). En razón a ello, la búsqueda de antagonistas p AF de origen natural, es un tema de notable actualidad.

La droga "Shung Cher" es comúnmente usada en los hospitales indígenas de Bhután y la misma ha sido tentativamente identificada como funiperus communis L. (Cupressaceae). Del extracto metanólico de esta droga se aislaron cuatro diterpenos del labdano, entre los cuales el 3a,15-Dihidroxi-labda-8(17),13E-dieno (55] y el ( + )-3a-Hidroximanool (56], manifestaron actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria inducida por PAF (Kagawa et al., 1993).

Con objeto de realizar estudios de relación estructura-actividad, se abordó la síntesis total enantioselectiva del diterpeno (56] a partir del Sclareol, y también la de su enantiómero el (-)-3a-Hidroximanool (57] a partir de la conocida cetona de Wieland-Miescher. Se observó que el enantiómero (57) no mostró significante actividad inhibitoria, comparada con la del compuesto natural (56]; estos resultados muestran claramente una enantioselectividad en la actividad biológica de estos labdanos. De igual manera se determinó que el grupo exometileno en C-8 puede ser reemplazado y esto no afecta la actividad; también se observó que el grupo hidroxilo en C-3a es indispensable para la actividad (Yasui et al., 1993).

(55] [56] [57]

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En este mismo proyecto de investigación se realizó la modificación del sistema trans-decalina del ( + )-3a.-Hidroximanool a un sistema trans-hidrindano (Esquema B) resultando en una disminución de la actividad. Esto hecho sugiere que el esqueleto del 3a.-hidroxilabdano es esencial para el efecto inhibitorio de la agregación plaquetaria inducida por PAF (Yasui et al., 1993).

OH HO

ud''' Hd'''

EsquemaB

El Pinesulido (58], un labdano lactónico aislado de la Biota orientales Endl. (Cupressaceae), mostró también ser un potente y específico antagonista de los receptores PAF. Es importante destacar que los resultados obtenidos con este labdano resultan altamente prometedores, dado que la actividad ensayada demostró ser superior a la reportada para el Ginkgolido B, un conocido antagonista P AF aislado del Ginkgo biloba L. (Yang et al., 1995; 1998).

Posteriormente también se investigó la relación estructura actividad del Pinesulido, mediante la preparación de diferentes derivados, determinándose que la integridad del anillo de butanolida a.,p-insaturada, la presencia del grupo éster carboximetílico en C-19 y la del doble enlace exometilénico en C-8 son condiciones necesarias para la máxima actividad inhibitoria de los receptores PAF (Han et al., 1998a). o

Pinesulido [58]

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12. ACTIVIDAD GASTROPROTECTORA

En la medicina tradicional se utilizan plantas para tratar diversos desórdenes gastrointestinales, incluyendo úlceras pépticas. Algunos terpenos aislados de plantas superiores y sus derivados, han mostrado actividad gastroprotectora en diferentes modelos de lesiones gástricas, inducidas en animales de experimentación (Giordano et al., 1990).

La Solidagenona (59] es un diterpeno labdánico aislado de los rizomas del Solidago chilensis Cabrera (Asteraceae ), una planta usada en Chile para tratar síntomas relacionados con la inflamación (Razrnilic et al., 2000). El efecto gastro­protector de (59] fue evaluado utilizando tres modelos de úlceras gástricas inducidas en ratas: 1) El modelo Shay (ligadura del píloro), 2) La inducción con Aspirina y 3) La inducción con etanol. En el modelo Shay, el índice ulcerativo disminuyó en un 37 %, cuado se usó la Solidagenona corno tratamiento, mientras que en el caso de úlceras inducidas por Aspirina y por etanol, la reducción en el número nP. lP.siones fue del 50 % comparada con el control; en este estudio fue también determinada la toxicidad de (59], encontrándose que este diterpeno no resulta tóxico a dosis menores de 600 mg/Kg (Rodríguez et al., 2002).

Posteriormente se estudió, el efecto gastroprotector de derivados semi­sintéticos y de productos de biotransformación de la Solidagenona. En lo que se refiere a la relación estructura actividad, se observó que la oxidación del anillo furánico de la Solidagenona para generar una lactona, resulta en un compuesto sin actividad gastroprotectora, por lo que se puede deducir que la presencia del anillo furánico es esencial para la actividad. Por otro lado la reducción del carbonilo (C-6) produjo dos alcoholes epímeros; mientras que uno de ellos (60) presentó buena actividad, el otro resultó casi inactivo. La estereoquírnica del grupo hidroxilo en C-6 también juega un papel importante en la actividad gastroprotectora (Schmeda-Hirschrnann et al., 2002).

Solidagenona (59] [60]

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13. ACTIVIDAD ANTINOCICEPTIVA

La nocicepción es la recepción de señales en el sistema nervioso central, provocadas por la activación de unos receptores sensoriales especializados denominados nociceptores. La modulación o antinocicepción, es el proceso por el que la transmisión del impulso nervioso es atenuada en distintos niveles (Millan, 1999).

Entre los compuestos labdánicos con este tipo de actividad, se encuentra la Marrubina (52], ya citada anteriormente (pág. 20); este diterpeno manifestó un potente efecto antinociceptivo dependiente de la dosis, en el ensayo de la Capsaicina, el cual resultó ser más potente que el de algunas drogas analgésicas bien conocidas. El efecto antinociceptivo producido por este diterpeno no fue revertido por la Naloxona, por lo que se asume que su mecanismo de acción no se encuentra relacionado con el sistema opioide (De Jesús et al., 2000).

14. ACTiViDAD .Al'~Til'vflJTAGÉNICA

La mutación se define como cualquier cambio del material genético de las células, no debido a fenómenos de recombinación o segregación, que se transmite a las células hijas, dando lugar a células o individuos mutantes. La mutación es la fuente primaria de variabilidad genética y como tal, es indispensable para que se produzca el fenómeno evolutivo; sin embargo, varios procesos carcinogenéticos se encuentran íntimamente asociados a la mutagénesis, la cual puede ser inducida por agentes químicos como el Trp-P-1 (3-Amino-1,4-dimetil-5H-pirido(4,3-b]indol], que resulta de la pirólisis del triptofano (Wakabayashi et al., 1992).

Algunos compuestos naturales poseen propiedades antimutagénicas; este es el caso del (+)-Ácido Poliáltico [61], un diterpeno labdánico aislado del extracto metanólico de Vitex rotundifolia L.f.f (Verbenaceae), el cual mostró un efecto supresor de la actividad mutagénica inducida por Trp-P-1 (Miyazawa et al., 1995).

Trp-P-1 [61]

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15. ACTIVIDAD CITOTÓXICA Y ANTITUMORAL

En la bibliografía se han reportado numerosos trabajos sobre la búsqueda de compuestos antiturnorales de origen natural (Cassady & Douros, 1980; Aszalos, 1981; Corbett et al., 1994; Powis, 1994); en lo que se refiere a los diterpenos dellabdano, citaremos en primer lugar algunos diterpenos ya referidos anteriormente corno el Potamogetonido [15) y el Potamogetonol (16] (pág. 11) que mostraron citotoxicidad hacia células C6/36 (larvas del mosquito Aedes albopictus) y SF9 (células de ovario de Spodoptera frugiperda) (Kittakoop et al., 2001).

Otros ejemplos son el Aulocarpinolido [11] y la Aulacocarpina B (13) (pág. 10) los cuales mostraron valores de ED50 hacia células L1210 (leucemia linfocítica en ratones) de 12,5 ¡.tg/rnL y 25 ¡.tg/rnL, respectivamente (Ayafor et al., 1994); los Micaperoxidos A (30] y B (31] (pág. 13), exhibieron citotoxicidad significativa frente a las líneas celulares: A-549 (carcinoma humano de pulmón), HT-29 (adenocarcinoma de colon) y P-388 (leucemia linfocítica) (Tanaka et al., 1993); el Aframodial [33] (pág. 14), el cual fue sometido a un "screening" anticáncer del NCI (Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos), encontrándose que el mismo mostró actividad anti-leucémica reproducible contra todas las líneas celulares ensayadas, con un índice de toxicidad de 50 mg/Kg (Nyasse et al., 2000); y el Miriadenolido (54] (pág. 21), que resultó citotóxico frente a varias líneas celulares ensayadas: BC-1(cáncer de seno), LU-1(cáncer de pulmón), COL-2 (cáncer de colon), KB (carcinoma epidermoide oral), KB-VI (KB resistente a Vinblastina) y LN- CaP (cáncer de próstata) (Zani et al., 2000). El Miriadenolido, fue también capaz de inducir la apoptosis en células de leucemia linfocítica (Jurkat) y de leucemia monocítica (THP-1), por activación de tres tipos de capasas, que son intermediarios claves en el proceso de apoptosis; determinándose además que este proceso es dosis dependiente (Souza-Fagundes et al., 2003b).

De las hojas de la Renealmia alpinia (Rottb). Mass (Zingiberaceae), se aisló un nuevo diterpeno de la serie dellabdano (35] (referido en pág. 14), el cual mostró citotóxicidad contra células M-109 (carcinoma de pulmón) (Zhou et al., 1997). Siguiendo con el género Renealmia, tenemos que de las semillas ds R. exaltata L.f. fueron reportados varios labdanos, entre ellos la Pacovatinina C (62] y sus análogos, r¡ue exhibieron actividad citotóxica frente a células L-1210 y KB; estos representan los primeros labdanos aislados de esta especie, que poseen una y lactona conjugada con un grupo olefínico exocíclico (Sekiguchi et al., 2001).

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La Coronarina A [63] y otros labdanos aislados de un extracto clorofórmico de los rizomas del Hedychium coronarium K.D Koeing (Zingiberaceae), fueron capaces de inhibir el crecimiento de células V-79 (fibroblastos de pulmón de hámster chino) y de sarcoma 180 (sarcoma altamente maligno en ratones) {Itokawa et al., 1988). Por otro lado la Coronarina E (64] aislada en pequeñas proporciones de las partes aéreas de la Alpinia chinensis Rose. (Zingiberaceae), fue sintetizada a partir del Sclareol y resultó citotóxica contra células P-388 y SNU-1 (adenocarcinoma humano gástrico); también se ensayó la actividad citotóxica de los compuestos intermediarios de la síntesis, y se observó que la conversión del doble enlace entre los carbonos C-8 y C-17 a un epóxido, resulta en una disminución de la actividad citotóxica (Sy et al., 1997; Jung et al., 1998). De otra especie de este mismo género, la Alpinia galanga Willd. fueron aislados el Galanal A (65] y el Galanal B [66), los cuales presentaron actividad citotóxica frente a células KB (Morita et al., 1988).

o

9 .-li

Coronarina A [63]

o ~ h

Coronarina E [64]

CHO

R= - OH Galanal A [65] R= ....... ,OH Galanal B [66]

En años recientes han sido aislados varios diterpenos labdánicos de plantas de la familia Zingiberaceae, pero los bis-labdanos son raros en estas plantas. De los rizomas de la Alpinia calcarata fueron aislados dos bis-labdanos llamados Calcaratarina D [67] y Calcaratarina E [68], las cuales mostraron citotóxicidad "in vitro'' hacia células humanas KB (carcinoma nasofaríngeo) (Kong et al., 2002).

Calcaratarina D [67) Calcaratarina E [68]

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Diversos compuestos han sido aislados de la resina de "ladano" obtenida del Cistus creticus L. (Cistaceae). El análisis de esta resina permitió el aislamiento de varios diterpenos de labdano, entre ellos el Acetato de (13E)-Labda-7,13-dien-15-ilo (69], el cual resultó activo contra algunas de las líneas celulares ensayadas: MOLT 3 (células T provenientes de un paciente con leucemia linfoblástica aguda), células RAJI (pre-celulas B originarias de un paciente con linfoma de Burkiit) y células H-9 (linfoblastoma-T provenientes de un paciente con leucemia linfoblástica aguda) (Demetzos et al., 1994).

En un estudio llevado a cabo frente a varias líneas celulares de leucemia, se encontró que otros labdanos aislados del C. creticus también mostraron actividad. Así pues, el compuesto [70] fue activo contra trece de las catorce líneas celulares ensayadas, mientras que [71] sólo lo fue frente a células de leucemia promielocítica (HL-60). En base a la comparación de los resultados se puede asumir que la ausencia, en el compuesto (70], del doble enlace entre los carbonos C-7 y C-8, resulta esencial para su actividad citotóxica (Dimas et al., 1998). En otro estudio se comparó la actividad citotóxica de [70] frente a su derivado acetilado y se encontró que la acetilación no influye significativamente en la misma (Demetzos et al., 2001). Posteriormente se observó que los labdanos tipo diol, resultan ser más citotóxicos que sus derivados epoxidados (Chinou et al., 1994).

(69] (70] (71]

De las partes aéreas de la Scoparia dulcis L. (Scrophulariaceae) se aislaron diterpenos benzoilados derivados dellabdano, como por ejemplo el Dulcidiol (72).

Dulcidiol (72]

OH La actividad citotóxica de estos compuestos fue ensayada frente a seis líneas celulares de cáncer estomacal, y los mismos resultaron citotóxicos hacia una o más de las seis líneas

~ celulares ensayadas, e incluso mostraron citotoxicidad comparable con la del Sulfato de Vinblastina (Ahsan et al., 2003).

o

29

De las partes aéreas del Baccharis gaudichaudiana D.C. (Asteraceae), se aislaron dos labdanos, la Gaudichaudona (73] y el Gaudichaudol e (74], los cuales exhibieron su potencial corno agente citotóxicos hacia varias líneas célulares: BC-1, COL-2, KB, KB-V1, LU-1 P-388, HT-1080 (fibrosarcorna) y MEL-2 (rnelanorna). (Fullas et al., 1994).

Gaudichaudona (73] Gaudichaudol e (74]

Otro diterpeno del labdano que presentó moderada citotoxicidad contra células cancerosas P-388, A-549 y HT-29, fue el (-)-Metil eopalato (75), aislado de de Copaifera paupera (Herzog) Dwyer (Caesalpinaceae) (Tincusi et al., 2002).

Del extracto hexánico de la corteza del Croton oblongifolius Buch-Harn. (Euphorbiaceae) fueron aislados tres nuevos labdanos; un ejemplo de estos es el diterpeno (76]. La actividad citotóxica de estos compuestos fue ensayada frente a líneas celulares de tumores humanos: KAT03 (carcinoma gástrico), SW620 (adenocarcinoma de colon), BT474 (carcinoma de mama), HEP-G2 (hepatoblastoma) y células CHAGO (carcinoma de pulmón). El diterpeno (76] mostró moderada citotóxicidad, no específica, contra todas las líneas celulares ensayadas, mientras que los demás diterpenos resultaron inactivos o débilmente activos. La carencia del grupo acetato en el compuesto (76] tendería a reforzar su capacidad de formar puentes de hidrógeno con ciertos receptores en las células tumorales y podría hacerlo más activo, pero menos selectivo (Roengsumran et al., 2001).

(75] (76}

30

En otro estudio sobre el C. oblongifolius se aislaron cuatro diterpenos del labdano, entre ellos el Labda-7,12(E),14-trien-17-al [77] (Roengsumran et al., 1999); por medio de modificaciones semi-sintéticas del grupo carboxilo del diterpeno (77] se lograron obtener una serie de derivados. La actividad citotóxica de este diterpeno y de sus derivados fue ensayada frente a cinco líneas celulares de tumores humanos: BT474, CHAGO, HEP-G2, KAT03 y SW620. En este ensayo se observó, que mientras algunos mostraron moderada citotoxicidad, no especifica, contra todas las líneas celulares, otros resultaron inactivos. La actividad citotóxica de alguno de estos compuestos, (77] tal vez pueda atribuirse a la presencia en la molécula de un aldehído a,p-insaturado, el cual puede experimentar una adición de Michael con grupos nucleófilos de las proteínas y del ADN. Los otros compuestos que resultaron activos poseen un alcohol primario alílico y se presume que este grupo es esencial para la actividad citotóxica (Somrnit et al., 2003).

Entre los diterpenos aislados de organismos marinos, cabe mencionar la Clorolisoclimida (78], presente en una ascidia denominada Lissoclinum voeltzkowi; este diterpeno es un labdano que contiene un grupo succinimida, el cual es muy raro en la Naturaleza; el mismo mostró efecto antiproliferativo sobre células del carcinoma epidermoide bronquial humano NSCLCN6, debido a un bloqueo de la fase G1 de estas células (Malochet-Grivois et al., 1992).

El estudio de otras especies de ascidias del género Lissoclinum, arrojó corno importantes resultados el aislamiento de cuatro nuevos diterpenos alcaloidales rnonoclorados que también contienen un grupo succinimida. Estos diterpenos, denominados Haterurnaimidas, exhibieron actividad citotóxica hacia células P-388. Un ejemplo ilustrativo lo constituye la Haterumaimida H (79]. En los estudios de relación estructura actividad de las Haterumaimidas, se observó que el grupo hidroxilo secundario en C-6 y C-12 parece ser muy importante para la actividad citotóxica"in vitro" (Uddin et al., 2001; 2002).

o

Cl

(79)

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16. ACTIVIDAD INHIBIDORA SOBRE V ARIAS ENZIMAS

Las neuropatías y las cataratas que surgen como una complicación de la diabetes, son causadas por la acumulación de sorbitol en los nervios periféricos y en el cristalino del ojo, como resultado de una reducción enzimática de la glucosa por la aldosa reductasa en el ciclo del sorbitol (Kinoshita et al., 1974). Debido a esto se ha incrementado la demanda terapéutica de nuevos agentes inhibidores de la aldosa reductasa. De una esponja marina del género Dysidea fueron aislados algunos metabolitos secundarios, entre ellos el Ácido Disideapalaúnico [80] el cual mostró inhibición de la aldosa reductasa a 400 J.tg/mL y podría ser usado para el tratamiento en la catarata galactosémica (Masashi et al., 1986). La síntesis total, en la cual quedó establecida la estereoquímica del ( +) Ácido Disideapalaúnico fue llevada a cabo por Hagiwara et al. (1988).

Por otro lado, el Halisulfato (32], anteriormente citado (pág. 13) como componente de una esponja de la familia Halichondriidae, inhibió en un 100% la fosfolipasa A2 a concentración de 16 J.tg/mL (Kernan et al., 1988). También de una Cesalpinaceae peruana, la Copaifera paupera (Herzog) Dwyer., fue aislado el (-)-Ácido Pinifolico (81], el cual mostró una débil inhibición de la aldosa reductasa (Tincusi et al., 2002).

De la raíz de la Scoparia dulcis L. (Scrophulariaceae) se aisló un labdano denominado Ácido Scopárico A [82], y resultó ser un potente inhibidor de la P-Glucoronidasa (Kawasaki et al., 1987). Posteriormente se determinó que la inhibición de P-Glucoronidasa por [82], no es competitiva con el p-Nitrofenil-P-D-glucorónido como sustrato, lo que quiere decir que esta inhibición es específica; también se estableció que el efecto inhibitorio, se da por la unión del diterpeno con la enzima p-Glucoronidasa (Hayashi et al., 1992).

OH

HOOC

[80) [81] (82)

32

17. ACTIVIDAD ANTI-ALGAL

Los estudios relacionados con los metabolitos secundarios de plantas acuáticas, han demostrado que muchas de ellas tienen un fuerte efecto anti-algal "in vitro," que podría justificar la reducción del fitoplacton en ecosistemas naturales (DellaGreca et al., 1998). La primera observación de que las plantas acuáticas podrían interferir con el fitoplacton fue debida a Hasler & Jones (1949); ellos refirieron una reducción de la población algal en las charcas donde estaban presentes algunas especies del género Potamogeton.

En la búsqueda de diterpenos activos de las plantas acuáticas, encontramos que el análisis de la Ruppia marítima L. (Potamogetonaceae) arrojó el aislamiento de siete ent-labdanos, como por ejemplo el nor-derivado [83]; todos ellos mostraron actividad anti-algal contra Selenastrum capricornutum (DellaGreca et al., 2000). Por otro lado, del Potamogeton pectinatus L (Potamogetonaceae) se aislaron varios labdanos con actividad anti-algal, tal es el caso del compuesto (84]. Estos resultados sugieren que algunos de los labdanos presentes en P. pectinatus juegan una función ecológica como alelo-químicos en el ecosistema acuático (Waridel et al., 2003), conclusión ésta, también sustentada por los resultados de Cangiano et al. (2002).

En otros estudios con el Potamogeton natans L. (Potamogetonaceae) se reportó el aislamiento de trece labdanos activos, entre los que se encuentra el compuesto [85] (Cangiano et al., 2001; 2002). En estos trabajos se reportan resultados de relación estructura actividad, los cuales permitieron establecer que la presencia del anillo furánico es importante para la actividad anti-algal; al parecer el grupo hidroxilo libre en C-1 9 también es elemental para el efecto algicida, ya que al acetilar el OH en C-19 la actividad disminuyó. Por otro lado se observó que la presencia de un carbonilo en C-19 disminuye la actividad, a menos que se encuentre otro carbonilo en C-12. Por último se confirmó que la presencia de una lactona entre C-19 y C-20 disminuye la actividad anti-algal (Cangiano el al., 2002).

HO'- reo

(83] (84] [85)

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18. EDULCORANfES

Las plantas que han demostrado efecto hipoglicemiante desempeñan un papel importante en la medicina popular. El ejemplo más significativo es el del Steviosido y los extractos preparados de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni. (Asteraceae ), los cuales han sido ampliamente usados en Japón desde mediados de la década de los setenta como agentes edulcorantes, modificadores del sabor y como sustituto del azúcar, en pacientes diabéticos (Kinhghorn & Soejarto, 1985).

En la búsqueda de compuestos edulcorantes provenientes de las plantas, se llevó a cabo el estudio fitoquímico del Baccharis gauchaudiana D.C. (Compositae) conocido comúnmente como "chilca melosa" y utilizado en la medicina tradicional de Paraguay como un agente antidiabético. Este estudio arrojó el aislamiento de cinco labdanos glicosidados, uno de ellos denominado Gaudichaudiosido A [86), representa el primer miembro de una nueva clase de sustancias edulcorantes, resultando ser 55 veces más dulce que una solución acuosa de sacarosa al 2 % p/v (Fullas et al., 1991).

De las raíces del Phlomis younghushandii Mukerjee (Labiatae) se aislaron dos furanolabdanos glicosidados dulces: Phlomisosido 1 [87) y Baiyunosido (90]; también se obtuvieron el Phlomisosido 111 (88) y el Phlomisosido IV (89), los cuales resultaron insípidos (Katagiri et al., 1994). Ambos diterpenos dulces [87] y [90] habían sido aislados con anterioridad de las raíces de la planta china Salvia digitaloides Diles. (Labiatae) (Tanaka et al., 1983b; 1985). Al comparar la estructura de los diterpenos que resultaron dulces con la de los que resultaron insípidos, se pudo deducir, que la presencia del 3-0H en el azúcar que se encuentra unido al labdano, así como la del gem-dimetil en C-4, resultan esenciales para el sabor dulce (Singh et al., 1999).

HOH2C -

~H 0

H H H

H H H OH

(86]

CH20H

R: Glc2-Rha (87]

R: Gld-Xyl (90)

COOR

R: Glc2-Xyl (88]

R: Gld-Rha (89]

Glu: ~~-o-glucopiranosil; Xyl: (>- o-xilopiranosil; Rha :a-L-ramnopiranosil

La síntesis total de estos agentes edulcorantes de origen natural ha sido llevada a cabo, con lo cual queda abierta uila nueva opción para desarrollar edulcorantes artificiales de alta calidad (Morí et al., 1987; Y amada et al., 1987).

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Entre los diterpenos dellabdano se han destacado, el Andrographolido (91) y la Forskolina (92], a los que se les ha atribuido numerosas actividades biológicas y/o farmacológicas, las cuales se encuentran debidamente sustentadas; de inmediato se abordarán aspectos relacionados con la actividad de estos diterpenos.

19. ANDROGRAPHOLIDO

El Andrographolido (91) es un diterpeno lactónico de sabor amargo, aislado de la Andrographis paniculada Ness. (Acanthaceae), un arbusto amargo que se conoce comúnmente corno "big chirata" y que se encuentra en las llanuras del oeste de la India y en Sri Lanka. Este diterpeno constituye el principio activo mayoritario de esta planta, cuyas hojas secas constituyen una droga denominada "Kalrnegh", la cual es ampliamente empleada en la medicina tradicional de la India para el tratamiento de diversas enfermedades (Koul et al., 1994). La misma es también utilizada para el tratamiento de la ictericia, habiéndose demostrado su actividad colerética y anti-colestática contra colestasis inducida por Paracetarnol; este efecto ha resultado más potente que el de la Silirnarina, un agente natural hepatoproiedur de uso clínico (Shukla et al., 1992; Visen et al., 1993; Kapil et al., 1993).

El "kan jang" es un extracto de la A. paniculata que contiene Andrographolido y Deoxiandrographolido; este extracto ha sido usado en Escandinavia por más de 20

años en el tratamiento del resfriado común. El "kan jang" tiene la capacidad de acortar significativamente la duración e intensidad de los síntomas del resfriado común (Cáceres et al., 1999; Melchior et al., 2000). También ha sido reportada la actividad hipotensora de diferentes extractos de esta planta, pero se ha aclarado que el Andrographolido, no es el responsable de esta actividad (Zhang et al., 1996; 1997) Otros estudios han demostrado que el extracto crudo de esta planta no produce toxicidad testicular en ratas (Burgos et al., 1997).

Para el Andrographolido se ha reportado su actividad protectora contra varios desórdenes del hígado inducidos por hepatotoxinas, tales como la Galactosamina, el Paracetamol y el CCl4 (Handa et al., 1986; Banda et al., 1990a; 1990b).

