relación entre las concentraciones de hormona
TRANSCRIPT
Facultad de Ciencias Veterinarias
-UNCPBA-
“Relación entre las concentraciones de hormona
antimülleriana y el número de embriones transferibles
en hembras bovinas”
Vales, Carla E.; Recavarren, Mariana I.; Gual, Fernando; Bianchi, Carolina.
Agosto, 2016
Tandil
“ Relación entre las concentraciones de hormona antimülleriana y el
número de embriones transferibles en hembras bovinas”
Tesina de la Orientación de Sanidad en Grandes Animales presentada
como parte de los requisitos para optar el grado de Veterinario de la
alumna: Vales, Carla Estefania.
Tutores: Recavarren, Mariana I.; Gual, Fernando.
Directora: Bianchi, Carolina.
Agradecimientos
Quiero agradecer a mis padres por haberme dado la oportunidad de cumplir el
objetivo de ser Veterinaria, en especial a mi mama por su esfuerzo y contención
durante los años de carrera.
Gracias a mis amigas y amigos por todas las experiencias vividas, sin ellos no
hubiera aguantado estar tan lejos de mi lugar.
Agradezco a Javier Soto y su familia por haberme dado un lugar en sus vidas
haciéndome sentir muy acompañada en los buenos y malos momentos.
También quiero agradecer a Nancy y Horacio por abrirme las puertas de su casa
en Mar del Plata para poder hacer la residencia en esa ciudad, hermosas
personas que siempre voy a recordar.
Gracias a mi tutora Mariana Recavarren, a Ivana Viera y José Ignacio Ronchi por
transmitirme parte de sus conocimientos y experiencias en tan poco tiempo. A
Ricardo Alberio por su generosidad de proporcionar las muestras para poder
realizar el experimento.
Gracias a mi directora Carollina Bianchi por la paciencia y ayuda brindada.
Finalmente gracias a “Jarme”, mi profesor de Porcinos en la secundaria, por
encaminarme y darme ese impulso tan necesario para que fuera a estudiar a
Tandil.
Resumen
El objetivo del presente trabajo fue relacionar las concentraciones séricas de
Hormona antimülleriana (AMH) tomada en el momento de realizar la inseminación
con el número de embriones transferibles obtenidos en hembras bovinas
sometidas a tratamientos superovulatorios. La concentración de AMH se
determinó mediante la prueba de ELISA en sándwich por medio de un kit
comercial para dosaje de AMH bovina. Los resultados obtenidos respondieron a
una distribución lineal, por lo que se utilizó el valor de correlación. El valor
obtenido fue cercano a 0,60, lo que indicó una moderada correlación entre el
número de embriones transferibles y la concentración de AMH en suero. Se pudo
observar que todos los animales con valores menores a 80 pg/ml tuvieron pocos
embriones transferibles; y todos aquellos animales con valores mayores a 450
pg/ml tuvieron muy buena cantidad de embriones transferibles. El número de
animales que se ubicaron en estos extremos fue bajo y, la correlación no explicó la
totalidad de los datos. Por tanto, es necesario realizar nuevos trabajos con mayor
número de animales y con muestras tomadas previas a iniciar el tratamiento
superovulatorio para poder llegar a una conclusión definitiva en cuanto al rol de la
AMH como predictor del número de embriones transferibles que dará una vaca
donante.
Palabras claves: Hormona Antimülleriana, ELISA, embriones transferibles.
Índice
Introducción 1
Revisión bibliográfica 3
Control neuroendocrino del ciclo estral 3
Ciclo estral bovino 4
Superovulación 8
Técnica de diagnóstico ELISA (Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay) 12
Materiales y Métodos 13
Resultados 14
Discusión 16
Conclusión 19
Referencia bibliográfica 20
1
Pág
ina1
Introducción
La superovulación y transferencia de embriones (Tecnología MOET) es la
tecnología utilizada en la cría de ganado para aumentar el número de crías en
hembras genéticamente superiores. Sin embargo, el número de embriones
transferibles (embriones de buena calidad) no ha cambiado significativamente en
los últimos 20 años y el uso de la tecnología MOET se acerca a una meseta (Rico
et al., 2009).
