Instituto de Inmunología, Facultad de Ciencias Médicas, UNR

Lic. Verónica V. Bozza

Directora: Dra. María Luisa Bay

Estudios moleculares y funcionales en células mononucleares de pacientes con Tuberculosis pulmonar, estimuladas in vitro con Mycobacterium tuberculosis y tratadas con Cortisol y/o Dehidroepiandrosterona

Esta situación es equivalente a más de 10 Boeing 747 llenos de personas muriendo por día a causa de esta crisis global de salud Nature immunology, vol 4, Nº 10 octubre,2003.

¿Por que investigar sobre Tuberculosis?

Es la 1º causa de mortalidad debido a un agente bacteriano.1/3 de la población mundial se encuentra afectada.Mueren 4.900 personas por día

Tuberculosis

Agente causal: Mycobacterium tuberculosis

Bacilo ácido-alcohol resistente

Aerobio estricto y de vida intracelular

Principal vía de transmisión:

AÉREA

Mayor incidencia de TB pulmonar

Eventos cronológicos en la Eventos cronológicos en la patogénesis de la tuberculosis:patogénesis de la tuberculosis:

Inhalación del M. tuberculosis

Eliminación del patógeno

Complejo primario

Estabilización(latencia)

Infección localizada

Diseminación del M. tuberculosis

Infecciónaguda

Estabilización(latencia)

Reactivación(TBC secundaria)

Th

Respuesta inmune frente al M. tuberculosis:

M

CPA

IL-12

NK

Th1

IFN-

T citotóxico

RIN

RIO

IL-2

Th

Respuesta inmune frente al M. tuberculosis:

CPA

TNF-

IL-12

NK

Th1

IFN-

T citotóxico

MRIN

RIO

IL-2 Granuloma

EJE HIPOTALÁMICO-PITUITARIO-EJE HIPOTALÁMICO-PITUITARIO-ADRENALADRENAL

GC

Sostenido apoptosis de linfocitos

Inhiben la síntesis de citocinas Th1

Inhiben la respuesta inflamatoria favoreciendo la actividad de linfocitos Th2

Optimizan el curso de respuestas biológicas agudas

DHEA

Facilita el patrón Th1

Esteroide sintetizado fundamentalmente en corteza suprarrenal y SNC

En humanos muchas enfermedades caracterizadas por inflamación crónica presentan bajos niveles séricos de DHEA o DHEA-S

OBJETIVO GENERAL DE LA LÍNEA DE TRABAJO

Estudiar los mecanismos inherentes a la interacción inmunoendócrina en pacientes con tuberculosis de distinta severidad, y convivientes íntimos no enfermos de estos pacientes.

MUESTRAMUESTRASS

PACIENTES: PACIENTES:

Enfermos con diagnóstico de TBC pulmonar, basados en criterios clínicos y radiológicos e identificación de bacilos ácido-alcohol resistentes en el esputo

CLASIFICACIÓN: Leves: pacientes con un único lóbulo

involucrado sin cavidades visibles Moderados: pacientes que presenten

compromiso unilateral de 2 o más lóbulos y las cavidades, de hallarse presentes, no excedan un diámetro total de 4 cm

Severos: enfermedad bilateral con afectación masiva y cavidades múltiples

GRUPO CONTROL:GRUPO CONTROL: Muestras provenientes de individuos sanos

similares en edad y sexo a los pacientes.

Tanto las muestras de los pacientes como las de los controles se analizaron en forma simultánea.

Se excluyen del estudio aquellos sujetos que:

Presenten co-infección con HIV.

Hayan iniciado el tratamiento antituberculoso.

Presenten patologías con compromiso directo

de la glándula suprarrenal.

Presenten patologías que involucren los ejes

hipotálamo-hipófiso-tiroideo y gonadal.

Padezcan patologías que requieran del consumo

de drogas corticosteroideas, inmunosupresoras

o inmunomoduladoras.