En otra investigación se demostró que la actividad hepatoprotectora de este diterpeno, se debe a una elevación significativa en diversos componentes de la defensa antioxidante celular, y a la reducción de la peroxidación lipídica; develando que la acción antioxidante puede desempeñar un papel importante en la actividad antihepatotóxica (Koul et al., 1994).

ury···sto

[91]

35

Otros estudios sugieren que el Andrographolido podría investigarse como un posible controlador de la fertilidad, utilizable en hombres, ya que mostró un efecto negativo sobre la espermatogénesis por inhibición de la citoquinesis; este efecto al parecer es transitorio (Akbarsha et al., 2000). Su efectividad en el tratamiento de la faringotonsilitis ha sido evaluada en otro trabajo (Thamlikitkul et al., 1991).

La actividad anti-inflamatoria y antipirética del Andrographolido también ha sido estudiada (Deng et al., 1982; Madav et al., 1996); un estudio experimental reportó su actividad analgésica y anti-ulcerogénica (Madav et al., 1995) y en otro se precisó que por lo menos parte de la actividad anti-inflamatoria, es probablemente debida a la inhibición de las moléculas de expresión (ICAM-1, ELAM-1 y VCAM-1) y a la inhibición de la adhesión de los leucocitos al endotelio (Habtemariam, 1998). Otros ensayos han puesto en evidencia que este diterpeno tiene la capacidad de inhibir la producción de especies reactivas inducidas por el oxígeno, como lo son el peróxido de hidrogeno (H20 2) y el anión superóxido (o-2); estas especies representan importantes metabolitos tóxicos que se encuentran involucrados en el daño de tejidos en el proceso inflamatorio. También se ha demostrado su capacidad de inhibir la adherencia de neutrófilos, lo que convierte a este compuesto en un potencial fármaco para el tratamiento de la lesión inflamatoria, inhibiendo las fases tempranas de la activación de neutrófilos (Shen et al., 2000).

Por otro lado, se ha reportado la actividad inmunoestimulante de este diterpeno, resultando en un potente estimulador de las respuestas inmune específica y no específica (Puri et al., 1993; Panossian et al., 2002). La actividad inmunomodulatoria del Andrographolido, quedó evidenciada por el incremento en la proliferación de los linfocitos (Rajagopal et al., 2003).

También se ha demostrado que el Andrographolido inhibe la proliferación de diferentes células cancerosas "in vitro" y que es un potente inductor de la diferenciación de células M1 (leucemia mieliode en ratones) (Matsuda el al., 1994); el mecanismo de acción está relacionado con la interrupción del ciclo celular en la fase GO/G1, debido a la inducción de la proteína inhibitoria p27 y a la disminución de la Quinasa-4 dependiente de Ciclina; estos 1 esultados sugieren que este diterpeno tiene potencial para ser desarrollado como un agente terapéutico contra el cáncer (Rajagopal et al., 2003).

La actividad anti-HIV del Andrographolido fue p:-imeramente P.studiada por Chang et al., (1988); recientemente se ha demostrado que este diterpeno inhibe el ciclo celular inducido por HIV, conduciendo a un incremento de Jo~ niveles de linfocitos CD4+ en individuos infectados (Calabrese et al., 2000). Los estudios en torno a su mecanismo de acción, han aclarado que dicho mecanismo se sustenta en su capacidad para inhibir las pro-proteínas convertasas (Basak et al., 1999).

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20. FORSKOLINA

En 1974 se reveló el efecto hipontensor y antiespasmódico de las raíces del Coleus forskohlii Briq. (Labiatae); el principio activo de esta planta resultó ser un diterpeno del labdano, el cual fue aislado en el "Central Drug Research Institute (CDRI)" y llamado Coleonol, pero el grupo Hoechst Pharmaceuticals lo denominó Forskolina [92). En razón a esta duplicidad de nombres, existió durante algunos años confusión en relación a la estructura de estas moléculas (Ammon et al., 1985); así pues, mientras que el grupo Hoechst determinó que la Fosrkolina poseía una configuración ~ en el grupo acetoxi situado en C-7 (Bhat et al., 1977), el CDRI estableció que en el Coleonol este grupo tenía configuración a (Tandon et al.,1977); posteriormente la identidad de ambas moléculas quedó esclarecida, al demostrarse que la propuesta del CDRI estaba errada (Saksena et al., 1985).

o ····~ QH

Forskolina [92] Coleus forskohlii Briq. (Labiatae)

Los efectos de la Forskolina sobre el sistema cardiovascular han sido estudiados extensamente. Este diterpeno mostró un efecto inotrópico positivo y un incremento del ritmo cardíaco en corazón aislado de cobayo; así como un efecto hipotensor en perros, gatos, ratas con hipertensión renal y en ratas hipertensas espontáneamente. El efecto hipotensor fue atribuido a una disminución de la resistencia periférica debida a la acción del diterpeno en el músculo liso arterial (Lindner et al., 1978).

El efecto inotrópico positivo de la Forskolina en el músculo cardíaco, fue relacionado con una estimulación de la membrana celular del miocardio por la adenil-ciclasa, seguido de un incremento del AMP cíclico, una activación de las quinasas en la superficie de la membrana, una disminución de la actividad del Na+ ,K+ y de la ATPasa en la membrana, y sendas activaciones de los canales lentos de Ca+2 y de las quinasas del citoplasma (Metzger et al., 1981; Laurenza et al., 1989; Scholz, 1989; Varro & Papp, 1995 ).

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Algunos derivados semi-sintéticos análogos de la Forskolina han sido preparados, y se ha observado que aunque varios de ellos exhiben actividad hipotensora en ratas, ninguno es considerablemente más potente que la Forskolina (Bhat et al., 1983).

Este diterpeno también ha sido investigado por su efecto broncodilatador, lo que lo convierte en un potencial agente terapéutico para el tratamiento del asma; la Forskolina es capaz de relajar, en experimentos "in vitro", las vías aéreas contraídas y de prevenir el broncoespasmo "in vivo" (Burka, 1983a; 1983b).

Como ya se ha expuesto, la Forskolina tiene la propiedad de estimular la producción de la enzima adenil-ciclasa; esta enzima, a su vez, estimula la producción del AMP cíclico el cual es capaz de disminuir la presión intraocular del ojo (PIO) reduciendo la afluencia del humor acuoso (Caprioli et al., 1984; Caprioli & Sears., 1984; Burstein et al., 1984; Meyer et al., 1987). Se ha comprobado que la Forskolina, aplicada tópicamente, es capaz de disminuir la PIO, a través de un mecanismo de acción relacionado con la activación de esta enzima (Zeng et al., 1995). Colirios que contienen Forskolina se encuentran disponibles en las farmacias.

Por último cabe destacar que se ha estudiado la acción de la Forskolina, como un agente vasoactivo en el control de la impotencia eréctil vasculogénica. En la prueba "in vitro" la Forskolina y la PGE1 (prostangalndina E1) causaron relajación dependiente de la dosis. En el estudio clínico con una muestra de 31 pacientes no se detectaron efectos adversos; el 61% de estos pacientes mejoró la rigidez del pene y/o la duración de la erección usando una combinación de Forskolina, Papaverina, Fentolamina y PGE1 (Mulhall et al., 1997; Drewes et al., 2003).

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Presentaciones Comerciales de Forskolina y Extractos de Coleus forskohlii

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REFERENCIAS BIBUOGRÁFICAS

1. AHSAN M., ISLAM S. K., GRAY A. l. and STIMSON W. H., 2003. Cytotoxic Diterpenes from Scoparia dulcis. J. Nat. Prod., 66, 958-61.

2. AKBARSHA M. A. and MURUGAIAN P., 2000. Aspects of the Male Reproductive Toxicity/Male Antifertility Proopertyof Andrographolide in Albion Rats: Effect on the Testis and the Cauda Epididymidal Spermatozoa. Phytother. Res., 14, 432-35.

3. ALCARAZ M. J. and JIMÉNEZ M. J., 1989. Anti-inflammatory Compounds from Siderites javalambrensis N-hexane Extract. J. Nat. Prod., 52, 1088-91.

4. ALMEIDA B. C. and MENEZES H., 2002. Anti-inflammatory Activity of Propolis Extracts: a Review. J. Venom. Anim. Toxins., 8, 191-12.

5. AMMON H. and MULLER A., 1985. Forskolin: From an Ayurvedic Remedy toa Modern Agent. Planta Medica, 51, 473-77.

6. ASZALOS A., 1981. "Antitumor Compounds of Natural Origin: Chemistry and Biochemistry, Vol 1 and Vol 11''. CRC Press, lnc., Boca Ratón (F1.), USA.

7. AYAFOR J. F., TCHUENDEM M. H. and NYASSE B., 1994. Novel Bioactive Diterpenoids fromAfromomum aulacocarpos. J. Nat. Prod., 57, 917-23.

8. BAILEY J. A., CARTER G. A., BURDEN R. S. and WAIN R. L., 1975. Control of Rust Diseases by Diterpenes from Nicotiana glutinosa. Nature, 22, 328-29.

9. BANTHORPE D. V., BROWN J. T. and MORRIS G. S., 1990. Accumulation of the Anti-Fungal Diterpcne Sclareol by Cell Cultures of Salvia sclarea and Nicotiana glutinosa. Phytochemistry, 29, 2145-48.

10. BASAK A., COOPER S., ROBERGE A., BANIK U., CHRÉTIEN. and SEIDAH N., 1999. Inhibition of Proprotein convertases-1, -7 and Furin by Diterpines of Andrographis paniculata and their Succinoyl Esters. Biochem. J., 338, 107-13.

11. BHAT S. V., BAJWA B. S., DORNAUER H. and SouzA N. J., 1977. Structures and Stc:reochemistry of New Labdane Diterpenoids from Coleus Forskohlii Briq. Tetrahedron Lettcrs, 19~ 1669-72.

12. BHAT S V., DOHADWALL:\ A. N., BAJWA B. S., DADKAR N. K., DORNAUER H. and DE. SouzA N. J., 1983. The Antihypertensive and Positive Inotropic Diterpene Forskolin: of Structural Modifications on its Activity. J. Med. Chcm., 26, 486-92.

39

13. BOHM M., 2002. Are Cardiac Glycosides Still Needed in the Treatment of Cardiac Insufficiency? Dtsch. Med. Wochenschr., 41, 2133-38.

14. BURGOS R. A., CABALLERO E., SÁNCHEZ N., SCHROEDER R., WIKMAN G. and HANCKE J., 1997. Testicular Toxicity Assesment of Andrographis paniculata Dried Extracts in Rats. J. Ethnopharmacol., 58, 219-24.

15. BURKARJ. F., 1983a. Inhibition of Antigen and Calcium Ionophore A23187 Induced Contractions of Guinea Pig Airways by Isoprenaline and Forskolin. Can. J. Physio.l Pharmacol., 61, 581-89.

16. BURKAR J. F., 1983b. Effects of Selected Bronchodilators on Antigen-and A23187-Induced Contraction of Guinea-Pig Trachea. J. Pharmacol. Exp. Ther., 225, 427-35.

17. BURSTEIN N., SEARS M. and MEAD A., 1984. Aqueous Flow in Human Eyes is Reduced by Forskolin, a Potent Adenylate Cyclase Activator. Exp. Eye Res., 39, 745-49.

18. CÁCERES D. D., HANCKE J. L., BURGOS R. A., SANDBERG F. and WIKMAN G. K., 1999. Use of Visual Analogue Scale Measurements (VAS) to Asses the Effectiveness of Standardized Andrographis paniculata Extract SHA-10 in Reducing the Symptoms of Common Cold. A Randomized Double Blind­Placebo Study. Phytomedicine, 6, 217-23.

19. CALABRESE C., BERMAN S., BABISH J., MA X., SHINTO L., DoRR M., WELLS K., WENNER C. and STANDISH L., 2000. A Phase 1 Trial of Andrographolide in HIV Positive Patients and Normal Volunteers. Phytother. Res., 14, 333-38.

20. CA!':GIANO T., DELLAGRECA M., FlORENTINO A., ISIDORI M., MONACO P. and ZARELLI A., 2002. Effec of ent-labdane Diterpenes from Potamogetonaceae on Selenastrum capricornutum and Other Aquatic Organisms. J. Chem. Ecol., 28, 1091-1.

21. CANGIANO T., DELLAGRECA M., FlORENTINO A., ISIDORI M., MONAGO P. and ZARELLI A., 2001. Lactone Diterpenes from the Aquatic Potamogeton natans. Phytochemistry, 56, 469-73.

22. CAPRIOLI J. and SEARS M., 1984. The Adenylate Cyclase Receptor Complex and Aqueous Humor Formation. Yale J. Biol. Med., 57, 283-90.

23. CAPRIOLI J., SEARS M., BAUSHER L., GREGORY D. and MEAD A., 1984. Forskolin Lowers Intraocl}~ar Pressure by Reducing Aqueous Inflow. lnvest. Opthalmol. Vis. Soi, 25, 268-77.

24. CASSADY J. M. and DOUROS J. R., 1980. "Anticancer Agents Based on Natural Product Models". Academic Press, New York.

40

25. CHAN-BAGAB M. J. and PEÑA-RODRIGUEZ L. M., 2001. Plant Natural Products with Leishmanicidal Activity. Nat. Prod. Rep., 18, 674-88.

26. CHANG R. S. and YEUNG H. W., 1988. Inhibition of Growth of Human Immunodeficiency Virus in vitro by Crude Extracts of Chinese Medicinal Herbs. Antivir. Res., 9, 163-76. Referencia localizada en la cita N° 14.

27. CHINOU l., DEMETZOS C., HARVALA C., ROUSSAKIS C. and VERBIST J., 1994. Cytotoxic and Antibacterial Labdane-Type Diterpenes from the Aerial Parts of Cistus incanus subsp. Creticus. Planta Medica, 60, 34-36.

28. CONOLLY J. D. and HILL R. A., 1991. "Dictionary of Terpenoids, Vol. 1". Chapman and Hall. London.

29. CORBETT T. H., VALERIOTE F. A. and BAKER L. H., 1994. "Anticancer Drug Discovery and Development: Natural Products and New Molecular Models: Proceedings of Second Deug Discovery and Development Symposiu". Kluwer Academic Publishers, New York.

30. DE }ESUS R. A., CECHINEL-FILHO V., ÜLrVEIRA A. E. aml SCHLEMFER V., ZGOO. Analysis of the Antinociceptive Properties of Marrubiin Isolated from Marrubium vulgare. Phytomedicine, 7, 111-15.

31. DE LAS HERAS B. and HOULT J. R., 1994. Non-Cytotoxic Inhibition of Macrophage Eicosanoid Biosynthesis and Effects on Leukocyte Functions and Reactive Oxygen Species of Two Novel Anti-lnflammatory Plant Diterpenoids. Planta Medica, 60, 501-06.

32. DELLAGREGA M., FERRARA M., FlORENTINO A., MONAGO P. and PREVITERA L., 1998. Antialgal Compunds from Zantedeschia aethiopica. Phytochemistry, 49, 1299-4.

33. DELLAGRECA M., FlORENTINO A., lSIDORI M., MONAGO P. and ZARELLI A., 2000. Antialgal ent-Labdane Diterpene from Ruppia marítima. Phytochemistry, 55, 909-13.

34. DEMETZOS C., DIMAS C., HATZIANTONIOU S., ANASTASAKI T. and ANGELOPOULOU D., 2001. Cytotoxic and Anti-inflammatory Activity of Labdane and cis-Clerodane Type Diterpenes. Planta Medica, 67, 614-18.

35. DEMETZOS C., KOLOCOURIS A. and ANASTASAKI T., 2002. A simple and Rapid Method for the Differenciation of C-13 Manoyl Oxide Epimers in Biologically Important Samples using GC-MS Analysrts with NMR Spectroscopy and Computational Chemistry Results. BioORg. Med. Chem. Letters ., 12, 3605-09.

41

36. DEMETZOS C., MITAKU S., COULADIS M., HARVALA C. and KOKKINOPOULOS D., 1994. Natural Metabolites of ent-13-epi-Manoyl Oxide and other Cytotoxic Diterpenes from the Resin "LADANO" of Cistus creticus. Planta Medica, 60, 590-91.

37. DENG W. L., NIE R. J. and LIU J. Y., 1982. Comparison of Pharmacological Effect of four Andrographolides. Chin. Pharma. Bull., 17, 195-98. Referencia localizada en la cita N° 152.

38. DIMAS K., DEMETZOS C., MARSELLOS M., SOTIRIADOU R., MALAMAS M. and KOKKINOPOULOS D., 1998. Cytotoxic Activity of Labdane Type Diterpenes Against Human Leukemic Cell Lines in vitro. Planta Medica, 64, 208-11.

39. DREWES S., GEORGE J. and KHAN F., 2003. Recent Findings on Natural Products with Erectile-Dysfunction Activity. Phytochemistry, 62, 1019-25.

40. DUKER-ESHUN G., JAROSZEWSKI J. W., ASOMANING W. A., BOACHIE-ÜPPONG F., ÜLSEN C. E. and CHRISTENSEN S. B., 2002. Antiplasmodial Activity of Labdanes from Aframomun latifolium and Aframomun sceptrum. Planta Medica, 68, 640-42.

41. EL BARDAl S., LYOUSSI B., Wmo M. and MOREL N., 2001. Pharmacological Evidence of Hypotensive Activity of Marrubium vulgare and Foeniculum vulgare in Spontaneously Hypertensive Rat. Clin. Exp. Hypertens., 23, 329-43.

42. EL BARDAl S., MOREL N., WIBO M., FABRE N., LLABRES G., LYOUSSI B. and QUETIN-LECLERCQ J., 2003. The Vasorelaxant Activity of Marrubenol and Marrubiin from Marrubium vulgare. Planta Medica, 69, 75-77.

43. FULLAS F., HUSSAIN R. A., CHAl H .. , PEZZUTO J. M., SOEJARTO D. and KINGHORN A. D., 1994. Cytotoxic Constituents of Baccharis gaudichaudiana. J. Nat. Prod., 57, 801-07.

44. FULLAS F., HUSSAIN R., BORDAS E., PEZZUTO J., SOEJARTO D. and KINGHORN A., 1991. Gaudichaudiosides A-E, Five Novel Diterpene Glycoside Constituents from the Sweet-Tasting Plant, Baccharis gaudichaudiana. Tetrahedron, 47, 8515-22.

45. GIORDANO 0. S., GUERREIRO E., PESTCHANKER M. J., GUZMAN J., PASTOR D. and GUARDIA T., 1990. The Gastric Cytoprotective Effect of Several Sesquiterpene Lactones. J. Nat. Prod., 53, 803-09.

46. HABIBI Z., EFTEKHAR F., SAMIEE K. and RUSTAIYAN A., 2000. Structure and Antibacterial Activity of a New Labdane Diterpenoid from Salvia leriaefolia. J. Nat. Prod., 63, 270-71.

42

47. HABTEMARIAM S., 1998. Andrographolide Inhibits the Tumour Necrosis Factor-a-induced Upregulation of ICAM-1 Expression and Endothelial­Monocyte Adhesion. Phytother. Res., 12, 37-40.

48. HABTEMARIAM S., 2003. In vitro Antileishmanial Effects of Antibacterial Diterpenes from Two Ethiopian Premna Species: P. schimperi and P.oligotricha. BMC Pharmacology, 3, 6.

49. rlABTEMARIAM S., GRAY A. and WATERMAN P., 1992. Antibacterial Diterpenes from the Aerial Parts of Premna oligotricha. Planta Medica, 58, 109-10.

50. HAGIWARA H. and UDA H., 1988. Total Synthesis of ( + )-Dysideapalaunic Acid. J. C. S. Chem. Commun., 815-17.

51. HAN B. H., YANG H. 0., KANG Y-H., SUH D-Y., Go H. J., SONG W-J., KIM Y. C. and PARK M. P., 1998a. In Vitro Platelet-Activating Factor Receptor Binding Inhibitory Activity of Pinusolide Derivatives: A Structure­Activity Study. J. Med. Chem., 41, 2626-30.

52. HAN S. B., KIM Y. H., LEE C. W., PARK S. M., LEE H. Y., AHN K. S., KIM I. H. and KIM H. M., 1998b. Characteristic Inmunostimulation by Angelan Isolated from Angelica gigas Nakai. Immunopharmacology, 40, 39-48.

53. RANDA S. S. and SHARMA A., 1990a. Hepatoprotective Activity of Andrographolide Against Galactosamine & Paracetamol Intoxication in Rats. Jndian J. Med. Res., 92, 284-92.

54. RANDA S. S. and SHARMA A., 1990b. Hepatoprotective Activity of Andrographolide from Andrographis paniculata against Carbontetrachloride. Indian J. Med. Res., 92, 276-83.

55. HANDA S. S., SHARMA A. and CHAKRABORTI K K, 1986. Natural Products and Plants as Liver Protecting Drugs. Fitoterapia, 57, 307-51.

56. HASLER A. D. and JoNES E., 1949. Demostration of the Antagonist Action of Large Aquatic Plants on Algae and Rotifers. Ecology, 30, 359-65.

57. 1-IAYASHI T., KAWASAKY M., ÜKAMURA K., TAMADA Y., MORITA N., TEZUKA Y., KIKUCHI T., MIWA Y. and TAGA T., 1992. Scoparic Acid A, A p-Glucoronidase Inhibitor from Scoparia dulcis. J. Nat. Prod., 55, 1748-55.

58. lTOKAWA H., MORITA H., KATOU 1., TAKEYA K., CAVALHEIRO A., ÜLIVEIRA R., lSHIGE M. and MOTIDOME M., 1988. Cytotoxic Diterpenes from the Rhizomes of Hedychium coronarium. Planta Medica, 54, 311-15.

59. lWAGAWA T., YAGUCHI S., HASE T., ÜKUBO T. and KIM M., 1992. Gomojosides, Labdane Diterpenoids from Viburnum suspensum. Phytochemistry, 31, 1311-15.

43

60. lWAGAWA T., YAGUCHI S., HASE T., ÜKUBO T. and KIM M., 1993. Diterpene Glucosides from Viburnum suspensum. Phytochemistry, 32, 1515-18.

61. lWAMOTO M., ÜHTSU H., TOKUDA H., NISHINO H., MATSUNAGA S. and TANAKA R., 2001. Anti-tumor Promoting Diterpenes from the Stem Bark of Thuja standishii (Cupressaceae). BioOrg. Med. Chem., 9, 1911-21.

62. JASSBI A. R., ZAMANIZADEHNAJARI S., AzAR P. A. and TAHARA S., 2002. Antibacterial Diterpenoids from Astragalus brachystachys Z. Natwforsch. [C], 57c, 1016-21.

63. JUNG M., Ko l., LEE S., CHOI S. J., YoUN B. H. and KIM S. K., 1998. ·A Concise Synthesis and in vitro Cytotoxicity of New Labdane Diterpenes. BioOrg. Med. Chem. Letters., 8, 3295-98.

64. KAGAWA K., TOKURA K., UCHIDA K., KAKUSHI H., SHIKE T., K!KUCHI J., NAKAI H., DORJI P. and SUBEDI L.,1993. Platelet Aggregation lnhibitors in a Bhutanese Medicinal Plant, Shug Chher. Chem. Pharm. Bull., 41, 1604-07.

65. KALPOUTZAKIS E., ALIGIANNIS N., MITAKTJ S., CHTNOU L CHARVALA C. and SKALTSOUNIS A. L., 2001. New Hemisynthetic Manoyl Oxide Derivatives with Antimicrobial Activity. Chem. Pharm. Bull., 49, 814-17.

66. KAPIL A., KOUL l. B., BENERJEE S. K. and GUPTA B. D., 1993. Antihepatotoxic Effects of Major Diterpenoid Constituents of Andrographis paniculata. Biochem. Pharmacol ., 46, 182-85.

67. KATAGIRI M., ÜHTANI K., KASAI R., YAMASAKI K., YANG C. R. and TANAKA 0., 1994. Diterpenoid Glycosyl Esters from Phlomis younghusbandii and P. medicinalis Roots. Phytochemistry, 35, 439-42.

68. KAWASAKI M., HAYASHI T., ARISAWA M., SHIMIZU M., HORIE S., UENO H., SYOGAWA H., SUZUKI S., YOSHIZAKI M., MORITA N., TEZUKA Y., KIKUCHI T., BERGANZA L., FERRO E. and BASUALDO l., 1987. Structure of Scoparic Acid A, a New Labdane-Type Diterpenoid from a Paraguayan Crude Drug "Typychá Kuratu" {Scoparia dulcis). Chem. Pharm. Bull., 35, 3963-66.

69. KERNAN M. R. and FAULKNER D. J., 1988. Sesteterpene Sulfates from a Sponge of the Family Halichondriidae. J. Org. Chem., 53, 4574-78.

70. KIMBU S. F., NGADJUI B., SONDENGAM L. B., NJIMI T. K., CONNOLLY J. D. and FAKUNLE C. 0., 1987. A New Labdane Diterpenoid from the Seeds of Aframomun danielli. J. Nat. Prod., 50, 230-31.

71. KINGHORN A. D. and SOEJARTO D. D., 1985. "Current Status of Stevioside as a Sweetening Agent for Human Use". Acadenúc Press Inc. London.

44

72. KINOSHITA J. H., 1974. Mechanisms Initiating Cataract Formation. lnvest Ophthalmol., 13, 713-24.

73. KITTAKOOP P., WANASITH S., WATTS P., KRAMYU J., TANTICHAROEN M. and THEBTARANONTH Y., 2001. Potent Antiviral Potamogetonyde and Potamogetonol, New Furanoid Labdane Diterpenes from Potamogeton malaianus. J. Nat. Prod., 64, 385-88.

74. KoNG L., QIN M. J. and NIWA M., 2002. New Cytotoxic Bis-labdanic Diterpenoids fromAlpinia calcarata. Planta Medica, 68, 813-17.

75. KOUL l. B. and KAPIL A., 1994. Effect of Diterpenes from Andrographis paniculata on Antioxidant Defense System and Lipid Peroxidation. Indian J. Pharmacol., 26, 296-00.

76. LAURENZA A., SUTKOWSKI E. M. and SEAMON K. B., 1989. Forskolin: a Specific Stimulator of Adenylyl Cyclase ora Diterpene Multiple Sites of Action?. Trends. Pharmacol. Sci., 10, 442-47.

