Universidad de San Carlos de GuatemalaFacultad de OdontologíaLic. Julio TurciosBioquímica

Reporte del Laboratorio:Identificación de Aminoácidos y Proteínas

Integrantes CarnéMax Alejandro Carrillo 200910847

María Fernanda Escobar 200910978John Stephen Vernon 20092245

Yasmin Susana Orozco 200922263Mayra Carlota Hernández 200922300

Nueva Guatemala de la Asunción, 26 de Abril de 2010

Introducción:

Las sustancias química están en todo nuestro entorno, que con el tiempo se ha aprendido a usarlas a nuestra conveniencia; en el cuerpo se encuentran una infinidad de moléculas y compuestos bioquímicos, que ayudan a realizar muchas funciones que nos mantienen vivos. Sabes que hay una infinidad de posibles combinaciones entre cualquieras que fueran sus distintos y elementos y dar inimaginables combinaciones posibles. Lo que más nos interesa a nosotros, como futuros profesionales de la salud, son las moléculas biológicas, y de entre ellas los aminoácidos.

Con los avances tecnológicos del mundo se ha podido comprender mejor que es lo que sucede en nuestro organismo y cuáles son las sustancias que intervienen durante las vías metabólicas y el mantenimiento de la homeostasis. En el pasado laboratorio de bioquímica, se tuvo la oportunidad de poder comprender mejor ciertas moléculas orgánicas que se encuentran en nuestro cuerpo y alimentos, estas moléculas son denominadas aminoácidos y proteínas. Durante el laboratorio se pudo identificar proteínas y aminoácidos, por medio de la cromatografía en papel, así como con reacciones biuret y de ninhidrina.

A continuación se presenta un informe donde se explica más ampliamente lo sucedido en dicho laboratorio, los resultados obtenidos, la explicación para dichos resultados y una guía paso a paso de cómo se realizo la cromatografía en papel, la reacción biruet y de ninhidrina ya mencionadas.

Resumen

Cromatografía en PapelInstrumentos y materiales: Papel alto en celulosa, Cámara cromatográfica,

Tijeras, Lápiz, Regla, H20, Tubos capilares, Aminoácidos (Cis, Gln), Secadora, Ninhidrina, Acido Acético (CH3COOH), N-Butanol, Pipetas (10 y 5 ml), Engrapadora, Beacker.

Procedimiento:

1. Se recubrieron las paredes internas de la cámara cromatográfica con papel alto en celulosa y se cortó otro pedazo de papel alto en celulosa, con unas medidas de 16.1x19 cm. A este papel ya cortado le trazamos los siguientes márgenes:

2. En la estación de sembrado se pusieron 3 gotas de aminoácidos con los tubos capilares de la siguiente manera, siempre siguiendo las instrucciones del folleto de laboratorio.

3. Se enrolló el mismo de modo que el sembrado quedó hacia el exterior.4. Luego, se colocó la cámara cromatografía en la estación designada para la fase

móvil. Aquí se le agregó, n-butanol y ácido acético, además se añadió agua, así se hizo la fase móvil.

5. Se introdujo la parte de la fase estacionaria a la cámara, aquí se debe dejar por un tiempo mínimo de 30. (Durante este experimento sólo se dejó por 5 minutos). Luego se procedió a revelar con ninhidrina.

Identificación de Aminoácidos y Proteínas

Instrumentos y materiales:

10 tubos de ensayo, Reactivo Biuret, Ninhidrina, H20, Gelatina, Caseína, Albúmina, Solución de Problema 1 y 2, Hidróxido de Sodio al 10% V/V, Papel Parafilm, Pipeta de 1ml, Masking Tape, Beacker, Gradilla, Estufa, Sartén, Perlas de Ebullición, Tenazas.

-Reacción Biuret:

1. Al tubo de ensayo No. 1 se le agregó 20 gotas de H20, al No. 2 se le agregó 20 gotas de gelatina, al No. 3 de caseína, al No. 4 de albúmina, al No. 5 de solución de problema 1, y al No. 6 solución de problema 2.