La principal limitación para el desarrollo de la tecnología MOET es la gran
variabilidad en la respuesta a los tratamientos superovulatorios. En la actualidad,
se ha establecido que la principal fuente de variabilidad es el estado de los
folículos ováricos en el momento del inicio del tratamiento con FSH. Cuando se
aplica un tratamiento de superovulación en vacas con pocos folículos pequeños
creciendo se observa una respuesta ovulatoria baja al tratamiento y éstas
producen un escaso número de embriones. Las mejoras en los tratamientos y el
desarrollo de protocolos de control de las ondas foliculares han mejorado las
respuestas pero no han eliminado las grandes diferencias entre los animales.
Estudios al respecto han sugerido que diferencias intrínsecas entre animales en el
desarrollo folicular causan variaciones marcadas de animal a animal en la
magnitud de la respuesta superovulatoria (Monniaux et al., 2010).
Una prueba predictiva para la selección de vacas que pueden producir alto
número de embriones transferibles u ovocitos fecundables haría representar un
gran avance en la tecnología MOET. En la actualidad, el recuento de folículos
antrales por ecografía ovárica es la única manera de seleccionar buenas donantes
de embriones, pero esta técnica requiere de personal entrenado y de un
equipamiento especializado (Monniaux et al. 2010).
Los perfiles endocrinos de gonadotrofinas, esteroides u otros compuestos, han
demostrado ser de valor limitado en la predicción de la capacidad de las donantes
de embriones en el ganado bovino. Recientemente, la atención se ha centrado en
la hormona antimülleriana (AMH), brindando nueva información sobre el pool
folicular y la respuesta a los tratamientos superovulatorios en bovinos. En esta
2
Pág
ina2
especie, como en otras, la hormona antimülleriana se expresa específicamente
por células de la granulosa de folículos antrales pequeños y disminuye durante el
crecimiento folicular terminal y atresia (Monniaux et al. 2010).
La determinación de las concentraciones plasmáticas de hormona antimülleriana
podría ayudar a predecir las respuestas superovulatorias y optimizar el
costo/beneficio. En Argentina, no existen antecedentes sobre la medición de
hormona antimülleriana para la selección de vacas donantes de alta producción de
embriones transferibles.
La presente tesina tiene como objetivo evaluar la relación entre las
concentraciones séricas de hormona antimülleriana con el número de embriones
transferibles obtenidos en hembras bovinas sometidas a tratamientos
superovulatorios.
3
Pág
ina3
Revisión bibliográfica
Control neuroendocrino del ciclo estral:
El ciclo estral bovino está regulado por una interacción hormonal comandada por
el eje hipotálamo-hipófisis-ovario-útero.
Figura 1: Interacciones hormonales del eje Hipotálamo-Hipófisis-Ovario-Útero
(Callejas, 2001).
Las neuronas del hipotálamo producen la hormona liberadora de gonadotrofinas
(GnRH). Esta hormona difunde a los capilares del sistema porta hipofisiario y de
aquí a las células de la adenohipófisis, lugar en el cual estimula la síntesis y
secreción de la hormona folículoestimulante (FSH) y luteinizante (LH). La FSH es
la responsable del proceso de estroideogénesis ovárica, crecimiento y maduración
folicular y la LH interviene en el proceso de estroideogénesis ovárica, ovulación,
formación y mantenimiento del cuerpo lúteo. Estas hormonas son secretadas a la
sangre en forma de pulsos y son reguladas por el sistema tónico y el cíclico. El
4
Pág
ina4
sistema tónico produce el nivel basal circulante de las hormonas hipofisiarias, las
que promueven el desarrollo de los elementos germinales y endocrinos de las
gónadas. El sistema cíclico actúa por sólo 12 a 24 hs en cada ciclo estral, y tiene
por función primaria provocar la ovulación. La neurohipófisis, parte posterior de la
hipófisis, produce oxitocina. Esta hormona tiene varias funciones, dentro del ciclo
estral y por ejemplo, interviene en el proceso de luteólisis (Callejas, 2001).
En los ovarios se produce progesterona, estrógeno e inhibina. Los estrógenos son
producidos por el folículo ovárico y tienen acción sobre diferentes órganos como
son las trompas de Falopio, útero, vagina, vulva y el sistema nervioso central, en
el cual estimulan la conducta del celo y, en el hipotálamo ejercen una
retroalimentación negativa en el centro tónico y una retroalimentación positiva en
el centro cíclico. La progesterona es producida por el cuerpo lúteo por acción de la
hormona luteinizante. Esta hormona prepara el útero para la implantación del
embrión y genera el ambiente apropiado para mantener la gestación. En cuanto al
control del ciclo estral, la progesterona ejerce una retroalimentación negativa
sobre el centro tónico (Callejas, 2001).