77. LEY K., 2001. "Physiology oflnflammation". Oxford University Press. New York.

78. LIN A. P., TSAI W. J., FAN C. Y., LEE M. J. and Kuo Y. C., 2000. Vandellia cordifolia Regulated Cell Proliferation and Cytokines Production in Human Mononuclear Cells. Am. J. Chin. Med., 28, 313-23.

79. LINDNER E., DOHADWALLA A. N. and BHATTACHARYA B. Y., 1978. Positive Inotropic and Blood Pressure Lowering Activity of a Diterpene Derivative Isolated from Coleus froskohli: Forskolin. Indian J. Chem., 15B, 880-83.

80. LUCKNER M., 1972. "Secondary Metabolism in Plants and Animals". Academic Press. New York.

81. MADAV S., TANDAN S. K., LAI J. and TRIPATHI H. C., 1996. Anti­inflamrnatory Activity of Andrographolide. Fitoterapia, 67, 452-58.

82. MADAV S., TRIPATHI H. C., TANDAN S. K. and MISHRA S. K., 1995. Analgesic, Antipyretic and Antiulcerogenic Effects of Andrographolide. Indian J. Pharm. Sci., 57, 121-25.

83. MALOCHET-GRIVOIS C., ROUSSAKIS C., ROBILLARD N., BIARD J. F., RIOU D., DEBITU C. and VERBIST J. F., 1992. Effects in vitro of two Marine Substances, Chlorolissoclimide and Dichlorolissodimide, on a non-small­cell Bronchopulmonary Carcinoma Line (NSCLN-6). Anticancer Drug Des., 6, 493-2.

84. MASASHI N., MISAKO 1., YOSHIHIRO H. and MAMORU E., 1986. Aldose Reductase Inhibitor from Palauan Sponges. Tennen Yuki Kagobutsu Torankai Koen Yoshishu, 28th, 200-07.

45

85. MATSUDA T., KUROYANAGI M., SUGIYAMA S., UMEHARA K., UENO A. and NISHI K., 1994. Cell Differentiatn-Inducing Diterpenes from Andrographis paniculata Ness. Chem. Pharm. Bull., 42, 1216-25.

86. MELCHIOR J., SPASOV A. A., ÜSTROVSKIJ 0. V., BULANOV A. E. and WIKMAN G., 2000. Double-Blind, Placebo-Controlled Pilot and Phase III Study of Activity of Standardized Andrographis paniculata Herbs Ness Extract Fixed Combination (Kan Jang) in the Treatment of Uncomplicated Upper­Respiratory Tract Infection. Phytomedicine, 7, 341-50.

87. MENDOZA L., TAPIA L., WILKENS M. and URZUA A., 2002. Antibacterial Activity of 13-epi-Sclareol, a Labdane Type Diterpene Isolated from Pseudognaphalium heterotrichium and P. cheiranthifolium (Asteraceae). Bol. Soc. Chil. Quim., 47, 91-98.

88. METZGER H. and LINDNER E., 1981. The Positive Inotropic-acting Forskolin, a Potent Adenylate Cyclase Activator. Arzneimittelforschung, 31, 1248-50.

89. MEYER B., STULTING A., MULLER F., LUUS H. and BADIAN M., 1987. The Effects Of Fors'Ko'~n "!;' · r--. ___ " -- T-L-- '"'-··1-- n-~nn .. -~ <! iJI;. 7160 ..1 T

1~ .uyl::J Ul"UiJ::i Ull J.J.J.U<l.-\Jl..U~CU. J. J.l;::;;:,;:au.c;. U• ~~JI.o .Lr.h., ..... J•t

71, 570-71.

90. MILLAN M. J., 1999. The Induction of Pain: An Integrative Review. Prog. Neurobiol., 57, 1-164.

91. MIYAZAWA M., SHIMAMURA H., NAKAMURA S. and KAMEOBA H., 1995. Antimutagenic Activity of ( + )-Polyalthic Acid from Vitex rotundiforia. J. Agric. Food Chem., 43, 3012-15.

92. MORI K. and KOMATSU M., 1987. Synthesis of ( + )-Baiyunol, The Diterpene Aglycone ofthe Sweet Glycoside Baiyunoside. Tetrahedron, 43, 3409-12.

93. MORITA H. and ITOKAWA H., 1988. Cytotoxic and Antifungal Diterpenes from the Seeds of Alpinia galanga. Planta Medica, 54, 117-20.

94. MULHALL J., DALLER M., TRAISH A., GUPTA S., PARK K., SALIMPOUR P., PAYTO K. and GOLDSTEIN I., 1997. Intracavernosal Forskolin; Role in Management of Vasculogenic Impotence Resistant to Standard 3-Agent Pharmacotherapy. J. Urol., 158, 1752-58.

95. NAVARRO A., DE LAS HERAS B. and VILLAR A. M., 1997. Diterpenoid with Anti-Inflammmatory Activity from Sideritis foetens Clemen. Z. Natwforsch. JC] ., 52c, 844-49.

96. NAVARRO A., DE LAS HERAS B. Immunomodulating Properties of Planta Medica, 66, 289-91.

and VILLAR ANGEL., 2000. the Diterpene Andalusol.

46

97. NYASSE B. and LENTA-NDJAKOU B., 2000. Aframodial, a labdane Diterpene Showing Selective in vitro Antileukemic Activity. Pharmazie, 55, 703-04.

98. PANOSSIAN A., DAVTYAN T., GUKASSYAN N., GUKASOVA G., MAMIKONYAN G., GABRIELIAN E. and WIKMAN G., 2002. Effect of Andrographolide and Kan Jang- Fixed Combination of Extracts SHA-10 and Extract SHE-3- on Proliferation of Human Lymphocytes, Production of Cytokines and Irnmune Activation Markers in the Whole Blood Cells Culture. Phytomedicine, 9, 598-95.

99. POWIS G., 1994. "Anticancer Drugs: Antimetabolite Metabolism and Natural Anticancer Agents". Pergamon Press, Oxford.

100. PURI A., SAXENA R., SAXENA R. P., SAX.ENA K. C., SRIVASTAVA V. and TANDON J. S., 1993. Inmunostimulant Agents from Andrographis paniculata. J. Nat. Prod., 56, 995-99.

101. QAIS N., MANDAL R. M., RA.SHID M. A., }ABBAR A., KOSHINO H., NAGASAWA K. and NAKATA T., 1998. A Furanoid Labdane Diterpene from Potamogeton nodosus. J. Nat. Prod., 61, 156-57.

102. RAJAGOPAL S., KUMAR R., DEEVI D., SATYANARAYANA C. and RAJAGOPALAN R., 2003. Andrographolide, a Potential Cancer Therapeutic Agent lsolated fromAndrographis paniculata. J. Exper. Ther. Oncol., 3, 147-58.

103. RA.zMILIC l. B. and SCHMEDA-HIRSCHMANN., 2000. Activity of Solidagenone and their Semisynthetic Derivatives on the Glucocorticoid-Mediated Signal Transduction. Planta Medica, 66, 86-88.

104. RECIO M. C. and Ríos J. L., 1989. A Review of Sorne Antimicrobial Compounds Isolated from Medicinal Plants Reported in the Literature 1978-1988. Phytother. Res., 3, 117-25.

105. RICHOMME P., GODET M., FOUSSARD F., TOUPET L., SÉVENET T. and BRUNETON J., 1991. A Novel Leishmanicidal Labdane from Polyalthia macropoda. Planta Medica, 57, 552-54.

106. RIJO P., GASPAR-MARQUEZ C., SIMOES M. F., DUARTE A., APREDA-ROJAS M. C., CANO F. H. and RODRÍGUEZ B., 2002. Neoclerodane and Labdane Diterpenoids from Plectranthus ornatus. J. Nat. Prod., 65, 1387-90.

107. RODRIGUEZ J. A., BUSTAMANTE C., ASTUDIU.O L. and SCHMEDA-HIRSCHMAJ\Itl G., 2002. Gastroprotective Activity of Solidagenone on E.xperimentally-induced Gastric Lesions in Rats. J. Pharm. Pharmacol., 54, 399-404.

47

108. ROENGSUMRAN S., PETSOM A., KUPTIYANUWAT N., VILAIVAN T., NGAMROJNAVANICH N., CHAICHANTIPYUTH C. and PHUTHONG S., 2001. Cytotoxic Labdane Diterpenoids from Croton oblongifolius. Phytochemistry, 56, 103-107.

109. ROENGSUMRAN S., PETSOM A., SOMMIT D. and VILAIVAN T., 1999. Labdane Diterpenoids from Croton oblongifolius. Phytochemistry, 50, 449-53.

110. ROJAS A., CRUZ S., PONCE- MONTER H. and MATA R., 1996. Smooth Muscle Relaxing Compounds from Dodonaea viscosa. Planta Medica, 62, 154-59.

111. ROTH B., BACCANARI D. P., SIGEL C. W., HUBBEL J. P., EADDY J., KAo J. C., GRACE M. E. and RAUCKMAN B. S., 1988. 2,4-Diamino-5-benzylpyrimidines and Analogues as Antibacterial Agents. 9. Lipophilic Trimethoprim Analogues as Antigonococcal Agents. J. Med. Chem., 31, 122-29.

112. SAKSENA A. K., GREEN M. J., SHUE H. and WONG J. K., 1985. Identity of Coleonol with Forskolin: Structure Revision of a Base-Catalysed Rearrangement Product. Tetrahedron Letters, 26, 551-54.

113. SANCHEZ-CRESPO M., ALONSO F., lNARREA P., ALVAREZ. and EGIDO J., 1982. Vascular Actions of Synthetic PAF-acether (a Synthetic Platelet-activating Factor) in the Rat: Evidence for a Platelet Independent Mechanism. Immunopharmacology, 4, 173-85.

114. SCHMEDA-HIRSCHMANN G., RODRIGUEZ J. and ASTUDILLO L., 2002. Gastroprotective Activity of the Diterpene Solidagenone and its Derivatives on Experimentally Induced Gastric Lesions in Mice. J. Ethnopharmacol., 81, 111-15.

115. SCHOLZ H., 1989. Mechanisms of Positive Inotropic Effects. Basic. Res. Cardiol., 84 (Suppl. 1}, 3-7.

116. SEKIGUCHI M., SHIGEMORI H., ÜHSAKI A. and KOBAYASHI J., 2001. Pacovatinins A-C, New Labdane Diterpenoids from the Seeds of Renealmia exaltata. J. Nat. Prod., 64, 1102-106.

117. SETHI A., KHARE A. and KHARE M. P., 1988. A Labdane Diterpene and its Glycoside from Melodinus monogynus. Phytochemistry, 27, 2255-59.

118. SHEN Y., CHEN C. and CHIOU W., 2000. Suppression of Rat Neutrophil Reactive Oxygen Species Production ar.d Adhesion by the Diterpenoid Lactone Andrographolide. Planta Medica, 66, 314-17.

119. SHIMIZU M., TSUJI H., SHOGAWA H., FUKUMORA H., TANAAMI S., HAYASHI T., ARISAWA M. and MORITA N., 1988. Anti-inflammatory Constituents of Topically Applied Crude Drugs. II. Constituents and Anti-inflammatory Effect of CIJ!Ptomeria japonica D. Don. Chem. Pharm. Bull., 36, 3967-73.

48

120. SHUKLA B., VISEN P. K., PATNAIK G. K. and DHAWAN B. N., 1992. Cholerectic Effect of Andrographolide in Rats and Guinea Pigs. Planta Medica, 58, 146-49.

121. SINGH M., PAL M. and SHARMA R. P., 1999. Biological Activity of the Labdane Diterpenes. Planta Medica, 65, 2-8.

122. SOMMIT D., PETSOM A., ISHIKAWA T. and ROENGSUMRAN S., 2003. Cytotoxic Activity of Natural Labdanes and theif"'·'Semi-Synthetic Modified Derivatives from Croton oblongifolius. Planta Medica, 69, 167-70.

123. SOUZA·FAGUNDES E., BRUMATTI G., MARTINS-FILHO 0. A., CORREA-ÜLIVEIRA R., ZAKI C. L. and AMARANTE-MENDES G. P., 2003b. Myriadenolide, a Labdane Diterpene Isolated from Alomia myriadenia (asteraceae) Induces Depolarization of Mitochondrial Membranes and Apoptosis Associated with Activation of Caspases-8, -9, and -3 in Jurkat and THP-1 Cells. Exp. Cell. Res., 290, 420-26.

124. SOUZA·FAGUNDES E., GAZZINELLI G., PARREIRA G. G., QUEIROZ A., MARTINS-FILHO O. A., AMARANTE·MENDES G. P., CORREA-ÜLIVEIRA R. and ZANI C. L., 2003a. In Vitro Activity of Labdane Diterpene from Alomia myriadenia (Asteraceae): Immunosuppresion Via Induction of Apoptosis in Monocytes. Intem. Immunopharm., 3, 383-92.

125. SOUZA-FAGUNDES E., QUEIROZ A., MARTINS 0. A., GAZZINELLI G., CORREA­ÜLIVEIRA R. and ZANI C. L., 2002. Screening and Fractionation of Plant Extracts with Antiproliferative Activity on Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 97, 1207-12.

126. SPADY D. K. and DIETSCHY J. M., 1983. Sterol Synthesis in vivo in 18 Tissues of the Squirrel Monkey, Guinea pig, Rabbit, Hamster, and Rat. ]. Lipid. Res., 24, 303-15.

127. SY L. K. and BROWN G. D., 1997. Labdane Diterpenoids from Alpinia. chinensis. J. Nat. Prod., 60, 904-08.

128. TANABE M., CHEN Y., SAlTO K. and K.ANo Y., 1993. Cholesterol Biosynthesis Inhibitory Component from Zingiber officinale. Chem. Pharm. Bull, 41, 710-13.

129. TANAKA J., HIGA T., SUWANBORIRUX K., KOKPOL U., BERNARDINELL; G. and }EFFORD C. W., 1993. Bioactive Norsesterpene 1,2-Dioxanes from a Thai Sponge, Mycale sp. J. Org. Chem., 58, 2999-3002.

130. TANAKA R., ÜHTSU H., IWAMOTO M., MINAMI T., TOKUDA H., NlSl-IINO H., MATSUNAGA S. and YOSHITAKEA., 2000. Cancer Chemopreventive Agents, Labdane Diterpenoids from the Stem Bark of Thuja standishii (Gord.) Carr. Cancer Lett., 161, 165-70.

49

131. TANAKA S., KASUYA Y., MASUDA Y. and SHIGENOBU K., 1983a. Studies on the Hypotensive Effects of Platelet Activationg Factor (PAF, 1-0-Alkyl-2-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphorylcholine) in Rats, Guinea Pigs, Rabbits, and Dogs. J. Pharm. Dyn., 6, 866-73.

132. TANAKA T., TANAKA 0., LIN Z. W. and ZHOU J., 1985. Sweet and Bitter Principies of the Chinese Plant Drug, Bai-Yun-Shen: Revision of the Assignment of the Source Plant and Isolation of Two New Diterpene Glycosides. Chem. Pharm. Bull., 33, 4275-80. --

133. TANAKA T., TANAKA 0., LIN Z. W., ZHOU J. and AGETA H., 1983b. Sweet and Bitter Glycosides of the Chinese Plant Drug, Bai-Yun-Shen (Roots of Salvia digitaloides. Chem. Pharm. Bull., 31, 780-83.

134. TANDON J. S., DHAR M. M., RAMAKUMAR S. and VENKATESAN K., 1977. Structure of a Biologically Active Diterpene from Coleus forskohlii. Indian J. Chem., 15B, 880-83.

135. THAMLIKITKUL V., DECHATIWONGSE T., THEERAPONG S., CHANTRAKUL C., BONNROJ P., PuNKRUT W., EKPALAKORN W., BOONTAENG N., TAECHAIYA S. and PETCHAROEN S., 1991. Efficacy of Androgrophis paniculata, Ness for Pharingotonsillitis in Adults. J. Med. Assoc. Thai., 74, 437-42.

136. TINCUSI B. M., JIMÉNEZ l. A., BAZZOCCHI I. L., MOUJI L. M., MAMAN! Z. A., BARROSO J. P., RAVELO A. G. and HERNÁNDEZ B. V., 2002. Antimicrobial Terpenoids from the Oleoresin of the Peruvian Medicinal Plant Copaifera paupera. Planta Medica, 68, 808-12.

137. UDDIN M. J., KOKUBO S., UEDA K., SUENAGA K. and UEMERA D., 2001. Hateruimides F-I, Four New Cytotoxic Diterpene Alkaloids from an Ascidian Lissoclinum Species. J. Nat. Prod., 64, 1169-73.

138. UDDIN M. J., KOKUBO S., UEDA K., SUENAGA K. and UEMERA D., 2002. Hateruimides J and K, Potent Cytotoxic Diterpene Alkaloids from the Ascidian Ii.ssoclinum Species. Chem. Lett., 10, 1028-29.

139. VARGAFTIG B. B., LERFORT J., CHIGNARD M. and BENVENISTE J., 1980. Platelet-activating Factor Induces a Platelet-dependent Bronchoconstriction Unrelated to the Formation of Prostaglandin Derivatives. Eur. J. Pharmacol., 65, 185-92.

140. VARRO A. and PAPP J. G., 1995. Classification of Positive Inotropic Actions B'lsed on Electrophysiologic Characteristics: Where Should Calcium S·.msitizers be Placed? J Cardiovasc. Pharmacol., 26 ( Suppl. 1), 32-44.

141. VILA R., MUNDINA M., TOMI F., FURLÁN R., ZACCHINO S., CASANOVA J. and CAÑIGUERAL S., 2002. Composition and Antifungal Activity of the Essential Oil of Solidago chilensis. Planta Medica, 68, 164-67.

50

142. VISEN P. K., SHUKLA B., PATNAIK G. K. and DHAWAN B. N., 1993. Andrographolide Protects Rat Hepatocytes Against Paracetamol-Induce Damage. J. Ethnopharmacol., 40, 131-36.

143. WAKABAYASHI K., NAGAO M., ESUMI H. and SUGIMURA T., 1992. Food­derived Mutagens and Carcinogens. Cancer Res., 52, 2092-98.

144. WARIDEL P., WOLFENDER J., LACHAVANNE J. and HOSTETTMANN K, 2003. ent­Labdane Diterpenes from the Aquatic Plant Potamogeton pectinatus. Phytochemistry, 64, 1309-17.

145. WEDMORE C. V. and WILLIANS T. J., 1981. Control of Vascular Permeability by Polymorphonuclear Leukocytes in Inflammation. Nature, 289, 646-50.

146. Y AMADA H. and NISHIZAWA M., 1987. Total Synthesis of Baiyunoside by a Novel2' Discriminated Glycosidation. Tetrahedron Letters, 28, 4315-18.

147. YANG H. O and HAN B. H., 1998. Pinusolidic Acid: Platelet-Activating Factor Inhibitor from Biota orientalis. Planta Medica, 64, 73-74.

148. YANG H. 0., KANG Y. H., SUH D., KIM Y. C. and HAN B. H., 1995. Biological and Pharmacological Effects of Pinusolide, a Novel Platelet Activating Factor Antagonist. Planta Medica, 61, 519-22.

149. YASUI K., KAWADA K., KAGAWA K., TOKURA K., KITADOKORO K. and lKENISHI Y., 1993. Synthesis of Manool-Related Labdane Diterpenes as Platelet Aggregation Inhibitors. Chem. Pharm. Bull., 10, 1698-97.

150. ZANI C. L., ALVES T. M., QUEIRÓZ R., FONTES E. S., SHIN Y. G. and CORDELL G. A., 2000. A Cytotoxic Diterpe from Alomia myriadenia. Phytochemistry, 53, 877-80.

151. ZENG S., SHEN B., WEN L., HU B., PENG D., CHEN X. and ZHOU W., 1995. Experimental Studies of the Effect of Forskolin on the Lowering of Intraocular Pressure. Yan Ke Xue Bao., 11, 173-76.

152. ZHANG C. Y. and TAN B. K., 1996. Hypotensive Activity of Aqueous Extract of Andrographis paniculata in Rats. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23, 675-78.

153. ZHANG C. Y. and TAN B. K., 1997. Mechanisms of Cardiovascular Activity o: Androgmphis paniculata in the Anaesthetized Rat. J. Ethnophannacol., 56, 97-101.

154. ZHOU B., BAJ N. J., GLASS T. E., MALONES., WERKHOVEN M. C., TROON F., WISSE J. H. and KlNGSTON D. G., 1997. Bioactive Labdane Diterpenoids from Rencalmia alpinia Collected in tb.e Suriname Rainforest. J. Nat. Prod., 60, 1287-93.

Capítulo 2

Aislamiento, Caracterización Estructural y Actividad Biológica de Diterpenos del

Labdano del Oxylobus glanduliferus

51

52

INTRODUCCIÓN

El género Oxylobus (Tribu Eupatoriae, Familia Asteraceae) lo componen cinco especies (Tabla I), las cuales se encuentran distribuidas en las regiones montañosas de Guatemala y del sur de México; sólo una de estas especies, el Oxylobus glanduliferus A. Gray extiende su distribución de manera discontinua, desde México y Guatemala, hasta las regiones andinas de Colombia y Venezuela (Turner, 1988; Tumer & Kerr, 1985). Taxonómicamente, este género está relacionado con el género Ageratina (el cual incluye unas 280 especies) y otros ocho pequeños géneros (Tabla II) conformando la subtribu Oxylobinae (King & Robinson, 1987).

Tabla 1: Especies que Conforman el Género Oxylobus J ESPECIE ÁREA DE DISTRIBUCIÓN

O. arbutifolius (H.B.K.) A. Gray México, Guatemala

O. glanduliferus (Sch.Bip.) Gray México, Guatemala, Colombia, Venezuela

O. oaxacanus Blake México

O. adscendens B. L. Rob. & Greenm. México, Guatemala

O. preecei B. L. Turner México

Tabla 11: Géneros que Conforman la Subtribu Oxylobinae 1 1

GÉNEROS No DE ESPECIES ! ÁREA DE DISTRIBUCIÓN 11---------------·--···· -------

1-A...::g::....e_ra_ti_·n_a_S_.:;p_a_c_h _________ z_s_o _____ .. J~~gión Neotropical

5 i México, Guatemala, Oxylobus A. Gray ll---------------------------_j_0Iombia, Venezuela

Piptothrix A. Gray 5 i 11--"--------::..........--------------- ---·- ·-··

México

Jaliscoa S. Watson, 3 1 México ··-··· ---.-- ···--------ti

Pachythamnus King & B. Rob. 1 1---· . . ------·- --·- ...

i México, Nicaragua -·----

Spaniopappus B. Robín. 5 Cuba

Standleyanthus Kin& P. B. Rob. 1 Costa Rica ___________________ _, ______________ -;1

Ka unía King & B. Rob. 14 Sudamérica ~---------~-----------T----------r---------11

faramilloa King & B. Rob. : 2 Colombia

53

La química de esta subtribu ha sido revisada recientemente (Herz, 2003), y como conclusión general se ha observado que sus especies, a diferencia de las especies incluidas en las otras subtribus de las Eupatoriae, biosintetizan una amplia variedad de metabolitos secundarios específicos, tales como cromenos, benzofuranos y monoterpenos aromáticos de la serie del p-mentano (timoles); también han sido reportados, pero en menor proporción, sesquiterpenos de varios tipos, y diterpenos de las series dellabdano, clerodano y kaurano.

Los primeros estudios fitoquímicos sobre el genero Oxylobus se iniciaron en la década de los ochenta y los mismos se centraron en el Oxylobus oaxacanus (Bohlmann et al., 1980) y el O. glanduliferus (Amaro & Adrián, 1982). Estos estudios revelaron que O. oaxacanus produce lactonas sesquitérpenicas, mientras que O. glanduliferus es particularmente rico en la elaboración de diterpenos de la serie dellabdano. Posteriormente, Bohlmann et al. (1985) continuaron estudiando el género, abordando el estudio de O. adscendens y O. arbutifolius. De la primera de estas especies se aislaron cinco lactonas sesquiterpénicas (1), (3), (4a), (4b), (5), y dos diterpenos (6a) y (6b). El estudio del O. arbutifolius arrojó como resultado el aislamiento de una lactona sesquiterpénica adicional (2), además de (1), (4a) y (6a) y los monoterpenos (7) y (8).

(1)

o (3)

Rwj (L-cOOJ· Rz'''

j H

(5a) Rt = OAc; Rz = H

(6b)R1 = Rz =O

ctq ....

(4a) R = H

(4b) R = OOH

o

(7)

(2) o

o (5)

(8)

54

A tenor de lo expuesto en el Capítulo 1 de la presente memoria, y ante el hecho de que el estudio preliminar realizado por Amaro & Adrián (1982) al Oxylobus glanduliferus (Sch. Bip.) Gray, reveló que dicha especie es una fuente importante de diterpenos del labdano, se decidió realizar un nuevo análisis a la núsma, en función de los siguientes objetivos:

OBJETIVOS

1. Reaislar y caracterizar los diterpenos del labdano anteriormente reportados por Amaro & Adrián (1982), con vistas a:

A. Realizar el estudio detallado de sus espectros de RMN uni- y bidimensionales, a objeto de asignar el mayor número posible de señales en sus espectros de RMN-1H y RMN-13C.

B. Evaluar la actividad antibacteriana, antifúngica y citotóxica del los referidos diterpenos.

C. Preparar derivados de estos diterpenos, y ensayar su actividad biológica frente a las mismas líneas microbianas y celulares usadas con los diterpenos naturales, con el fin de establecer relaciones estructura química-actividad biológica.

2. Intentar realizar estudios sobre el posible mecanismo de acción de los compuestos que posean actividad citóxica positiva. En razón del carácter lipofílico de estos diterpenos, estos estudios se realizarían con biomodelos de membranas lipídicas.

3. Profundizar el estudio fitoquímico de esta especie, con el fin de aislar y caracterizar los metabolitos secundarios minoritarios que pudieran estar presentes en la misma, y en particular los de naturaleza isoprénica.