2. A cada uno de los tubos de ensayo se le agregó 1 ml de hidróxido de sodio al 10% v/v con un gotero, se anotaron los cambios en las distintas soluciones (ver resultados). Se le agregó el hidróxido de sodio para volver el pH de las soluciones más alcalino, ya que el reactivo biuret funciona en pH muy elevados.

3. Se agregó al tubo de ensayo no. 1 con una pipeta 3 gotas de biuret con un gotero, se cubrió el tubo con papel parafilm y se agitó vigorosamente de arriba hacia abajo por 1 minuto. Este procedimiento se hace con todos los tubos. Una vez terminado con todos los tubos se dejan reposar por 15 en la gradilla.

-Reacción Ninhidrina:

1. Al tubo de ensayo No. 1 se le agregó 20 gotas de H20, al No. 2 de gelatina, al No. 3 de caseína y al No. 4 de albúmina.

2. Se agregó al tubo de ensayo no. 1 con una pipeta 5 gotas de ninhidrina con un gotero, se cubrió el tubo con papel parafilm y se agitó vigorosamente de arriba hacia abajo por 1 minuto. Este procedimiento se hace con todos los tubos, una vez terminado con todos los tubos se colocaron en un beacker.

3. Una vez que todos los tubos estén en el beacker, se colocan baño maría por 10 minutos.

ResultadosLos resultados obtenidos durante la práctica coinciden con lo esperado

teóricamente, tanto para la cromatografía en papel como para la identificación de proteínas. Además, se da una explicación coherente sobre por qué suceden o no las tinciones respectivas durante en análisis de proteínas, así como el porqué del uso de los distintos materiales en la cromatografía (ver resultados y discusión de resultados).

Resultados:

Identificación de Proteínas:Durante la identificación de proteínas con la reacción de ninhidrina y la

reacción biuret se anotaron los distintos cambios que se observaron respectivamente durante el proceso, los cuales se describen a continuación en los cuadros:

Reacción Biuret:

Tubos de Ensayos: Soluto: (20 gotas) Tubo de Ensayo 1 AguaTubo de Ensayo 2 GelatinaTubo de Ensayo 3 CaseínaTubo de Ensayo 4 AlbúminaTubo de Ensayo 5 Solución problema 1Tubo de Ensayo 6 Solución problema 2

Resultados:

Inicialmente:

Al agregarle Na2OH al 10% (1 ml):

Con 3 gotas de Biuret (después de 15 minutos):

Reacción Ninhidrina:

Tubos de Ensayos: Soluto: (20 gotas) Tubo de Ensayo 1 AguaTubo de Ensayo 2 GelatinaTubo de Ensayo 3 CaseínaTubo de Ensayo 4 Albúmina

Resultados:

Inicialmente:

Con Ninhidrina (5 gotas):

10 minutos después del baño maría:

Cromatografía en Papel:

Proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de equipamiento extraordinario.

Consta de dos fases: fase móvil y fase estacionaria. La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el solventen (ver resumen). Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo.

Después de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado, en nuestro caso, ninhidrina, sumamente útil para revelar aminoácidos.

Los resultados obtenidos en el experimento están expresados por la ecuación:

R f=D /D f

Siendo D la distancia recorrida por cada muestra y Df la distancia del frente de avance del eluente (fase móvil).

Los Rfs son una forma de expresar la cantidad de lo que avanzó el aminoácido relativamente con lo que avanzó el eluente en el papel (fase estacionaria). Los Rfs obtenidos empíricamente, durante 5 minutos de corrimiento para las siembras de aminoácidos son:

Cis: 1.8/3 = 0.6 cm Gln: 1.4/2.5= 0.56cm Cis y Gln: 1.5/2.6= 0.58cm

Discusión de Resultados:

Identificación de Proteínas:

REACCIÓN BIURET:

Biuret

Los péptidos y proteínas producen una reacción coloreada muy usada para la valoración de los mismos, llamada reacción del Biuret, que contiene Cu2SO4 como disolvente. Las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta. Se necesitan 2 ó más uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado. Esta prueba sirve para la identificación de tripéptidos en adelante.