El útero produce prostaglandina F2α, hormona que interviene en la regulación del
ciclo estral por su efecto luteolítico. A su vez interviene en los mecanismos de la
ovulación y el parto (Callejas, 2001).
Ciclo estral bovino:
Los acontecimientos que comienzan en un celo y finalizan en el siguiente reciben
el nombre de ciclo estral. El ciclo estral bovino tiene una duración promedio de 21
días (rango 17-25) y se produce en forma continua a lo largo del año (Callejas,
2001).
El ciclo estral se divide en etapas que representan sucesos de comportamiento o
gonadales. En términos generales, el ciclo estral bovino se divide en proestro, el
cual posee una duración de 3 a 4 días, y es la etapa donde ocurre el desarrollo
folicular que acontece después de la regresión del cuerpo lúteo y termina en el
estro. Este último, dura de 6 a 24 horas y es el momento de receptividad sexual.
5
Pág
ina5
Se continúa con el metaestro, el cual es el periodo de desarrollo del cuerpo lúteo y
tiene una duración de alrededor de 3 a 4 días, y finalmente el diestro que dura
aproximadamente 14 días y es la etapa de maduración del cuerpo lúteo
(Ungerfeld, 2002; Davidson y Stabenfeldt, 2009).
Ovogénesis y foliculogénesis:
La ovogénesis comienza en la vida fetal con la división mitótica de las ovogonias.
En determinado momento, estas células se transforman en ovocitos y comienzan
el proceso de meiosis, el cual permite obtener un óvulo (Callejas, 2001).
Luego de comenzada la meiosis, los ovocitos son rodeados por células foliculares
y se produce la detención de la misma en el estadio de diploteno, profase I,
ovocito I, denominado estadio dictiático. Cuando se produce el pico preovulatorio
de LH, sólo el ovocito contenido en el folículo preovulatorio reinicia su meiosis
hasta el estadio de metafase II, ovocito II, estadio en el cual ovula y permanece
así, hasta el momento de la fecundación. Se debe tener en cuenta que al
momento del nacimiento, todas las hembras mamíferas nacen con una gran
reserva de ovocitos los cuales declinan rápidamente a medida que se llega a la
pubertad (Callejas, 2001).
La foliculogénesis permite obtener un folículo preovulatorio o de DeGraff a partir
de folículos primordiales. Este proceso comienza en la vida fetal, en la cual se
genera la reserva de folículos primordiales (Callejas, 2001).
Dinámica folicular bovina:
En los bovinos se producen dos o tres ondas foliculares consecutivas por ciclo
estral. En cada ola se produce el reclutamiento de una cohorte de folículos de la
reserva ovárica total, y de éstos se selecciona un folículo dominante que continua
creciendo y madurando mientras que los demás sufren atresia (Ptaszynska y
Molina, 2007).
Se pueden distinguir tres fases distintas en el desarrollo folicular: reclutamiento,
selección y dominancia.
6
Pág
ina6
En cada onda folicular se produce el reclutamiento simultáneo de varios folículos
(entre tres y seis) que crecen hasta llegar a un diámetro de 4-5 mm. A los pocos
días del inicio de la onda folicular surge un folículo dominante, éste crece y se
diferencia mientras que los demás folículos reclutados dejan de crecer y se
atresian. Normalmente los folículos de las primeras ondas del ciclo regresionan
pero, estos folículos podrían ovular si se les brindan las condiciones endocrinas
adecuadas (Ptaszynska y Molina, 2007).
El reclutamiento de olas de folículos
Las ondas foliculares están precedidas de un pequeño pico de FSH. Los folículos
que salen de la cohorte de descanso folicular contienen receptores específicos
para FSH, y dependen de esta gonadotrofina para crecer (Ptaszynska y Molina,
2007).
Selección del folículo dominante
Uno de los folículos de la cohorte reclutada es seleccionado, una de las
características para dicha selección podría ser su mayor capacidad para la
producción de estradiol. El futuro folículo dominante expresa receptores para LH
que permite que siga creciendo (Ptaszynska y Molina, 2007).
Folículo dominante seleccionado.