El O. glanduliferus es la única especie de este género reportada para Venezuela. La núsma se encuentra sólo an los páramos andinos de los estados Mérida y Táchira (Badillo, 1994). De acuerdo a Aristiguieta (1964), se presenta como una planta sufruticosa, erect<t hasta subdecumbente, de ramas pubescentes y hojas opuestas, pecioladas, oblongas, de bordes crenados, obtusas en el ápice, redondeadas hasta subtruncél das en la base; capítulos dispuestos en cimas compuestas tricótomas, su!.>t::ésiles o pedicelados, de involucro acampanado, biseriado y con receptáculo plano, en el cual se insertan numerosas flores cuyo color varía del blanco al rosado. Aquenios negros, dotados de papus escamoso.

55

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las partes aéreas (sin moler) del Oxylobus glanduliferus (Sch.Bip.) Gray, una vez secas al aire, se sumergieron en diclometano durante cinco minutos. Posteriormente, el material vegetal se secó bajo campana, se molió, y se extrajo con metanol caliente en forma continua en un sohxlet (Natori et al., 1981). Las disoluciones obtenidas después de separar por filtración el material vegetal fueron concentradas en un rotavapor. El extracto en diclorometano fue preadsorbido en gel de sílice y posteriormente sometido a diferentes procesos de percolado, fraccionamiento y purificación (Esquema 1), utilizando técnicas cromatográfica (Coll & Bowden, 1986; Henke, 1995; Mikes, 1979; Simpson, 1976; Sjovall et al., 1968;

Snyder & Kirkland, 1974; Stahl, 1969).

1 Esquema 1: Procedimiento Empleado en la Separación y Purificación de

los Compuestos del Oxylobus glanduliferus (Sch.Bip.) Gray

Extracción con Extracción con

Diclorometano a 25 oc Material Vegetal Metano! a Reflujo

Seco • ... ,. ~ Cromatografía en Extracto en Extracto Columna al Vacío

Diclorometano Metanólico ~ ~

l 1 Subfracciones

1

L.¡ A,B,C,D,F,G,H,I 1

Extracto no Analizado

Recromatogrnfia l enColumm:

Productos

-[iU~t :-acciones j

Puros Cristalización

56

De esta manera, se lograron aislar cuatro diterpenos de la serie dellabdano, cuyas estructura se representan a continuación (Cuadro 1).

Cuadro 1: Productos Aislados del Extracto en Diclorometano de las Partes Aéreas del Oxylobus glanduliferus (Sch.Bip.) Gray

CHzOH

Labdan-8a.,15-diol [1] 13-epi-Labdan-8a.,15-diol [5]

CHzOH

Oxylobusol [6] 13-epi-Oxylobusol [7]

Los cuatro productos aislados fueron estructuralmente caracterizados sobre la base de estudios espectroscópicos, utilizando técnicas convencionales (IR, EM, RMN-1H y RMN-13C) y técnicas de RMN bidimensionales CH. 1H-COSY, HMQC, HSQC, HMBC y NOESY). En el caso del producto [lj se obtuvieron algunos derivados, los cuales también fueron caracterin dos mediante· técnicas espectroscópicas.

A continuación describiremos con detalle el análisis estructural realizado a cada uno de estos productos.

57

Labdan-8a, 15-diol [1]

De la reunión H de la cromatografía general, correspondiente a las fracciones 81-84 eluidas con mezclas diclorometano-acetona 4:1 y 3:2, se logró aislar un sólido blanco, el cual fue purificado mediante cristalización en acetona, para dar finas agujas blancas, homogéneas en TLC; P. F. = 81-83 °C, [a]0 : -38,5°.

Su espectro IR (Fig. lA; Tabla lA), muestra bandas típicas de alcoholes [vmax: 3.360 cm·1 (0-H) y vmax: 1.062 cm·1 (C-0)], así como también absorciones propias de enlaces C-H alifáticos [v max: 2.926 y vmax: 2.869 cm·1 (tensión C-H) y V max: 1.386 y 1.364 cm·l (deformación C-H)].

La presencia en su espectro de masas (Fig. lD; Tabla 1D) de un ion molecular a m/z: 310, y los datos derivados de sus espectros de RMN-1H (Fig. 1B-1 y 1B-2; Tablas 1B-1 y 1B-2) y de RMN-13C (Fig. 1C; Tabla 1C), en relación al número y tipo de hidrógenos y carbonos presentes en la molécula, permitió establecer la formula molecular C20H380 2 (Tabla 1). Dicha fórmula molecular corresponde a un compuesto con dos instauraciones, el cual necesariamente tiene que ser bicíclico, puesto que los datos de IR y de RMN-13C indican la carencia de dobles enlaces y de carbonilos.

Tabla 1: Determinación de la Fórmula Molecular del Labdan-8a, 15-diol [1)

Grupos Estructurales Composición Elemental

Número de Tipos de Número de Número de Número de Grupos Grupos Carbonos Hidrógenos Oxígenos

5 -CH3 5 15 -8 >CH2 8 16 -

1 >CH2-0- 1 2 1

3 >CH 3 3 -

2 >C< 2 - -

1 >C-0- 1 - 1

2 -OH - 2 .¡;_

Fórmula Molecular Czo H3u Oz

( *) Los oxígenos de los hidroxilos ya fueron contabilizados al denotar la composición elemental de los grupos -CHz-0- y -C-0-.

Figura lA: Espectro Infrarrojo (KBr), del Labdan-8a,15-diol (1]

100,0

80

60

%T

40

2

19 18

'

15 CH20H

2.869 cm·1

/ (Tensión C-H) /\ 1.062 cm·1

20 3.360 cm·l 2.926 cm·I 1.386 cm·1 y 1.364 cm·t

(Deformación C-H} (C-0)

(O-H) / (Tensión C-H) 10,0 -1------r------,.-----....-------,-------.-.

4000,0 3000 2000 1500 1000 450,0 cm-1

Tabla lA: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (KBr), del Labdan-8a,15-diol [1]

Umáx. ( cm-1) 3.360 2.926 y 2.869 1.386 y 1.364 1.062

Asignación 0-H tensión C-H deformación C-H C-0

58

Los dato5 anteriores permiten establecer como hipótesis de trabajo, que el compuesto en estudio es posiblemente un diterpeno de las series del labdano o halimano, dado que, el número de metilos, rnetilenos, melinos y carbonos cuaternarios concuerdan sólo para esqueletos de este tipo (Dev & Misra, 1986);

la posibilidad de otros esqueletos bicíclicos, tales como clerodano ó portulano queda excluida porque sus estructuras exigen tres metilos secundarios.

H

B

M

J (Hz)

Figura 1B-1: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDCl3),

del Labdan-8a,15-diol [1]

19 18

H-19 H-20

H-17 H-18

HJ

Tabla 1B-1: Desplazamientos Químicos (8) en el Espectro de RMN-1H (CDCl3, 400 MHz), del Labdan-8a,15-diol (1]

H-7 H-9 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 '

1,77y 1,34 0,95 :i,58 0,85 1,08 0,81 0,73 0,73

dt t m D S S S S

12 y 3,1 3,1 - 6,3 - - - --

59

OH

2,83

S

-

Figura 1B-2: Espectro de RMN-1H {400 MHz, CaDa), del Labdan-8a, 15-diol [1)

2

19 18

H-17

H-18

H-19 1

H-20

H-15 OH

Jo ZO 1.!> 1 o

Tabla 1B-2: Desplazamientos Químicos {B) en el Espectro de RMN-1H {CaDa, 400 MHz), del Labdan-8a,15-diol [1]

H H-7 H-9 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 OH -

60

o (ppm) 1,97 1,19 3,79 1,10 1,27 0,97 0,88 0,86 3,24

M dt t m D S S S S S

](Hz) 12 y 3 3,7 - 6,5 - - - - -

Figura 1C: Espectro de RMN-13C (100 MUz, CDC13),

del Labdan-8a,15-diol [1]

11 zo

z ¡o 9 e ····oH 3 4 05

\.H s 19 18

C-18 C-17 c-19 C-16

~JC-14 l_C-1 , C-2

C-7 C-3 C-12 C-11 C-6

C-10 1

• e~ C-13 C-20

C-9 C-5

C-15

Tabla 1C: Desplazamientos Químicos (8) en el Espectro de RMN-13C (CDCl3, 100 MUz), del Labdan-8a,15-diol (1]

e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7

o (ppm) 39,5 18,3 41,9 33,1 56,0 20,2 44,0

Tipo >CH2 >CH2 >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2

e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14

o (ppm) 74,4 62,3 39,0 22,9 40,7 30,4 39,6

Tipo >CH-0- >CH >C< >CH2 >CH2 >CH >CH2

e C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 TMSi

o (ppm) 60,2 19,9 23,8 32,9 21,4 15,4 como Patrón

Tipo >CHz-0- -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 Interno

61

62

Los espectros HMQC (Fig. 1F) y HMBC (Fig. 1G-1) permitieron correlacionar cada uno de los picos del espectro de RMN-13C con las señales de los respectivos hidrógenos, unidos a uno, dos y tres enlaces. Con ello fue posible confirmar las asignaciones hechas en los espectros de RMN (Tablas 1B-1; 1B-2 y 1C) y también establecer la presencia en la molécula de las siguientes sub-unidades estructurales:

1) Subunidad Estructural [A]: Metilo situado sobre un carbono cuaternario sp3,

unido a un oxígeno [singulete a oH: 1,08 (H-17); HMQC: H-17 .... Sc: 23,8 (C-17); HMBC: H-17 ++oc: 74,4 (C-8)].

2) Subunidad Estructural [B]: Oximetileno [oH: 3,58, m (WY' :;: 20 Hz), H-15; HMQC: H-15 +-+Oc: 60,2 (C-15)].

Es evidente que los dos oxígenos presentes en las subunidades estructurales (A] y [B] corresponden a grupos hidroxilos, caracterizados ambos a través del IR: vmax: 3.360 cm·1 (0-H); vmax: 1.062 cm·1 (C-0), del RMN-1H: singulete ancho intercambiable con D20 a oH: 2,83 (OH), y del EM: iones abundantes a m/z: 292 [M+ -H20] y a m/z: 277 [M+- CH3-H20].

Subunidad Estructural [A]

15

e-CH20H

Subunidad Estructural [B]

3) Subunidad Estructural [C]: gem-Dimetilo [singuletes a oH: 0,81 (H-18) y a oH: 0,73 (H-19)*; HMQC: H-18 H Oc: 32,9 (C-18) y H-19 4-+ Oc: 21,4 (C-19); HMBC: H-18 /H-19 H Se= 33,1 (C-4); C-18 H H-19 y C-19 +-+ H-18].

4) Subunidad Estructural [D]: Metilo angular [singulete a oH: 0,73 (H-20)*; HMQC: H-20 H Oc: 15,4 (C-20); HMBC: H-20 H oc= 39,0 (C-10)].

5) Subunidad Estructural [E]: Metilo secundario [oH: 0,85 (d, f:;: 6,3 Hz), H-16; correlaciones HMQC: H-16 .... oc: 19,9 (C-16) y HMBC: H-16 ..... oc: 30,4 (C-13)).

16 19 20 16

H3C /CH3 CH3 "~H3 \4 .;~'e e

/\) ~h'-Subunidad Sub unidad Subunidad

Estructural ~q Estructural [D] Estructural [E]

(*) En el espectro de RMN-1H corrido en CeD6 (Fig. lB-2; Tabla lB-2), puede observarse la resolución de dicho singulete (a 311: 0,73), en otros dos singuletes a 311: 0,88 (H-19) y On: 0,86 (H-20), cada uno de los cuales integra para tres hidrógenos.

63

7) Subunidad Estructural [F]: Secuencia de tres grupos metilenos contiguos, integrados a un sistema alicíclico* [oc: 39,5 (C-1), Oc: 18,3 (C-2) y oc: 41,9 (C-3); HMBC: C-3 +-+ H-1 +-+ C-2 +-+ H-3 +-+ C-1 +-+ H-2].

6) Subunidad Estructural [G]: Metino angular [señal solapada a oH: 0,87 (H-5)t; HMQC: H-5 +-+ Oc: 56,0 (C-5)], unido a un resto etilo [HMBC: C-5 +-+ oH: 1,58 (H-6); C-5 +-+oH: 1,77 (H-7); C-6 (oc: 20,2) +-+ H-5; C-6 +-+ H-7 y C-7 (oc: 44,0) +-+ H~6].

8) Subunidad Estructural [H]: Metino vecinal a dos centros cuaternarios [triplete U= 3,1 Hz) a oH: 0,95 (H-9); HMQC: H-9 +-+Oc: 62,3 (C-9)], el cual se une a una cadena metilénica: [1H/H-COSY (Fig. lE): H-9 +-+ H-11 +-+ H-12; HMQC: H-11 +-+Oc: 22,9 (C-11) y H-12 +-+oc: 40,7 (C-12); HMBC: C-9 +-+ H-11 y C-12 +-+ H-9].

CHz

~2( '". rlz'-'"e

Sub unidad Estructural [F]

Subunidad Estructural [G]

Submúdad Estructural [H]

(*l La secuencia se determinó localizando a través del HMQC las señales solapadas de los hidrógenos H-1, H-2 y H-3, sus cruces en el 1H/H-COSY y sus correlaciones en el HMBC.

(t) En el espectro de RMN-1H corrido en C6D6 (Fig. lB-2) puede distinguirse dicha señala a 8H:1,19

Las ocho subunidades estructurales hasta ahora conformadas incluyen un total de diecinueve (19) carbonos, treinta y seis hidrógenos (36) y dos (2) oxígenos, con lo cual faltarían, para satisfacer la fórmula molecular, un (1) carbono y dos (2) hidrógenos. Es lógico suponer entonces que la novena subunidad estructural [1] corresponda a un metileno, el cual origina el único pico no asignado hasta ahora en el espectro de RMN-13C: 6c: 39,6 (C-14).

Submúdad Estructural [1]

Al tomar en cuenta los dos gr¿ dos de insaturación que exige la fórmula molecular, el número y la naturalezc:. úe las nueve subunidades estructurales que conforman la molécula, se llegó a la conclusión que el compuesto en estudio es posiblemente un diterpeno de la serie dellabdano, con un hidroxilo terciario en C-8 (subunidad estructural [A]) y un hidroxilo primario en C-15 (subunidad estructural [B]).

64

Sobre la base de la hipótesis anterior, fue posible engranar las subunidades estructurales [A]-[1], con la ayuda de la información aportada por el espectro HMBC.

Así pues:

1. Las subunidades estructurales (A], [C], [D], [F] y [G] se unen entre sí para conformar el sistema bicíclico (un anillo decalínico), incorporando al C-9 de la subunidad [H]. En efecto:

1.1. Las correlaciones C-8 +-+ H-9 +-+ C-7/H-7 H C-9 +-+ H-17/C-17 +-+ H-9 de una parte, y de otra, la secuencia C-9 +-+ H-20 +-+ C-10 +-+ H-9 +-+ C-20 (Fig 1G-2) demuestran que las subunidades [A] y [D] se acoplan entre sí, a través de la unión C-8 --- C-9 --- C-10, que involucra a la subunidad [H].

1.2. La secuencia C-17 +-+ H-7 +-+ C-5 +-+ H-6 +-+ C-7 +-+ H-17 +-+C-8 +-+ H-7 +-+C-6 +-+ H-5 indica que [A] se une a [G] a través del enlace C-8 --- C-7. A su vez [G] se une por el otro extremo (C-5) a [D] (a través del C-10), en concordancia con los cruces C-5 +-+ H-20 y C-20 +-+ H-5. De esta manera se completa el anillo B del sistema decalínico, con lo cual son entendibles las correlaciones C-5 +-+ H-9 y C-9 +-+ H-5 (Fig. 1G-2).

Figura lG-2

~H ~7"'-H

65

1.3. El anillo A del sistema decalínico se genera (según indica la secuencia H-3 +-+C-4 +-+H-18 +-+C-19 +-+H-3 +-+C-18 +-+H-19 +-+C-4 +-+H-18 +-+C-3 +-+H-19),

por el acoplamiento entre las subunidades [C] y [F] a través del enlace

C-3 --- C-4; la unión entre [C] y [G] mediante el enlace C-4 --- C-5 (sustentada en las correlaciones: C-18 +-+ H-5 +-+ C-19 y H-18 +-+ C-5 +-+ H-19)

y la inserción de la subunidad [D], la cual se acopla a la [F], formando

el enlace C-1 --- C-10 (cruces H-20 +-+ C-1 +-+ H-9) (Ftg. 1G-3).

CHz

HzC.; 'e H2~.:. ~

l:H3 !Ot

/ ..... ~,· ~ [@]

• • ...... - / \/ ;\

H 3C CH3 18 19

[!§] Figura 1G-3

2. La subunidad [H], se une a la subunidad [E], mediante el enlace C-12 --- C-13

(cruce C-13 +-+ H-12) y esta última se prolonga a través de la subunidad [1] (cruces C-13 +-+ H-14 y C-14 +-+ H-13), hasta la subunidad terminal [B]

(secuencias de correlaciones HMBC: H-15 +-+ C-13 +-+ H-16 +-+ C-14 +-+ H-15 y H-13 +-+ C-15 +-+ H-14 +-+ C-16 +-+ H-13) (Fig. 1G-4) para completar la cadena lateral.

13 {

16H3 ./' He

CH2--8 H e/ 12

2 ¡n

[@[]

9 CH e' e ![H]j

¡ ~.----- e -cHz-e

[0]

1

e <!HzOH

~

66

Los datos anteriores permiten concluir que la estructura gruesa del compuesto en estudio corresponde a la de un labdan-8,15-diol (1]. Esta estructura resultó congruente con el patrón de fragmentación (Esquemas 1D-1 y 1D-2) observado en su espectro de masas (Fig. 1D; Tabla 1D), el cual presenta picos de carácter diagnóstico (Ej. m/z: 137 y m/z: 239) para 8,15-dioles de la serie dellabdano (Enzel & Ryhage, 1965; Enzel et al., 1972; Enzel & Wahlberg, 1980).

Una vez establecida la estructura gruesa del compuesto [1], se procedió a determinar su estereoquímica. Así pues:

1. La disposición del grupo hidroxilo en C-8 es ecuatorial y en consecuencia la del metilo es axial, en razón de las siguientes consideraciones:

1.1. El apantallamiento del singulete de los hidrógenos H-20 (oH: 0,73; CH3) evidencia una interacción 1,4-dia.xial originada por los metilos C-19 y C-17, situados respectivamente sobre C-4 y C-8; si el hidroxilo en C-8 estuviera en disposición axial, H-20 sufriría un efecto desapantallante apareciendo su señal a oH= 0,95-0,99 (De Pascual Teresa et al., 1977; 1982; 1983a; Hugel et al., 1966).

1.2. El desplazamiento diamagnético del pico del carbono C-17 (oc: 23,8; CH3)

y el efecto desapantallante que ejerce el grupo hidroxilo sobre la señal de C-9 (oc: 62,3; CH); de poseer el hidroxilo una configuración axial se observarían los siguientes desplazamientos químicos: C-17 (<>e= 30,5) y C-9 (oc= 59,0) (Buckwalter et al., 1975).

1.3. La disposición ecuatorial del grupo alcohólico en C-8 también quedó evidenciada por los desapantallamientos observados en las señales de los carbonos C-6 (oc: 20,2), C-7 (oc: 44,0) y C-8 (oc: 74,2), en comparación con los desplazamientos de las mismas, cuando el grupo hidroxilo se encuentra en posición axial: C-6 (~\ = 18,0), C-7 (oc= 41,0) y C-8 (oc= 73,0) (lmamura et al., 1977).

2. La configuración relativa de los carbonos que conforman la unión de los anillos A/B fue asumida como "trans" (C-5 a-H y C-10 [3-CH3 , o viceversa*) debido al desplazamiento observado en el espectro de RMN-13C, para la señal asignada al metilo angular C-20 (oc: 15,4). Este desplazamiento se corresponde con los r~portados en la bibliografía para metilos angulares en sistemas 5,10-trans-esteroidales (Gough et al., 1972) y para un gran número de 9-metil-trans-deca inas (Dalling et al., 1973).

(*) La configuración C-5 a-H y C-10 l3-CH3, corresponde a labdanos de la serie nonnal y la contraria, C-513-H y C-10 a-CH3 a labdanos de la serie "ent".

Figura 1D: Espectro de Masas (Impacto Electrónico, 70 eV), del Labdan-8a,15-diol [1]

lO

9

7

70

65

60

55

50

45

40

35 55

30

2

20

15

lO

69

l

5

o~~N

95

81

l37

109

121

lsol63

15

177

1 1 2

19 18

277

292

Tabla 1D: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas del Labdan-8a,15-diol [1]

m/z 310 292 277 236 221 207

Abund. Relat. 2,21 43,11 52,74 6,36 5,03 5,43

m/z 177 163 157 150 137 121

Abund. Relat. 41,90 14,67 8,58 13,92 70,09 44,15

m/z 95 81 79 71 69 67

Abund. Relat. 69,94 58,92 17,38 11,10 50,24 21,33

191

100

109

53,29

55

35,55

67

Esquema 1D-1: Patrón de Fragmentación del Labdan-8a.,15-diol [1].

¡t CHzOH

--+

¡t CHzOH

,,

J'="• "1 0-c~ '\_/·UH ---- ' V'OH mft 239

~CH,OH_j mlz: 221 ¡t

CH20H

----. CH,OH ~0.,

Q;CH20H q··'' -H20 1 + CH20H

m/z:157 m/z:139

¡t CH20H

HaC~CHaOH • cXf~H

/'...~

-H1o , QY m/z: 209 m/z:191

CHzOH

0'1 00

Esquema 10-2: Patrón de Fragmentación del Labdan-8a,15-diol [1]

¡t CH20H

1-H,O ¡t

CH20H

• miz: 292

j!

CH20H r<_CH20H

m/z:124

CH20H

___,., 9 m/z:109 m/z:95

D".,.,m< rr r, ~

m/z:137

¡t ("f'Y r;t1 -eH,, ~ m/z:192 m/z:177

0'\ -o

70

3. Desde el punto de vista biogenético se conoce que la estereoquímica relativa C-9/C-10 es "anti" (C-9 a-H y C-10 ~-CH3 o viceversa) debido a que la ciclación del pirofosfato de geranil-geraniol que da origen a los diterpenos del labdano es un proceso concertado y por lo tanto estereoespecífico (Hanson, 1971). Mas aún, en lo que se refiere a labdanos de la serie normal, Cocker & Halsall (1956a) determinaron la configuración ~ de la cadena carbonada en C-9 por medio de reacciones químicas, al demostrar que la ,-,, hidrogenación de un 1:18

'9 -labdano, derivado del ácido labdanólico, ocurre

por la cara a menos impedida. Un año más tarde Cocker & Halsall (1957), evidencian nuevamente dicha configuración, al mostrar que un cetoácido derivado del ácido labdanólico no sufre epimerización en C-9 cuando es sometido a tratamiento alcalino; si la cadena tuviera configuración a, C-9 se epimerizaría, al cambiar H-9 de la disposición axial a la ecuatorial.

4. La estereoquímica de C-13 no fue posible determinarla utilizando los métodos espectroscópicos a nuestra disposición, ya que este carbono se encuentra formando parte de una cadena lateral abierta, la cual presenta gran movilidad. Por ello, fue necesaria la obtención del respectivo ácido [3] y del éster metílico (4], a objeto de comparar sus constantes físicas con las reportadas en la bibliografía para estos derivados. La comparación de constantes físicas de los diferentes 8, 15-dioles isómeros, no resulta en este caso concluyente, en vista de que se encuentra bien establecido en la literatura, que los valores de [a]0 para los 8-hidroxi-labdanos suelen ser muy pequeños y además, muy similares en valor absoluto para los dos posibles epímeros (Carman, 1966; 1973).

En razón a lo anteriormente expuesto se procedió a oxidar el dial, utilizando el reactivo de Jones (K2Cr20 7/H2S04). La reacción se llevó a cabo en baño de hielo* y la misma fue controlada por cromatografía de capa fina, observándose que en principio se formaba un producto menos polar, el cual, en la medida que transcurría la reacción, evolucionaba hacia otro producto de mayor polaridad que el dial. La reacción se detuvo, cuando se detectó la desaparición total del producto de partida, y la mezcla de reacr:ión obtenida se procesó de la manera usual (ver parte experimental) y se sometió a cromatografía preparativa, obteniéndose de esta manera, dos productos, los cuales describiremos a continuación.

(*)La reacción se hizo a baja temperatura para evitar o minimizar la formación de subproductos de eliminación, los cuales podrían generarse al protonarse el hidroxilo terciario en C-8, en el medio ácido en el cual transcurre la reacción.

Figura tE: Espectro 1H/H-COSY (CDCl3) del Labdan-8a,15-diol [1]

2

3

,...; 1

::X::

19 18

~ :::J

B ¡ .f .). t-..

1

::X::

:r: o

3.0 i! 5 2.0 1.5

H-1~ 1

l.O

LO

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

ppm

71

Figura 1F: Espectro HMQC (CDCI3) del Labdan-8a,15-diol (1]

2

19 18

C-13----<

C-18,-----.t:.

H-15 Olf

C-5

C-9 C-15 "-'L 15

H-17llJ16 ~-19 H-20

"-AJ" 'V"\ f"VI""'

1.& J. O

If-9 If-5

~ ~ ~® -

""' l ' J.O l ~ lO 1.' 1 O

72

zo

JO

40

DIP

Figura 1G-1: Espectro HMBC (CDC13) del Labdan-8a,15-diol [1]

e e-1

e

C-20

-6 9

C-17

C-13 -4

e-10 e-')

e-14+ e-1 e-7

C-5

e-15 C-9

C-8

""" 1.5 1 o

Correlaciones HMBC que Evidencian la Posición del Alcohol Primario y del Alcohol Terciario

C-13---<

C-14

H-15 _,v.,.__

[ -e -C-13 /H-15

r 4/H-15

1 C-1

L.AJ

- :S

73

H-20 o:0,73(s)

H-9 o: 0,95 (t)

-21,31 -:::..33, 1

H C ~H \@ @) H-19

0 : 0,73 (s) H-18

o: 0,80 (s)

H-17 8 : 1,08 (s)

H-7

H-16 o: 0,85 (el) = 6,3 Hz

~ "CH3

@,,'' 19,9 ..