Un color violeta resulta cuando los iones cúpricos en medio alcalino forman complejos con los electrones no saturados de los átomos de nitrógeno y oxígeno de los enlaces de todas las proteínas. La cantidad de color producido es proporcional a la concentración de proteínas. Sin embargo, el método es un poco insensible siendo el límite menor de 0.25mg de proteínas.

Las sustancias que dan el color violeta tienen dos grupos –CONH2 unidos directamente o por un carbono o nitrógeno. Los compuestos que contienen –CH2NH2, -C(NH)NH2 y –CSNH2 en lugar de los grupos –CONH2 también reaccionan. Las estructuras peptídicas en proteínas y sus derivados que contengan enlaces peptídicos también dan positivo para la prueba de Biuret.

De los aminoácidos, la histidina da positivo. Los dipéptidos dan pruebas negativas. Las proteínas dan color morado o violeta mientras que las proteosas o peptonas (enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas) dan un color rosado y los péptidos dan un color rosado claro. Además, los aminoácidos dan un color amarillento [3].

Agua:

El agua no cambió en ningún momento del procedimiento porque no contiene ningún tipo de elemento orgánico y mucho menos compuestos proteicos, por esta razón da negativo a la reacción de biuret.

Gelatina

La geltaina es una mezcla coloide, incolora, translúcida, quebradiza y casi insípida que se obtiene a partir del colágeno procedente del tejido conectivo de despojos animales hervidos con agua. El colágeno es un compuesto proteico hecho sustancialmente de prolina, hidroxiprolina y glicina. El reactivo biuret debería dar positivo, debido a los componente peptídicos del colágeno presente en la gelatina. El resultado del laboratorio fue un color morado claro, que concuerda con lo que la teoría requiere, aunque se han hechos estudios donde la gelatina da un color azul [1]. Por ende podemos decir que si se hubiera dejado reaccionar por más tiempo o si se hubiera añadido más gelatina, se hubiera obtenido el color azul.

Caseína:

La caseína es una fosfoproteína presente en la leche y en algunos de sus derivados. En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio en un complejo que se ha denominado caseinógeno. El resultado del laboratorio fue el cambio de coloración de levemente blanco a un blanco opaco total. El resultado teórico esperado es un cambio de coloración a un azul lechoso, que en nuestro caso no fue azul, sólo lechoso. Deducimos que fue el hecho de solamente usar 20 gotas de caseína, el que produjo nuestro resultado: es posible que en la solución de caseína no se alcanzó el límite mínimo (0.25 mg) de caseína para que se llevara a cabo la reacción biuret [2].

Concordamos, también, en que posiblemente el factor tiempo influyó en la manifestación de la reacción.

Albúmina:

La albúmina es una proteína que se encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre y a su vez la más abundante en el ser humano. Es sintetizada en el hígado. Lo esperado en esta reacción es obtener un color violeta translucido. En la práctica del laboratorio, después de 15 minutos de reacción, no se notó ningún cambio convincente para afirmar que hay presencia de proteínas. Sin embargo una observación efectuada 20 minutos después de la primera observación, demostró un cambio de coloración amarillento. Según la teoría, la reacción Biuret, un color amarillento indica presencia de aminoácidos.

[1], [2] s.a. (2007). Prelab3: propiedades químicas de las proteínas. 05/05/2007. s.l.. Consultado el: 21/04/2010. Disponible en: http://www.doschivos.com/trabajos/biologia/88.htm.

[3] s.a. (2004). Experimento 2, identificación de aminoácidos. 06/03/2004. s.l.. Consultado el 23/04/2010. Disponible en: http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp. 34.

Solución Problema 1:

Ésta era una solución desconocida en la cual se quería probar la presencia o no de proteínas. El resultado fue un cambio de coloración nulo, lo que nos indica ausencia de proteínas. Esto no quiere decir que no existiera aminoácidos en la solución, ya que la reacción biuret no reacciona con aminoácidos sino que con enlaces peptídicos.