Tras su selección, el crecimiento, la actividad estrogénica y el plazo de vida de un
folículo dominante son controlados por el patrón de pulsos de la LH (Ptaszynska y
Molina, 2007).
7
Pág
ina7
Figura 2: Modelo esquemático de las ondas de crecimiento folicular y desarrollo
del cuerpo lúteo en bovino (Rosales Torres, 2012.)
Las primeras etapas de desarrollo folicular: activación de los folículos primordiales
y crecimiento de los folículos preantrales.
El conocimiento de los mecanismos que regulan la activación de folículos
primordiales, el crecimiento de los mismos y la diferenciación del folículo preantral
son de gran interés ya que permitiría la utilización del pool de folículos
primordiales para mejorar la eficiencia reproductiva. El desarrollo folicular se
puede dividir en tres etapas: la activación de los folículos primordiales, la
transición a folículos secundarios y el desarrollo de los folículos secundarios a la
etapa periantral (Fortune, 2003).
Luego de estudios in vitro se ha demostrado que la activación de folículos
primordiales en el ganado vacuno se produce sin el agregado de factores de
crecimiento u hormonas. También se comprobó que existen factores inhibitorios
para la salida gradual de folículos del pool de descanso (Fortune, 2003).
Los folículos se forman cuando los ovocitos primarios están envueltos por una sola
capa de células de la granulosa aplanadas. En el ganado bovino, la formación de
8
Pág
ina8
los folículos se produce durante la vida fetal, esta formación no se produce de
manera sincrónica sino que el ovario fetal contiene folículos preantrales y antrales
tempranos. La transición de folículos primordiales a la etapa primaria puede ser
muy prolongada. La etapa secundaria comienza con el desarrollo de una segunda
capa de células granulosas, progresa a través de la adición de hasta seis o siete
capas de células y termina con el desarrollo gradual de una cavidad antral
(Fortune, 2003).
Numerosos estudios in vitro en diferentes especies han logrado dilucidar que
existen diversos moduladores de la activación de folículos primordiales y
crecimiento de los folículos preantrales (Fortune, 2003).
Superovulación:
El objetivo de la transferencia de embriones es obtener a partir de progenitores de
alto valor genético el mayor número posible de descendientes utilizando el útero
de receptoras de menor valor económico para llevar la gestación a término
(Callejas, 2001). Para llegar a producir un número elevado de descendientes con
alto valor genético, debe generarse en la hembra donante una estimulación
ovárica adecuada mediante la administración de gonadotrofinas (Callejas, 2001).
Un alto grado de imprevisibilidad en las respuestas superovulatorias todavía existe
después de 35 años, lo cual afecta la eficiencia y rentabilidad de la transferencia
comercial de embriones (Bo y Mapletoft, 2014).
Se han desarrollado protocolos que controlan la emergencia de la onda folicular
logrando obtener mejores resultados.
Protocolos de tratamientos de superestimulación actuales
La vida media de la FSH en la vaca es de 5 horas o menos, por éste motivo debe
ser administrada dos veces al día para inducir superovulación con éxito. El
protocolo habitual ha sido la aplicación cada 12 h vía intramuscular de FSH
durante 4 o 5 días. Después de 48 a 72 horas de la iniciación del tratamiento se
9
Pág
ina9
administra PGF2α para inducir luteólisis. Las ovulaciones comienzan entre 24 y 36
horas más tarde luego del estro (Bo y Mapletoft, 2014).
Estudios recientes han indicado que la tasa de ovulación puede mejorarse en
algunas donantes si la FSH es administrada durante 6 o 7 días. La mayoría de los
protocolos de superestimulación han tenido éxito en la inducción de la
superovulación pero, algunos han incorporado un dispositivo de progesterona al
protocolo inicial, lo cual asegura que las donantes no entren en celo
tempranamente (Bo y Mapletoft, 2014).
Con el uso de la ecografía se ha demostrado que 8 a 12 días después del estro es
el momento de la emergencia de la segunda onda folicular y una cohorte de
folículos en crecimiento está presente en ese momento. Pero se ha observado que
el día de la aparición de la segunda onda folicular varía según se traten ciclos
estrales con dos o tres ondas (Bo y Mapletoft, 2014).