Muestra

Células

Tratamientos

Evaluar la

blastogénesis

Obtener sobrenadantes para dosar citocinas

TRATAMIENTOSTRATAMIENTOS

Cortisol (Gc)Cortisol (Gc)

1010-6-6 Molar Molar 1010-7-7 Molar Molar

Dehidroepiandrosterona(DHEA)Dehidroepiandrosterona(DHEA)

1010-7 -7 Molar Molar 1010-8-8 Molar Molar 1010-9 -9 Molar Molar 1010-10-10 Molar Molar

Sonicado de Mycobacterium tuberculosis,

concentración: 8 g/ml (Tso)

Concanavalina A, concentración: 2,5g/ml (Con A)

Los sobrenadantes se levantaron a las 36 hs y 4 días de cultivo Se fraccionaron y congelaron para la posterior determinación de las citocinas

D 10-10D 10-8 D 10-9

GC 10-6

GC 10-7

D 10-7

GC 10-6 GC 10-6GC 10-6

GC 10-7 GC 10-7 GC 10-7

D 10-7

D 10-8

D 10-8

D 10-9

D 10-9

Basal TSO

D 10-7

GC 10-7

D 10-10

GC 10-6

D 10-10

TratamientoTratamiento GruposGrupos

ControlesControles LevesLeves ModeradosModerados SeverosSeveros

TsoTso 1274812748(7839-(7839-20834)20834)

25712571(1474-(1474-11049)11049)

64876487(1593-16439)(1593-16439)

42434243(600-(600-

7356)¶7356)¶

Tso +Tso +Cortisol 10Cortisol 10-6-6

MM

25712571(1333-(1333-8376)8376)**

881881(442-7857)(442-7857)

11351135(469-4620)(469-4620)**

18261826(359-(359-

3563)3563)**

Tso +Tso +Cortisol 10Cortisol 10-7-7

MM

87948794(3256-(3256-13994)13994)

14961496(1124-(1124-3611)3611)

35093509(794-6380)(794-6380)

27912791(498-(498-

12907)12907)

Difieren de Controles, ¶ p<0,04*Comparaciones entre grupos: Cultivos estimulados con Tso vs cortisol (10-6 M), Controles (p<0,01), Moderados (p<0,025), Severos (p<0,05).

Resultados Previos:Scandinavian Journal of Immunology 60, 639–646, 2004

TratamientoTratamiento GruposGrupos

ControlesControles LevesLeves ModeradosModerados SeverosSeveros

TsoTso 1274812748(7839-20834)(7839-20834)

25712571(1474-11048)(1474-11048)

64866486(1592-16439)(1592-16439)

42434243

(600-7356) (600-7356) ¶¶Tso +Tso +

Cortisol 10Cortisol 10-6-6 M M25702570

(1333-8376) (1333-8376) **880880

(441-7857)(441-7857)11351135

(469-4620) (469-4620) **18261826

(359-3563) (359-3563) **+ DHEA 10+ DHEA 10-7-7 M M 32193219

(840-9486)(840-9486)809809

(554-4881)(554-4881)17251725

(488-5533)(488-5533)15801580

(449-4314)(449-4314)

+ DHEA 10+ DHEA 10-8-8 M M 26752675(1034-8857)(1034-8857)

906906(471-7925)(471-7925)

11221122(512-4785)(512-4785)

16691669(419-4742)(419-4742)

+DHEA 10+DHEA 10-9-9 M M 27932793(755-9084)(755-9084)

760760(490-5284)(490-5284)

890890(552-6847)(552-6847)

18311831(467-4496)(467-4496)

+ DHEA 10+ DHEA 10-10-10 MM

22172217(822-8990)(822-8990)

809809(498-5812)(498-5812)

895895(713-5942)(713-5942)

21662166(464-3070)(464-3070)

Difieren de Controles, ¶ p<0,04*Comparaciones entre grupos: Cultivos estimulados con Tso vs cortisol (10-6 M), Controles (p<0,01), Moderados (p<0,025), Severos (p<0,05).

1- Conocer si las modificaciones observadas en la respuesta inmune específica de las CPM frente a TSO, por el agregado de Cortisol y/o DHEA, se encontrarían asociadas a un patrón diferencial en el proceso de muerte celular programada y analizar los mecanismos implicados en este proceso.