Solución Problema 2:

Al igual que en el problema 1, se quería probar la presencia o no de proteínas. El resultado fue un cambio de coloración a púrpura translucido, lo que nos demuestra presencia de proteínas en solución.

REACCIÓN CON NINHIDRINA:

Ninhidrina (2,2-Dihidroxindeno-1,3-diona)

La ninhidrina es un poderoso agente reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos (y por ende proteínas) por cromatografía o electroforesis. Ésta reacciona con los aminoácidos (pH entre 4 y 8) y en caliente, produciendo amoniaco, dióxido de carbono y un complejo de color púrpura azulado. Todos los aminoácidos primarios forman el mismo complejo químico tras su reacción con ninhidrina. Si la coloración es violeta o amarillo claro se trata de una proteína, un polipéptido o un aminoácido. Además, si el color es rojo o amarillo fuerte se trata del aminoácido prolina, o la hidroxiprolina.

Agua:

El agua no cambió en ningún momento del procedimiento, ni al agregar ninhidrina ni al momento de aplicarle calor, porque no contiene ningún tipo de elemento orgánico y mucho menos compuestos proteicos, por ende la ninhidrina no tiene con quién reaccionar.

Gelatina:

Como ya se mencionó anteriormente la gelatina es un compuesto proteico, que en la reacción de biuret cambió de color por la presencia de colágeno; sin embargo, en el procedimiento con ninhidrina la muestra de gelatina no cambió de color, aunque la teoría dice que por la presencia de prolina e hidroxiprolina, debería cambiar a una tonalidad amarillenta o roja. Suponemos que esto sucedió debido a problemas durante el goteo. Esto lo notamos porque el tubo de ensayo de la gelatina presentaba un notorio volumen mayor que el de los otros tubos de ensayo. Al ser una gran cantidad de gelatina y una cantidad relativamente menor de ninhidrina, ésta última tuvo una saturación más lenta para su reacción, dejando poco producto visible (lo que proveería su notorio color positivo).

Caseína:

Como ya se sabe la caseína es un compuesto proteico presente en la leche y sus derivados. En la práctica del laboratorio, la caseína actuó tal y como lo dice la teoría; cambio de color a un azul-morado, debido a la presencia de proteínas; y también cambió de estado (debido al aumento de termperatura): se coaguló, esto indica presencia de globulinas [3].

Albúmina:

Al hacerse la reacción con ninhidrina, la albumina cambió de un color transparente a rojo sangre y además se coaguló. El cambio de color indica la presencia de prolina e hidroxiprolina. La albúmina se coagula por el calor, lo que confirma su identidad [3].

[3] s.a. (2004). Experimento 2, identificación de aminoácidos. 06/03/2004. s.l.. Consultado el 23/04/2010. Disponible en: http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp. 34.

Cromatografía

Se recurrió al uso de Cromatografía en papel ya que es más fácil, y rápido en su aplicación además de observación de las reacciones.

La preferencia en el uso del papel Whatman 1, se debe a su característica de polaridad, ésta impide el rompimiento del papel.

La línea trazada más importante fue la inferior que media 2cm (ver resumen), ésta nos daba la pauta de inicio de los aminoácidos. Todos los trazos se hicieron a lápiz porque si se usaba lapiceros, debido a su tinta orgánica, se hubiera reaccionado con los aminoácidos, impidiendo la observación de ellos.

Las paredes internas de la cámara cromatográfica se revistieron con papel alto en celulosa. Esto previene que la presión externa de la cámara interviniera en el proceso cromatogáfico.

La fase estacionaria no toca la cámara cromatográfica porque está saturada de agua (para la adhrencia) en sus paredes; si el papel de la fase estacionarioa toca las paredes, o el papel que las recubre, absorbe fácilmente agua y ya no se puede observar con claridad el avance de los aminoácidos.

Al momento de sembrar la muestra se requirió el uso de capilares para tener una muestra más exacta, pero su uso no era necesario ya que podríamos utilizar un gotero.