La mayoría de los protocolos de superovulación utilizados en la actualidad
implican la iniciación de tratamientos con FSH posteriores al control exógeno de la
emergencia de la onda folicular. (Bo y Mapletoft, 2014)
Manipulación de la emergencia de la onda folicular
- Estradiol y progesterona. El protocolo más común para sincronizar la
aparición de una nueva onda folicular para superestimulación consiste en la
aplicación de 17β-estradiol o benzoato de estradiol más progesterona en el
momento de la inserción del dispositivo intravaginal conteniendo
progesterona. El estradiol suprime la liberación de FSH, lo que provoca la
atresia del folículo dominante. Luego de que el estradiol es metabolizado
sube el nivel de FSH y surge una nueva onda folicular, esto sucede 4 días
después del tratamiento. Emerge una nueva cohorte de folículos de un
tamaño entre 3 a 5 mm que crecen al mismo tiempo.
- Ablación del folículo dominante. La eliminación del folículo dominante
mediante ablación guiada por ultrasonido elimina el efecto supresor del
10
Pág
ina1
0
mismo provocando la emergencia de una nueva onda folicular. Los
tratamientos se inician después de 1 a 2 días luego de la eliminación del
folículo dominante. Este método es apropiado para centros de producción
de embriones.
- GnRH. Luego de la aplicación de GnRH se produce la ovulación y una
nueva onda folicular surge. Sin embargo, esta nueva onda folicular surge
sólo cuando la GnRH produce la ovulación, por lo tanto en fases aleatorias
del ciclo estral los porcentajes de ovulación son muy variables. Se
obtuvieron resultados más prometedores colocando un dispositivo de
progesterona en las fases aleatorias del ciclo estral y, aplicando GnRH 2 o
3 días más tarde e iniciando los tratamientos de superestimulación luego de
1,5 a 2,5 días. La respuesta ovulatoria mejora debido a que la presencia del
dispositivo con progesterona impide la ovulación de folículos maduros
aumentando así la eficiencia de la GnRH.
Un protocolo de superestimulación recomendado consiste en la
administración de PGF2 α en el momento de la inserción de un dispositivo
con progesterona. Siete días más tarde (con el dispositivo en su lugar) se
administra GnRH para inducir la ovulación del folículo persistente y la
sincronización de la emergencia de la onda folicular. Los tratamientos de
FSH se inician 36 horas después de la administración de GnRH (Bo y
Mapletoft, 2014).
Durante una onda folicular normal los folículos subordinados regresionan debido a
la disminución de las concentraciones de FSH circulante causada por las
secreciones de estradiol e inhibina por parte de la cohorte y especialmente del
folículo dominante. Los folículos pequeños requieren de FSH para continuar su
crecimiento, y se ha demostrado que los folículos de 1 mm de diámetro inician el
crecimiento bajo la influencia de la FSH. Los tratamientos de superovulación se
deben iniciar en presencia de folículos con un diámetro de 3 a 4 mm. Se han
realizado estudios en los cuales se administraron dos veces al día durante dos
días consecutivos pequeñas dosis de FSH para reclutar más folículos antrales de
11
Pág
ina1
1
1 mm de diámetro, con esto se logra llegar a folículos de 3 a 4 mm de diámetro al
momento de iniciar el protocolo de superestimulación. Como alternativa, los dos
días con FSH pueden ser reemplazados con una sola inyección de eCG. (Bo y
Mapletoft, 2014).
Número de folículos y la respuesta a la superovulación
Se ha sugerido que el número de folículos presentes en el ovario en el momento
del tratamiento con gonadotrofinas afecta la respuesta a la superovulación en el
ganado. Identificaron dos clases de vacas que respondieron mal al tratamiento de
superestimulación. El primer grupo tenía de 50 a 200 folículos en crecimiento por
ovario, en comparación con 600 o más folículos en los ovarios de vacas que
respondieron bien. El segundo grupo de vacas que no respondieron tenían un
gran número de folículos pero muchos de ellos sufrieron atresia en el momento
que se iniciaron los tratamientos. La segunda clase de vacas respondieron cuando
el tratamiento se inició en el momento de la emergencia de la onda folicular a
diferencia del primer grupo de vacas en las cuales la población de folículos no era
suficientemente grande; esta condición no está sujeta a mejora (Bo y Mapletoft,
2014).