~ 39,6

@>

H:20H 60,2 'l

r·a__;: -"---1-5 ~

[L;3,58 (m)

o: 1,79 y 1,34 (dt) J= 12 y 3,1 Hz

LABDAN·8a, 15-DIOL (1)

Fórmula molecular: C20H38Üz

Peso Molecular: 310 glmol

Punto de Fusión: 81-83 °C

[a.]0 : -38,5°

-...l +:-

7§

Labdan-Sa-ol-15-al [2]

El producto de menor polaridad obtenido al oxidar el Labdan-8a, 15-diol (1] con el reactivo de Jones (K2Cr2Ü7/H2SÜ4), resultó ser un aceite incoloro, homogéneo en TLC, el cual no se logró cristalizar después de repetidos intentos.

Al tomar en cuenta el origen del mismo y considerando la información aportada por su espectro de RMN-13C (BB y DEPT) (Fig. 2C; Tabla 2C) sobre el número y tipo de carbonos presentes en la molécula, resultó fácil establecer la fórmula molecular C20H36Ü2• La exploración minuciosa de los datos espectrales de este derivado: IR (Fig. 2A; Tabla 2A), RMN-1H (Fig. 2B; Tabla 2B), RMN-13C, 1H/H-COSY (Fig. 2E), HSQC (Fig. 2F) y HMBC (Fig. 2G) permitió identificarlo como el Labdan-Sa.-ol-15-al [2]. Sus datos espectrales fueron muy parecidos a los del alcohol de partida [1], por lo que se obviará la descripción de los mismos, y sólo se destacarán aquellas discrepancias importantes y características que definen la existencia del aldehído en la molécula, como lo son:

A. La atenuación en el espectro IR de las bandas de tensión 0-H y la aparición en el mismo, de dos nuevas bandas características de aldehídos [vmax: 2.867 cm·1 (H-C=O) y vmax: 1.723 cm·1 (C=O)].

B. Al comparar los espectros de RMN de [1] y [2], se aprecian las siguientes diferencias:

B-1 El reemplazo de la señal compleja atribuida a los protones metilénicos del grupo -CH20H (bH: 3,58; m) en [1], por un triplete (b11 : 9,75; ]= 3Hz) en [2], indicativo de la presencia, en C-15 de un grupo aldehído, cuyo hidrógeno (H-15) se acopla con los hidrógenos metilénicos (H-14), generando el referido triplete.

B-2 El desplazamiento en el espectro de RMN-13C, del pico atribuido en [1) al carbono C-15 (oc: 60,2) que soportaba al alcohol primario, hasta la región propia de los carbonilos aldehídicos (oc= 203,5) (Breitmaier & Voelter, 1987).

B-3 El corrimiento a campos bajos (.&o: 0,88 ppm) de los protones metilénicos (H-14) (OH: 1,43 (en (1]) VS. OH: 2,31 (en (2))}, y también, el desplazamiento paramagnético (óo: 11.f ppm) del pico asignado al carbono que soporta dichos hidrógenos tC-14) [be= 39,6 (en [1]) vs. be: 51,4 (en [2])]. Esta desprotección se explica por el efecto anisotrópico que ejerce el grupo carbonilo del aldelúdo.

76

En razón a lo anteriormente expuesto, y al análisis detallado de los espectros de RMN bidimensionales, se concluyó que el alcohol primario en C-15 se había oxidado al correspondiente aldehído. Al consultar la bibliografía pudo constatarse que los datos físicos y espectrales (IR y RMN-1H) de éste, concuerdan con los descritos para el Labdan-Sa.-ol-15-al (2], el cual hasta el presente sólo ha sido aislado del Haplopappus arbutoides Remy (Asteraceae) (Zdero et al., 1991a). No hemos encontrado en la literatura ningún otra referencia sobre este derivado y en consecuencia, es el presente trabajo se reportan por primera vez su espectro de RMN-13C y sus espectros bidimensionales CH,1H-COSY, HSQC y HMBC).

1 1

l

Figura 2A: Espectro Infrarrojo (film), del Labdan-Ba.-ol-15-al (2]

8.l

80

7S

71)

6.1

60

jj

.lO %T

4l

4)

)j

30

V

20

¡j

10

3.437 cm·1

Q.H 2.867 cm·1

C-H

2.929cm·1

C-H

1.082 cm·1

C.O

/ ' 1.461 cm·1 1.385 cm·1

1.723 cm·1

C=O

C·H C-H

19 18

~~--~--------~------~--------~--------~------~ 4l00Jl Jj(J) 1(0) 4JOJl .... ,

Tabla 2A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (film), del Labdan-Ba-ol-15-al [2]

1

1

~~ J~ (e~·:) 1 3.437 12.92:~;-8671 1.461 y 1.3851 1.723 ~ 1~~:21, 0-H C=O C-H Astgnacton

Figura 2B: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDC13),

del Labdan-Ba-ol-15-al [2]

H-17

H-20 H-19

H n -18:1

•1

1

77

H-15 19 18 H-15

H

1 -

o (ppm)

m

J(Hz)

1 2.C5

-·-.--~---.--~-~-~----.--

·- ~~~ IJtD ~~ fHI

1 1'5

1 1.50

1 1.25

H-16 !

1t'il

Tabla 2B: Desplazamientos Químicos (5) en el Espectro de RMN-1H (CDCl3 , 400 MHz), del Labdan-Ba-ol-15-al (2]

H-5 H-7 H-13 H-14 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19

0,88 1,87 2,03 2,24 y 2,39 9,75 0,96 1,13 0,86 0,78

d dt sx Cd t d S S S

3,1 12,1 y 3,1 6,6 15; 5,6 y 2,2 3 6,7 - - -

H-20

0,78

S

-

H:

Figura 2C: Espectro de RMN-13C (100 MHz, CDCI3),

del Labdan-Sa-ol-15-al [2]

7 e-13 6 e-18 C-19

19 18 e~7 lc-16

'" J C-6

- - .... e-1 - -e 14 e 7 c-12 e 11 e 2

e-9 C-5 C-39-10 J-4

e-20

. J .. l._ .L ... lJJ.il ___ ...l .1 WJ..l.. e-8

l .. " zo

Tabla 2C: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de RMN-13C (CDCI3 , 100 MHz), del Labdan-Sa-ol-15-al [2]

e e-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7

5 (ppm) 40,0 18,7 42,2 33,6 56,4 20,8 44,8

Tipo >CH2 >CH~ >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2

e e-s C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14

5 (ppm) 74,5 62,5 39,4 23,1 41,2 29,4 51,4

Tipo >CH-0- >CH >C< >CH2 >CH2 >CH >CH2 -

78

e C-15 C-16 C-17 C-l~ C-19 C-20 TMSicomo - Patrón o (ppm) 203,5 20,2 24,2 33, i 21,7 15,7

Interno Tipo -e OH -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -CH3

-

79

Figura 2E: Espectro 1H,1H-COSY (CDCI3), del Labdan-Ba.-ol-15-al (2]

19 18

)

H-13 /H-14 . . -, ~~· H-14 /H-14

~@ ...,. l.O t.O

Correlaciones 1H, 1H- COSY más Destacadas

H-15

1

: H-14/H-15

"""

LO

1.5

2.0

...,.

80

Figura 2F: Espectro HSQC (CDCI3), del Labdan-Ba.-ol-15-al (2]

H-15

1 t50

19 18

ppm

ppm 8

C-2 E-16 C-2

-6 C-19 C-11 C-17C-13

C-18 C-1

C-1 C-3

C-7

C-14

C-5 o® t C-9

111111 1.0 t.S t.O

-1,

Figura 2G: Espectro HMBC (CDCI3), del Labdan-Ba.-ol-15-al [2]

C-20 C­

C-1 C-19 C-1

2 6

3

C-15/H-14

1

C-1 e e

-18 :-'i

C-1 o 1:~

C-7

C-1 . C-5

C-9

C-8

1

- 2.2 2.0

H-15

C-8/H-7 otQ

1.1

1

1.6

2

3

19 18

C-8/H-11 A O®o V C-8/H-12 C-8/H-1

... 1.2 1.0 o.e

Correlaciones HMBC que Detenninan la Posición del Aldehído

30

81

H-20 8 : 0,78 (s)

H-17

H-16 8: 0,96 (d) = 6,7 Hz 1

~ ,CH3 )

@,,,''20~ 29~~0 H-15 24,2\ ' s: 9,75 (t]

_ ~2,5 ©CH3

@ @11 JJ= 3Hz

® (514 C-H ® ,74,5 ' 203 5 .. '

ÚH

15,7

H3C®

21,71 -;:.33,4

H C CH ~@ @) H-19 H-18

8 : 0,78 (s) 8 : 0,86 (s)

CVJ44,8

H-7

H-14 8 : 2,24 y 2,39 (cd) J= 15; 5,6 y 2,2 Hz

8: 1,87 (dt) J= 12,1 y 3,1 Hz

H-5 8: 0,88 (d)

= 3,1 Hz

LABDAN·8a·OL·15·AL (2)

Fórmula molecular: C20H36Ü 2

Peso Molecular: 30ª-&mol

00 N

83

Ácido Labdanólico (3]

El producto más polar y mayoritario, obtenido al hacer reaccionar el Labdan-8a, 15-diol [1] con el reactivo de Jones (K2Cr20 7/H2S04) (ver parte experimental), resultó ser también un aceite incoloro, el cual se reveló en cromatografía de capa fina como una mancha alargada característica de ácidos carboxílicos (Stahl, 1969); [a.]0 : -2,66°. Al tomar en cuenta el origen del mismo y la detección en su EM (Fig. 3D; Tabla 3D; Esquemas 3D-1 y 3D-2) de un ion molecular a m/z: 324, fue posible determinar su fórmula molecular como C20H36Ü 3•

El estudio detallado de sus espectros de IR (Fig. 3A; Tabla 3A), RMN-1H (Fig. 3B; Tabla 3B), RMN-13C (Fig. 3C; Tabla 3C), 1H, 1H-COSY (Fig. 3E), HMBC (Fig. 3G) y NOESY (Fig. 3H), permitió establecer las siguientes diferencias espectrales en relación, al producto de partida [1]:

A. La transformación del alcohol primario en un grupo carboxilo quedó evidenciada en el espectro IR, donde se observa una banda fuerte y ancha característica del OH de un ácido carboxílico (vwax: 3.430-3.190 cm-1

), así corno también bandas intensas de tensión C=O (vwax: 1. 710 cm-1

) y C-0 (vwax: 1.255 Cm'"1

), típicas de este grupo funcional.

B. En el espectro de RMN-1H se observan las siguientes novedades:

B-1 La aparición de una señal ancha y difusa (<>H: 3,52), propia de un protón hidroxílico acídico, que se intercambia con un protón hidroxílico alcohólico (Jackrnan & Sternhell, 1969).

B-2 La presencia de dos dobletes de dobletes parcialmente superpuestos, a <>H: 2,32 (H-14.J y <>H: 2,21 (H-148) U14A.s= 15 y / 13.14A= / 13.148 = 6,5 Hz), los cuales caracterizan a dos hidrógenos metilénicos, a- al carbonilo de un ácido carboxílico.

C. En el espectro de RMN-13C se identifica la señal de un carbono metilénico a.- a un carbonilo, a <>e: 41,2 (C-14) y se aprecia el desplazamiento hacia campos bajos del pico asignable a C-15 (<>e: 177,6), debido a la conversión del alcohol primario en un grupo carboxilo.

D. En el EM se observa, además de la diferenci~ en magnitud del ion molecular, la presencia de picos a m/z: 278. f'-.1+ -HCOOH], m/z: 253, m/z: 235, m/z: 217, m/z: 171 y m/z: 153 (Esquema 3D-1), que diagnostican el reemplazo del grupo -CH20H por un grupo -COOH.

84

El análisis detallado de los espectros de RMN bidimensionales confirmó la estructura gruesa (3], y a través de la información aportada por el espectro NOESY fue posible establecer la configuración de los carbonos C-8 y C-10. En efecto, la detección de un cruce entre los singuletes asignados a H-17 y H-20, indica que ambos metilos se encuentran ubicados en la misma cara de la molécula, ratificándose la disposición ecuatorial del hidroxilo terciario situado en C-8. Para establecer la configuración de C-13 se comparó la rotación óptica del ácido obtenido, con la de los diferentes estereoisómeros de estructuHi gruesa (3] descritos en la literatura; en dicha comparación se encontró que el signo de la rotación especifica ([a.] 0 : -2,66°) de nuestro producto, coincide con la del Ácido Labdanólico, cuya configuración absoluta se encuentra perfectamente establecida desde el año 1956 (Cocker & Halsall, 1956a; Cocker et al., 1956b; Cocker & Halsall, 1957; Bory & Lederer, 1957; Bigley et al., 1960; Bjamer et al., 1968).

Figura 3A: Espectro Infrarrojo (film), del Ácido Labdanólico (3]

100.1

C.Q 1.082 cm·1

e .o j{)

n 4$ O.H 4) 1.462 cm· 1

Jj C-H ))

2.867 cm·1

2$ C·H

lO 19 18 1.710 cm ·l

u C=O

ID

2.929cm·1

0,0 C·H

.j{)Q,O """' """' lDOD '""' I(IIJI .,., .. ....

Tabla 3A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (film), del Ácido Labdanólico [3]

-um4x. ( cm-t) 3.430 y 3.190 2.929 y 2.867 1.462 1.710 1.082 1.255

Asignación 0-H C-H C-H C=O C-0 C-0

H

o --

m

Figura 3B: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDCl3),

del Ácido Labdanólico (3]