El orden de las siembras de las muestras no afectaba nuestros resultados, lo único importante era colocar la misma cantidad de aminoácidos en cada punto, y no contaminar el papel de la fase estacionaria.

La fase estacionaria se dobló hacia afuera para que las muestras de los aminoácidos no entraran en contacto entre ellos (y así fuera más fácil la absorción de la fase móvil) colocándole grapas en los extremos para unirlos, porque si hubiéramos utilizado masking tape, se hubiera despegado, rompiendo la estructura requerida de la fase estacionaria.

Al momento de realizar la fase móvil procuramos que la cámara estuviera tapada para que no se contamine y no reaccionara con otro compuesto.

Al momento de sacar la fase estacionaria de la fase móvil, era necesario colocarse guantes debido a los componentes químicos que podrían afectar la mano. Era importante secar la fase estacionaria porque se tenía que revelar con ninhidrina, disminuyendo así la cantidad de los eluentes para evitar la reacción de los mismos. Obteniendo así la coloración de los aminoácidos.

La Cisteína corrió mas debido a su bajo peso molecular, y la Gluteína corrió menos debido a su alto peso molecular.

En la combinación de los aminoácidos se puede observar que su recorrido es el promedio de los recorridos de la Cisteína y la Gluteína. La Cisteína hizo que la mezcla de ambos aminoácidos corriera más pero al mismo tiempo la Gluteína impidió que siguiera avanzando, esto debido a las diferencias entre pesos moleculares.

Conclusiones: Para que se lleve a cabo una reacción como la de biuret revela únicamente la

presencia de proteínas y péptidos pequeños. La reacción de ninhidrina es más genérica que la de biuret. Identifica

aminoácidos y proteínas no por sus enlaces, sino por su constitución química, lo cual le otorga un mayor poder de identificación ante el biuret.

Otros factores como el tiempo, temperatura y cantidad de sustrato afectan la calidad de la reacción y resultados para la identificación de proteínas.

Dependiendo de la estructura primaria de cada proteína, la manifestación en las reacciones puede tener ciertas variaciones específicas.

El tiempo es indispensable en la cromatografía ya que con tiempos de corrida cortos no se aprecian claramente los cambios relevantes.

El método de identificación por cromatografía en papel es efectivo ya que los elementos utilizados como eluentes eran ideales para correr en el papel alto en celulosa y disolver los aminoácidos; además.

Conforme avanza el tiempo, la corrida del aminoácido variará dependiendo de su peso; a mayor peso, más lento el corrimiento, a menor peso, más veloz.

Las interacciones entre el solvente y soluto dieron a mostrar las características de cada aminoácido.

Bibliografía:

Mathews, C.K.(1996). Bioquímica. Segunda edición: España. Wikipedia. (2010). Peptidasa. (en línea). s.f.ed.. s.l.. Consultado el:

21/04/2010. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidasa. Wikipedia. (2010). Albúmina. (en línea). s.f.ed.. s.l.. Consultado el:

21/04/2010. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Albúmina. Wikipedia. (2010). Caseína. (en línea). s.f.ed.. s.l.. Consultado el: 21/04/2010.

Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Caseina. s.a. (2007). Prelab3: propiedades químicas de las proteínas. 05/05/2007.

s.l.. Consultado el: 21/04/2010. Disponible en: http://www.doschivos.com/trabajos/biologia/88.htm.

Usuario: denis_qca. (2008). Proteínas y sus reacciones. 09/19/2008. s.l.. Consultado el: 21/04/2010. Disponible en: http://www.scribd.com/doc/2309987/Proteinas-y-sus-reacciones.

s.a. (©2009). Precipitación de proteínas. s.f.ed.. Salamanca, España. Consultado el: 21/04/2010. Disponible en: http://html.rincondelvago.com/precipitantes-de-proteinas.html.

s.a. (2004). Experimento 2, identificación de aminoácidos. 06/03/2004. s.l.. Consultado el 23/04/2010. Disponible en: http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp 34.