Recientemente, varios estudios han demostrado que el número de folículos en las
ondas foliculares son altamente variables entre los animales pero muy repetible
dentro de los individuos. Se ha comprobado que el número máximo de folículos ha
sido tan bajo como 8 folículos en algún ganado en comparación con ganado que
han tenido 56 folículos. Se han informado diferencias en las respuestas de
superestimulación entre vacas que tenían más de 30 folículos de 3 a 5 mm de
diámetro en comparación con aquellas que tenían menos de 30 folículos. Por lo
tanto podría ser posible seleccionar vacas donantes basándose en el número de
folículos presentes en el surgimiento de la onda folicular detectado mediante
ecografía. Se ha reportado que el número de folículos se asocia con las
concentraciones séricas de la hormona antimülleriana (AMH). La hormona
Antimülleriana es una glicoproteína que pertenece a la familia del factor de
crecimiento β, que se produce en las células de la granulosa de todos los folículos
12
Pág
ina1
2
en crecimiento y es mayor la producción en los pequeños folículos antrales, que
contribuyen a los niveles endocrinos de AMH. En vacas y cabras los niveles fueron
muy variables entre los individuos pero característico de cada animal durante un
periodo de tiempo. Por lo tanto, podría ser posible evaluar la reserva de folículos
gonadotrofina-sensibles en el ovario. Rico et al., 2009 han demostrado una
correlación entre la producción de AMH y la respuesta superovulatoria en vacas
donantes, se ha sugerido que serviría para diferenciar entre vacas que producen
más o menos de 10 embriones transferibles (Bo y Mapletoft, 2014).
Técnica de diagnóstico ELISA (Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay):
Una de las técnicas utilizadas para determinar concentraciones de hormonas es la
técnica de ELISA. Existen diversas variaciones de la técnica de ELISA, pero la
más utilizada es la denominada ELISA en sándwich la cual utiliza dos anticuerpos
reactivos con diferentes epitopes del antígeno cuya concentración se desea
determinar (Abbas et al., 2012).
La técnica de ELISA en sándwich se utiliza para identificar un antígeno específico
de la muestra. La superficie de lo pocillos se prepara con una cantidad límite de
anticuerpos conocida, para capturar el antígeno. Después de la unión no
específica se bloquean los sitios libres de la placa utilizando albúmina de suero
bovino. Se agrega la muestra a la placa. A continuación se añade anticuerpo
primario específico para el antígeno. Luego se agrega anticuerpo secundario
ligado a enzimas, que se unen al anticuerpo primario, conjugados anticuerpo-
enzima no unido se eliminan mediante un lavado. Se añade el sustrato que es
enzimáticamente convertido y genera un color que puede ser cuantificado (Gan y
Patel., 2013).
13
Pág
ina1
3
Materiales y Métodos
El presente trabajo se realizó en noviembre del año 2013, en el Área de
Veterinaria del Fares Taie Instituto de análisis, de la ciudad de Mar del Plata.
Las muestras de suero fueron obtenidas de 34 vacas de raza Aberdeen Angus
luego de ser tratadas con dosis diferentes de hormonas comerciales (Foltropin ® y
Pluset®) con el objetivo de estimular la superovulación, antes de la inseminación
de las mismas, pertenecientes a un establecimiento privado de la provincia de La
Pampa.
La extracción de sangre se realizó el mismo día de la inseminación artificial, las
muestras se centrifugaron y el suero fue almacenado a una temperatura de – 18
°C hasta su análisis. Los datos fueron brindados por el Dr. Ricardo Alberio
mediante planillas en las cuales figuraba fecha de extracción de sangre, número
de vaca y número de embriones transferibles.
La determinación de AMH se realizó por la prueba de ELISA en sándwich por
medio de un único kit comercial para dosaje de AMH bovina (Bovine AMH Elisa,
AL-114, AnshLbas®); siguiendo el procedimiento indicado por el fabricante.
Para la realización de la prueba de ELISA en sándwich se utilizaron los siguientes
materiales:
- Agua destilada o desionizada.
- Pipeta automática 10-100 microlitros.
- Tips 10-100 microlitros.
- Pipeta automática 100-1000 microlitros.
- Tips 100-1000 microlitros.
- 7 tubos khan.
- Un vortex.
- Un shaker.
- Lector de densidad óptica (SIRIO plus SEAC).
14
Pág
ina1
4
Se siguieron los pasos que se encuentran detallados en el Kit.
Luego de realizar la lectura de las muestras se calculó la densidad óptica para el
calibrador, control y muestra.
Se graficó el logaritmo de la densidad óptica para cada calibrador en el eje y
versus el logaritmo de la concentración de AMH (pg/ml) en el eje x utilizando una
curva cúbica de regresión.