85

H-19 H-20

H-18

H-17

19 18

H-16 OH

1 ....,...-.-, 1.0 3.5 3.0

H-14A H-5

\ H-14 B

~~~~~~~~~~-~~~-~~~~~~~~~~-- 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8

Tabla 3B: Desplazamientos Químicos (S) en el Espectro de RMN-1H (CDCI3, 400 MHz), del Ácido Labdanólico (3]

H-5 H-7 H-9 H-13 H-14 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 OH

1 o 89 '

1,85 1,02 1,92 2,21 y 2,32 0,98 1,13 0,85 0,77 0,77 3,52

d dt t q Dd d S S S S S

](Hz) 2 8y3 3,4 6,6 15 y 5,6 6,8 - - - - -

Figura 3C: Espectro de RMN-13C {100 MHz, CDCl3),

del Ácido Labdanólico [3]

C-9 C-5 C-8

ppn 70 60

19 18

u::¡

r­r--

~15 -ppm

C-7 rt-10

C-4 C-13 '-

.JIL

C-2

. • .1.. ,j,

--~-----,-------~1-,------·--,-":-------,----- ------------------,~----- ~ ~5 3C 2! 20

~u i

Tabla 3C: Desplazamientos Químicos {o) en el Espectro de RMN-13C (CDCl3 , 100 MHz), del Ácido Labdanólico (3]

e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7

~ (ppm) 39,8 18,6 42,1 33,5 56,2 20,6 44,2

Tipo >CH2 >CH2 >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2

e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14

~ (ppm) 74,8 62,3 :i9,2 23,1 40,6 31,3 41,2

Tipo >CH-0- >CH >C< >CH2 >CH2 >CH >CH2 -

86

e C-15 e-16 C-17 C-18 C-19 C-20 TMSicomo o (ppm) 177,6 20,0 24,1 33,3 21,6 15,6 Patrón

Tipo -COOH -CH3 -CH3 -eH3 -CH3 -CH3

Interno

Figura 3D: Espectro de Masas (Impacto Electrónico, 70 e V), del Ácido Labdanólico [3]

137.26

16 95.20

2

81.17 3

19 18

.17

1

278 [M+ -HCOOH]

Tabla 3D: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas del Ácido Labdanólico (3]

miz 324 315 306 291 253 235 217

Abund. Relat. 5,48 34,21 32,39 53,10 3,94 11,49 2,6

miz 209 192 191 177 171 163 149

Abund. Relat. 9,66 11.44 56,75 39,17 11,16 11,61 16,47

miz 137 124 123 109 95 81 69 --Abund. Relat. 100 32,73 57,03 82,70 86,36 74,29 89,20

87

Esquema 3D-1: Patrón de Fragmentaci6n del Ácido Labdanólico [3].

OH

' ¡t

rw~H ''OH --4

H

¡t

____.....

m/z:253

COOH [ti~

m/z: 324 [M+] ~~ •' ,.· . -HzO COOH

M¡·''' ~ ~=C=O • -Hzl~

¡t m/z: 217 m/z: 235

OH ~OOH ~OH

-Hz O

~'

·Y:~ • COOH Q:_;,.;

---

j! m/z:171 m/z:153

COOH HzC~COOH

• -H20 ~

+

miz: 209 m/z:191 00 00

Esquema 3D-2: Patrón de Fragmentación del Ácido Labdanólico (3].

Pico Base COOH

~00: g:

¡t • ~+ ¡-{ r· (~l ~H •• c;t t

+ X m!z,109 /l· m/z: 12!~ mfc123 y _j-H'

OH

~~ OOH

•

~~ m/z:137

~

¡t /

-cH3.

... ··'' OOH ~OOH

,~

m'7z:192 miz: 177 ----- JI

00 \0

90

Figura 3E: Espectro 1H/H-COSY (CDCI3), del Ácido Labdanólico [3)

H-13 \ H-7 H-6

.úVV'-'""

___)

H-5ax/ H-6ec ~ =&: H-16/ H -13 ~.___--'-~-t-~¡¡¡;;--;~ 1.0>

19 18

= ... ...

I.S

;): . ~~ .f.! ·~ 13/H-14----+-----+----f

•• .. ~ H-14 1 H-14

l.O 1.5 1.0

Correlaciones 1H, 1H-COSY más Destacadas

~'-.[r---H--1----..3 }-( H-16 } { H-14s }/

ffiFJ-( H-7ec)

( H-5ax) ( H-LJ

Figura 3G: Espectro HMBC (CDC13) del Ácido Labdanólico [3]

" • Q

C-7 C-5/ H-7

C-5 • o

C-9 C-9/ H-7 <:>e> C-9/ H-1 o ' C-8 C-8/ H-7 C-8/ H-17

H-14A

(\ {\ 1\ ____, '--' '--" -

C-15/ H-14 C-15 opo•• ••

19 18

2.2 C-13 ---"" • C-13/H-14

C-12 o o o C-12/ H-14

Correlaciones HMBC que Corroboran la Posición del Grupo Carboxilo

25

!10

100

H-14 B

91

Figura 3H: Espectro NOESY (CDCl3) del Ácido Labdanólico (3]

H-20p-ax--===:;

H-16=~

H-17~-ax--~

19 18

H-13 H-17~-ax '\ H-7 ~-ec

o

l g 1 o

Correlaciones NOESY más Destacadas

1.&

2.0

1 V

92

·1

11

93

El Ácido Labdanólico (3] presenta el metilo C-16 en disposición a, lo que le confiere a C-13 una configuración "S". Este ácido fue detectado por primera vez como producto natural en la resina del Cistus labdaniferus Curtís (Cistaceae); el mismo pudo ser aislado por hidrólisis del éster metílico respectivo, el cual fue separado en la cromatografía de la resina cruda previamente metilada de la referida especie (Cocker & Halsall, 1956a). Posteriormente se presentaron pruebas contundentes sobre la estereoquímica en los centros quirales C-5, C-8, C-9 y C-10, pero no para C-13 (Cocker et al., 1956b). Años más tarde, se demostró por difracción de rayos X que la configuración en C-13 era "S' (Bigley et al., 1960; Bjamer et al., 1968).

El Ácido Labdanólico (3] se encuentra ampliamente distribuido en la familia Cistaceae, específicamente en el género Cistus, habiendo sido aislado como componente mayoritario del C. labdaniferus Curtís (Cocker & Halsall, 1956a), del C. symphytifolius Lam. (Calabuig et al., 1981) y del C. monspeliensis L. (Tabacik et al., 1971), entre otros. De igual manera, ha sido obtenido de varias especies pertenecientes a la familia Asteraceae, tal es el caso de Espeletiopsis muiska Cuatr. (Ramirez et al., 1998), Haplopappus shumannii Br. et Clark (Urzua et al., 1997) y Macowania glandulosa N. E. Br. (Bohlmann & Zdero ,1977). Esporádicamente ha sido descrito en especies de otras familias, tales como Copaiba cearensis Huber (Leguminosae), de la cual se separó como éster metílico, luego de una metilación del extracto metanólico crudo del aceite de esta especie (Braga et al., 1998).

Otro aspecto a resaltar es que el Ácido Labdanólico fue sintetizado por primera vez en 1957, siendo obtenido por saponificación de su éster metílico, el cual fue preparado por medio de una serie de reacciones químicas en las cuales se utilizó el Sclareol como material de partida (Bory & Lederer, 1957). Este ácido y su epímero en C-13, el Ácido 13-epi-Labdanólico, han sido utilizados en la síntesis de Ambrox®, un principio de agradable olor (ambergris), ampliamente utilizado en la elaboración de colonias y perfumes de gran valor (Urones et al., 1992a; 1992b; Bolster et al., 2001., Castro et al., 2002; De Groot, 2002). Además se ha empleado como material de partida en la obtención de las espirolactonas a y 13-levantenolida (González et al., 1976a; 1976b) y de otras lactonas diterpénicas y norditerpénicas (De Pascual Teresa et al., 1987); así como también en la síntesis de diterpenos triciclicos (Urones et al., 1995) y de drimanos con actividad disuasiva de la alimentación de insectos (Lithgow et al., 1995; Vlad et al., 1997).

En lo que se refiere a la actividad biológica del Ácido Labdanólico es oportuno re.;altar su potencial alelopático y su capacidad para inhibir el crecinúento vegetal y la gernúnación (Alías et al., 2005), y en especial aquellas que han sido ya patentadas: Su actividad antifúngica (Nozoe et al., 1999) y sus propiedades como inhibidor de la producción de melanina (Tamai. et al., 2002).

H-20 8 : 0,77 (s)

21,6

HC ~t H-19

8: 0,77 (s)

H-9 8: 1,02 (t) J= 3,4 Hz

~33,3

~H3

H-18 8 : 0,85 (s)

H-17 8: 1,13 (s)

..

H-16 8: 0,98 (d) = 6,8 Hz

~ H-13

(): 1,92 (q) = 6,6 Hz

....

,CH3 _@,,'' 20,0

" íOHl ~

H-7

~ ~ ~COOH

177,6

H-14 8: 2,21 y 2,32 (dd)

J= 15 y 5,6 Hz

8 : 1,85 (dt) J= 8 y 3Hz

H-5 8= 0,89 (d)

= 2Hz

ÁCIDO LABDANÓUCO (3)

Fórmula molecular: C20H36Ü 3

Peso Molecular: 324 glmol

[a]0 : -2,6°

':f

95

El tratamiento del Ácido Labdanólico con CH2N2 en éter etílico, condujo al correspondiente éster metílico, el cual describiremos brevemente a continuación:

Labdan-8a-ol-15-oato de Metilo [4]

Este derivado se purificó por recristalización en metanol, produciendo finas agujas de P.F = 70-72 °C; [a] 0 : -6,31°. Su fórmula molecular C21H38Ü 3 , fue determinada a través de la información derivada de sus espectros de RMN-1H (Fig. 4B; Tabla 4B) y RMN-13C (BB y DEPT-135 (Fig. 4C; Tabla 4C). Al comparar sus espectros con los del Ácido Labdanólico [3], se observan algunos cambios los cuales evidencian la completa metilación del ácido:

A. Presencia en el espectro IR (Fig. 4A; Tabla 4A) de bandas típicas de ésteres Vmax: 1.738 cm-l (C=O) y vmax: 1.199 y 1.083cm-l (C-0-C).

B. En su espectro de RMN-1H se detecta la aparición de un nuevo singulete a oH: 3,64 (H-1') el cual integra para tres protones y se correlaciona en el espectro HMQC (Fig. 4F) con un carbono a Oc: 51,5 (C-1'), características estas que demuestran la presencia en la molécula de un metilo unido directamente a un átomo de oxígeno (-OCH3).

C. Apantallamiento del pico asignable al carbonilo del éster [4] [eSe= 174 (C-15)], cuando se compara con el desplazamiento químico de su señal análoga en el ácido [3) [Oc: 177,6 (C-15)]; este hecho ratifica que el grupo carboxilo se encuentra esterificado (Breitmaier & Voelter, 1987).

Las constantes físicas del éster metílico (4] coinciden con las reportadas en la bibliografía para ellabdanolato de metilo (Cocker & Halsall, 1956a; Bmy & Lederer, 1957; De Pascual Teresa et al., 1978a; Amaro & Adrián, 1982), e igualmente concuerdan los desplazamientos de RMN-13C (Hirota et al., 1988). Por otro lado el valor de [a]0 : -6,31° encontrado para este compuesto sugiere que la estereoquímica del centro quiral C-13 es "S", puesto que si fuera "R", observaríamos, de acuerdo a lo reportado en la literatura, un valor de rotación óptica positivo (Bigley et al., 1960; Carman, 1966). Considerando que el ácido proviene de una reacción de oxidación del alcohol diterpénico natural [1], resulta obvio el heeho de que dicho producto también presente configuración "S" en C-l3.

De igual manera se puede inequívocamente ct mcluir que tanto el éster metílico (4] como su ácido de partida [3] pertenecen a la serie normal (5a.H, 10(3Me), en razón de los resultados obtenidos por difracción de rayos X (Bjamer et al., 1968). Por lo tanto el diol [1) también pertenece a esta serie.

100,0

9S

90

85

80

1S

70

65

60

SS

.lO %T

4l

4l

3.1

30

2.1

lO

\S

\0

Figura 4A: Espectro Infrarrojo (KBr) del Labdan- 8a-ol-t5-oato de Metilo (4]

3.436 cm·1

0-H

2.868 cm·l

C·H

2.928cm·1 1.738 cm·l

C=O

1 '........_ 1.083 cm·1

1.199crrr1 " C.Q-C

1.158cm·1

e .o-c C.Q

1.462 cm·1

C-H

0.0 ~-~----~C~-H----~----~- 19 18 4lOO,Q 400 1500 liD)

Tabla 4A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR del Labdan-8a-ol-15-oato de Metilo (4]

96

Umáx. (cm-t) 3.436 2.928 y 2.868 1.462 1.738 1.158 1.199 y 1.083

Asignación 0-H C-H C-H C=O C-0 C-0-C

El Labdan-8a.-ol-15-oato de Metilo (4] se aisló y caracterizó por primera vez como componente natural del Cistus monspeliensis (Tabacik et al., 1971); posteriormente se obtuvo de C. psilosepalus (De Pascual Teresa et al., 1978a) y de C. ladaniferus (De Pascual Teresa et al., 1982). También se ha aislado en varias oportunidades al tratar con CH2N2 fracción crudas de extractos procedentes de especies del género Cistus, que contiene el ácido libre (Calabuig et al.,198!; Cocker & Halsall, 1956a; De Pascual Teresa et al., 1983a).

El primer intento de síntesis de este éster metílico fue realizado en 1957 pi r Bory & Lederer, quienes utilizaron como producto de partida el Sclareol. Posteriormente, con el fin de realizar estudios relativos a la estereoquímica de los centros quirales, fue nuevamente sintetizado por Bigley et al. (1960).

Figura 4B: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDCl3),

del Labdan-Ba-ol-15-oato de Metilo (4]

19 18

97

-20 -19

H-1'

1.00

- ).!10 !.25 !.00 2.75

0.75

H-14B H-7 t H-14 Al H;13/

2.!10 2.25 2.00 1.75 1.!10

H-18 H-17

H-16

I.Z 1.00

Tabla 4B: Desplazamientos Químicos (5) en el Espectro de RMNm1H (CDCl3, 400 MHz) del Labdan-Ba-ol-15-oato de Metilo [4]

H H-5 H-7 H-9 H-13 H-14 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 H-1'

o 0,88 1,84 0,99 1,90 2,15 y 2,32 0,92 1,12 0,84 0,77 0,77 3,64

(ppm) -m d dt t q dd d S S S S S

J(Hz) 2 l2y3 3,5 6,4 14,6 y 5,8 6,6 - - - Q -

Figura 4C: Espectro de RMN-13C (100 MHz, CDC13),

del Labdan-Sa.-ol-15-oato de Metilo (4]

o . . Cl. ....

? J.:5 19 18 C-4 C-18

C-8 C-9

- 70 60

C-14 1\ C-13- j C-2 c-12 e c::\9

c~-~-16 c-0 1c-1

\ ! C-17\ ¡(c-zo C-5 c-1' "-.. f ! ""' .. 1 1 111 1 1

50

/ C-7

\ C-10

JO 20

Tabla 4C: Desplazamientos Químicos (B) en el Espectro de RMN-13C (CDCl3 , 100 MHz) del Labdan- Sa.-ol-15-oato de Metilo (4]

e e-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7

o (ppm) 39,8 18,6 42,1 33,5 56,3 20,7 44,3

Tipo >eH2 >CH2 >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2

e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14

o (ppm) 74,4 62,2 39,2 23,0 40,8 31,4 41,57

Tipo >CH-0- >CH >C< >CH2 >CH2 >CH >CH2

e e-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 C-1'

o (ppm) 174 20 24,2 33,4 21,6 15,6 51,5

Tipo -COO- -CH3 -CH3 -eH3 -eH3 -CH3 -OCH3

98

Figura 4E: Espectro 1H/H-COSY (CDCI3),

del Labdan- Ba.-ol-15-oato de Metilo (4]

H-1a.·ax~........,< H-16--=-...

2

3

19 18

1 H-1 -ax 1 H-2 a.-ec ...... lJ

H-16 1 H-13 ~- .. / .. .-.. !¡{_'! I.QSil. •. r::. . """ lll'*-e i· -- .J.

...L

1 ~ 1.0

H-7 o:-ax 1 H-7 p-ec -.. • . ~ ~

}" . . •• l~ : 1 .

r~'t· . -.. ' .. 90

~- -~-~ .. ~ . - ~ . i. . . H-6 a.-ec / H-7 j)·ec . ~ .. ·

r~ ;¡t ~---· ~~ •tr ... •

1.!1

H-13 /H-14 JI GfD :~

~ ~~-·;

' 2.0

• • . H-14A / H-14B

rt • -1

- 2.0 1.5 1.0

Correlaciones 1H,1H- COSY más Destacadas

( H-16 )

(Jf6~ • {_I-I-7 ec }• 1{ H-7 ax)

99

f ¡ 1

C-20 1-

C-2 ·-8-16 -19

C-17

C-18

C­

C-

,_

-

1!..__.

5-

C-9

Figura 4F: Espectro HMQC (CDC13),

del Labdan-Ba.-ol-15-oato de Metilo (4]

2

15 1' 14 COOCH3

19 18

H-1'

~ ®t - .. @N ~

,......_. ~

@+@

18 G

~ • oto ~

@ -

• ~ ~ Q

(i)t

!.0 2.!1 2.0 1.!1 1.0

100

30

19 18

Figura 4G: Espectro HMBC (CDC13), del Labdan-Ba.-ol-15-oato de Metilo [4]

H-1'

_. C-16/H-14 • - .. ~~ . "' lB. . . C-13/H-14 • • ... + t._.

c-12/H-1.4 ...... "'l"' ~ 'l'' C-5/H-7 a ... .. 1

... . . . , ~ C-8/H-7

._A

1 C-15--1 ~ C-15/H-1' C-15/H-14

C-5---R

C-9------c

C-8·-......... c-B/H-7e

, .. 1.1

~·· ~ . .tt

CA

..

~ . .. 1

' .. ¡.., "' ...

101

H-20 o : 0,77 (s)

H-9 8: 0,99 (t) = 3,5 Hz

15,6

H3C®

21,6

H3C '\@ H-19

o : 0,77 (s)

-::. 33,4 -H ~ ~

H-18 8 : 0,84 (s)

H-17 8 : 1,12 (s)

= H-13 8: 1,90 (q) = 6,4 Hz

.....

-OCH 3 8= 3,64 (s)

® --- ~ OCIÍ~

51,5 3

H-14 8: 2,15 y 2,32 (dd) J= 14,6 y 5,8 Hz

H-7 8: 1,84 (dt)

J= 12 y 3Hz

H-5 o: 0,88 (d)

=2Hz

LABDAN- 8a-OL-15-0ATO

DE METILO (4)

Fórmula molecular: C21H38Ü3

Peso Molecular: 338 g/mol

Punto de Fusión: 70-72 °C

[a.]n: -6,3o -o N

103

La obtención del ácido (3] y del éster (4] a partir del diol (1], confirma de manera definitiva la estructura y configuración absoluta de este último compuesto, como la correspondiente al Labdan-8a,15-diol. Este diterpeno se aisló y caracterizó por primera vez, como componente natural del Aeonium lindleyi Webb & Berthel. (Crassulaceae) (Baker et al., 1962). Posteriormente ha sido aislado de varias especies del género Cistus (Cistaceae), donde se presenta como un producto abundante y característico, tal es el caso de: C. ladaniferus (Tabacik-Wlotzka et al., 1963), C. monspeliensis (Cavero et al., 1970), C. psilosepalus Sweet y C. populifolius L. (De Pascual Teresa et al., 1978a; 1978b), C. symphytifolius (Calabuig et al., 1981) y C. palhinhae Ingram (De Pascual Teresa et al., 1983a). También ha sido aislado de Nolana elegans Reiche (Nolanaceae) (Chamy et al., 2002) y de sólo dos especies de la familia Asteraceae, el Haplopappus arbutoides J. Rémy (Zdero et al., 1991a) y en un análisis preliminar realizado con anterioridad, de la especie objeto del presente estudio: Oxylobus glanduliferus (Sch.-Bip) Gray (Amaro et al., 1982).

Es oportuno también resaltar que, recientemente, este dial fue reportado como componente del Zanthoxylum rhoifoilum Lam., una especie perteneciente a la familia Rutaceae {Santiago Brugnoli, 2004). Este último resultado es altamente sorprendente, dado que hasta el presente, para las más de cien especies del género Zanthoxylum estudiadas desde el punto de vista fitoquímico, sólo se han reportado dos diterpenos, la Euphoractina A del Z. budrunga D. C. (Islam et al., 2001; 2002) y el Ácido Centipédico del Z. syncarpum Tull. (Facundo et al., 1997).

La síntesis total estereoselectiva de [1] también ha sido llevada a cabo en dos oportunidades (Hirota et al., 1988; Nakamura et al., 1986). Desde el punto de vista industrial este diterpeno ha sido utilizado como material de partida para la preparación de lactonas diterpénicas naturales, tales corno la 12-nor-arnbreinolida y la a- y ¡3-levantenolidas, las cuales a su vez son utilizadas como intermediarios en la síntesis de Ambrox®, (González el al., 1976a; De Pascual Teresa et al., 1985; Uronesetal.,1992~.

Sorprendentemente, al hacer una revisión exhaustiva de la literatura, observarnos que hasta el presente no se ha realizado ningún estudio sobre la posible actividad biológica o farmacológica de este dial. Este hecho llamó poderosamente nuestra atención, ya que, como se puso de manifiesto en el primer capítulo de la presente memoria, los diterpenos del labdano son dianas de notable interés para este tipo de estudios. Suponemos que hasta el presente no se han realizado ensayos biológicos con e<;te producto, porque siempre se han aislados mínimas cantidades del mismo. Pm dlo, consideramos procedente destacar, que el rendimiento de este diol en el O. glanduliferus es notablemente alto (> 10% en el extracto en CH2Cl2),

con lo cual cabe suponer que este compuesto cumple un papel biológico destacado en esta especie.

104

13-epi-Labdan-8a,15-diol (5]

De la subfracción E6 (fracciones 5-12, eluidas con hexano-acetona 4:1) de la cromatografía en columna seca de la reunión E, se logró purificar por cromatografía preparativa en gel de sílice, un aceite amarillo, de aspecto homogéneo en cromatografía de capa fina, el cual no se logró cristalizar; [a]0 : -7,6°.

El estudio detallado de sus espectros: IR (Fig. 5A; Tabla 5A), RMN-1H (Fig. 5B-1 y 5B-2; Tablas 5B-1 y 5B-2), RMN-13C (Fig. 5C; Tabla 5C), HMQC (Fig. 5F) y HMBC (Fig. 5G), y su comparación con los mostrados anteriormente para el Labdan-8a, 15-diol [1] (ver Tabla 5), indican que el compuesto es un estereoisómero de este último. En efecto, en su espectro de masas (Fig. 5D; Tabla 5D) se observa un patrón de fraccionamiento idéntico al de [1], en el cual se identifica un ion molecular a miz: 310, que se corresponde con la fórmula molecular esperada C20H38Ü 2 •

Sus datos espectrales son muy parecidos a los de (1], y los mismos muestran igualmente la presencia en la molécula de un grupo -CH20H {IR, vmax: 3.372 cm-1

(OH); Rl'.1N, 8H: 3,46, m,-CH2-0H (H-15) y 8c: 60,2 (C-15); EM, m/z: 292 [M+-H20] y m/z: 277 [M+- CH3-H20]}. De igual manera evidencian la existencia de un carbono cuaternario sp3 [oc: 73,8 (C-8)] que soporta a un hidroxilo terciario [vmax: 1.060 cm-1

(tensión C-0); 8H: 3,30 (OH)] y a un metilo [oH: 0,98, s, (H-17) y oc_: 23,6 (C-17)].

Las únicas diferencias notables en los espectros de RMN de [1] y [5] (Tabla 5), residen en las señales correspondientes a los hidrógenos y carbonos próximos a C-13. En razón a ello, es lógico suponer que [5] es el epímero en C-13 de (1], es decir el13-epi- Labdan-8a, 15-diol en el cual C-13 exhibe configuración "R".

Tabla 5: Comparación de los Valores de Desplazamientos Químicos (o), de los Hidrógenos y Carbonos próximos a C-13 en [1] y [5].

1 Labdan-8a, 15-diol [1]

11 13-epi- Labdan-8a, 15-diol [5] 1

H-9 0,95 C-9 62,2 H-9 0,89 C-9 61,2

H-11 - C-11 22,9 H-11 - C-11 21,6

H-12 - C-12 40,7 H-12 - C-12 39,9

H-13 1,49 C-13 30,4 1 H-13 1,43 C-13 29,7

1 H-14 1,43 C-14 39,6 H-14 1,52 C-14 38,8

H-15 3,58 C-15 60,2 l H-15 3,46 C-15 60,2

H-16 0,85 C-16 19,9 H-16 0,75 C-16 19,8

105

Figura 5A: Espectro Infrarrojo (film), del13-epi-Labdan-8a,15-diol [5]

lOO O

80

60

%T 40

\f -- 2.866 cm·1

3.372 cm·1

2.924 crn1 C-H

20 \ C-0

1.386 y 1.364cm·1

0.0 +----r---O-_H_--.-.:C:::..;-H:.:._ _ ___,-----.-----.,.------.,...,

4500.0 4000 3000 2000 1500 1000 450.0 cm-1

Tabla 5A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR del 13-epi-Labdan-8a, 15-diol [5)

\)máx. ( cm·l) 3.372 2.924 2.866 1.386 y 1.364 1.060

Asignación 0-H C-H C-H C-H (gem dirnetilo) C-0

El 13-epi-labdan-8a,15-diol [5], al igual que el Labdan-8a,15 diol [1], fue ya descrito en el estudio preliminar del Oxylobus gland!lliferus (Amaro et al., 1982). Asimismo, ha sido aislado de algunas otras especies de la familia Asteraceae, tales Aristeguietia glutinosa K. & R. (Zdero et al., 1991b) y también del Cistus ladaniferus (Cistaceae) (Urones et al., 1992a) y de la Mimosa lustilis Benth (Mirnosaceae) (Fukuyama et al., 1999). Este compuesto ha sido utilizado corno material de partida en la síntesis de lactonas diterpénicas y norditerpénicas de notable interés biológico (De Pascual Teresa et al., 1985; 1987).

Figura 5B-1: Espectro de RMN-1H {400 MHz, CDCI3),

del13-epi-Labdan-8a,15-diol (5]

H-20 19 18 H-19

H-17 H-17 H-1

0.9 0.8

H-1 \

1 1 1.!1 1.0

H-15

3.0 a., 1.0 '·' 1.0

Tabla 5B-1: Desplazamientos Químicos (S) en el Espectro de RMN-1H (CDCI3 , 400 MHz), del13-epi-Labdan-8a,15-diol (5]

H H-7 H-9 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20

B (ppm) 1,68 y 1,53 0,89 3,46 0,75 0,98 0,72 0,64 0,64

m dt t m d S S S S

J (Hz) 12 y 3,3 3,5 - 6,8 - - - -

106

OH

3,3

S ---

,_

Figura 5B-2: Espectro de RMN-1H (400 MHz, C6D6),

delt3-epi-Labdan-8a,15-diol [5]

H-19

H-17 H-181H-ZO

19 18

H-15

JO 20 1 5 1 o

Tabla 5B-2: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de RMN-1H (~606, 400 MHz), del13-epi-Labdan-8a,15-diol (5]

107

H H-7 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20

B (ppm) 1,78 3,59 0,95 1,11 0,85 0,76 0,71

m dt m d S S S S -J (Hz) 12 y 3 - 6,5 - - - -

108

Figura 5C: Espectro de RMN-13C (lOO MHz, CDCI3),

del13-epi-Labdan-8a,15-diol (5]

C-8 C-15

C-9 C-5

10 110

C-18

C-14 C-3 \

C-1 C-4

C-14 1 C-10

C-12

Tll

C-17 C-20

C-16

C-11 l C-2

C-6

C-19 11

C-20 1

C-13

1

1 20

Tabla 5C: Desplazamientos Químicos (B) en el Espectro de RMN-13C (CDCI3,100 MHz), de 13-epí-Labdan-8a,15-diol (5]

e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7

B (ppm) 39,5 18,1 41,7 33,1 55,7 20,2 43,9

Tipo >CH2 >CH2 >CH2 >C< >CH >CHz >CH2

e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14

B (ppm) 73,8 61,2 38,7 21,6 39,9 29,7 38,8

Tipo >CH-0- >CH >C< >CH2 >CH2 >CH >CH2

e C-15 C-16 C-17 · C-18 C-19 C-20 TMSi -B (ppm) 60,2 19,8 23,6 33,1 21,2 16,1 como

Patrón Tipo >CH2-0- -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 Interno

109

Figura 5D: Espectro de Masas (Impacto Electrónico, 70 e V), del13-epi-Labdan-8a,15-diol (5]

~

2

3

95 ~37

19 18

109

T 111

~50 163

Tabla 5D: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas delt3-epi-Labdan-8a,15-diol (5]

m/z 310 292 277 236 221 207 191

Abund. Relat. 0,68 21,63 27,91 3,95 2,90 3,29 100

m/z 177 163 157 150 137 121 109 -·

Abund. Relat. 30,04 5,96 2,46 5,35 41,08 - 4<!,33 54,74 -

m/z 95 81 79 77 69 67 55

Abund. Relat. 70,45 58,12 22,75 10,64 48,28 26,41 40,52

110

Figura 5F: Espectro HMQC (CDC13), del13-epi-Labdan-8a,15-diol [5]

2

19 18

C-2tJ----<

C-1~+---i

C-1~~

H-5

_HA__5 _Jv~

@·

lJUL

1 S 1 o o.

111

Figura 5G: Espectro HMBC (CDCl3) del13-epi-Labdan-8a,15-diol [5]

2

3

19 18

..

C-8--~

"

H-15 ___})\___

____,:;¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡;¡¡;;;¡~ i C-13/ H-15

C-1~3-------; ~~---~ rJD

C-14/ H-15 C-14:--::==:;¡¡¡¡¡¡¡¡¡;;;::::1 Lo

H-9 8: 0,89 (t) J= 3,5 Hz

H-20 8 : 0,64 (s)

@./"55,7 373,ff.

21,2 . ~33,1

l

H-17 8 : 0,98 (s)

H C f:H )@ @ .3

.--~-----

H .. 19 8 : 0,64 (s)

H-18 8 : 0,72 (s)

H-16 8: O, 75 (d) = 6,8 Hz

@ -38,8

~ CH3 IOHl 19,8 ~

~ ® OH H2 60,2) nf-15 ~1,46(m)

13-EPI-LABDAN-Ba, 15-DIOL (5)

Fórmula molecular: C20H38Ü 2

Peso Molecular: 31 O g/ mol

Punto de Fusión: Líquido

[c:x.]o: -7,6o .... -N

113

Oxylobusol [6]