D 10-9D 10-7 D 10-8

GC 10-6D 10-7

GC 10-6 GC 10-6GC 10-6

D 10-8D 10-9

Basal TSOGC 10-6

solo

GC 10-7

soloD 10-7

sola

Determinación de los niveles de apoptosis por citometría de flujo

Anexina V/IP(24 Horas de cultivo)

Hipodiploidía (IP)(4 días de cultivo)

Anexina V/IP

Hipodiploidía (IP) (4 días de cultivo)

Células apoptóticas

Niveles de IL-10

Niveles de TGF-

Niveles de IFN-

Los pacientes TB presentaban:Niveles de

CortisolNiveles de DHEA

Niveles de IL-6

Resultados Previos en Plasma:

CONVIVIENTES: CONVIVIENTES:

Personas que viven con un enfermo diagnosticado y con esputo positivo; sin sintomatología, RX normal y sin trastornos endócrinos

Tanto las muestras de los pacientes como las de los convivientes y controles se analizaron en forma

simultánea

2- Analizar el perfil de citocinas (IFN-γ, TGF-β, IL-10, IL-6 y TNF-α) producidas en la respuesta inmune específica de CPM de pacientes y de convivientes íntimos; así como los niveles plasmáticos de los mencionados mediadores, y de Cortisol y DHEA en los distintos grupos de estudio

Determinación de los niveles de citocinas en sobrenadantes de cultivo:

•IFN-

•TNF-

•IL-6

•IL-10

•TGF-

•24 Hs

•36 Hs

•4 Días

Las determinaciones se realizarán por ELISA, utilizando kits comerciales

Resultados Previos:

Los pacientes TB presentaban:

En la producción de IFN-

En la producción de TGF-

= En la producción de IL-10

CULTIVOS ESTIMULADOS CON TSO:

(VS. CONTROL)

CULTIVOS ESTIMULADOS CON TSO + GC 10-6 M: (VS. CULTIVOS ESTIMULADOS)

En la producción de IFN-

= En la producción de TGF-

= En la producción de IL-10

• Adaptación adherente de la línea original NCI-H295

que crece en suspensión.

• Se originaron a partir de un adenocarcinoma adrenal

proveniente de una mujer de edad media de raza

negra.

• Conservan la capacidad de respuesta a estímulos

fisiológicos produciendo todos los esteroides adrenales.

Línea celular adrenal NCI-H295-R

Producción porcentual de DHEA en sobrenadantes de cultivos de células NCI-H295-R, adicionadas con pool de sobrenadantes de CPM de pacientes tuberculosos y controles sanos con o sin el agregado de TSO.

4- Investigar qué mediador(es) secretados por las células periféricas mononucleares (estimuladas o no con TSO) estarían implicados en la inhibición de la síntesis de DHEA por parte de la línea celular adrenal humana NCI-H295-R.

Cultivo de Células Periféricas Mononucleares con y sin el agregado de TSO

Recolección de sobrenadantes de 24, 36 hs y 4 días de cultivo

Adición de los sobrenadantes de las CPM a la línea adrenal NCI-H295-R

Luego de 48 horas de cultivo se retira el Sobrenadante de la línea adrenal

Cuantificación de DHEA y Cortisol

Cultivo de Células Periféricas Mononucleares con y sin el agregado de TSO

Recolección de sobrenadantes de 24, 36 hs y 4 días de cultivo

Adición de los sobrenadantes de las CPM a la línea adrenal NCI-H295-R

Luego de 48 horas de cultivo se retira el Sobrenadante de la línea adrenal

Cuantificación de DHEA-S y Cortisol

Adición de anti-TGF-

Muestra

Células

Tratamientos

Evaluar la

blastogénesis

Obtener sobrenadantes para dosar citocinas

Obtener células para estudiar apoptosis

Obtener sobrenadantes para exp. con la línea adrenal

HEMOGRAMA

POBLACIONES