Se determinó la concentración de AMH de las muestras mediante la curva de
calibración.
Todas las muestras se determinaron en un único ensayo y el coeficiente de
variación intraensayo fue menor a 11% para muestras con concentraciones
comprendidas entre 27 y 765 pg/ml.
Se utilizó el proc.reg del paquete estadístico SAS para determinar el grado de
relación entre el número de embriones transferibles y las concentraciones de AMH
determinadas.
15
Pág
ina1
5
Resultados
Los resultados obtenidos en este trabajo respondieron a una distribución lineal de
datos, por lo cual se utilizó el valor de correlación.
En este estudio los valores de correlación fueron cercanos a 0,6 lo que indicó una
moderada correlación entre el número de embriones transferibles y la
concentración de la AMH. Debe tenerse en cuenta que la mayoría de los datos se
ubican en la zona difusa en donde la correlación no explica la totalidad de los
datos.
En la presente Tesina se trabajó con el dato de embriones transferibles debido a
que es lo que resulta de importancia en los sistemas productivos. En la siguiente
tabla se muestra que los animales utilizados brindaron entre 0 a 37 embriones con
posibilidades de ser transferidos.
Tabla 1. Producción de embriones transferibles y concentración de AMH (pg/ml)
obtenidos de hembras bovinas superovuladas.
N° de orden
N° pocillo Caravana Embriones transferibles pg/ml de AMH
1 21 1266 0 380,4
2 28 295 0 209,6
3 2 1 1 123,2
4 30 2 1 233,5
5 1 435 2 34,0
6 6 2622 2 180,4
7 11 1654 2 201,1
8 17 2658 2 178,7
9 24 1650 2 208,5
10 4 6 3 71,1
11 23 434 3 33,7
12 32 2402 3 74,4
13 9 1784 4 198,7
14 19 2988 4 45,0
15 3 3130 5 167,5
16 10 921 5 434,5
17 25 192 5 60,3
18 26 981 5 136,4
19 18 2626 6 168,1
20 7 2642 7 91,2
21 20 1264 7 239,0
22 22 1493 7 195,1
23 14 2624 8 233,5
16
Pág
ina1
6
24 33 1019 8 268,9
25 27 228 9 83,6
26 5 1055 11 308,5
27 16 2872 11 244,5
28 34 1396 11 140,2
29 15 X230 12 200,0
30 12 42 13 241,7
31 8 2226 16 241,5
32 13 6X 18 737,1
33 29 856 23 291,1
34 31 2610 37 603,5
Grafico 1. Relación entre las concentraciones de AMH y el número de embriones
transferibles obtenidos de hembras bovinas superovuladas.
17
Pág
ina1
7
Discusión
Los resultados de este trabajo brindan evidencia de que existe una correlación
positiva media entre la concentración sérica de AMH y la producción de embriones
transferibles por parte de vacas donantes sometidas a tratamientos
superovulatorios. Si bien las concentraciones séricas de AMH no siempre
estuvieron en relación con el número de embriones transferibles, se puede
observar que los valores menores a 80 pg/ml se correlacionaron con animales que
dieron menos de 5 embriones transferibles. Sin embargo, hubo animales que
dieron pocos embriones transferibles y tuvieron concentraciones séricas
superiores a ese valor. También es importante destacar que los animales con
valores superiores a 450 pg/ml tuvieron una elevada producción de embriones
transferibles, por encima de 18, aunque los que se ubican en este extremo son
muy pocos.
Estos resultados coinciden parcialmente con los obtenidos en el trabajo
experimental realizado por Danielle Monniaux et al. (2010), en el cual se asignaron
las vacas donantes a grupos distintos en función de la concentración de AMH
determinada por el Active MIS/AMH ELISA Kit en una sola muestra, obtenida
independientemente de la fase del ciclo estral de las vacas donantes. Estos
autores observaron que había una correlación positiva entre la concentración de
AMH de las vacas donantes y el número de embriones obtenidos por vaca. La
asignación de las vacas donantes a diferentes grupos según la concentración de
AMH puso en evidencia que las vacas con concentraciones plasmáticas de AMH
entre 100 – 200 pg/ml y mayores a 200 pg/ml produjeron mayor cantidad de
embriones transferibles que las vacas con valores menores a 100 pg/ml de AMH.