La reunión E correspondiente a las fracciones 17-46 de la cromatografía general eluidas con mezcla CH2Cl2-acetona (7:3) fue recromatografiada en columna seca de gel de sílice. De la fracción E3 se aisló, mediante cromatografía preparativa en placas de gel de sílice [hexano-acetona (4:1), triple recorrido], un aceite homogéneo, el cual no fue posible cristalizar, pero el mismo se reveló en capa fina como una sustancia pura; [a]0 : +5,0 °.

Figura 6A: Espectro Infrarrojo (film), del Oxylobusol (6]

C,t.¡__~-~-~-~---~-~----~-~-~-~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

=-1

Tabla 6A: Bandas de Absorción Significativas en el

J 1 Espectro IR (film), del Oxylobusol (6]

umb.(cm'1) 3.470 2.925 2.855 1.382 y 1.111

Asignación 0-H C-H C-H C-0-C

2

3

Figura 6B: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDCl3),

del Oxylobusol [6]

12 16

14 ¡llo..

··'' 'CH20H 13 15

H-16

19 18 -17

H-15

114

-18 -19

-20

~---.-~---.--- ·----.--~--.---~-,--~---,--~-

..... 3.5 3.0 2.5 2.0 1.!1 1.0

Tabla 6B: Desplazamientos Químicos (S) en el Espectro de RMN-1H (CDCl3, 400 MHz), del Oxylobusol [6]

H H-5 H-9 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 OH

B 0,97 1,19 3,80 1,30 1,28 0,84 0,78 0,76 1,91 (ppm)

·~

m dd t ddd S S S S S S

J (Hz) 11,8 y 2,3 2,4 11,0; 7,5 y 3,0 - - - - - -

Figura 6C: Espectro de RMN-13C {100 MHz, CDCI3),

del Oxylobusol (6]

"r ' ,.

C-8 c-13

'' T

C-9 C-5

.L

C-15

C-15 C-9C-5

3

19

16 12 14

11 ···'''e o 20 11 ~3

15Hz H

• -18

,,

9 ,,,,tO C-18 o 8

5 7 6

..1 -¡o·

C-14 • C-7C-3 C-1C-12

C-4 C-18

C-12 C-7C-3 C-1 C-10

C-14 1 ¿

C- 6 C-17

C-19 l

C-20

.1

C-6 C-2

.J.

C-11

C-S C-20

C-19! C-2 tc-11 C-16 C-17

1

----.-----,~-~---.--------,---------~. ------ -----------.-·--,·-m ~ ~ ~ e ~

Tabla 6C: Desplazamientos Químicos (B) en el Espectro de RMN-13C (CDCl3, 100 MHz), del Oxylobusol [6]

e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7

B (ppm) 39,1 18,5 42,1 33,3 56,3 19,8 43,1

Tipo >CH2 >CH2 >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2

e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14

B (ppm) 75,9 58,2 36,9 15,2 37,0 75,8 45,8

Tipo >C-0- >CH >C< >CH2 1 >CH2 >C-0- >CH2

115

e C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 TMSi como B (ppm) 59,6 27,6 24,5 33,2 21,2 15,7 Patrón

Tipo >CH2-0- -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 Interno

116

La presencia en su espectro de masas (Fig. 6D; Tabla 6D) de un ion molecular a m/z: 308, junto a los datos derivados de sus espectros de RN.IN-1H (Fig. 6B; Tabla 6B) y de RMN-13C (BB y DEPT-135) (Fig. 6C; Tabla 6C), relativos al número de hidrógenos y carbonos presentes en la molécula, así como al grado de hibridación y tipo de sustitución de cada carbono, permitió establecer la fórmula molecular C2Jf360 2•

Su espectro IR (Fig. 6A; Tabla 6A) muestra absorciones características de hidroxilos [vmax: 3.470 cm-1 (0-H)] y bandas asignables a C-0-C [vmax: 1.382 cm-1 y vmax: 1.111 cm-1

], con lo cual se deduce que de los dos átomos de oxígeno que exige la fórmula molecular, uno forma parte de un grupo alcohólico y el otro de un grupo éter (Bellamy, 1975). Esto pudo ser confirmado a través del espectro de RMN-13C porque en el mismo se observan tres picos, asignables a carbonos sp3 unidos a oxígeno, dos de ellos cuaternarios [be: 75,9 (C-8) y <>e= 75,8 (C-13)] y el tercero oximetilénico [<>e= 59,6 (C-15)]. En el espectro de RMN-1H se observan dos singuletes a BH: 1,30, 3H, (H-16) y <>H: 1,28, 3H, (H-17), los cuales, en virtud de sus desplazamientos químicos, representan a metilos terciarios ubicados sobre átomos de carbono que soportan un oxígeno; este hecho sugiere que estos metilos son sustituyentes de los carbonos oxiránicos. Los picos correspondientes a los carbonos de estos metilos fueron localizados a través del HMQC (Fig. 6F) a <>e= 27,6 (C-16) y <>e= 24,5 (C-17). Analizando la información aportada por el HMBC (Fig. 6G-1) se pudo conformar la sub-unidad estructural [A], dado que en el mismo se evidencia que cada uno de los metilos situados sobre los carbonos cuaternarios oxigenados del grupo éter se correlacionan con diferentes oxicarbonos; en efecto mientras que la señal de H-16 se cruza con la de C-13, la señal de H-17 lo hace con la de C-8.

La presencia en el espectro de RMN-13C de un pico a <>e= 59,6 (C-15) que se orienta en el DEPT-135 en fase inversa y que se corresponde en el HMQC con un multiplete que integra para dos protones [<iH: 3,80, ddd, f = 3,0; 7,5 y 11,0 Hz, (H-15)], reveló la existencia en la molécula de un oximetileno ( ·CH2-0); éste identifica a un alcohol primario (IR, vmax: 3.470 cm-1 (0-H), cuyo protón hidroxílico fue localizado a <>u: 1,91 en el espectro de RMN-1H, como una señal ancha y difusa que carece de correlación alguna en el HMQC. Más aún, este grupo alcohólico pudo ser ratificado por la presencia en el espectro de masas

15 ._CH20H

[BJ de fragmentos notables a m/z: 275 [M+·CH3-H20] y -a m/z: 263 [M+ -CH2-CH2-0H]. A la luz de estos datos fue posible sugerir la presencia en la molécula de la subunidad estructural [B].

Figura 6D: Espectro de Masas (Impacto Electrónico, 70 eV), del Oxylobusol (6]

16 12

117

14 ,,,~...

··' 'CH20H 13 15

m/z

Abund.Relat.

miz

Abund.Relat.

137.1066

116.1m

181.~

2

3

19 18

Z75.&l [M+ -CH3-H20]

2IUII' [M+ -CH3 )

Tabla 6D: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas del Oxylobusol (6]

308 293 290 275 263 245 220

1,47 18,36 6,90 24,47 60,62 100 0,46

192 177 137 123 109 95 81

23,31 18,84 39,09 32,08 55,84 59,62 59,27

205

10,84

69

58,18

Esquema 6D-1: Interpretación del Patrón de Fragmentación del Espectro de Masas (lE, 70 eV.), del Oxylobusol [6]

[miz: 245]

Pico Base

~OH 4 5..._,.. 7 ·~ 6

18 ;=-9m/z: 308 [M+]

X'-./ C2Jf3s02 1

m/z: 69 m 1-c,n.. y '

~--'fr m/z: 109 m/z: 95

¡t 1 ~QY I

ón "K") ln/z: 205 \ (ión "G")

l + y

m/z: 137 (ión "E")

Q:Y ~[si] m/z: 177 m/z: 123

118

119

Ahora bien, en el espectro HMBC se observa que el pico que resuena a 8H: 1,30 (H-16), asignado al metilo ubicado sobre uno de los carbonos oxigenados del puente éter (C-13), se correlaciona con los pico de dos metilenos [8c: 37 (C-12) y <>e: 45,8 (C-14)]; a su vez, los hidrógenos del metileno C-12 se correlacionan con la señal de C-13. Por otro lado, el multiplete de los hidrógenos oximetilénicos (H-15) se cruza con las señales del carbono del metileno C-14 y con la del carbono cuaternario oxigenado, C-13. Estos datos permiten conjugar las sub-unidades estructurales [A] y [B] para generar la sub-unidad estructural [C] .

. to.J, 1\~~~

H~C C-CH3 .....

17 l [A1 ~\J < .... .le"" hy t4H2'CH20H

... e~ > t7CH3 1

.... '-.t,..o e 15 s~ (C]

e--cH20H ....

B [ ] ....

El singulete asignado al metilo H-17 se cruza en el HMBC (Fig. 6G-1), con cuatro picos, los cuales, de acuerdo al espectro HMQC, simbolizan a: A) uno de los carbonos cuaternarios unido a un átomo de oxígeno del puente éter [Be: 75,9 (C-8)], B) un carbono metilénico [Be: 43,1 (C-7)], C) un carbono cuaternario sp3 [<>e: 36,9 (C-10)] y D) un carbono metínico [<>e: 58,2 (C-9)]. A su vez, el pico de este último carbono (C-9), se correlaciona con la señal de los hidrógenos de un segundo metileno [<>e: 15,2 (C-11)]. En virtud de este análisis es posible postular la sub-unidad estructural [D], la cual, en concordancia con la correlación C-11 +-+H-12, se engrana a la (C] para conformar la subunidad estructural [E].

120

Los espectros de RMN CH y 13C) y el HMQC, muestran la existencia en la molécula de tres metilos terciarios [<>e: 33,2 (C-18) y <>H: 0,84 (H-18); <>e: 21,2 (C-19) y c)H: 0,78 (H-19) y <>e: 15,7 (C-20), c)H: 0,76 (H-20)], los cuales exhiben correlaciones HMBC de la siguiente manera:

• El singulete de los hidrógenos del metilo H-20 se cruza con los picos de cuatro carbonos: Dos carbonos metínicos [<>e: 56,3 (C-5) y <>e: 58,2 (C-9)]; un carbono cuaternario angular [<>e: 36,9 (C-10)] y un carbono metilénico [<>e: 39,1 (C-1)]. Con esta información se logró conformar la sub-unidad estructural (F].

• Las señales de los hidrógenos de los metilos H-18 y H-19 se correlacionan, ambas, con tres picos: Un carbono cuaternario [<>e: 33,3 (C-4)], un carbono metilénico [be: 42,1 (C-3)] y el metino (C-5) anteriormente identificado en la sub-unidad estructural [F]. Así mismo, se observan cruces entre las señales de estos dos metilos: C-18 +-+H-19 y C-19 -H-18. A la luz de estos datos es posible configurar la sub-unidad estructural [G].

Las sub-unidades estructurales [F] y [G] pueden ser conectadas entre sí, puesto que ambas comparten un carbono (C-5), y además, la correlación HMBC: C-5 +-+H-20 así lo ratifica; de esta manera queda estructurada la subunidad [H].

3 [G]

121

Las secuencias de correlaciones HMBC: C-5 H H-20 H C-10; C-9 H H-20; H-11 +-+C-9 HH-17 HC-7; C-13 HH-12 y H-18 HC-5 HH-19 determinan el engranaje de las sub-unidades estructurales (E] y [H] para originar la sub-unidad (1] (Fig. 6G-2)

3

Fig. 6G-2. Correlaciones HMBC que Permiten Unir las Sub-unidades [E] y [H].

122

Al quedar conformada la subunidad estructural [1], sólo faltaría incorporar los dos metilenos, cuyos picos en el espectro de RMN-13C no han sido asignados hasta ahora [oc: 18,5 (C-2) y oc: 19,8 (C-6)]. Es obvio que los mismos encajan perfectamente en la sub-estructura [1], cerrando en la misma los ciclos A y B de un anillo decalínico, con lo cual se completarían los tres (3) grados de instauración que exige la fórmula molecular C20H36Ü 2 • El metileno de la posición C-6 pudo ser claramente identificado debido 1:! que en el espectro HMBC se detecta la correlación C-8 +-+H-6. De esta manera se completa la estructura gruesa del compuesto [6].

16 12 14

CH20H 15

2

3

19 18 (6]

Dicha estructura corresponde a la rle tm diterpeno de la serie dellabdano tipo Óxido de Manoílo (labdan-8,13-óxido) (Demetzos & Dimas, 2001). La misma es congruente con el patrón de fragmentación (Esquema 6D-1), observado al analizar su espectro de masas. En efecto, la presencia en dicho espectro de un fragmento notable a m/z: 220 y la existencia de iones abundantes a m/z: 263 [M+ -CH2-CH2-0H] y a m/z: 245 (pico base) [M+ -H20-CH2CH20H] (Esquema 6D-2) identifican de manera irrefutable a los diterpenos de la serie 8,13-epoxi-labdan-15-ol (Audier et al., 1964). De igual manera, los picos a m/z: 205 (ión "G"), m/z: 192 (ión "K"), m/z: 177 (ión K-15) y m/z: 137 (ión "E") caracterizan de manera inequívoca a un diterpeno dellabdano que carece de oxígenos en los anillos A y B (Enzell & Ryhage, 1965; Enzell et al., 1972). Con ello se confirma indirectamente que el grupo éter forma parte del anillo C.

~= \ miz: 263 ______ __..

.Y. miz: 308 [M+ 1

+ /.

m/z24~ ,-u,o #" Esquema 6D-2: Posible Mecanismo de Formación del Ion m/z: 245

2

3

C-19

Figura 6F: Espectro HMQC (CDC13), del Oxylobusol [6]

19 18

C-20

C-17

C-16

C-18

-. .. "'l

C-15 ~

~ r-~

C-

H-15

_A\

16 14 tilo...

··'' "CH20H 13 15

1.l5

i>JJ. ts·· "\'"

1 1 1

1.~

1

H-16 H-17

1.2

1 1

t. O

H-18 H-19 H-20

o.e

---~~---1

~\9 1 1

1

123

L

t

124

Figura 6G-t: Espectro HMBC (CDCI3), del Oxylobusol [6]

2

3

19 18

C-14-

i

--

1

16 12 14 ......

···' -......CH20H 13 15

H-15

~ ( ~-C·14/H·15A C·14/H·15B

AC-13/ H·15A

:Y -¡..

f..

.

. ¡...

' . C·13/H·15BJ)

...C,.13 .. ::: /'...._) '-- _) ( ..,_

---:::>( )' \. '-:? • -~-

Correlaciones HMBC que evidencian la unión de los anillos A B

H-16 H-17

H-18H-19 H-20

Correlaciones HMBC que evidencian la unión de los anillos B C-cadena lateral

H-20

H-9 8: 1,19 (t) = 2,4 Hz

8 : 0,76 (s) @

\_______ H3G.s,7

21t2

-------H3C J, @

H-19 8 : 0,78 (s)

-::.33,2

CH @\3 H-18

8 : 0,84 (s)

H-17 8 : 1,28 (s)

H-5 8 : 0,97 (dd)

J= 11,8 y 2,3 Hz

OH 8 : 1,91 (s) ·

ÜXYLOBUSOL [6)

Fórmula molecular: C20H36Üz

Peso Molecular: 308 glmol

Punto de Fusión: Líquido

[a.]D: + 5,00

...... N Vl

126

Una vez establecida la estructura gruesa del producto en estudio, solo faltaría por definir la estereoquímica en los centros quirales C-5, C-8, C-9 y C-10. Para ello se constataron los siguientes hechos:

• Por consideraciones de tipo biogenético, al igual que en el caso del Labdan-8a,15-diol [1] (pág. 70), se puede asumir que la unión de los anillos A y B es "trans", y por lo tanto la configuración relativa en los centros que forman el puente de unión entre los anillos NB es: C-5 a-H y C-10 13-Me (o viceversa). Por otro lado, también por razones de tipo biogenético, la unión C-9 y C-10 exige una disposición "anti" (C-9 a-H y C-10 13-Me o viceversa) (Hanson, 1971; McCrindle & Overton, 1965; West, 1981).

• La posición relativa, en el espectro de RMN-1H, de los singuletes asignados a los metilos H-16 y H-17, es consonante con lo esperado para metilos con interacción 1,3-diaxial. Este hecho indica que ambos metilos se orientan hacia el mismo lado (Almqvist et al., 1975). Esto pudo también ser corroborado con la información suministrada por el espectro de RMN-13C, donde se pudo comprobar que los desplazamientos químicos de los carbonos del anillo e y los de los metilos C-16 y C-17, se corresponden con los reportados en la bibliografía, para metilos unidos a los carbonos del puente éter de los óxidos de manoílo, que se ubican en una misma cara de la molécula (Barrero & Altarejos, 1993; Buckwalter et al., 1975).

• En el espectro NOESY (Fig. 6H-1) se observan efectos NOE entre, H-19/H-20, H-19/H-2ax, H-20/ H-2ax y H-20/H-17, por lo que se puede asumir que los metilos H-19 y H-20 también se orientan hacia el mismo lado que los metilos H-16 y H-17 (Fig. 6H-2).

Fig. 6H-2: Efectos NOE que Evidencian la Orientación de los Metilos en (6]

127

La estereoquímica en C-13 pudo ser definida en base a las siguientes observaciones:

• La señal en el espectro de RMN-13C del metilo C-16, ubicado en C-13, se encuentra apantallada, mientras que la del metileno de C-14 aparece desapantallada por acción del puente éter. En razón a ello el metilo {C-16), como ya se había señalado anteriormente, presenta disposición axial y el metileno (C-14), obviamente, presenta disposición ecuatorial. Más aún, de encontrarse este metileno en disposición axial, el pico del metilo C-17 (ubicado sobre C-8), estaría··:~desapantallado

(Barrero & Altarejos, 1993).

• En el espectro de RMN-1H los hidrógenos del oximetileno (H-15) resuenan como un par de doble de doblete de dobletes (sistema ABC) parcialmente superpuestos con sus tres constantes de acoplamientos bien definidas: Jgem.= 11,0 J14•15 (antiJ = 7,0 y Jz4•15 rgaucheJ = 3,0 Hz. Estos valores sustentan una conformación eclipsada H-14/H-15, que a pesar de ser de mayor energía se ve compensada por la formación de un puente de hidrógeno entre el hidróximetileno y el oxígeno del grupo éter. En virtud de lo explicado se concluye que el diterpeno en estudio representa a un confórmero "exo" (Fig. 61), ya que de encontrarse libre el oximetileno su señal se presentaría en el espectro de RMN-1H como un triplete.

Fig.61 Conformero "exo" de (6]

• La relación de las intensidades en el EM, del ión a m/z: 275 (abundancia relativa de 24,47%) vs. m/z: 257 (abundancia relativa 27,47%), corrobora la estereoquímica relativa establecida para C-8 y C-13, en la cual ambos metilos (independientemente de que su disposición sea a- ó p.) serían axiales y se orientarían hacia un mismo lado (Demetzos et al., 2002).

128

Todos los datos anteriormente expuestos demuestran que la esteroquímica relativa del compuesto en estudio se corresponde, para un labdano de la serie normal, con la de un 5aH, apMe, 9aH, 10PMe, 13PMe-óxido de manoilo (6], y para un labdano de la serie "ent" con la de un 5PH, 8aMe, 9pH, 10aMe, 13aMe­óxido de manoilo [6a]. Discernir entre estas dos alternativas no es posible con los datos espectrales disponible; sin embargo, si se toma en cuenta que los otros dos labdanos descritos anteriormente (1] y (5], (ambos componentes naturales de la especie en estudio) pertenecen a la serie normal (5aH, 10PMe), sería lógico suponer en base a consideraciones biogenéticas, que este tercer producto natural también perteneciera a la serie normal, con lo cual su estructura y configuración absoluta se correspondería con la del 5a.H, 8f3Me, 9aH, 10f3Me, 13f3Me-15-hidroxi-óxido de manoilo (6].

2

3

[6] [6a]

Figura 6H-1: Espectro NOESY (CDC13), del Oxylobusol [6]

12

19 18

16 14 .. ~

··'' -.......CH20H 13 15

_ --- J H-20/ H-2

•. J r· H-20/ H-19 V -- --~_, ··r~t

~~ r------~--~~~ t. O

=~ ~------=-=~:-:! ....'E

.:i-, ~"'-

~ 2.0

~'--'M--.-1-''-+---;-

'VW • o

t.O

129

Al realizar una rev1s10n bibliográfica exhaustiva con el objetivo de constatar si este producto o alguno de sus estereoisómeros se encontraban o no descritos en la literatura, se comprobó que hasta ahora, el estereoisómero perteneciente a la serie normal [6] no ha sido reportado como producto natural, pero en cambio si que lo ha sido el correspondiente a la serie "ent'' [6a]. Éste fue aislado por primera vez de la Sideritis gomera e Bolle (Lamia ce a e) y en razón a ello se le asignó en nombre de Gomerol (González et al., 1975); posteriormente se encontró también en Sideritis nutans Svent. (Fernández et al., 1986) y se detectó en el aceite esencial de Citrus sinensis (L.) Osbeck (Rutaceae) (Ziegler & Spiteller, 1992).

El isómero de la serie normal sólo se conoce como producto sintético, el cual ha sido obtenido en diversas transformaciones parciales de otros labdanos naturales (Audier et al., 1964; Cambie et al., 1991; Márquez et al., 1975).

Ante estos hechos se consideró oportuno comparar las constantes físicas (en particular la rotación específica) y espectrales del producto en estudio con las dadas en la bibliografía para ambos estereoisómeros (Cuadro 6), a objeto de determinar a que serie pertenecía y con ello establecer su configuración absoluta.

Cuadro 6: Posibles Estereoisómeros del8a.,13-Epoxi-labdan-15-ol

1 Gomerol

11 ent-Gomerol

1

= ~CH20H

Q:Y [a]0 = -3,5° (González et al., 1975)

[a]n= +4 o (Audier et al., 1964) (a]0 = +2 ° (Marquez et al., 1975) [a]n= +3,5 ° (Cambie et al., 1991

Al contrastar el valor de la rotación específica del producto en estudio ([a]0 =+5,0°) con los datos bibliográficos (Cuadro 6), se concluyó que, como se había supuesto anteriormente sobre la base de argumentos biogenéticos, éste es el estereoisómero de la serie normal [6]. En v!sta de que dicho compuesto se reporta aquí por primera vez como producto natural, se le asignó al mismo, el nombre de Oxylobusol. Cabe destacar que también se incluye aquí por primera vez un estudio detallado de RMN ( lD y 2D), a través del cual fue posible la asignación definitiva de las señales de todos los hidrógenos y carbonos presentes en esta molécula.

130

13-epi-Oxylobusol [7]

De la reunión E, correspondiente a las fracciones 17-46 de la cromatografía general, luego de realizar columna seca y cromatografía preparativa en placas de gel de sílice (hexano-acetona 4:1, triple recorrido), se logró purificar un producto que resultó ser un aceite homogéneo; [a.]u: +14,4°. Su fórmula molecular, C20H36Ü 2• fue determinada al analizar sus espectros de RMN-1H (Fig.7B; Tabla 7B) y de RMN-13C (BB y DEPT-135) (Fig.7C; Tabla 7C). Dicha fórmula pudo ser confirmada en su espectro de masas (Fig. 7D; Tabla 7D) donde, a pesar de que el ión molecular esta ausente, se observa el fragmento significativo a m/z: 290 [M+ -H20].

Figura 7 A: Espectro Infrarrojo (film), del 13-epi-Oxylobusol (7]

16 12 ~ 14

11~r.H~OH 20 17 r3 is--... ---

·' ..• o

8

%T

75 o

500

l 1.076 cm ·1

25 o 2.&64 c.m· 1 ca CH :.379 cm ·l

O.H

2.937 cm·1

C.H

00 40000 30000 2000 o 15000 1000 o 500.0

Tabla 7 A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR del 13-epi-Oxylobusol (7]

uméx. (cm·t) 3.369 2.937 2.864 1.379 1.076

Asignación 0-H C-H C-H 0-H C-0

H-15

Figura 7B: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDC13),

del 13-epi-Oxylobusol [7]

2

3

1.!! 12 = 14

19 18

CH20H 15

H-15

.----,·---.-----~- -...----- ... --1 .•• .,. --•- -··----.- -,- ' ' • • 1 ' • • • 1 • -• -· • -~- ·-T·~-

J.g, l.9) J e!! l eo J ~ l.7o

H-16

H-17

H-19 H-20

H-18

l

131

,-~-- -,-----, - ----- -..- ----.-----.-- --- --,--~ - 3.5 3.0 lO 1.5 1.0

Tabla 7B: Desplazamientos Químicos (8) en el Espectro de RMN-1H (CDCI3, 400 MHz) del13-epi-Oxylobusol [7]

H H-5 H-9 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20

B (ppm) 0,94 1,43 3,81 1,23 1,29 0,86 0,79 0,79

m J dd - dt S S S S S

J (Hz) j12 y 2,8 - 11; 9 y 5 . . - . -

132

Figura 7C: Espectro de RMN-13C (100 MHz, CDCI3),

del 13-epi-Oxylobusol [7]

1.!! 12 14

11 20 3

2:~1 9 ~~ ••• ,o 10 8

3 4 5 6 7

19 18

c-sC-13

- 1 70

u-15

C-15

' 60

C-5 C-9

C-5 C-9

1 50

C-17 C-20

C-18 C-16 C-19

;¡ .r ~-3 c-1 .::-12

C-14 C-7

1 .o

C-SC-2 C-11

C-6 \ C-2

r-16 rl7Crll C-¡¡-11

1 30

1 20

Tabla 7C: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de RMN-13C (CDCI3, 100 MHz), del13-epi-Oxylobusol [7]

e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7

o (ppm) 39,3 18,8 42,4 33,5 56,8 20,3 44,1

Tipo >CH2 >CH2 >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2

e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14

o (ppm) 75,7 54,4 37,5 15,2 35,2 74,7 44,4

Tipo >C-0- >CH >C< >CHz >CH2 >C-0- >CH2

e C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 TMSi

o (ppm) 60,3 29,0 25.G 33,7 21,7 15,4 como Patrón

Tipo >CH2-0- -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 Interno

133

Figura 7D: Espectro de Masas (Impacto Electrónico, 70 eV), del 13-epi-Oxylobusol (7]

CH20H 15

2

3

19 18

....

--

Tabla 7D: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas del 13-epi-Oxylobusol (7]

miz 293,24 290,26 275,23 263,22 245,20 205,16 192,5

Abund. Relat. 11,59 6,59 22,40 37,17 100 10,05 14,55

miz 177,13 137,11 123,10 109,09 95,08 81,07 69,07

Abund. Relat. 13,59 38,82 26,56 43,30 45,53 43,29 39,98

134

Al examinar en detalle sus otros datos espectrales: IR (Fig.7 A; Tabla 7 A), HMQC (Fig.7F) y HMBC (Fig.7G), se deduce que los mismos guardan mucha similitud con los del Oxylobusol [6], anteriormente descrito, por lo que se concluye que el compuesto representa un estereoisómero de este último. Más aún, el análisis detallado de sus espectros de RMN bidimensionales (HSQC y HMBC), permitió la asignación de prácticamente todas las señales en sus espectros de RMN-1H y RMN-13C; y además, las correlaciones en el espectro HMBC, fijaron de manera inequívoca la posición de los metilos en el esqueleto carbonado, la del puente éter C-8 ---O--- C-13 y la del hidroxilo en C-8. Con ello quedó establecido que la estructura gruesa de este compuesto es idéntica a la de (6]. De igual manera que en el caso de los compuestos (1] y [5], las únicas diferencias espectrales notables detectadas entre [6] y este producto se concentran en las señales de los hidrógenos y carbonos próximos a C-13.

En razón a esto es lógico suponer que [7] es el epímero en C-13 de [6]; esta suposición pudo ser confirmada en base a los siguientes cambios y variaciones, detectadas en los espectros de este producto, cuando se comparan con los de [6]:

A. Pequeñas diferencias no cuantificables en el espectro de RMN-1H, en lo concerniente a los desplazamientos químicos de los singuletes asignados a los metilos H-16, H-17 y H-20.

B. Variaciones en la posición de algunos picos en el espectro de RMN-13C:

• Desapantallamiento de la señal del metilo C-16 (óc= 29,0 en (7] vs.

óc= 27,6 en [6]), lo que indica que en [7], este metilo adopta una disposición ecuatorial. Por ende, si se asume que este compuesto pertenece también a la serie normal (5aH, 10~Me), C-13 exhibe configuración absoluta "S" (Barrero & Altarejos, 1993).

• Apantallamiento del pico correspondiente al metileno C-14 [oc= 44,4 en [7] vs. oc= 45,8 en (6]), debido a que el sustituyente -CH2-CH20H, ubicado sobre C-13, se orienta en una disposición axial.