Por su parte, Rico et al. (2009) investigaron las relaciones entre las
concentraciones de AMH en plasma, las poblaciones foliculares y las respuestas a
los tratamientos superovulatorios. Las concentraciones de AMH medidas en
plasma en T0 (antes de la aplicación del tratamiento superovulatorio) fueron
altamente correlacionadas con los números de folículos pequeños y medianos
18
Pág
ina1
8
detectados por ecografía en T0 y el número de folículos grandes en TE (tiempo del
estro). También encontraron correlaciones significativas en los números de
cuerpos lúteos en TL (fase luteal). Estos investigadores concluyeron en la
existencia de una fuerte relación entre las concentraciones endocrinas de AMH y
el número de folículos sensibles a gonadotrofinas en los ovarios de las vacas; en
nuestro trabajo se obtuvo una correlación moderada entre la concentración de
AMH y el número de embriones transferibles obtenidos.
Si bien, según lo observado en la bibliografía, hay una correlación positiva entre el
nivel de AMH entre las distintas fases del ciclo estral; los mismos varían en las
distintas fases. Por lo tanto, para una correcta interpretación de los resultados de
las concentraciones de AMH, se sugiere extraer sangre antes de la aplicación del
tratamiento superovulatorio. En este punto, la obtención de las muestras en
nuestro trabajo se realizó luego de aplicar el tratamiento superovulatorio, por lo
que es necesario realizar nuevos ensayos con el fin de lograr una correcta
interpretación de los resultados tomando las muestras antes de aplicar el
tratamiento superovulatorio.
19
Pág
ina1
9
Conclusión
Como conclusión, según los datos que se obtuvieron en este trabajo, la
concentración sérica de Hormona Antimúlleriana, al momento de la inseminación
artificial, tiene una correlación moderada con el número de embriones transferibles
que se obtienen en hembras bovinas sometidas a tratamientos superovulatorios.
Es necesario realizar nuevos trabajos con muestras tomadas en otros momentos y
con un número mayor de animales estudiados para poder llegar a una conclusión
definitiva en cuanto al rol de la AMH como predictor del número de embriones
transferibles que dará una vaca donante.
20
Pág
ina2
0
Referencia bibliográfica
- Bó, G. A., Mapletoft, R. J. (2014). Historical perspectives and recent
research on superovulation in cattle Theriogenology 81, 38-48.
- Callejas, S. (2001). Fisiología del ciclo estral bovino, pp 37 – 60. Palma,
G.A. (eds) Biotecnología de la Reproducción.
- Davidson, A.P.; Stabenfeldt, G.H. (2009). Reproducción y lactación,pp 465-
525. In: J.G. Cunningham; B.G. Klein (Eds). Fisiología Veterinaria. 4ta
edición. Elsevier Saunders. Amsterdam.
- Fortune, J. E. (2003). The early stages of follicular development: Activation
of primordial follicles and growth of preantral follicles. Animal
ReproductionScience78, 135-163.
- Monniaux, D., Barbey, S., Rico, C., Fabre, S., Gallard, Y., Larroque, H.
(2010). Anti-Müllerian hormone: a predictive marker of embryo production in
cattle? Reproduction, Fertility and Development, 22 (7), 1083-1091.
- Ptaszynska, M., Molina, J.J. (2007). Compendium de reproducción animal.
Intervet.
- Rico, Ch. (2009). Anti- Müllerian Hormone is an Endocrine Marker of
Ovarian Gonadotropin- Responsive Follicles and Can Help to Predict
Superovulatori Responses in the Cow. Biology of reproduction 80, 50-59.
- Rosales Torres, A.M, Guzmán Sánchez, A. (2012). Role of Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF) and its receptors during the ovarian
cycle. Review. Rev. Mex. de Ciencias Pecuarias, 89- 111.
- Ungerfeld, R. (2002). Control endocrino del ciclo estral, pp 41-55. In: R.
Ungerfeld (Ed.) Reproducción en los animales domésticos. Tomo I. Melibea
ediciones. Montevideo, Uruguay.
21
Pág
ina2
1
- Abbas, A. K.; Lichtman, A. H.; Pillai, S. (2012). Técnicas de laboratorio
usadas con frecuencia en inmunología, pp 513- 514. Inmunologia celular y
molecular. 7 ma Edición.
- Gan, S. D.; Patel K. R. (2013). Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology 133.