• Desapantallamiento del pico asignado al metilo C-17 (óc= 25,6 en (7] vs. óc= 24,5 (6]), por su interacción con la cadena lateral que contiene el grupo hidroximetileno (C-15).

C. La relación de las intensidades en el EM, del ión a m/z: 275 (abundancia relativa de 22,40 %) vs. m/z: 257 (abundancia relativa de 17,16%), confirma la estereoquímica (configuración "S") del C-13 (Demetzos et al., 2002).

D. Su rotación específica ([a] 0 : +14,4°) muestra el mismo signo, pero distinto valor a la del compuesto (6], con lo cual se descarta la alternativa de una relación enantiomérica entre ambos productos.

Figura 7F: Espectro HSQC (CDC13), del13-epi-Oxylobusol (7]

2

3

19 18

C··~--(

C-5

1.8 1.6 1.<1

20

JO

40

50

1.2 1.0 0.8

135

136

Figura 7G: Espectro HMBC (CDCI3), del 13-epí-Oxylobusol (7]

2

3

19 18

H-15 -A....L__

:di l. n l 1 C-14 C-15 ·c-1líH-'s

( 13/H-1

6 c-a

- '·' '·

Correlaciones HMBC que evidencian la unión de los anillos A B

1.8 1.6 ...

H-16 H-17

1.2

IM)•llti~-lc1a/H-19

1.0 0.8

C-10/H-20 ..

-

Correlaciones HMBC que evidencian la unión de los anillos B C-cadena lateral

~ ~~

~~_Q ~~~

H-9 o: 1,43

H-20 \ @l 0 : 0,79 (s) 1 @ '"

LH3Ct5,4

21,7

H3C {@

H-19 o : O, 79 (s)

-~33,7

CH @\3 H-18

o : 0,86 (s)

H-17 o : 1,29 (s)

H-5 o: 0,94 (del)

J= 12 y 2,8 Hz

Q~

(~H20H 60,3 \

~ H-15

: 3,81 (dt) 11; 9 y 5Hz

'

13-EPI·ÜXYLOBUSOL (7]

Fórmula molecular: C20H36Ü 2

Peso Molecular: 308 glmol

Punto de Fusión: Líquido

[a] 0 : + 14,4°

-w -...,J

138

Al quedar establecido que el compuesto en estudio es el epímero en C-13 del Oxylobusol (6], es oportuno resaltar que su conformación más probable, como es lógico, pareciera ser opuesta a la sugerida para [6]. En efecto, los hidrógenos del hidroximetileno H-15 resuenan en el espectro de RMN-1H como dos grupos de señales: Una de ella es un doblete de doblete de dobletes "ddd" U= 6,4; 4,8 y 2,0 Hz) y la otra es un doblete de tripletes ("dt'') U= 11.2 y 5,2 Hz). Con ello queda claro que la disposición de los hidrógenos H-15 es alterna frente a la de los hidrógenos H-14. En consecuencia, es indudable que el hidroxilo en C-15 forma un puente de hidrógeno con el éter, adoptando una disposición "endo" (Fig. 71).

H H \/

4,8 Hz ,',.

H

l.~

H

11,2 Hz

.~

11,2 Hz

Fig. 71. Confonnero "endo" y Multiplicidad de H-15 en el13-epi-Oxylobusol [7]

En conclusión el producto en estudio es el 13-epi-Ox:ylobusol (7]. Sus constantes físicas, excepto el signo de la rotación específica, coinciden con las reportadas para el13-epi-Gomerol [7a].

13-epi-Oxylobusol (7] 11

13-epi-Gomerol [7a]

[a]0 = -13 ° (González et al., 1975) [a]0 = +16 ° (Audier et al., 1964) [n]0 = -18 ° (De Pascual Teresa et al., 1983b)

~==============~===============~~ El 13-epi-Oxylobusol tampoco ha sido reportado antes como producto

natural. La única referencia que se tiene de este producto, es su obtención a partir del sclareol (Audier et al., 1964).

139

Preparación de Algunos Ésteres del Labdan 8a., 15-Diol [1]

Ante la notable cantidad obtenida del producto Labdan-8a.,15-diol [1] (ver parte experimental) se consideró oportuno, preparar algunos derivados con vistas a evaluar su actividad biológica. Los ensayos preliminares realizados en torno a la actividad antimicrobiana con los labdanos naturales [1] y (5] y con el ácido {3] indicaron que el grupo hidroxilo en C-15 es una característica fundamental para la actividad, al igual que la estereoquímica en C-13 (ver pág. 165). En razón a ello, se planificó la preparación de derivados, centrando la atención en modificaciones del grupo hidroxilo.

En consecuencia con lo anterior, procedimos a obtener diferente ésteres del Labdan-8a.,15-diol, mediante tratamiento del mismo con diferentes anhídridos o haluros de acilo, trabajando a la temperatura ambiente y usando piridina como disolvente y catalizador. En el Esquema II, se representan las reacciones realizadas y los productos obtenidos.

Esquema 11: Ésteres Sintetizados a Partir del Labdan 8a., 15-Diol [1] 1

#/o,,~ # /o, pi,-cu,

rn, fi ~ r _ CH,fi o

-(8) (9)

~~ H

-[t)

~/o,,d~ #o P•, / ' ,.eHz eH3 Hz e 'e~ Hz fi 11

O iBuLOipiridina Bulz.Oipiridina o

- -{11) (101

A continuación describiremos en detalle ]a identificación de los ésteres obtenidos.

140

15-0-Acetato de Labdan-8a, 15-diol (8]

El acetato [8] resultó ser un aceite homogéneo amarillento, el cual no se logró cristalizar; [a] 0 : -6,3°. Considerando el origen del compuesto, los datos derivados de sus espectros de RMN-1H (Fig. 8B; Tabla 8B) y de RMN-13C (Fig. 8C; Tabla 8C), y la detección en su EM (Fig. 8D; Tabla 8D) de un ion molecular a miz: 352, se calculó su fórmula molecular, C22H400 3 • Al comparar sus datos espectrales con los de [1] se observan cinco cambios significativos:

A. En el espectro IR (Fig. 8A; Tabla 8A) se detectan, además de bandas típicas de alcoholes [vmax: 3.464 cm·1 (0-H) y vmax: 1.132 cm·1 (C-0)] la aparición de una nueva banda a vmax: 1.739 cm·1 (C=O) característica del grupo carbonilo de un éster. Esto fue confirmado al localizar en el espectro de RMN-13C un pico asignable al carbonilo de un éster [óc: 171,0 (C=O; C-1')].

B. Aparición en el espectro de RMN-1H de un nuevo singulete [óH: 1,97, 3H, (H-2')] y en el espectro de RMN- 13C de un pico a óc= 20,8 (C-2'). Los desplazamientos de estas señales se corresponden con los del metilo de un grupo acetilo, lo cual fue corroborado al denotar que ambas señales se cruzan en el espectro HMQC (Fig. 8F).

C. Desplazamiento a campos bajos (~0 : 0,46 ppm) de la señal atribuida a los protones del oximetileno (H-15), que en [1] correspondían a protones base a un alcohol primario, y ahora corresponden a protones base de un éster [oH: 3,58 vs. oH: 4,04, respectivamente].

D. Apantallamiento en relación a (1] del metileno C-14, por efecto del grupo acetilo en (8), apareciendo el pico de su carbono en (8) a Oc: 35,4 "versus" óc= 39,6 (en [1]).

E. Detección en el EM de iones que identifican la presencia de un grupo acetato en la molécula: m/z: 352 [M+]; m/z: 291[M+-H20-CH3CO} y m/z: 274 [M+-H20-CH3 COOH].

Los datos físicos y espectroscópicos de [8) concuerdan bien con los reportaios en la literatura para el 15·0·Acetato de Labdan·8a,15·diol [8]P (De Pascual Teresa ~t al., 1983a; Urones et al., 1992a). Este diterpeno se aisló por primera vez coüt.J producto natural de las partes aéreas de Cistus palinhae (Cistaceae) (De Pascual et al., 1983a) y su primer reporte como producto sintético, obtenido por esterificación del alcohol [1] se debe a Baker et al., 1962.

100,0

80

60

%T 40

20

0,0

4000,0

Figura 8A: Espectro Infrarrojo (film) del, 15-0-Acetato de Labdan-8a, 15-diol (8]

12

R Hz-ü-C-CH3

2 15 1' 2'

19 18

3.464cm·1

O.H ~ 1.242 cm·1 \

C-0-C 1 ' 1.158 cm·1

:.739 cm·l c.o-c 1.132 crr:l C·H C=O C.O

3000 1500 1000 cm-1

Tabla 8A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR del15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol (8]

umáx. ( cm·l) 3.464 2.930 2.868 1.739 1.158 y 1.242

-Asignación 0-H C-H C-H C=O C-0-C

141

450,0

1.132

C-0-C

H-2'

Figura 8B: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDC13),

del15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol [8]

2

12

19 18

H-15

o ......,._~·uz-O-~-cH3

15 1' 2'

H-17

Ak..____ 3.:1

H-19 H-18 H-20

H-16

142

Tabla 8B: Desplazamientos Químicos (5) en el Espectro de RMN-1H (CDC13 , 400 MHz), del15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol [8]

H H-7 H-9 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 H-2'

o (ppm) 1,81 0,94 4,04 0,84 1,07 0,80 0,72 0,72 1,97 ., m dt t rr. d S S S S S

J (Hz) 12,3 y 3,1 3,4 - 6,4 - - - - -

Figura 8C: Espectro de RMN-13 C (100 MHz, CDCl3),

del15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol [8]

11 ~p 14

1 17 r;; 10 9

8 ·,,/

3 OH

4 5 7 -.\. 6

19 18

o 11

CH2-0-c-CHa 15 1' 2'

o

? 1 C-1'

f"'~' -··.-· _ .... • .. -~·-.·- ""'1- N

"'" lt!O

C-18 C-19

C-17f\-2'

143

C-15 C-1 C-11 C-2

C-7C-3 C-14 C-6

C-9 C-5 C-12 C-10 C-4 C-13 C-~6 C-20 '\. \

C-8

Pll" 70 3D 20

Tabla 8C: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de RMN-C13 (CDCI3, 100 MHz), del15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol [8]

e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7

o (ppm) 39,7 18,3 41,9 33,2 56,0 20,4 44,3

Tipo >CH2 >CH2 >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2

e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14

o (ppm) 73,9 62,3 39 22,7 40,9 30,6 35,4

Tipo >CH-0- >CH >C< >CH2 >eH2 >CH >CH2

e C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 C-1' C-2' -o (ppm) 62,8 19,3 23,8 33,1 21,4 1E,4 171 20,8

Tipo >CH2-0- -CH3 -CH3 -CH3 -eH3 -CH3 >C=O eH3

144

Figura 8D: Espectro de Masas (Impacto Electrónico, 70 eV), del15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol [8]

69

121

95

81 109 137

150 163

1 1

177

12

19 18

334

o CHz-O~-cH3 15 1' 2'

Tabla 8D: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas del15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol [8]

miz 352 334 319 278 274 265 263

Abund. Relat. 5,69 48,01 70,51 9,46 3,53 5,24 4,86

miz 249 199 191 177 163 150 137 --

Abund. Relat. 6,35 2,59 100 47,58 21,46 24,12 82,92

miz 124 121 109 95 81 69 55

Abund. Relat. 47,48 92,84 83,57 87,72 83,32 69,68 49,03

145

Figura 8F: F.spectro HMQC (CDCI:J, del15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol (8]

H-15

... •• !1 2.0 t.!l 1.0

146

Figura 8G: Espectro HMBC (CDC13), del15-0-Acetato de Labdan-8a,15-diol [8]

19 18

C-1'

H-15

C-13/ H-15 C-14/ H-15

H-2'

~ C-8/ H-7 1~H2-o-~-~H31--+--- C-8/ H-17 --t--'--;

C-8/ H-9

C-1'/ H-15 C-1'/ H-2' ~~--~--------~--~~

3.5 3.0 ~-5 4'.0 L5 1.0

Correlaciones HMBC que Evidencian la Posición del Alcohol Terciario

Correlaciones HMBC que Evidencian la Posición del Grupo Acetato

50

tOO

125

150

147

15-0-Propanoato de Labdan-8a,15-diol (9]

El producto obtenido al tratar el Labdan-8a, 15-diol [1] con cloruro de propionilo en piridina a temperatura ambiente (ver parte experimental), fue purificado por cromatografía preparativa en placas de gel de sílice, obteniéndose un aceite homogéneo que no se logró cristalizar.

Al tomar en cuenta la información aportada por su espectro de RMN-13C (BB y DEPT-135) (Fig. 9C; Tabla 9C), sobre el número y naturaleza de los carbonos presentes en la molécula, se calculó su fórmula molecular, C23H420 3 • Al cotejar la fórmula molecular del alcohol de partida [1] (C20H38Ü 2) con la de este derivado, resulta obvio la ganancia de tres carbonos, cuatro hidrógenos y un átomo de oxigeno, lo cual concuerda perfectamente con la sustitución del hidroxilo del alcohol primario por el grupo propionilo.

La exploración de sus datos espectrales: IR (Fig. 9A; Tabla 9A), RMN-1H (Fig. 9B; Tabla 9B), RMN-13C, 1H, 1H COSY (Fig. 9E), HSQC (Fig. 9F) y HMBC (Fig. 9G), reveló que, en efecto, se trata del Labdan-8a-ol-15-0-propionilo [9]. Los espectros de este derivado guardan mucha similitud con los del producto de partida, por lo que solo se destacarán aquellos rasgos que sustenten la presencia del nuevo grupo propionilo en la molécula, como lo son:

A. Presencia en el espectro IR de absorciones típicas de ésteres: Banda de tensión del carbonilo (vmax: 1.738 cm-1

) y las bandas de tensión simétrica (vmax: 1.083 cm-1

) y asimétrica (vmax: 1.188 cm-1) de los

enlaces C-0-C.

B. Variaciones considerables en la posición de las señales atribuidas a H-15 (oH: 4,08 (9] vs. oH: 3,58 [1]). Así mismo en el espectro de RMN-13C se observa una variación importante en la posición del pico asignado al C-15 (Oc: 62,9 [9] vs. Oc: 60,2 [1]).

C. Detección en el espectro de RMN-13C de un pico a c5c: 174,8, atribuible a un carbono carbonílico propio de ésteres.

D. En su espectro de RMN-1H, a oH: 2,3 (H-2') se observa una nueva señal, [cuarteto, 2H, U = 7,6 Hz)], correspondiente a un metileno unido a un carbonilo, cuyos hidrógenos se acoplan a un metilo (O=:C-CH2-CH3). Por otro lado, también se observa un triplete a oH: 1,l4 U= 7,2 Hz; H-3'), que evidencia la existencia de este metilo. Este análisis fue además sustentado por el espectro de RMN-13C, en el cual se localizan dos nuevas señales a Oc: 27,7 (CH1 ; C-2') y a oc: 9,30 (CH3 , C-3').

100

90

80

JU •

60

.50

40

30

20

10

0,0

4500,0 4000

Figura 9A: Espectro Infrarrojo (film), del15-0-Propanoato de Labd~n-8a,15-diol [9]

19 18

n V

3.511 cm·1

0-H

2.868 cm·1

C-H

2.931 cm·1

C-H

3000

o CH2-0~-cH2-CH3 15 1' 2' 3'

1.462 cm·1

1.083 cm·1

C-0-C

C-H 1.188 cm·1

2000

1.738 cm·1

C=O

em-1

C-0

1500 1000

148

Tabla 9A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (film), del 15-0-Propanoaio :de Labdan-8a, 15-diol [9]

-UmAx. (cm-t) 3.511 2.931 2.861 1.738 1.083 1.188 --Asignación 0-H C-H C·H C=O C-0-C C-0-C

Figura 9B: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDCI3),

del 15-0-Propanoato de Labdan-8a, 15-diol (9]

H-20 H-19

149

19 18

H-17 H-18

H-15

1

- •. o 1

3.5 1

J.O 1

2.5

H-2'

1 2.0

1 1.5

H-3'

-1

r 1.0

Tabla 9B: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de RMN-1H (CDCl3, 400 MHz), del15-0-Propanoato de Labdan-8a,15-diol (9]

H H-7 H-9 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 H-2' H-3'

B (ppm) 1,84 y 1,36 0,98 4,08 0,91 1,12 0,85 0,77 0,77 2,3 1,14

m dt t m d S S S S e t -/(Hz) 12 y 3 3,6 - 6,4 - - - - 7,6 7,2

1

150

Figura 9C: Espectro RMN-13C (CDC13,, 100 MHz), del15-0-Propanoato de Labdan-8a,15-diol (9]

11 20 14

1 17 r; 10 9 a·,,,

3 OH 4 5 7

\ 6 19 18

-

o 11

CHz-0-C-CHz-cH3 15 1' 2' 3'

1 70

1 >o

C-19 C-18 1

C-13 C-17 C-16

C-2' C-6 C-2 , c~~-12 C-14 C-11

C-1 C-10 C-4 C-20 C-3'

" C-7

' ~' ' .., ' "'

' 10

Tabla 9C: Desplazamientos Químicos (5) en el Espectro de RMN-13C (CDC13, 100 MHz), del15-0-Propanoato de Labdan-8a,15-diol (9]

e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8

o (ppm) 41,2 18,6 42,1 33,5 56,3 20,7 44,6 74,4

Tipo >CH2 >CH2 >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2 >CH-0-

e e-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14 C-15 C-16

. o (ppm) 62,6 39,3 23,0 39,9 30,9 35,7 62,9 19,6

Tipo >CH >C< >CH2 >CH2 >CH >CH2 >CH2-0- -CH3

e C-17 C-18 C-19 C-20 C-1' C-2' C-3' TMSi ·- como o (ppm) 24,1 33,3 21,6 15,6 174,8 27,7 9,30

Patrón Tipo -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 >C=O >CH2 -CHJ Interno

,

Figura 9E: Espectro 1H/H-COSY (CDCl3),

del15-0-Propanoato de Labdan-8a,15-diol (9]

H-2' H-15

H-3'/H-2' H-3'~==::::: •

H-14 H-14

o

1.0

1.5

2.0

11 2.5 CHz-o-c-cHz-CH3 15 1' 2' 3'

19 18

ppoo 1.5 3.0 2.5

Correlaciones 1H, 1H-COSY que Evidencian la Posición del Grupo Propionilo

2.0 1.5

3.0

3.5

~.0

1.0

151

Figura 9F: Espectro HSQC (CDCI3),

del15-0-Propanoato de Labdan-8a,15-diol (9]

H-15

- •. o 1.1 1.0 ••• 1.0 •••

152

.... t.t

C-3~' -.....; C-2~'1

C-~ -C-14

-----1

C-1.:._

2

19 18

Figura 9G: Espectro HMBC (CDCI3),

del15-0-Propanoato de Labdan-8a,15-diol [9]

H-15 Ht H-3'j ll! ~'-----------J'~"--__ ;LY~~JL~} J~ -·

1 o

C-3'/H-2' ::. - ~~- * ~iiir -- t.- l ,i/ H- 1 ;> -~ ~at -- C-14/H-15 ~

.o .... ~a ·•O-e

C-2'/H-3' ··+ ~ .. .. - -~t .. - -·· ··•

. - -- .~ .. ·-·~~--·---- ~-'···-~ .-.-- ~~~·--·-· .. ··~·····-·· ···----·-,·- ~-~-- ·········--··....,.._,.._..,~~,. ___ . ----+ =----'>

1

_C-1'/H-15 C-1'/H-2' C-1'/H-3' --- -- '--4111>-

1.·1 2.C :.5 :.o

12 o

.........___. "H2-ü-~-CH2-cH3 15 1' 2' 3'

Correlaciones HMBC que Evidencian la Posición del Grupo Propionilo

153

-~

_,.,

154

15-0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol (10]

De la reacción del Labdan-8a,15-diol [1] con anhídrido butírico, se obtuvo un compuesto como un aceite incoloro, el cual fue purificado por cromatografía preparativa. Su fórmula molecular, C24H44Ü 3, se estableció al determinar, a través de su espectro de RMN-13 C (BB y DEPT-135) (Fig.10C; Tabla lOC) el número y naturaleza de los carbonos que integran la molécula. Esta fórmula concuerda para el derivado esperado, el 15·0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol [10]. En vista de la semejanza de los datos espectrales de [10], con los del producto de partida [1], sólo se resaltarán aquellas características que revelen la presencia en la molécula del nuevo grupo butanoilo, como lo son:

A. Existencia en su espectro IR (Fig.lOA; Tabla lOA) de absorciones propias de ésteres: Banda de tensión del carbonilo (vmax: 1.736 cm-1

) y bandas de tensión simétrica (vmax: 1.084 cm-1

) y asimétrica (vmax: 1.181 cm-1) de los

enlaces C-0-C.

B. Desplazamiento a campos bajos (~~: 0,5 ppm) del multiplete asignado a los hidrógenos del oximetileno H-15 (~": 4,08 en [10] vs. ~H: 3,58 en [1]). Igualmente se observa una variación del pico asignado a C-15 en el espectro de RMN-13 C (~e: 62,9 (10] vs. ~6 60,2 (1]).

C. Identificación en el espectro de RMN-13C de una nueva señal a ~e: 174,1 (C-1'), propia del carbonilo de un éster (-0-C=O).

D. Aparición en el espectro de RMN-1H de las señales típicas de un resto propilo (-CH2-CH2-CH3): Triplete a ~": 2,27, j ;:; 7,4 Hz, 2H, (H-2'); multiplete a ~H: 1,63, 2H, (H-3') y triplete a ~11 : 0,94, f =8Hz, 3H, (H-4'). Estas señales se corresponden en el espectro HSQC (Fig. 10F) con picos que resuenan a oc= 36,6, O=C-~H2·CH2- (C-2'), oc= 18,7, -CH2-CH2-CH3,

(C-3') y ~e: 13,9, -CH2-CH3 (C-4').

E. Los espectros 1H,1H-COSY (Fig. lOE), HSQC (Fig. 10F) y HMBC (Fig. 10G), confirman la naturaleza del éster butírico, mediante las secuencias de correlaciones COSY: H-2' -H-3' -H-4' y HMBC: H-2' -C-1' -H-3' y i-I-4' -C-2' -H-3' -C-4' -H-2' -C-3' -H-4'. Por otro lado, es evidente QUe la ubicación del éster quedó establecida de manera inequívoca en C-15, a raíz de la observación en el espectro HMBC de un cruce entre la señal asignada a los hidrógenos H-15 y el pico atribuido al carbonilo del éster (C-1').

uo

11

Figura lOA: Espectro Infrarrojo (film), del15-0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol [10]

3.513 c:m·1

0-H

C·H

2.931 cm·:

C-H

1.736 cm·1

:=o

1.460 cnr1

C-H 1.181 cm·l

e .o

'-'J.---------------------------.,.._. .... ,... 1,.. .,. .. .... 1

155

Tabla lOA: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR, del15-0~3utanoato de Labdan-8a,15-diol (10]

Umb. ( cm-t) 3.513 2.931 2.869 1.736 1.084 1.181 ~

Asignación 0-H C-H C-H C=O C-0-C C-0-C

156

Figura 10B: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDCI3),

del15-0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol [10]

12 o

" ~-r:H2-0-c-CH2-cHz-CHa 15 1' 2' 3' 4'

H-3'

H-2' 1

H-19 H-20

H-17H-18

H-1

H-4' 1

H -1..._5 ___ ·~-·~~_ .... _ ..... _ .... _.~·~~_ ..... _ .... _ ..... _ .. ~·-~~· ___ ,. '---HJ-' ~ 7___.;L~NJL 1 ji l

• ., r .. f • .. r - , - . ~ 1.5 lO , ~

Tabla lOB: Desplazamientos Químicos (B) en el Espectro de RMN-1H (CDC13, 400 MHz), del15-0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol [10]

H H-7 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 H-2' H-3' H-4'

o 1,86 y 1,37 4,08 0,91 1,13 0,86 0,78 0,78 . 2,27 1,63 0,94

(ppm)

m dt m d S S S S t m t

/(Hz) 12y 3 - 6,8 - - - - 7,4 - 8

C-8

-

Figura tOC: Espectro de RMN-13C (tOO MHz, CDCI3),

del15-0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol [10]

"" ~· .,

C-13 y-19 C-18 C~7 1 /C-16

T .....

! t-- C-14 C-3 1 C-2'

C-12

"T

C-6 C-2, C-11 C-3

C-20

157

C-1 C-7 1 C-10 ~-4

\ ' + C-15c_9 "-... C-5

1 y-4'

1 70

·. 1

60 1 ~o

1 30

1 20

..

.J.

Tabla 10C: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de RMN-13C (CDCl3 , 100 MHz), del15-0-Butanoato de Labdan-8«,15-diol (10]

e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8

o (ppm) 41,3 18,7 42,3 33,6 56,4 20,8 44,7 74,5

Tipo >CH2 >CH2 >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2 >CH-0

e C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14 C-15 C-16

o (ppm) 62,7 39,4 23,2 40,1 31,1 35,9 62,9 19,7

Tipo >CH >C< >CH2 >CH2 >CH >CHz >CH2-0 -CH3

e C-17 C-18 C-19 C-20 C-1' C-2' C-3' :;-4'

o (ppm) 24,2 33,5 21,7 15,7 174,1 36,6 18,7 13,9

Tipo -CH3 -CH3 -Clla -CH3 >C=O >C..'iz >CHz -CH3

19 18

Figura tOE: Espectro 1H/H-COSY (CDCI3),

del15-0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol (10]

o

" ~-CH2-ü-c-cH2-cHz-CH3 15 1' 2' 3' 4'

Correlaciones 1H, 1H COSY más Destacadas

H-4' )· ·( H-3' )• •{ H-2' )

H-6

H-15

H-4'~~ _ _j____j__l-_j_-l-_(fj~~ H-6 H-14

H-3' H-14/H-15 H-14/H-15

.,.,. ~.o 3.5 3.0

. -

2 5 2.0 1.5 1 o

H-7

DCIO

158

Figura tOF: Espectro HSQC (CDCI3),

del15-0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol (10]

C-4' C-20----W' C-16 E=l~~~.

C-5-~

C-9-~-'

,. ... 1.1 ;.o ... '·G 1.0

159

19 18

H-1!>

Figura tOG: Espectro HMBC (CDCl3),

del15-0-Butanoato de Labdan-8a,15-diol [10]

C-1'/H-15

e-z.!._• .;;;;:;;;;:¡ 1

.. 2.1

C-t'íH-2' C-1'/H-3'

Correlaciones HMBC, que Evidencian la Presencia y Posición del Grupo Butanoilo

160

••

161

15-0-Isobutanoato de Labdan-8a,15-diol [11]

La reacción del Labdan-8a.,15-diol [1] con anhídrido isobutírico produjo un aceite transparente, el cual no fue posible cristalizar. El estudio rrúnucioso de sus datos espectrales: IR (Fig. 11A; Tabla llA), RMN- 1H (Fig. 11B; Tabla 11B) y 1H, 1H-COSY (Fig. 11E), lo identificó como el: 15-0-Isobutanoato de Labdan-8a,15-diol (11]. En efecto, el análisis comparativo de sus espectros con los del producto de partida [1], puso en evidencia las siguientes diferencias:

A. Detección en su espectro IR de absorciones atribuibles al grupo éster: banda del carbonilo (C=O; vmax: 1.736 cm-1

) y bandas de tensión (vmax: 1.080 cm-1

) y (vmax: 1.159 cm-1) correspondientes a vibraciones de

tensión de los enlaces C-0-C.

B. Desplazamiento a campos bajos (~o: 0,51 ppm) de la señal asignada a los hidrógenos del oximetileno H-15 (oH: 4,09 en (11] vs. oH: 3,58 en [1)), ..]_1_!..1- _, -~--.1.- _, ___ .- • 11 • 1 1 1_ ., 1,,. Ut:U!UU éU t:lt::CLU Ut:::Séi!JéU!létillilltt::l Ut:Jl Céil"UUllllU Uel est:er.

C. Aparición en el espectro de RMN-1H de señales típicas de un grupo isopropilo: Doblete a~: 1,14, f = 3,3 Hz, 6H [-GH (C!L)2) y septuplete a oH: 2,54, J =7Hz, 1H, (CH3-CH-CH3). El mutuo acoplarrúento de estas dos señales, fue observado en el espectro 1H, 1H-COSY.

lOO

90

so

'JO

60

%T :;o

4)

JI)

;!)

ID

0.0 COO,D

Figura 11A: Espectro Infrarrojo (film), del15-0-Isobutanoato de Labdan-8a,15-diol [11]

401

19 18

2.869cm·1

C-H

2.931 c.m·1

C-H

300)

O /CHa CH2-ü~-cH

3'

15 1' 2' " CH3

1.736 cm·' C=O

.... 1

4'

1.467 cm·' C-H

llOO

1.080cm·1 C-0-C

1.159 cm·' C-0

1000

Tabla 11A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR del15-0-Isobuaanoato d~ Labdan-8a,15-diol [11]

-\)máx. ( cm-1) 3.514 2.931 2.869 1.736 1.159 1.080 --

Asignación 0-H C-H C-H C=O C-0-C C-0-C

162

Figura 11B: Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDC13),

del15-0-lsobutanoato de Labdan-8a,15-diol (11]

O /CH3 14 CH2-o-'t-CH

3,

15 1' 2' "' CH3 4'

t9 is

H-15

JJL OH

3.5 3.D

PPII 4.0

H-17

H-3' H-4' H-18 H-19

H-20

H-16

163

H-2'

lZ 2 o 1 B 1.6 1.~ I.Z J o O B

Tabla 11B: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de RMN-1H (CDC13, 400 MUz), del15-0-Isobutanoato de Labdan-8a,15-diol (11]

H H-7 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 H-2' H-3' H-4' OH

B 1,85 4,09 0,91 1,16 0,85

(ppm) 0,78 0,77 2,54 1,14

1·

1,14 3,15

m dt m d S S S S spt d d S

J (Hz) 12;3 - 6,4 - - - - 7 3,3 3,3 -a.=

Figura 11E: Espectro 1H/H-COSY (CDCI3),

del15-0-Isobutanoato de Labdan-8a,15-diol (11]

19 18

14/ H -15 --+---1¡---:

H-14/ H-15

J.!l 3.0 zo

Correlaciones 1H, 1H-COSY más Destacadas

1 ~ 1.0

H-3' )-( H-2'

164

1.0

l.S

2.0

2.5

J.O

J.5

4 o

OPO